ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ...
Transcript of ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ...
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DETERJAN KATKI MADDESİ OLARAK MİKROBİYAL KAYNAKLI
LİPAZ ÜRETİM KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI Banu Şükran ŞENGEL
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2007
Her hakkı saklıdır
i
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
DETERJAN KATKI MADDESİ OLARAK MİKROBİYAL KAYNAKLI LİPAZ ÜRETİM KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI
Banu Şükran ŞENGEL
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Serpil TAKAÇ
Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen ve genetik tanımlama ile türünün Debaryomyces hansenii olduğu belirlenen mikroorganizmadan, deterjanlarda kullanılmak üzere aktif ve kararlı lipaz üretimi için karbon ve azot kaynakları, metal iyonları, sıcaklık, pH gibi uygun üretim koşullarının belirlenmesi amaçlanmıştır. TBA ortamında çoğaltılan mikroorganizma, steril koşullarda öncelikle sıvı ön çoğalma ortamına, ön çoğalma ortamından da farklı üretim parametrelerinin incelendiği üretim ortamlarına 1/10 aşılama oranı ile aktarılmış ve çalkalamalı hava banyosunda N=150 rpm’de izoterm koşullarda enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Farklı kalma sürelerinde üretim ortamlarından alınan örneklerle hücre derişimi, protein derişimi ve lipolitik aktiviteler izlenmiştir. Mikroorganizma derişimi türbidimetrik olarak spektrofotometre ile ölçülmüş; lipaz aktivitesi ise titrimetrik ve spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın ürettiği protein miktarı Bradford yöntemi ile ölçülmüştür. Hücre içi lipaz aktiviteleri belirlenirken, hücre cam boncuklu homojenizatörde parçalanmıştır. Lipaz üretimi için en uygun koşullar belirlendikten sonra, bu koşullarda üretilen lipaz saflaştırılmıştır. Bu amaçla ardışık olarak ultrafiltrasyon ve anyon değişim kromatografisi yapılmıştır. Son olarak kısmen saflaştırılmış lipazın SDS, EDTA, Triton X-100, H2O2, amilaz ve proteaz gibi deterjan katkı maddelerinin varlığında aktivitesi incelenmiş ve enzimin deterjanlarda kullanıma uygun olup olmadığı araştırılmıştır. Sonuç olarak lipolitik aktivite için en uygun koşullar, karbon kaynağı olarak %1 derişimde soya yağı, azot kaynağı olarak %1 derişimde soya unu, metal tuzları içerisinde 10 mM KCl, üretim sıcaklığı T=30oC, üretim başlangıç pH’ı 6.5 olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın hücre dışına salgıladığı lipazın aktivitesi, hücre içi lipaz aktivitesinden daha yüksektir. Kısmen saflaştırılmış olan lipaz, deterjan katkıları varlığında aktivitesinin büyük çoğunluğunu koruyabildiği için üretilen enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir.
2007, 158 sayfa
Anahtar Kelimeler : Debaryomyces hansenii, deterjan enzimleri, lipaz, lipaz aktivitesi, mikrobiyal lipaz üretimi
ii
ABSTRACT
Master Thesis
INVESTIGATION OF MICROBIAL LIPASE PRODUCTION CONDITIONS AS DETERGENT ADDITIVE
Banu Şükran ŞENGEL
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering
Supervisor: Prof.Dr. Serpil TAKAÇ
The aim of this study is to produce active and stable extracellular lipase enzyme by yeast isolated from waste of a milk products plant; and to test its compatibility with detergent additives. The yeast was determined as Debaryomyces hansenii using molecular identification methods; and the most effective conditions for lipase production including carbon and nitrogen sources, temperature, initial pH and metal ions were investigated. The microorganism grown on TBA was first inoculated into pre-culture medium and then transferred into enzyme production medium with the volume ratio of 1/10. Enzyme production was carried out in shake flasks isothermally at 150 rpm. Samples drawn from the medium with certain time intervals were analyzed for the determination of cell concentration, protein concentration and lipolytic activity. The cell concentration was determined turbidimetrically and the protein concentration was measured by Bradford method. Lipolitic activity was determined by spectrophotometrically and titrimetric analysis. To determine intracellular lipase activity, the cells were disrupted with a homogenizator using glass beads. The enzyme produced under optimal conditions was partially purified by ultrafiltration and anion exchange chromatograpy in successive. Partially purified enzyme was tested for its recovered activity in the presence of detergent additives such as SDS, EDTA, Triton X-100, amylases and proteases. As a result, optimal parameters for lipase production from D. hanseneii were found out to be soybean oil (%1v/v) as carbon source, soybean flour (%1 w/v) as nitrogen source and 10 mM KCl as metal salt. The optimal temperature and initial pH for high lipase activity were T=30oC and pH=6.5, respectively. The extracellular lipase activity was found to be higher than intracellular lipase activity. The partially purified lipase succeeded to recover its activity in the presence of detergent additives tested; therefore, the enzyme has been considered to have a required potential for the usage in detergent industry.
2007, pages 158 Key Words : Debaryomyces hansenii, detergent enzymes, lipase, lipase activity, microbial lipase production
iii
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans çalışmam boyunca bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, çalışmamın
her aşamasında ilgi ve desteğini gördüğüm danışman hocam Prof. Dr. Serpil TAKAÇ’a
çok teşekkür ederim.
Çalışmamda, mikroorganizmanın genetik olarak tanımlanmasındaki yardımları için
Doç. Dr. Hilal ÖZDAĞ’a; DNA izolasyonu ve mikroorganizmanın morfolojik olarak
tanımlanmasındaki yardımları için Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ ve Prof. Dr. Sedat
DÖNMEZ’e, bitkisel yağların analizlerindeki yardımları için Prof. Dr. Aziz TEKİN’e;
enzim saflaştırma basamağındaki yardımlarından dolayı Dr. Duygu ÖZEL
DEMİRALP’e;
Tez çalışmamın mikroorganizma izolasyonu kısmında bana yardımcı olan Araş. Gör.
Sevgi ERTUĞRUL ve Araş. Gör. Nur KOÇBERBER KILIÇ’a; mikroorganizmanın tür
tayini ile ilgili kısmındaki yardımlarından dolayı Gamze ÖZSÖZ’e; zamanımın büyük
bir kısmını geçirdiğim Reaksiyon Mühendisliği Laboratuarındaki çalışma arkadaşlarım
Başak MARUL, Araş. Gör. Ayşe Ezgi ÜNLÜ BÜYÜKTOPÇU ve Banu ERDEM’e;
Maddi ve manevi destekleri ile yanımda olan, üzüntülerimi, sevinçlerimi paylaştığım,
çalışmalarım süresince birçok fedakarlıklar göstererek beni destekleyen, her şeyimi
borçlu olduğum annem Canan ŞENGEL ve babam Mustafa ŞENGEL’e; beni anlayan,
dinleyen ve hep destek olan Funda OĞUZKAYA ve Remzi KAYA’ya
çok teşekkür ederim.
Bu tez çalışmasını maddi olarak destekleyen Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji
Enstitüsü’ne (Proje No: 2005-189) ve Bilimsel Araştırma projelerine (Proje No:
20070745004HPD) teşekkür ederim.
Banu Şükran ŞENGEL
Ankara, Temmuz 2007
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET…………………………………………………………………………………….i
ABSTRACT…………………………………………………………………………….ii
TEŞEKKÜR……………………………………………………………………………iii
SİMGELER DİZİNİ………………………………………………………………….vii
ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………………ix
ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………………………….xv
1. GİRİŞ………………………………………………..………………………………..1
2. KAYNAK ÖZETLERİ……………………………………………………………...3
2.1 Enzimler ve Kullanım Alanları…………………………………………………....3
2.2 Enzimlerin Deterjan Formülasyonlarındaki
Yeri ve Deterjanlarda Kullanımının Önemi……………………………………..4
2.3 Enzim Esaslı Deterjanlardaki Gelişme…………………………………………..4
2.4 Enzimlerin Deterjanlarda Bulunuş Şekilleri ve
Formülasyona Katılacak Enzimin Hazırlanması……………………………….10
2.5 İdeal Deterjan Enzimlerinin Özellikleri…………………………………………14
2.6 Deterjan Enzimleri………………………………………………………………..14
2.6.1 Proteazlar……………………………………………………………………..…15
2.6.2 Selülazlar……………………………………………………………………...…15
2.6.3 Amilazlar………………………………………………………………………...15
2.6.4 Lipazlar……………………………...…………………………………………...16
2.6.4.1 Lipaz kaynakları……………………………………………………………....20
2.6.4.2 Lipaz üretiminde önemli parametreler……………………………………...21
2.6.4.2.1 Karbon ve azot kaynakları etkisi…………………………………………..22
2.6.4.2.2 pH etkisi…………………………………………………………………...…25
2.6.4.2.3 Sıcaklık etkisi……….……………………………………………………….25
2.6.4.2.4 Metal iyonları etkisi………………………………………………………....25
2.6.4.2.5 Oksijen aktarımı etkisi……………………………………………………...26
2.6.4.3 Lipazların kullanım alanları………………………………………………...26
2.6.4.4 Lipazların deterjan enzimi olarak kullanımı ve üretimi…………………..27
2.6.4.5 Lipazın saflaştırılması………………………………………………………..31
2.6.4.5.1 Saflaştırmanın önemi……………………………………………………….31
v
2.6.4.5.2 Protein saflaştırma yöntemleri……………………………………………..31
2.6.4.5.2.1 Çöktürme…………………………………………………………………..31
2.6.4.5.2.2 Diyaliz ve ultrafiltrasyon………………………………………………….32
2.6.4.5.2.3 Kromatografik yöntemler………………………………………………...33
2.7 Debaryomyces hansenii Mayasından Lipaz üretimi…………………………….35
3. MATERYAL ve YÖNTEM ……………………………………………………….38
3.1 Materyal…………………………………………………………………………..38
3.2 Yöntem………………………………………………………………………….....38
3.2.1 Mikroorganizma izolasyonu…………………………………………………....38
3.2.2 Mikroorganizma tür tayini…….………………………………….....................39
3.2.2.1 Mikroorganizmanın morfolojik tanımlaması………………………….........39
3.2.2.2 Mikroorganizmanın genetik tanımlaması…………………………………...40
3.2.3 Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamlarının hazırlanışı…………………...44
3.2.3.1 Agar ortamı…………………………………………………………………....44
3.2.3.2 Ön çoğalma ortamı…………………………………………………………....44
3.2.3.3 Lipaz üretim ortamı…………………………………………………........…..45
3.2.4 Hücre parçalama…………………………………………………………..........45
3.2.5 Lipaz saflaştırması…………………………………………………….........….46
3.2.6 TCA çöktürmesi………………………………………………………...............47
3.2.7 SDS-PAGE yöntemi……………………………………………………….........47
3.3 Analizler…………………………………………………………………...............50
3.3.1 Spektrofotometrik yöntemle lipaz aktivitesi………………………….......…..50
3.3.2 Titrimetrik yöntemle lipaz aktivitesi……………………………………..........51
3.3.3 Proteaz aktivitesi…………………………………………………………..........51
3.3.4 Hücre derişimi………………………………………………………….......…...52
3.3.5 Protein derişimi……………….……………………………………...................52
3.3.6 Bitkisel yağ analizleri...………………………………………………................53
3.4 Verilerin Değerlendirilmesi………………………………………………............53
3.4.1 Spesifik aktivite…………………………………………………………............53
3.4.2 Mikroorganizmanın özgül çoğalma hızları……………………………...........54
4. BULGULAR……………………………………………………………..…............55
4.1 Mikroorganizma İzolasyon ve Tanımlama………………………………...........55
vi
4.2 Lipaz Üretiminde Önemli Parametreler…………………………………...........56
4.2.1 Karbon kaynaklarının etkisi……………………………………………...........56
4.2.1.1 Bitkisel yağların etkisi…………………………………………………...........57
4.2.1.2 Yağ asidi esterlerinin etkisi…………………..………………………............72
4.2.1.3 Yağ asitlerinin etkisi………………………………………….……….............79
4.2.1.4 Gliserolün etkisi………………………………………………….……............87
4.2.1.5 Glukozun etkisi…………………………………………………. ……............89
4.2.1.6 Peyniraltı suyu etkisi……………………………………………….…............90
4.2.1.7 Triton X-100 etkisi…………………………………………………….............92
4.2.2 Azot kaynaklarının etkisi…………….…………………………………............95
4.2.3 pH etkisi……………………………………………………………….…..........103
4.2.4 Sıcaklık etkisi……………………………………………………………..........108
4.2.5 Metal iyonları etkisi………………………………………………….…...........113
4.3 En iyi koşullarda lipaz üretimi………………………………………….............119
4.4 Lipazın Üretim Ortamından Ayrılması ve Kısmi Saflaştırılması…….............122
4.5 Kısmi Saflaştırılmış Lipazın Deterjan Katkı Maddeleri ile
Kullanım Potansiyeli……………………………………………………...........126
5. TARTIŞMA ve SONUÇ…………………………………………………..............127
KAYNAKLAR……………………………………………………………….............137
EKLER……………………………………………………………………….............141
EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler………...........142
EK 2 Polimeraz Zincir Reaksyonunun Bileşenleri ………………………..............145
EK 3 Spektrofotometrik Aktivite Örnek Hesabı…………………………..............146
EK 4 Titrimetrik Aktivite Örnek Hesabı……………………………………..........148
EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği………………………………………….............149
EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı……………………………………..............150
EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği………………………………….................151
EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği………………………………….............152
EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi……………………………….............153
EK 10 5.8S ve 26S rRNA Analizi…………………………………………...............154
EK 11 BLAST Sonuçları.............................................................................................157
ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………………….............158
vii
SİMGELER DİZİNİ
A Absorbans
APS Amonyum Persülfat
b Işının çözelti içinde aldığı yol (cm)
BLAST Basic Local Alignment and Search Tool
BSA Bovine Serum Albumin
C Çözelti derişimi (mg/ml)
CAL Candida antarctica lipazı
CM Karboksi Metil
Cx Hücre derişimi (mg hücre/ml)
Cxo t=0. saatteki hücre derişimi (mg hücre/ml)
DEAE Di Etil Amino Etil
dNTP Deoksiribonükleozid trifosfatlar
EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit
IDR Image Development Reagent
N Karıştırma hızı (rpm)
SDS Sodyum Dodesil Sülfat
SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat -Poliakrilamid Jel Elektroforez
PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
pI İzoelektrik nokta
PL Fosfo Lipaz
pNF p-nitrofenol
PNFP p-nitrofenil palmitat
RDR Reduction Moderator Solution
rRNA Ribozomal RNA
rx Hücre çoğalma hızı (mg hücre/ml.st-1)
viii
SCS Silver Complex Solution
SDS Sodyum Dodesil Sülfat
SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel
Elektroforez
T Sıcaklık (oC)
TAED Tetra Asetil Etilen Diamin
TBA Tribütirin Agar
TCA Trikloroasetik asit
TEMED Tetra Etil Metilen Diamin
Tm Bağlanma – annealing sıcaklığı (oC)
U Ünite (µmol/dk)
U/mg Spesifik aktivite
U/mg hücre Hücre miktarı başına aktivite
UV Ultraviyole
V Hacim (ml)
ε Molar absorptivite katsayısı (L/mol.cm)
λ Dalga boyu (nm)
µ Özgül çoğalma hızı (st-1)
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Lipazların kristal yapısı…………………………………………………...…20
Şekil 3.1 SDS-PAGE aparatlarının şematik olarak gösterimi…………………….…...50
Şekil 4.1 Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü…………………..55
Şekil 4.2 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi……………………………………………………………….…59
Şekil 4.3 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..59
Şekil 4.4 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye
(U/mg) etkisi………………………………………………………………....60
Şekil 4.5 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..60
Şekil 4.6 Soya yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi…………………………………………………………………..62
Şekil 4.7 Soya yağının farklı derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..62
Şekil 4.8 Soya yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye
(U/mg) etkisi…………………………………………………………………63
Şekil 4.9 Soya yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………..63
Şekil 4.10 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi………………………………………………….......................65
Şekil 4.11 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi……………………………………………………….............65
Şekil 4.12 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye
(U/mg) etkisi……………………………………………………………...…66
Şekil 4.13 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi……………………………………………………….............66
Şekil 4.14 Mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi……………………………………………………………...…68
x
Şekil 4.15 Mısır yağının farklı derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi ……………………………………………….......................68
Şekil 4.16 Mısır yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye
(U/mg) etkisi…………………………………………………......................69
Şekil 4.17 Mısır yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi……………………………………………….……………...69
Şekil 4.18 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler
(U/ml)……………………………………………………….……………...70
Şekil 4.19 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek spesifik aktiviteler
(U/ml)………………………………………………………………………71
Şekil 4.20 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi……………………………………………………...................73
Şekil 4.21 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi…………………………………………..…………………...74
Şekil 4.22 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz
aktivitesine (U/mg)etkisi………………………………………....................74
Şekil 4.23 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi…………………………………………………….................75
Şekil 4.24 Tristearinin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi………………………………………...…………………….…76
Şekil 4.25 Tristearinin farklı derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………76
Şekil 4.26 Tristearinin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi………………………………………………………………..77
Şekil 4.27 Tristearinin farklı derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………77
Şekil 4.28 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek lipolitik
aktiviteler (U/ml)………………………….………..……………………....78
xi
Şekil 4.29 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek spesifik
lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………………................79
Şekil 4.30 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi………………………………………….……………………...81
Şekil 4.31 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml)etkisi………………………………………...…………..................82
Şekil 4.32 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi………………………………………………………………..82
Şekil 4.33 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………83
Şekil 4.34 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin lipaz
aktivitesine (U/ml) etkisi…………………………….……………………..84
Şekil 4.35 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin protein
derişimine (mg/ml) etkisi……………………………………….…………84
Şekil 4.36 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin spesifik
lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi……………………..……………...............85
Şekil 4.37 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin hücre
derişimine (mg/ml) etkisi………………………….……………………….85
Şekil 4.38 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
yağ asitleri ile elde edilen en yüksek lipolitik
aktiviteler (U/ml)…………………………………..……………………….86
Şekil 4.39 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
yağ asitleri ile elde edilen en yüksek spesifik
lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………………………....87
Şekil 4.40 %1 Gliserol içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein
derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi……..........................................................................................88
Şekil 4.41 %1 Gliserol içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi………………89
Şekil 4.42 Glukozun farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml)
etkisi…………………………………………………..…………………….90
xii
Şekil 4.43 Glukozun farklı derişimlerinin deney sonunda (87. saat)
hücre derişimine etkisi……………………………………………………...90
Şekil 4.44 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın lipaz aktivitesi(U/ml),
protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi………………………………………………………………...91
Şekil 4.45 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın hücre derişimine
(mg/ml) etkisi………………………………………………………………92
Şekil 4.46 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100
içeren ortamların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi…………………………93
Şekil 4.47 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100
içeren ortamların protein derişimine (mg/ml) etkisi………………………..94
Şekil 4.48 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100
içeren ortamların spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi…………………94
Şekil 4.49 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100
içeren ortamların hücre derişimine (mg/ml) etkisi………………………...95
Şekil 4.50 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının lipolitik
aktiviteye (U/ml) etkisi……………………………………………………..97
Şekil 4.51 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının protein
derişimine (mg/ml) etkisi……………………………..…………………….98
Şekil 4.52 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının spesifik lipaz
aktivitesine (U/mg) etkisi……………………………..……………………99
Şekil 4.53 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının hücre derişimine
(mg/ml) etkisi…………………………………………..………………….100
Şekil 4.54 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen
en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml)……………………………………..101
Şekil 4.55 Farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek
spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)………………………...……………….102
Şekil 4.56 Farklı ortam pH’larının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi………………...105
Şekil 4.57 Farklı ortam pH’larının protein derişimine (mg/ml) etkisi……………….105
Şekil 4.58 Farklı ortam pH’larının spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi………………………………………………..…….............106
xiii
Şekil 4.59 Farklı ortam pH’larının hücre derişimine (mg/ml) etkisi…………...........106
Şekil 4.60 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek lipolitik
aktiviteler (U/ml)……………………………………………..…………..107
Şekil 4.61 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek spesifik
lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………………………..108
Şekil 4.62 Farklı sıcaklıkların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi………………….......110
Şekil 4.63 Farklı sıcaklıkların protein derişimine (mg/ml) etkisi…………………….110
Şekil 4.64 Farklı sıcaklıkların spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi……………………………………………………….............111
Şekil 4.65 Farklı sıcaklıkların hücre derişimine (mg/ml) etkisi……………...............111
Şekil 4.66 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek
lipolitik aktiviteler (U/ml)…………………………………………...……112
Şekil 4.67 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek
spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)…………………………………….........113
Şekil 4.68 Farklı metal tuzlarının 1 mM’lık derişimlerini içeren
ortamların 48. saatteki lipaz aktiviteleri (U/ml)………..………………....115
Şekil 4.69 Farklı metal tuzlarının 1 mM’lık derişimlerini içeren
ortamların 48. saatteki hücre derişimleri (mg/ml)…………..….……….....115
Şekil 4.70 KCl’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye
(U/ml) etkisi…………………………………………………………….…..117
Şekil 4.71 KCl’nin farklı derişimlerinin protein derişimine
(mg/ml) etkisi……………………………………………………………...117
Şekil 4.72 KCl’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye
(U/mg) etkisi……………………………………………………………….118
Şekil 4.73 KCl’nin farklı derişimlerinin hücre derişimine
(mg/ml) etkisi……………………………………………………………...118
Şekil 4.74 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı titrimetrik lipaz
aktiviteleri (U/mg)………………………………………………………....120
Şekil 4.75 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı spektrofotometrik
lipaz aktiviteleri (U/mg hücre)…………………………………..………...121
Şekil 4.76 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı proteaz
aktiviteleri (U/mg hücre)………………………………………..................121
xiv
Şekil 4.77 En iyi koşullarda hücre dışı protein ve hücre
derişimleri (mg/ml)……………………………………………………….122
Şekil 4.78 Anyon değişim kromatografisi sonucunda elde edilen
kromatogram…………………………………………………………..….124
Şekil 4.79 SDS-PAGE analizi sonuçları……………………………………………..125
xv
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler………………………………………..3
Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda
kullanılan ticari enzimler…………………………………………...............7
Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi………………………………………….10
Çizelge 2.4 Bazı mikrobiyal lipazların özellikleri………………………………….......21
Çizelge 2.5 Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamaları………………………...…27
Çizelge 2.6 Ticari deterjan lipazları……………………………………………………29
Çizelge 4.1 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
bitkisel yağları içeren ortamlarda hesaplanan özgül
çoğalma hızları …………………………………………………………...71
Çizelge 4.2 Kullanılan yağ asidi esterleri ve basit formülleri………………………....72
Çizelge 4.3 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
yağ asidi esterlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma
hızları………………………….………………………………………….79
Çizelge 4.4 Kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları
ve molekül formülleri…………………………………………….............80
Çizelge 4.5 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki
yağ asitlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma
hızları…………………………………………………………………….87
Çizelge 4.6 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarını
içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları…………………...103
Çizelge 4.7 Farklı ortam pH’larında hesaplanan özgül
çoğalma hızları……………………………………………………….…108
Çizelge 4.8 Farklı ortam sıcaklıklarında hesaplanan özgül
çoğalma hızları……………………………………………………….…113
Çizelge 4.9 KCl’nin farklı derişimleri için hesaplanan özgül
çoğalma hızları………………………………………………………….119
Çizelge 4.10 Lipaz enzimi saflaştırma basamakları………………………….............123
Çizelge 4.11 Saflaştırılmış lipaz enzimi aktivitesine deterjan katkıları
etkisi……………………………………………………………………126
38
1. GİRİŞ Enzimler reaksiyonların ılımlı koşullar altında gerçekleşmesini sağlayan yüksek
katalitik etkinliğe sahip biyokatalizörlerdir. Bu özellikleri ile günümüzde gıda,
kozmetik, farmasötik, tekstil, deri, kağıt ve deterjan gibi çok çeşitli endüstrilerde
kullanım alanı bulmaktadırlar. Enzimlerin en önemli uygulama alanlarından biri
deterjan endüstrisidir.
Deterjanlara, temizleme etkilerini artırabilmek amacıyla katkı maddeleri konulur.
Bunlar yüzey aktif maddeler, temizleme gücünü arttırıcı maddeler, yapıcı maddeler
(alkaliler, kompleks yapıcılar, iyon değiştiriciler), köpük düzenleyiciler, enzimler,
ağartıcılar, korozyon önleyiciler, parfüm, antiseptik maddeler, antidepozitörler ve
aşınma önleyicilerdir. Deterjan katkı maddeleri içinde önemli bir yeri olan enzimler,
deterjan formülasyonuna lekelerin çıkarılmasını kolaylaştırmak amacıyla katılırlar.
Deterjan enzimleri, başlıca proteinlere etki eden proteazlar, nişastalara etki eden
amilazlar ve yağlara etki eden lipazlardır.
Deterjanlarda kullanılan enzimler, yüksek pH ve sıcaklıkta kararlı olmalı, oksidasyona,
şelatlama ajanlarına dayanıklı olmalı, düşük derişimlerde aktif olmalı ve geniş substrat
spesifikliğine sahip olmalıdır. Deterjan formüllerinde ilk olarak kullanılan enzim 1913
yılında bir proteaz olan tripsin, sonra sırasıyla amilaz, selülaz ve lipaz olmuştur.
Enzimler etkilerini kısa sürede gösteremezler ve genellikle 50oC’ın altında aktiftirler;
daha yüksek sıcaklıklarda ise bozunabilirler. Enzimlerin, özellikle yıkama prosesinin
esas yıkamaya geçmeden önce ön hazırlık olarak soğuk suyla ıslatma içerdiği
durumlarda kullanımları daha uygundur. Yıkama koşullarının ılımlı hale getirilmesi -
çevre kirliliği etkileri düşünülerek fosfat içermeyen deterjanların kullanımı ve enerji
kullanımının azaltılması- ile düşük yıkama sıcaklıklarında çalışılması enzimlerin
deterjan formülasyonlarındaki önemini artırmaktadır.
Günümüzde Japonya, Amerika ve Avrupa ülkelerinin çoğu, deterjanlarda enzim
kullanmaktadır. Japonya’daki tüm deterjan markaları enzim içermektedir. Avrupa’da
39
çok uzun zamandan beri kaliteli deterjanların vazgeçilmez unsuru olan enzimler,
Türkiye’de 1982 yılından itibaren kullanılmaya başlanmıştır. Deterjan enzimlerinin
üretimi ve özelliklerinin geliştirilmesi, bugün pek çok bilim insanının üzerinde çalıştığı
bir konudur.
Deterjanlarda kullanılan hidrolitik enzimler içerisinde önemli bir yere sahip olan
lipazlar, proteaz içeren deterjanların yıkama kapasitesini artırır; trigliseritleri yağ asidi
ve gliserole hidrolizleme özellikleri ile yağlı yiyecek lekelerinin ve kumaşlardaki
sebumun çıkarılmasını sağlarlar. Lipazlar bitki ve hayvan dokularından ekstraksiyonla
veya mikroorganizmalardan fermantasyon yoluyla üretilirler. Ticari lipazlar genelde
mikrobiyal kaynaklıdır. Lipaz üreten mikroorganizmalar bakteriler, fungi ve
mayalardır. Mikrobiyal lipazlar çoğunlukla sıvı ortamda üretilir. Lipaz üretiminde
karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimi, üretim pH’ı, sıcaklık, metal iyonları ve
çözünmüş oksijen derişimi etkilidir.
Tez projesi kapsamında, süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen ve
genetik tanımlama ile türünün Debaryomyces hansenii olduğu belirlenen mayadan,
deterjanlarda kullanımını araştırmak üzere aktif ve kararlı lipaz üretimi için karbon ve
azot kaynakları, metal iyonları, sıcaklık, pH gibi uygun üretim koşullarının belirlenmesi
amaçlanmıştır. Mikroorganizmadan üretilen lipaz kısmen saflaştırılarak, bazı deterjan
katkı maddelerinin varlığında aktivitesi incelenmiş ve enzimin deterjanlarda kullanıma
uygunluğu araştırılmıştır. Çalışma, lipaz üretimi için atıktan izole edilmiş bir
mikroorganizmanın kullanılması, türü sekans analizlerini kapsayan genetik bir çalışma
sonucu Debaryomyces hansenii olarak belirlenmiş mayadan lipaz üretim koşullarının
optimizasyonu ile ilgili literatürde bir çalışmanın olmaması, üretilen lipazın dünya
pazarında önemli yeri olan deterjan sektöründe kullanım potansiyelinin olması
nedeniyle önem kazanmaktadır.
40
2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Enzimler ve Kullanım Alanları Enzimler canlı sistemlerde gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonlarda yer alarak
reaksiyonun daha ılımlı şartlar altında gerçekleşmesini sağlayan ve biyokatalizör olarak
bilinen, protein yapılı moleküllerdir. Günümüzde enzimler; gıda, tekstil, farmasötik,
deterjan, kağıt ve deri endüstrisi, kozmetik, parfümeri, biyosensör üretimi gibi çok
çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Enzimlerin katalitik potansiyeli anlaşıldıktan sonra,
bu çok faydalı maddelerden endüstride geniş ölçüde yararlanılmaya başlanmıştır. Bugün
çok sayıda enzim bilinmesine rağmen, büyük miktarlarda üretimi yapılan ve endüstriyel
amaçla kullanılan enzim sayısı azdır. Endüstride kullanılan bazı enzim grupları ve
uygulama alanları Çizelge 2.1’de verilmektedir.
Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler (Telefoncu 1997)
Uygulama Alanı Enzim
Yağların parçalanması ve interesterifikasyon Lipazlar
Peynir üretimi Rennin, pepsin
Sindirime yardımcı Çeşitli proteazlar
Etin gevrekleştirilmesi Papain
Dericilik Çeşitli proteazlar
Nişasta hidrolizi Amilaz (α ve β), pullulanaz
Sakkoroz inversiyonu Invertaz
Meyve suyu, sirke ve şarap berraklaştırma Pektinazlar
Lezzet kontrolü (tat verici) Nükleazlar
Besin maddesinden istenmeyen ve toksik bileşiklerin
uzaklaştırılması
Hidrolitik enzimler
Oksidasyonun önlenmesi ve besin maddelerinde renk kontrolü Oksidazlar
Amino asit üretimi Pronaz, amino peptidaz
Peynir atık suyu ve sütteki laktozun hidrolizi Laktaz (β-galaktosidaz)
Selüloz hidrolizi Selülaz
Dekstroz üretimi Amiloglikosidaz
Penisilin üretimi Penisilin amidaz
41
Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler (devam)
Organik sentezler Değişik enzimler
Sterilizasyon ve soğuk pastörizasyon Katalaz
Glukozun fruktoza dönüştürülmesi Glukoz izomeraz
2.2 Enzimlerin Deterjan Formülasyonlarındaki Yeri ve Deterjanlarda
Kullanımının Önemi
Deterjanlarda genel olarak yüzey aktif maddeler, yapıcı maddeler, köpük düzenleyiciler,
asıltı yapıcı ve yeniden çökmeyi önleyici maddeler (antidepozitörler), enzimler,
korozyon önleyiciler, ağartıcılar, yumuşatıcılar, parfüm ve antiseptik maddeler bulunur.
Enzimler lekeleri çıkarmak için ihtiyaç duyulan üstün bir temizleme performansı
göstermeleri nedeniyle deterjanlarda kullanılmaya başlanmıştır. Her bir enzim, belirli
tipte bir lekeyi çıkarma yeteneğine sahiptir. Enzimler tekrarlanan yıkamalara olan
ihtiyacı, daha ilk yıkamada zorlu kirlerin büyük çoğunluğunu çıkararak önleyebilirler.
Enzimler yıkama sıcaklığını düşürerek tüketicilerin enerji masrafını azaltırlar. Enzimler
çevre dostudur. Sentetik deterjanlar yavaş bir şekilde biyobozunmaya uğrayarak ciddi
ekolojik problemlere neden olmakla birlikte enzim kullanımıyla bu problemlerin
üstesinden gelinebilmektedir. Ayrıca toksisitelerinin az oluşu ve korozif olmamaları
enzimlerin deterjanlarda kullanımını özendirici diğer üstün özellikleridir.
2.3 Enzim Esaslı Deterjanlardaki Gelişme
Enzimler deterjan katkısı olarak ilk kez 1913 yılında Alman kimyacı Otto Rohm
tarafından kullanılmıştır. Rohm, pankreatik enzimlerin (tripsin, kimotripsin gibi
proteazlar) çamaşır temizlemede yıkama yardımcıları olarak kullanılabileceğini
gösterdikten sonra Rohm patentli ürün ‘Burnes’ adı altında ön yıkama deterjanı olarak
piyasaya sunulmuştur. Ürün, esas olarak sodyum karbonat ve hayvanların pankreatik
bezlerinden elde edilmiş az miktarda pankreatin içermektedir. Enzimin proteolitik
42
aktivitesi günümüz deterjanlarından oldukça düşüktür. Bu ürün yaklaşık 50 yıl Avrupa
marketlerinde satılmıştır (Starace 1983, Telefoncu 1997, Kumar et al. 1998).
İkinci Dünya Savaşında, yağ ve sabuna olan ihtiyaç sonucunda enzimatik yıkama
ajanları önem kazanmıştır. 1940’larda İsviçre’de enzimlerin sabun tüketimini
azaltabileceğine dair raporlar yayınlanmıştır. 1940’ların sonuna yaklaşılırken, insülin
üretimi için pankreatik bezlere olan talep tripsinin çamaşır yıkama ürünlerinde
kullanımını sınırlamıştır. Pankreatik enzimlerin çamaşır yıkama maddelerine karşı
nispeten daha az kararlılık göstermesi, bilim adamlarına bakteriyel fermantasyonla
üretilecek enzimin, pankreatik tripsine avantajlar sağlayabileceğini düşündürmüştür. Bu
şekilde bulunan nötral bakteriyel proteaz, tripsine göre büyük bir gelişme olmasına
rağmen enzim, hala pH 9-10 aralığında düşük bir kararlılık göstermekteydi (Starace
1983).
1959’da İsviçreli kimyacı Dr. Jaag, Bio 40 olarak adlandırılan tripsin yerine bakteriyal
bir proteaz içeren yeni bir ürün geliştirmiştir (http://www.mapsenzymes.com 2005).
1960’ların ortalarında, Bacillus licheniformis tarafından üretilen bir proteaz örneği,
alkali pH’larda (pH=8-10) kararlı ve aktif olup Novo Industry A/S tarafından ‘Alkalase’
ticari ismiyle piyasaya sunulmuştur (Kumar et al. 1998).
1970’lerde proteazların deterjanlarda kullanımında geçici bir duraklama olmuştur;
çünkü bazı üreticiler ve kullanıcılarda alerjik reaksiyonlar gözlenmiştir. Bu problem, toz
oluşumunu önleyen, enzimi saklarken diğer deterjan bileşenlerinin olumsuz etkilerinden
koruyan tozsuz granüllerin geliştirilmesiyle çözülmüştür (Kumar et al. 1998).
1985’te Novo, Humicola isolens’ten elde edilmiş, kiri ortadan kaldırmak, pamuklu
tekstilleri yumuşatmak ve eski renklerine kavuşturmak için üretilmiş olan, deterjan
sanayinde bir devrim yaratan selülaz deterjan enzimini, ‘Cellulase’ı sunmuştur (Kumar
et al. 1998).
43
Son yirmi yılda, rekombinant DNA teknolojilerinin başka bir ifade ile genetik ve
protein mühendisliğinin uygulamaları ile enzimolojideki yeni gelişmeler,
biyomühendislik ürünü enzimlerin çağını başlatmıştır. Novo 1988’de deterjan lipazını
ilk biyomühendislik ürünü olarak ‘Lipolase’ adıyla sunmuştur (Kumar et al. 1998).
Novo enzimin, 60oC’a kadar olan sıcaklıklarda ve pH 7-11’de kararlı olduğunu
bildirmiştir. Lipolase, aktivitesini, fosfat ve surfaktan gibi diğer deterjan bileşenlerine
karşı koruyabiliyor ve proteinleri parçalayan proteaz enzimiyle birlikte
kullanılabiliyordu (Gillis 1988).
1989’da yine rekombinant DNA teknolojisine dayanılarak başka enzimler de pazara
sunulmuştur (Kumar et al. 1998):
Savinase-Novo Nordisk, Denmark
Maxacal-Gist-brocades, Delft
Subtilisin Novo-Genencor International of California
Daha sonra enzim deterjanı imalatçıları, daha iyi yıkama performansı ve perboratlar gibi
oksidatif ağartma ajanlarına karşı daha kararlı yeni jenerasyon enzimler keşfetmiştir
(Kumar et al. 1998):
Maxapem- Solvey Enzymes, Germany
Durazym- Novo Nordisk, Denmark
Çizelge 2.2’de deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan
enzimlere örnekler verilmiştir.
44
Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan ticari enzimler (Kumar et al. 1998) Ticari İsim Mikroorganizma Optimum Optimum İmalatçı Firma pH sıcaklık (oC) Alkali proteazlar/Subtilisinler Alcalase Bacillus 8-9 60 Novo Nordisk licheniformis Bagsvaerd, Denmark Savinase Alcalophilic 9-11 55 Novo Nordisk, Denmark Bacillus sp. Esperase Alcalophilic 9-11 60 Novo Nordisk, Denmark Bacillus sp. Maxacal Alcalophilic 11 60 Gist-brocades, Delft Bacillus sp. The Netherlands Maxatase Alcalophilic 9.5-10 60 Gist-brocades Bacillus sp. The Netherlands Opticlean Alcalophilic 10-11 50-60 Solvey Enzymes Gmbh Bacillus sp. Hannover, Germany Optimase Alcalophilic 9-10 60-65 Solvey, Germany Bacillus sp. Protosol Alcalophilic 10 50 Advanced Biochemical Ltd Bacillus sp. Thanc, India Alcaline Alcalophilic 10-11 40-50 Wuxi Synder Bioproduct Ltd protese ‘Wuxi’ Bacillus sp. Chine Proleather Alcalophilic 10 50 Amano Pharmaceuticals Ltd Bacillus sp. Nagoya, Japan Protease P Aspergillus sp. 8 40 Amano, Japan Durazym Protein engineered 10-10.5 50 Novo Nordisk, Denmark variant of SavinaseTM
Maxapem Bleach-resistant, 11-12 60 Solvay, Germany protein engineered variant of alkalophilic Bacillus sp. Purafect Recombinant enzyme 10 40-65 Genencor International Inc. Donor- B. lentus Rochester, USA Expressed in Bacillus sp. Amilazlar BAN Bacillus 6-7 70 Novo Nordisk, Denmark amyloliquefaciens Termamyl Donor- Humicola sp. 7-8 70-75 Novo Nordisk, Denmark Expressed in Aspergillus sp.
45
Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan ticari enzimler (devam) Maxamyl Alkalophilic 6-8.5 100 Gist-brocades, Bacillus sp. The Netherlands Solvay Thermostable Bacillus 5-8 75-90 Solvay, Germany amylase licheniformis Lipazlar Lipolase Recombinant enzyme 10.5-11 40 Novo Nordisk, Denmark Donor- Humicola lanuginosa Expressed in Aspergillus oryzae Lumafast Recombinant enzyme 7.5-9 60 Genencor, USA Donor- Pseudomonas mendocina Expressed in Bacillus sp. Lipofast NA* 8.5 50 Advanced Biochemicals, India Cellulase Celluzyme Humicola insolens 6-7 50-55 Novo Nordisk, Denmark
*Mevcut değil Son zamanlarda Çizelge 2.2 ile verilen enzimlere yenileri katılmıştır. Örneğin
İsviçre’nin en iyi satan çamaşır deterjanı markası Total, beyaz çamaşırlar için bir selülaz
enzimi olan Endolase’ı içeren bir sıvı deterjan piyasaya sunmuştur. Deterjan proteaz
enzimi Savinase ve amilaz enzimi Termamyl’i de içermektedir. Renklilerde Carezyme
daha iyi sonuç vermektedir. Carezym giyeceklerde tüylenme sonucu oluşan
topaklaşmaları gidermede daha etkili bir enzimdir. Bunun sonucu olarak giysilerin
renklerine parlaklık verir. Endolase ise çok iyi bir antiredepozitördür
(http://www.novozymes.com, 2006).
1990-1995 arasında çok sayıda protein mühendisliği ürünü lipaz deterjan enzimi olarak
incelenmiştir. 1996’da Novo Nordisk’in Danimarka’daki pilot ölçekli fermantasyon
fabrikasında verimli bir türden elde edilen enzimler, tipik yıkama koşulları altında test
edilmiştir. Bu testler boyunca LipoPrime, proteaz ve ağartma ajanı varlığında, geniş bir
46
su sertliği aralığında kararlılık gösterebilmiştir. Enzim 10-50oC aralığında performans
göstererek maksimum aktivitesini 20-30oC’da göstermiştir. LipoPrime, Avrupa
şartlarına, Amerika ve Asya’ya oranla daha uygun bulunmuştur. Bunun, deterjan
formüllerine katılan surfaktan bileşimindeki farklılıktan olduğu düşünülmüştür.
Avrupa’daki deterjanlarda non-iyonik ve anyonik surfaktanların kullanılması,
LipoPrime’ın daha iyi bir yıkama performansı göstermesini sağlamıştır
(http://www.novozymes.com, 2006).
Novo Nordisk tarafından piyasaya sunulan başka bir deterjan lipazı Lipex’dir. Lipex de
LipoPrime gibi 20oC’a kadar düşük sıcaklıklarda iyi bir performans göstermektedir.
Sadece yüzeydeki yağ asitlerini değil, liflerin içine işlemiş yağ asitlerini de çıkarır.
Liflerin içinde tutulan yağlar, Lipex ile gliserin ve yağ asitlerine parçalanır ve surfaktan
sistemiyle uzaklaştırılır (http://www.novozymes.com, 2006).
Yine Novo Nordisk’in insanlara tanıştırdığı proteaz Kannase, 10-20oC gibi çok düşük
sıcaklıklarda bile yüksek bir etki gösterebilmektedir. Bu, çamaşırların soğuk suyla
yıkandığı Japonya, diğer Asya ülkeleri, Avustralya, Afrika ve Latin Amerika için
oldukça önem taşır. Karşılaştırma amacıyla, Avrupa’da suyun yıkama makinelerinde
ısıtıldığını ve en iyi yıkama sıcaklığının 40oC olduğunu belirtmek gerekir. Şimdiye
kadar proteazlar, sıcak sularda kullanıma en uygun enzim olmasına rağmen düşük
sıcaklıklarda da kullanılabilmekteydi. Savinase’ın Japonya gibi çamaşır yıkamada
soğuk su kullanan ülkelerde geniş bir kullanım alanı bulmasının nedeni de budur.
Bununla birlikte Kannase 15oC’ta gerçekleştirilen yıkama testlerinde Savinase’dan daha
iyi bir temizleme performansı göstermiş olup düşük sıcaklık yıkamaları için daha
uygundur (http://www.novozymes.com, 2006).
Polarzyme, Novo Nordisk’in sunduğu başka bir düşük sıcaklık enzimidir. Daha az
kimyasal kullanımıyla güçlü bir temizlik sağladığı için, çevre kirliliğini önlemek
açısından düşünüldüğünde oldukça faydalı bir enzimdir. Günlük deterjanla temas göz
önünde tutulursa, daha az tehlikelidir. Ayrıca enzim, narin kumaşları korur
(http://www.novozymes.com, 2006).
47
Stainzyme, bulaşık ve çamaşır deterjanlarında kullanılan ve en çok nişasta bazlı lekeleri
çıkaran bir deterjan enzimidir. Çamaşırlarda beyazlığı artırır, renkleri korur. 40-55oC
arasında en iyi performansını gösterir. Hem tablet halinde, hem de sıvı deterjanlarda
kullanılır. Ayrıca enzim, bulaşık deterjanlarında yaşanan büyük problemlerden biri olan,
cam yüzeyinde zamanla biriken nişastanın yarattığı matlığın giderilmesinde diğer
amilazlardan daha çok umut vaat etmektedir (http://www.novozymes.com, 2006).
2.4 Enzimlerin Deterjanlarda Bulunuş Şekilleri ve Formülasyona Katılacak
Enzimin Hazırlanması
Enzimler deterjanlarda önceleri toz halinde kullanılıyorken granülasyon tekniklerinin
ilerlemesi ile enzimler vakslı maddelerle kapsüllenerek kullanılmaya başlanmıştır.
Enzimler için sıvı formülasyonlar da mevcuttur (Kumar et al. 1998). Toz deterjan ve
tabletlerde enzimler granüllere bağlanmış halde kullanılmaktadır. Enzim, koruyucu
madde olarak NaCl gibi inorganik bir tuz ve şeker içeren bir karışımla birleştirilir ve
karboksimetil selüloz veya benzeri bir kolloidin fiberleri ile sağlamlaştırılır. Oluşan bu
iç, parafin yağı veya polietilen glikol ile hidrofilik bağ yapıcılardan oluştuğu için yıkama
esnasında dağılan, inert vakslı materyalle kaplanır (Chaplin and Bucke 1990). Enzim
içeren partiküllerin boyutu segregasyonu (ayrılma) önlemek için iyi ayarlanmalıdır.
Granüller genellikle 0.5 mm boyutundadır. Partiküller kolayca çözünebilmelidir.
Günümüzde vaks kaplı enzim deterjan granülleri diğer deterjan granüllerinden renkli
oluşlarıyla ayrılır. Renkli granüller deterjanlarda ekstradan eklenen aktif bir bileşenin
varlığını sembolize eder ve deterjan imalatçıları tarafından ‘işaret granülleri’ olarak
isimlendirilir (Telefoncu 1997). Çizelge 2.3’te toz ve sıvı deterjanların bileşimi
verilmektedir.
Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi (Telefoncu 1997)
Bileşen Toz (% ) Sıvı (%)
Anyonik sürfaktanlar 2-10 8-10
Noniyonik sürfaktanlar 0.5-6 18-20
48
Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi (devam)
Sabun 2-5 7-12
Sekuestranlar 30-50
Etilendiamin 1
tetraasetikasit
Ağartıcı + Aktivatör 20-30
Trietonolamin 7-13
Etanol 4-6
Propilenglikol 4-6
Enzimler 0.5 1
Parfüm 0.2 0.4
Optik beyazlatıcılar 0.4-0.8 0.2
Sodyum Sülfat %100’e tamamlanır
Su %100’e tamamlanır
Enzimler deterjan formüllerine çok az miktarda katılır. Çok düşük kullanım derişimi,
biyokatalizör oldukları gerçeğine dayanır. Temizleme prosesi boyunca enzimin kendisi
tükenmez ve tek bir enzim çok sayıda reaksiyonu başlatabilir (Kumar et al. 1998).
Sıvı deterjanlarda en büyük problem otoparçalanmadır (otoproteoliziz). Alkali pH ve
iyonik bileşiklerin varlığı proteazların otoparçalanmasına neden olur. Serbest su
derişiminin azaltılması ve enzimi tersinir olarak inhibe eden ve kararlı hale getiren borat
veya fenil boronik asit türevlerinin kullanımıyla bu problemin üstesinden gelinmeye
çalışılmaktadır (Maurer 2004). Son zamanlardaki enzim uygulamaları, enzimatik sıvı
deterjanların performansını artırmayı amaç edinmiştir (Mitidieri et al. 2006).
Toz halindeki enzimlerin otoliziz ve nem varlığında, deterjan bileşenlerinin zararlı
etkilerine bağlı olarak kararlılıklarının azalması problemi, granülasyon tekniklerinin
gelişmesiyle enzimin inert, suda çözünen vakslı maddelerle kaplanması sonucu
azalmıştır (Kumar et al. 1998).
49
Enzim esaslı otomatik bulaşık yıkama deterjanlarına, sitrat ve diğer poliakrilat yapıcılar
eklenmektedir. Bunun haricinde perboratlar ve perkarbonatlar da kullanılır. Bu peroksi
ağartıcı oluşturan sistemler, enzimler için çok zararlı değildir ve tetraasetiletilendiamin
(TAED) gibi aktivatörlerin de eklenmesiyle, düşük sıcaklıklarda kabul edilebilir bir
ağartma faaliyetini mümkün kılarlar (Kumar et al. 1998).
Tabletlerin preslenmesinde ağartma bileşenleri ile olan yoğun temastan dolayı
enzimlerin depolama kararlılığının yüksek olması gerekir (Maurer 2004). Depolama
kararlılığı, enzim üreticilerinin başlıca endişesidir. Saklama esnasında enzim, proteolitik
ve otolitik parçalanmaya uğrayabilir. Enzim aktivitesi, sert operasyon koşullarına ani
maruz kalma sonucunda hızla düşebileceği gibi, fabrikada, taşıma esnasında; örneğin
müşterilere gemi ile nakilde, müşteri hizmetlerinde, örneğin depolamada da aktivite
kaybıyla karşılaşılabilir. Enzimin inaktivasyon hızı, büyük ölçüde, sıcaklığa, pH ve
yüzey aktif ajanlara, bağlayıcılar ve ağartma ajanları gibi deterjan bileşenlerine bağlıdır.
Bunun haricinde, yüksek sıcaklık ve alkalilik, daha az kararlı enzim demektir (Kumar et
al. 1998).
Enzimin aktivite kaybı, temelde polipeptit zincirinin kısmen açılmasına bağlıdır.
İnaktivasyon ajanı, bunu, doğal konformasyonu muhafaza eden, kovalent olmayan
bağların zayıf dengesini bozarak gerçekleştirir. Enzimi kararlı kılmak için ideal
yaklaşım, inaktivasyon mekanizmasını belirlemek ve mekanizmanın gerçekleşmesini
önleyen bir prosedür tasarlamaktır (Kumar et al. 1998).
Enzimi denaturasyona karşı korumak için, Ca tuzları, Na format, borat, polihidrik
alkoller ve protein örnekleri gibi kararlaştırıcıların eklenmesi başarı sağlamıştır.
Saklama sırasında, son ticari ham örneğin kontaminasyonunu önlemek için, %18-20
derişimdeki NaCl eklenmesi iyi sonuç vermiştir. Bu prosesler, enzim aktivitesini korur
ve saklama kararlılığını iyileştirir. Saklamadaki uygun amaçlar için sıvı enzim örnekleri,
çoğunlukla liyofilizasyondan daha ucuz ve ılımlı vakum veya havada kurutma ile toz
haline getirilir (Kumar et al. 1998).
50
Deterjanlarda kullanılacak enzimler için, öncelikle uygun mikroorganizma kaynakları
seçilmelidir. Bunun için doğa, zengin bir kaynaktır. Toprak ve su örneklerinden izole
edilen mikroorganizmaların taranması ile en uygun deterjan enzimi kaynakları
belirlenir. Novozymes her hafta 1 milyondan fazla enzimin kapasitesini araştıracak bir
teknoloji platformu yaratmıştır. En çok umut veren kaynaklar daha detaylı bir analize
tabi tutulmaktadır. Belirli bir enzim tanımlandıktan sonra, klasik yöntemlerle ya da
protein mühendisliği ilkeleriyle enzim performansı artırılmaya çalışılır (Maurer 2004,
http://www.housekeepingchannel.com, 2005).
Endüstriyel ürünleri üretmek için fermantasyon, bir vialdeki kurutulmuş veya
dondurulmuş mikroorganizma ile başlar. Bu mikroorganizma, Bacillus gibi bir bakteri,
Aspergillus veya Trichoderma gibi bir fungus veya Saccharomyces cerevisiae gibi bir
maya türü olabilir. Bu mikroorganizmalar, büyük miktarlarda protein üretimi için
ihtiyaç duyulan temel mekanizmaya sahiptir ve patojenik değildir
(http://www.housekeepingchannel.com, 2005).
Enzim fermantasyonunu enzimi ayırma ve saflaştırma prosesleri izler. Bunlar, fermente
edilmiş ürünün, formülasyon için hazır, saf ve deriştirilmiş ürünlere dönüştürülmesi
için yapılan işlemleri tanımlamada kullanılmaktadır. İlk önce, enzim fermantasyon
biyokütlesinden ekstrakte edilmelidir. Bu işlem, biyokütlenin santrifüj veya filtrasyon
ile uzaklaştırılmasının ardından fermantasyon sıvısına çeşitli kimyasal maddeler
eklenerek gerçekleştirilir (http://www.housekeepingchannel.com, 2005).
Enzim ekstraksiyonundan sonra, enzim yarı geçirgen membranlar veya buharlaştırma
yardımıyla deriştirilir. Ürünler yüksek saflıkta istendiğinden proses, sıkça, istenmeyen
safsızlıkları ortadan kaldırmak için özel bir adıma ihtiyaç duyar. Bu çoğu kez seçici
çöktürme, safsızlıkların adsorpsiyonu veya son derece saf enzim ürünlerinin elde
edilebileceği ileri kristalizasyon tekniği ile yapılabilir (http://www.
housekeepingchannel.com, 2005).
Enzim üretiminin son aşaması formülasyondur. Formülasyon, ürünün son haline (sıvı
veya kuru) ve enzim aktivitesine karar vermektir. Deterjan formülasyonları artık birden
51
fazla enzimi kapsamaktadır. En başarılı markaların çoğu, iki, üç veya dört farklı enzim
tipini kapsamaktadır. Novozymes’in özellikle donatılmış ev laboratuarlarında, temel
deterjan formülasyonlarına eklenecek enzimin çeşidi ve dozunu optimize edecek titiz
yıkama denemeleri yapılmaktadır (http://www.housekeepingchannel.com, 2005).
Novozymes’in deterjan teknik servis takımından Claus Ladefoged, bir çamaşır
deterjanının çeşitli enzimleri içermesinin ilerde temizleme performansını geliştirmeye
nasıl yardımcı olduğunu şöyle açıklar: ‘‘Bir enzim deterjanında herhangi bir enzimin
derişiminin arttırılması temizleme performansını ancak belli bir maksimum performans
platosuna ulaştırır, daha fazla fayda ancak deterjan formülasyonlarına yeni enzimlerin
eklenmesiyle sağlanabilir” (http://www.housekeepingchannel.com, 2005).
2.5 İdeal Deterjan Enzimlerinin Özellikleri Deterjan enzimleri; çeşitli deterjan bileşenleriyle yüksek sıcaklıklarda bir arada
bulunabilmeli, deterjan çözeltilerinde düşük seviyelerde (%0.4-0.8) etkili olabilmeli ve
uzun bir raf ömrüne sahip olmalıdır.
Deterjan enzimlerinin, kullanım koşullarına direnç yetenekleri önemlidir. Enzim,
granüle halden serbest hale geçtiği zaman, anyonik ve noniyonik surfaktanlara, sodyum
perborat gibi H2O2 üreten oksidantlara, optik beyazlatıcılara ve diğer reaktif
materyallere pH 8-10.5 arasındaki tüm pH’larda dirençli olmalıdır. Enzimlerin deterjan
bileşimine katılmasının bir nedeni, düşük yıkama sıcaklıklarında çalışabilmeyi
sağlayarak enerji tüketiminde tasarruf sağlamak olsa da, enzimin 60oC’ın üzerinde de
aktivitesini koruyabilmesi istenir (Chaplin and Bucke 1990).
2.6 Deterjan Enzimleri
En çok kullanılan deterjan enzimleri; proteaz, amilaz, selülaz ve lipazdır. Gıda
ürünlerinde stabilizör ve koyulaştırma ajanı olarak kullanılan guar gum içeren yiyecek
lekelerini çıkarmada mannanaz enzimi de kullanılmaktadır (Kirk et al. 2002,
52
http://www.mapsenzymes.com, 2005). H2O2 üretme anlamında, glukoz oksidaz,
lipoksigenaz ve gliserol oksidaz enzimleri de deterjan formülasyonuna katılabilir.
Peroksitin ağartma etkisine, peroksidazların katılımı da yardımcı olabilir (Chaplin and
Bucke 1990).
2.6.1 Proteazlar
Proteazlar deterjan endüstrisinde en çok kullanılan enzimlerdir. Çimen, kan, süt,
yumurta ve ter gibi protein lekelerini çıkarırlar. Proteazlar proteinleri hidroliz eder ve
daha iyi çözünebilen polipeptitlere veya serbest amino asitlere parçalar
(http://www.mapsenzymes.com, 2005). Deterjan endüstrisinde kullanılan bütün
proteazları Bacillus türlerinden elde edilen subtilisinler sağlar. Subtilisinlerin başarısı,
yüksek kararlılık ve nispeten düşük substrat spesifikliğine dayanır. Subtilisinler her tip
çamaşır deterjanında ve otomatik bulaşık deterjanlarında kullanılır (Maurer 2004).
2.6.2 Selülazlar
Deterjan enzimlerinin gelişimi esas olarak lekeleri çıkarma yeteneği olan enzimler
üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte selülaz enzimi pamuk veya pamuk
karışımındaki selüloz lifin yapısını değiştirmeyi mümkün kılan özelliklere sahiptir
(http://www.mapsenzymes.com, 2005). Deterjanlarda selülaz kullanımı renk parlatma,
yumuşatma, kirlerin çıkarılması gibi önemli faydalar sağlar.
2.6.3 Amilazlar
Amilazlar, patates, spagetti, krema ve çikolata gibi nişasta esaslı yiyecek kalıntılarının
çıkarılmasında kullanılır. Enzimatik deterjan formülasyonlarında kullanılan ilk enzim
sınıfı proteaz olup, kullanılan ikinci enzim çeşidini amilazlar oluşturur. Amilaz sadece
çamaşır deterjanlarında değil, bulaşık deterjanlarında da kullanılmaktadır (Mitidieri et.
al. 2006, http://www.mapsenzymes.com, 2005). Deterjanlarda amilazın kullanımı, bir α-
53
amilaz olan Termamyl ile olmuştur. Termamyl B. licheniformis’ten elde edilmiş bir
enzimdir. α-Amilaz, özellikle bulaşıkta ve çamaşıra sertlik ve parlaklık veren bir çeşit
özel nişasta olan kolanın çıkarılmasında kullanışlıdır. Termamyl ve Alcalase’ı birlikte
içeren preparasyonlar üretilmiştir. Proteolizize karşı dirençli bir enzim olan Termamyl,
fonksiyonunu tamamlayabilmesi için yeteri kadar uzun bir süre aktivitesini
koruyabilmektedir (Chaplin and Bucke 1990). Çoğunlukla enzimler 20-60oC arasında
çalışırken, Termamyl aktivitesini 100oC’ın üzerinde bile sürdürür (http://www.
novozymes.com, 2006).
2.6.4 Lipazlar
Lipazlar (trigliserol açilhidrolazlar; EC 3.1.1.3), hidrolitik enzimlerden serin hidrolazlar
grubunda yer almaktadır. Hidrolitik enzimler, proteinlerde, lipidlerde ve şeker
konjugelerinde bulunan ester ve amit bağlarını hidrolizler ve serin hidrolazlar, sistein
hidrolazlar, metalloproteazlar ve aspartil proteazlar olmak üzere dört gruba ayrılırlar.
Serin hidrolazlar grubuna giren enzimler aktif bölgelerinde, serin, histidin ve genellikle
aspartik asitten oluşan bir katalitik üçlü taşır. Serin kalıntısı, başlangıç nükleofil görevi
görerek ürün oluşumunu katalizler. Serin hidrolazlara örnek olarak kimotripsin, subtilisin
ve lipaz verilebilir. Hidrolitik enzimler arasında lipazlar en geniş kullanım alanına sahip
enzimlerdir (Ünlü 2004).
Lipazlar, sulu ortamda yağların hidrolizini katalizleyerek, diaçilgliserin,
monoaçilgliserin, gliserin ve serbest yağ asitlerini oluşturur. Gerçekleşen enzimatik
reaksiyonlar çoğunlukla tersinirdir (Telefoncu 1997). Triaçilgliserollerden gliserin ve
serbest yağ asitlerinin oluşumu Eşitlik 2.1’de verilmektedir.
………….(2.1)
triaçilgliserol su gliserol (gliserin) yağ asidi
Lipazlar
54
Lipazların doğal substratları olan uzun zincirli yağ asitlerinin gliserin esterleri suda çok
az çözünürler. Lipazlar, enzimin çözündüğü sulu faz ve su ile karışmayan substrat fazı
arasındaki arayüzeyde ester bağlarının hidrolizini katalizler. Lipazların suda çözünen
esterlere karşı aktiviteleri oldukça düşüktür (Telefoncu 1997).
Lipaz katalizli reaksiyonlar iki temel kategoride incelenebilir;
(i) Hidroliz
RCOOR’ + H2O RCOOH + R’OH……………........…(2.2)
(ii) Sentez
(a) Esterifikasyon
RCOOH + R’OH RCOOR’ + H2O…………………....(2.3)
(b) İnteresterifikasyon
RCOOR’ + R’’COOR* RCOOR* + R’’COOR’…….(2.4)
(c) Alkoliziz
RCOOR’ + R’’OH RCOOR’’ + R’OH……………....(2.5)
(d) Asidoliziz
RCOOR’ + R’’COOH R’’COOR’ + RCOOH…………..(2.6)
Eşitlik (2.4) - (2.6) çoğunlukla transesterifikasyon terimi altında toplanır. Reaksiyon
ortamında suyun az olduğu durumlarda interesterifikasyon ana reaksiyondur (Gandhi 1997,
Telefoncu 1997).
Lipazların substrat spesifiklikleri, analitik ve endüstriyel uygulamalarda çok önemlidir.
Substrat spesifikliği, enzimin moleküler özellikleri ve substratın yapısına bağlı olup,
enzimin substrata bağlanmasına etki eden faktörler tarafından kontrol edilir. Lipazlar
substrata spesifikliklerine göre üç ayrı grupta incelenir (Telefoncu 1997, Saxena et al.
1999);
Spesifik Olmayan Lipazlar
Bu grupta yer alan enzimler, trigliseritlerin tüm pozisyonlarındaki açil gruplarını
koparabilme yeteneğine sahiptir. Reaksiyonda ara ürün olarak diaçil ve mono açil
55
gliserinler oluşur. Candida cylindracae, Corynebacterium acnes, Taphylococcus aureus ve
Geotrichum candidum tarafından üretilen lipazlar bu gruba girer (Telefoncu 1997, Saxena
et al. 1999).
1,3-Spesifik Lipazlar
Bu gruba giren lipazlar nötral yağları, eşdeğer konumdaki 1 ve 3 pozisyonlarından spesifik
olarak hidrolizler. Reaksiyon sonucunda, triaçilgliserollerden yağ asitleri, 1,2(2,3)-
diaçilgliserinler ve 2-monoaçilgliserinler oluşur. 1,2(2,3)-diaçilgliserinler ve özellikle 2-
monoaçilgliserinler kimyasal olarak kararsız olup sırasıyla 1,3-diaçilgliserinlere ve 1(3)-
monoaçilgliserinlere izomerleşir. Böylece oluşan izomerler, enzim tarafından tekrar
substrat olarak kullanılabilir ve sonuçta 1,3-spesifik lipazlar da spesifik olmayan lipazlar
gibi trigliseritleri gliserin ve serbest yağ asitlerine kadar parçalayabilir. Pankeas,
Aspergillus niger, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Humicola
lanuginosa, Rhizopus ve Mucor türlerinden elde edilen lipazlar 1,3- spesifiktir (Telefoncu
1997, Saxena et al. 1999).
Yağ Asidi Spesifik Lipazlar
Bu gruptaki lipazlar, açilgliserinlerdeki bazı yağ asitlerine spesifik olup bu yağ asitlerinin
oluşturduğu ester bağlarını parçalar.
Lipazların bazıları, doymamış yağ asitlerinden kısa zincirli olanlara (asetik, butirik, kaprik,
kaproik, kaprilik), bazısı ise daha uzun zincirli yağ asitlerine (oleik, linoleik, linolenik vb)
ilgi duyar (Saxena et al. 1999). Örneğin, Geotrichum candidum tarafından üretilmiş lipazın
uzun zincirli bir yağ asidinin özel bir tipinin esterlerinin hidrolizi için birçok özelliğe sahip
olduğu bildirilirken, M. miehei lipazının, düşük pH’larda süt yağındaki bütirik aside
spesifiklik gösterdiği ifade edilmiştir (Telefoncu 1997, Saxena et al. 1999). Bununla
birlikte çok sayıda lipaz spesifik olmayıp, trigliseritlerin yağ asitlerini rastgele parçalar
(Saxena et al. 1999).
56
Lipazın izoformları mevcuttur. İzoformlar; konumsal spesifiklerde, molekül ağırlıklarında,
arayüzey aktivasyonlarında, stereoseçicilikte ve maksimum aktivite gösterdikleri
substratlarda farklılıklar gösterir. Rhizopus niveus tarafından üretilen iki çeşit lipaz (Lipaz I
ve Lipaz II) bilinmektedir. Lipaz I ve Lipaz II’nin molekül ağırlıklarında farklılık
gösterdiği, Lipaz I’in sınırlı proteoliziz ile Lipaz II’ye dönüşebildiği bildirilmiştir.
Geotrichum candidum’un dört farklı lipaz ürettiği açıklanmıştır. Lipaz I’in konumsal
spesifikliği yoktur, Lipaz IV ise alışılmışın dışında bir konumsal spesifiklik
göstermektedir. Martinelle (1995), Candida antarctica lipazı izoformlarından A ve B’nin
(CALA ve CALB) arayüzey aktivasyonu üzerinde çalışmıştır. CALB hiç arayüzey
aktivasyonu göstermemiştir, bu da aktif konuma girişi düzenleyen kapak yapısının
yokluğunu işaret etmektedir. C. rugosa’nın A ve B lipaz izoformları tarafından p-nitrofenil
esterlerinin hidrolizi Rodendo (1995) tarafından belirlenmiştir. Lipaz B maksimum
aktiviteyi laurat, Lipaz A ise kaprilat üzerinde göstermiştir; yani izoformların maksimum
aktivite gösterdikleri substratlar farklılık gösterebilmektedir. Kültür ortamına eklenen
Tween 20, Tween 80 ile bir izoform karışımındaki izoformların bağıl miktarı
değiştirilebilmektedir (Sharma et al. 2001).
Lipazlar yağ ve su ara yüzeyinde fonksiyon gösterir. Bununla birlikte arayüzey
aktivasyonu göstermeyen lipazlar da mevcuttur. Bunlara örnek olarak Pseudomonas
glumae ve Candida antartica B türü lipaz verilebilir (Schmid and Verger 1998). Ara yüzey
alanı emülsifiyerlerin kullanımı (örneğin Tweenler) ile belli ölçülerde artırılabilir. Lipaz
katalizli reaksiyonların çözünmeyen substrat ve enzimin çözündüğü sulu faz arasındaki ara
yüzeyde gerçekleşmesi, reaksiyon kinetiğinin belirlenmesinde ve deneylerde zorluk yaratır
(Saxena et al. 1999).
Lipazlar α/β hidrolaz kıvrım ailesine mensuptur. Yapı, α sarmallarıyla çevrili, merkezi
paralel β yapraklarından oluşur. Aktif nükleofilik serin kalıntısı, bir α-sarmal ve bir β-
yaprak arasındaki bölgede yer alır. α/β hidrolaz ailesi, lipaz, esteraz, proteaz, peroksidaz,
liyaz ve diğer enzimleri içerir. Bununla birlikte bütün lipazlar aynı yapısal aileye girmez.
Örneğin, PLA2 (fosfolipaz A2), PLA-D (fosfolipaz D) ve bazı lizo-fosfolipazlar,
triaçilgliserol lipazlar ile karşılaştırılırsa oldukça farklı bir yapıya sahiptir (Schmid and
Verger 1998, Svendsen 2000).
57
Lipazların çoğu, bir α- sarmal peptit dizininden oluşan, kapalı formasyonda (örneğin ara
yüzey veya organik çözücü yokken), substratın katalitik üçlüye ulaşmasını engelleyen bir
kapağa sahiptir. Kapağın aktif bölgeye bakan kısmı hidrofobik, diğer kısmı hidrofiliktir.
Kapak açıldığında, hidrofobik substratın bağlandığı geniş bir hidrofobik yüzey ortaya
çıkar. Hidrofobik yüzey, yağın temas ettiği bölgenin merkezinde ve substratın içine
yerleşmesi için uygun yapıda olup açil parçalarının içini doldurması için uzatılmış bir cep
gibidir. Lipaz enziminin faaliyeti, bazen birkaç kapağın hareketi ile olur. İnsan pankreatik
lipazı ve Candida rugosa lipazı birden fazla kapağa sahiptir. Bazen aktivasyon sadece belli
substratlar için gösterilir. Örneğin Fusarium solani pisi kütinazı, uzun zincirli açil
substratlarla bir araya geldiğinde yapısında ufak bir değişiklik gerçekleşir (Schmid and
Verger 1998, Svendsen 2000). Şekil 2.2’de Humicola lanuginosa lipazının yapısı
gösterilmiştir.
Şekil 2.1 Lipazların kristal yapısı (Humicola lanuginosa lipazı) (Svendsen 2000). Mavi oklar ile gösterilenler β-yapraklar. β-yaprakları çevreleyen sarı helezonlar
α-sarmallar. Aktif serin kalıntısı kırmızı çubuk, onun üzerinde kırmızıyla
gösterilen bölüm ise kapak.
2.6.4.1 Lipaz kaynakları
Lipazlar, bitki ve hayvan dokularından ekstraksiyonla veya mikroorganizmalardan
fermantasyon yoluyla üretilir. Ticari lipazlar genelde mikrobiyal kaynaklıdır. Lipaz
üreten mikroorganizmalar bakteriler, fungi ve mayalardır. Bakteriler daha çok proteaz
58
kaynağı olarak kullanılmakta, bakteri lipazlarının endüstriyel üretimi fazla
yapılmamaktadır. Çizelge 2.4’te bazı mikrobiyal lipazların özellikleri verilmektedir.
Çizelge 2.4 Bazı mikrobiyal lipazların özellikleri (Saxena et al. 1999)
2.6.4.2 Lipaz üretiminde önemli parametreler
Lipaz üretiminde; karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimi, üretim pH’ı, sıcaklık,
metal iyonları ve çözünmüş oksijen derişimi etkilidir.
Organizma
Spesifiklik
Moleküler
ağırlık
(kDa)
İzolelektrik
noktası
Optimum
pH
Optimum
Sıcaklık
(°C)
Chromobacterium
viscosum
Spesifik değil 30 7.3 6.5-7.0 70
Pseudomonas sp. 1,3 spesifik 32 4.5 7.8 47
P. fluorescens 1,3 spesifik 32 4.5 7.0 50-55
Candida
cylindracea
Spesifik değil 120 4.2 7.2 45
C. carvata 18:1>16.0
=14.0
195 - 5.0-8.0 60
C. deformans 1,3 spesifik 207 - 7.0 80
Aspergillus niger 1,3 spesifik 38 4.3 5.6 25
Geotrichum
candidum
cis-
∆9doymamış
yağ asitleri
55 4.3 6.6 40
Humicola
lanuginosa
Spesifik değil 27.5 - 8.0 60
Mucor miehei 1,3 spesifik - - 8.0 40
Lipaz A Spesifik değil 27 4.9 7.5 35
Lipaz B Spesifik değil 36 4.1 5.8 40
Rhizopus arrhizus 1,3 spesifik 43 6.3 8.0 -
R. delemar 1,3 spesifik 41.3 4.2 5.6 35
59
2.6.4.2.1 Karbon ve azot kaynakları etkisi
Mikrobiyal lipazların üretiminde çoğunlukla zeytinyağı, ayçiçek yağı, soya fasulyesi
yağı, susam yağı, pamuk yağı, mısır yağı, yer fıstığı yağı ve palmiye yağı gibi bitkisel
kaynaklı yağlar denenmektedir. Yağlı bir ortamda çoğalan mikroorganizmalar, lipaz
üretme potansiyeline sahiptir. Mikroorganizmalar yağları karbon veya azot kaynağı
olarak kullanırken bir yandan da lipaz üretmektedir.
Sugihara 1991’de Bacillus sp.’den %1 zeytinyağı içeren kültür ortamında lipaz
üretmiştir. Rhodotorula glutinis’ten elde edilen hücre dışı lipazın üretiminde palmiye
yağı en iyi lipid kaynağı olarak belirlenmiştir. P. fluorescens SIK WI tarafından
üretilen lipaz için ise trikaproik (C6), trikaprilin (C8) en iyi triaçilgliserol kaynağı
olarak gözlenmiş, bununla birlikte enzim triolenin 1 ve 3 konumundaki ester bağlarını
da hidroliz etmiştir (Sharma et al. 2001).
Termofilik Bacillus sp. türü Wai 28A45’ten ısıl kararlı lipaz üretimi tripalmitin,
tristearin, trimiristin karbon kaynakları ile test edilmiş ve tripalmitin en iyi lipaz
aktivitesi vermiştir. Yine termofilik Bacillus türü A30-1 (ATCC 53841), mısır yağı ve
zeytinyağı (%1) kullanıldığında maksimum seviyede lipaz üretmiştir (Sharma et al.
2001) .
Rhizopus oryzae için kolza tohumu ve mısır yağının lipaz üretimi için en uygun
substratlar olduğu, optimal çoğalma için yağ derişiminin %3, optimal lipaz üretimi için
yağ derişiminin %2 olduğu bildirilmiştir (Sharma et al. 2001).
Bir alkali lipazın, P. alcaligenes M-1 tarafından sitrik asit ve soya yağı içeren ortamda
üretildiği bildirilmiştir. Bu lipaz alkali bir ortamda yağ lekelerini çıkarmak için
mükemmel bir özellik göstermektedir. Bacillus stearothermophilus L1’den sığır eti,
palmiye yağı içeren ortamda yüksek alkali ısıl kararlılıkta lipaz üretildiği açıklanmıştır.
Sentetik substratlarla aktivite değerlendirmesi sonucunda enzimin özellikle p-nitrofenil
kaprilata etki gösterdiği anlaşılmıştır (Sharma et al. 2001).
60
P. aeruginosa’nın KKA-5 karbon kaynağı olarak hint yağı kullanıldığında maksimum
lipaz aktivitesi verdiği ifade edilmiştir. Enzim alkali koşullarda kararlıdır (Sharma et
al. 2001).
Acremonium structum’un, azot kaynağı olarak soya fasulyesi içeren ortamda büyük
miktarda lipaz üretmiş olduğu bildirilmiştir (Sharma et al. 2001).
Farklı Rhizopus türlerinin lipazlarının (40-45 kDa) orta zincirli yağ asitlerine (C8-C10)
karşı maksimum aktivite gösterdiği açıklanmıştır. Candida curvata, C. tropicalis, C.
valida ve C. pellioculosa’dan üretilen lipazların trigliseritlerdeki farklı ester bağlarına
nonspesifik olduğu belirlenmiştir (Saxena et al. 1999).
Geotrichum candidum süt ürünlerindeki yağı hidrolize ederken C9’da cis çift bağı
içeren yağ asitlerine spesifiklik göstermiş olup, bu özelliği nedeniyle trigliseritlerin
yapısal analizleri için başvurulan bir türdür (Saxena et al. 1999).
Aspergillus niger’in hücre içi ve hücre dışı lipazları 1,3-(konum)spesifiktir. P.
cyclopium, P. verrucosum var. cyclopium ve P. crustosum gibi Penicillium türlerinden
izole edilen lipazlar bütirik asit için spesifiklik göstermiştir. P. cyclopium lipazının di
ve monogliseritlere trigliseritlere oranla daha yüksek aktivite gösterdiği açıklanmıştır.
H. lanuginosa lipazları kokonat yağı ve yüksek miktarlarda laurik asit içeren yağlara
daha fazla hidrolitik aktivite göstermektedir (Saxena et al. 1999).
Lezitinin, R. japonicus’un lipaz üretimini artırdığı belirlenmiştir. Doymamış yağ asidi
tuzları P. fragi’nin lipaz üretimini inhibe etmiştir (Saxena et al. 1999).
Zeytin yağı, yer fıstığı yağı, pamuk yağı ile oleik asit, linoleik asit ve linolenik asit gibi
yağ asitleri P. mephitica’nın lipaz üretimini artırmaktadır (Saxena et al. 1999).
Gao ve Breuil (1995) bir fungus olan Ophiostoma piceae lipazının üretiminde zeytin,
soya fasulyesi, ayçiçeği, susam pamuk, mısır yağı ve yer fıstığı yağı gibi farklı bitki
61
yağlarını karşılaştırmış, maksimum lipaz üretiminin zeytinyağı kullanıldığında
gözlendiğini bildirmiştir (Saxena et al. 1999).
Rhizopus oryzae ile yapılan bir incelemede ise ortama farklı türde yağların eklenmesi
hem lipaz aktivitesini yükseltmiş, hem de yağsız ortamla karşılaştırıldığında hücre
derişimi artmıştır. Hücre çoğalması için optimum bir yağ derişimi olup, optimum lipaz
üretimi için bu derişim değişmiştir (Sharma et al. 2001).
Lipaz üretimi için kullanılan karbon kaynaklarından biri de glukozdur; P. fragi
lipazının üretimi için glukoz gerekli görülmüştür. Talaromyces emersonii’de ise kuru
mikroorganizma kütlesi başına lipaz aktivitesinin, karbon kaynağı olarak laktoz,
mannoz, ksiloz, fruktoz, dekstrin ve ramnoz kullanıldığında glukoza oranla daha
yüksek olduğu gözlenmiştir (Saxena et al. 1999).
Genellikle mikroorganizmalar yüksek miktarda lipazı organik azot kaynakları
(özellikle polipepton, mısır unu özütü, maya özütü) kullanıldığında sağlar. Penicillium
citrinum türü için yapılan bir incelemede pepton içeren ortamda maksimum üretim elde
edilmiştir (Sharma et al. 2001).
Humicola sp., T. lanuginosus, Penicillium purpurogenum ve Chrysosporium sulfureum
mikroorganizmalarından ısıl kararlı lipaz üretim çalışmalarında azot kaynağı olarak
maya özütü kullanımının yüksek lipaz üretimi verdiği açıklanmıştır. Salleh et al. (1993)
tarafından, Rhizopus oryzae tarafından hücre dışı lipaz üretimi için pepton optimal azot
kaynağı olarak belirlenmiştir. Lin et al. (1996) P. alcaligenes F-111 tarafından soya
tozu, pepton ve maya özütü içeren ortamda bir hücre dışı alkali lipaz üretildiğini,
üretilen bu lipazın aktivitesinin sodyum dodesil sülfat, sodyum tripolifosfat, sodyum
dodesil benzen sülfonat ve sodyum alkil benzen sülfonat gibi katyonik surfaktanlardan
etkilenmediğini bildirmiştir (Sharma et al. 2001).
Üre ve amonyum sülfat kullanımı genel olarak lipaz sentezini inhibe etmekte, oleik asit
ve Tween 80 lipaz üretimi için hızlandırıcı etki göstermektedir (Sharma et al. 2001).
62
2.6.4.2.2 pH etkisi
Çoğalma ortamının başlangıç pH değeri lipaz üretimi için önemlidir. Maksimum
aktivite P. fragi için pH > 7; P. aeruginosa için pH=9 iken gözlenmiş olup ortamın
asitliğinin artmasının lipaz aktivitesini düşürdüğü belirlenmiştir. Buna karşılık
maksimum çoğalma S. lipolytica, M. caseolyticus, B. licheniformis, A. wentii, M.
hiemalis, R. nigricans, Mucor racemosus, R. oligosporus, P. aeruginosa EF2 için
asidik pH (4.0-7.0) olarak açıklanmıştır (Saxena et al. 1999).
2.6.4.2.3 Sıcaklık etkisi
Oso (1978), T. emersonii ’den lipaz üretiminde 45oC’ın en iyi sıcaklık olduğunu
bildirmiştir. 22-35oC aralığındaki sıcaklıkların da A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans,
M. racemosus, R. oligosporus ve P. aeruginosa ’nın maksimum lipaz üretimi için
optimum olduğu açıklanmıştır (Saxena et al. 1999).
P. fluorescens’ten elde edilen lipazın bir proteaz olan subtilisin tarafından 20oC’ta
inaktive olduğu bildirilmiş, bu etki mikroorganizma çoğalma ortamında daha yüksek
sıcaklıklarda (30-40oC) daha fazla görülmüştür (Saxena et al. 1999).
2.6.4.2.4 Metal iyonları etkisi
Pokorny et al. (1994) Mg+2’nin Aspergillus niger’den lipaz üretimini artırdığını
açıklarken, benzer şekilde Jannsen et al. (1994) termofilik bir Bacillus sp.’nin lipaz
üretimini üretim ortamına eklenen magnezyum, demir ve kalsiyum iyonlarının birkaç
kat artırdığını bildirmiştir. Kok et al. (1995)’un açıklamasına göre Aci. calcoaceticus
BD 413’ten hücre dışı lipaz üretimi de yine ortama eklenen Mg+2, Ca+2, Cu+2, Co+2 ile
artmıştır. Lin et al. (1995) P. pseudualcaligenes F-111’in lipaz üretiminin fosfat içeren
ortama Mg+2 eklenmesi ile artış gösterdiğini ifade etmiştir. Metal iyonlarının 1 mM
derişimlerinin lipaz aktivitesine etkisini incelediği çalışmasında Lin et al. (1996) P.
pseudoalcaligenes F-111 lipazının Fe+3 varlığında %60 inhibe olduğunu açıklamıştır.
63
Sidhu et al. (1998) tarafından ortamda Ca+2’nin termofilik Bacillus sp. RS-12’nin lipaz
üretimini artırdığı ifade edilirken, Sharon et al. (1998), P. pseudoalcaligenes KKA-5
için ortamdaki Ca+2’nin lipaz üretimine etki etmediğini açıklamıştır. Sharon et al.
(1998), P. aeruginosa KKA-5 lipazının Ca+2 ve Mg+2 varlığında aktivitesini
koruduğunu fakat Mn+2, Cd+2 ve Cu+2 varlığında az miktarda, Fe+2, Zn+2, Hg+2, Fe+3
gibi ağır metal tuzları varlığında güçlü bir şekilde inhibe olduğunu açıklamıştır. Benzer
şekilde Hiol et al. (2000) Rhizop oryzae lipazının aktivitesinin Fe+2, Fe+3, Hg+2, Cu+2
varlığında azaldığını rapor ermiştir. Chartrain et al. (1993) P. aeruginosa MB5001
lipazının 1 mM ZnSO4 ile %94 inhibe olduğunu açıklamıştır. Genellikle Ca+2 ve Mg+2
iyonlarının lipaz üretimini artırdığı görülmektedir. Fe+2, Fe+3, Hg+2, Cu+2, Zn+2, Ag+1
gibi ağır metal tuzları ise enzimi genellikle inhibe etmektedir (Sharma et al. 2001).
2.6.4.2.5 Oksijen aktarımı etkisi
Güçlü havalandırma R. oligosporus, P. fragi, P. aeruginosa ve M .racemosus
tarafından lipaz üretimini büyük ölçüde düşürmüştür (Saxena et al. 1999).
Row and Gilmour (1982) P. florescens ile yaptığı incelemede düşük oksijen
derişiminin lipaz üretimini hızlandırdığını belirlemiştir. Oso (1978), T. emersonii’den
maksimum lipaz üretiminin durağan şartlarda gerçekleştiğini açıklamıştır. Bununla
birlikte P. mephitica var. lipolytica, A. wentii ve M. hiemalis yüksek lipaz aktivitesi
için yüksek havalandırmaya ihtiyaç duymaktadır (Saxena et al. 1999).
2.6.4.3 Lipazların kullanım alanları
Lipazlar deterjan, gıda, farmasötiklerin sentezi, kağıt imalatı, kozmetik ve daha pek çok
endüstriyel alanda kullanılan enzimlerdir. Lipazların en önemli uygulamaları Çizelge
2.5 ile özetlenmiştir.
64
Çizelge 2.5 Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamaları (Sharma et al. 2001)
Endüstri Faaliyet Ürün veya Uygulama
Deterjan Yağların hidrolizi Kumaşlardan yağ lekelerinin
çıkarılması
Süt Ürünleri Sütteki yağın hidrolizi,
peynir olgunlaştırma,
tereyağının modifikasyonu
Süt, peynir ve tereyağındaki tat
vericilerin geliştirilmesi
Unlu Mamüller Lezzetin artırılması Raf ömrünün uzaması
İçecek Aromanın artırılması İçecek
Yiyecek Sosları Kalite iyileştirme Mayonez, sos
Et ve Balık Lezzetin artırılması Et ve balık ürünleri; yağı
azaltma
Yağ Transesterifikasyon;
hidroliz
Kakao yağı, margarin, yağ
asitleri, gliserol, mono ve
diglisertler
Kimyasallar Enanatiyoseçimlilik,
sentez
Kiral yapılandırma blokları,
kimyasallar
Farmasötik Transesterifikasyon,
hidroliz
Özel lipidler, sindirim
yardımcıları
Kozmetik Sentez Emülsifiyerler, nemlendiriciler
Deri Hidroliz Deri ürünleri
Kağıt Hidroliz Geliştirilmiş nitelikte kağıt
Temizlik Hidroliz Yağların çıkarılması
2.6.4.4 Lipazların deterjan enzimi olarak kullanımı ve üretimi
Lipazlar, yağları hidroliz etme özellikleri ile deterjan katkısı olarak büyük bir kullanım
alanı bulmuştur. Deterjan lipazları, farklı bileşimdeki yağların parçalanabilmesi için
düşük substrat spesifikliğine sahip olmalı, sert yıkama koşullarına (pH=10-11, 30-
60oC), çok sayıda deterjan formülasyonlarının önemli bileşenleri olan surfaktan ve
65
enzimlerin (örneğin lineer alkil benzen sülfonat ve proteazlar) zararlı etkilerine karşı
dayanabilmelidir.
Lipazların çoğu optimum aktivitesini nötral pH’larda ve 35-48oC aralığında
göstermektedir. Misset et al. (1994), Pseudomonas alcaligenes lipazının, alkali
pH’larda (7-11) ve 60oC’ın üzerindeki sıcaklıklarda noniyonik ve anyonik surfaktanlar
varlığında aktivitesinin geliştirildiğini açıklamıştır. Bu enzim, yıkama makinelerinde ve
surfaktanlarla depolama esnasında da kararlı bulunmuştur. Novo grubu, Streptomyces
sp.’den yüksek alkali ve spesifik olmayan bir lipaz elde edildiğini ve lipazın pek çok
bakteriyel termofilik lipazla birlikte çamaşır ve bulaşık deterjanlarında, endüstriyel
temizleyicilerde faydalı olduğunu bildirmiştir. Deterjan enzimlerinin kararlılığı ve
aktivitesi ‘surfaktan lipaz’ olarak isimlendirilen genetik mühendisliği ürünlerle
geliştirilmiştir. Unilever, Cosmo Oil ve Procter&Gamble, surfaktan lipazlar için
rekombinant DNA teknolojisi üzerinde çalışmaktadır (Pandey et al. 1999).
En önemli ticari deterjan lipazları Çizelge 2.6 ile verilmiştir. 1994’te Novo Nordisk, ilk
ticari rekombinant lipaz ‘Lipolase’ı sunmuştur. Enzim, bir fungus olan Thermomyces
lanuginosus’ta klonlanmış ve Aspergillus oryzae’de ekspres edilmiştir. İlk defa
endüstriyel boyutta Hokkaido, Japonya’da üretilen enzim, buradan, Kuzey Amerika ve
Avrupa’ya ihraç edilmiştir. 1995’te Genencor International tarafından, aynı
mikroorganizmada klonlanıp ekspres edilen iki bakteriyal lipaz, Pseudomonas
mendocina’dan ‘Lumafast’ ve P. alcaligenes’ten ‘Lipomax’ piyasaya sunulmuştur.
Gerritse et al. (1998), P. alcaligenes M-1’in ürettiği alkali lipazın modern makine
yıkama koşullarında yağ lekelerinin çıkarılması için çok uygun olduğunu bildirmiştir
(Schmid and Verger 1998, Sharma et al. 2001).
66
Çizelge 2.6 Ticari deterjan lipazları (Schmid and Verger 1998)
Marka
adı
Firma Lipaz Kaynağı Optimum
pH
Optimum
sıcaklık
(oC)
Lipolase Novo-
Nordisk
Humicola lanuginosa kaynaklı,
Aspergillus oryzae’de ekspres edilmiş
10 40
Lipomax Gist-
Brocades[a]
Pseudomona spseudoalcaligenes’de
yeniden klonlanıp aynı organizmada
ekspres edilmiş
11 45
Lumafast Genencor[a] Pseudomonas mendocina kaynaklı,
Bacillus spec.’de ekspres edilmiş
10.5 40
[a] Gist-Brocades’in enzim üretimi, 1995’te Genencor International B. V.’ye (Delft, The Netherlands)
verildi.
Deterjanlarda kullanılacak lipazların oksidatif kararlılık göstermesi ve şelatlama
ajanlarına karşı dirençli olması gerekmektedir. Lipazlar diğer enzimlere oranla
oksidatif maddelere karşı daha kararlıdır. Pseudomonas sp.’deki metioninler diğer
kalıntılarla yer değiştirilerek enzimin oksidatif kararlılığı arttırılabilmekle beraber bazı
durumlarda enzim aktivitesi azalabilmektedir (Swendsen, 2000). P. pseudoalcaligenes
F-111 lipazı üzerine ise metal şelatlama ajanları (EDTA, o-fenantirolin) etki etmemiştir
(Sharma et al. 2001).
Deterjan enzimlerinin ısıl kararlı olması istenmektedir. Pankreatik lipazlar 40oC’ın
üzerindeki sıcaklıklarda saklandığında aktivite kaybederken, bazı mikrobiyal lipazların
ısıl inaktivasyona karşı oldukça dirençli olduğu saptanmıştır (Saxena et al. 1999).
Isıl kararlı lipazlar pek çok kaynaktan izole edilebilmektedir; P. fluorescens, Bacillus
sp., B. coagulans, B. cereus, B. stearothermophilus, Geotricum sp., Aeromonas sobria,
P. aeruginosa bunlardan bazılarıdır.
Sidhu (1998) tarafından izole edilen bir hücre dışı Bacillus lipazının ise en yüksek
aktiviteyi 50oC’ta gösterdiği, enzimin yarı ömrünün 75oC’ta 15 dakika olduğu
açıklanmış; enzimin çeşitli oksitlenme-indirgenmelere, şelatlama ajanlarına, yüzey
aktif ajanlara karşı kararlı olduğu bildirilmiştir (Sharma et al. 2001).
67
A. niger, R. japonicus ve C. viskosum lipazlarının 50oC’ta, H. lanuginosa, P. sp.
nitroreducens’tan elde edilen lipazların ise sırasıyla 60oC ve 70oC’ta kararlı olduğu
belirlenmiştir. A. terreus’un saflaştırılmış lipazının, 60oC’ta 24 saat sonra aktivitesini
%100 koruyabildiği bildirilmiştir. Bununla birlikte C.gigantea’den ve diğer
mezofillerden elde edilen lipazların maksimum aktivitesinin 30-35oC’ta olduğu
belirlenmiştir.
Sıcak su kaynaklarından elde edilen termofilik bakterilerin lipazlarının ise yüksek
aktiviteyi 40-60oC aralığında gösterdiği bildirilmiştir (Saxena. et al. 1999) Başka bir
incelemede Wang tarafından Bacillus türünden izole edildiği bildirilen ısıl kararlı bir
enzimin 60oC ’ta maksimum aktiviteye sahip olduğu, 75oC’ta 30 dakika kalması
halinde aktivitesinin %100’ünü koruduğu, enzimin yarı ömrünün 75oC’ta 8 saat olduğu
açıklanmıştır (Sharma et al. 2001).
Bazı lipazların asidik pH’ta, bazılarının ise alkali pH’ta kullanımları daha aktiftir. A.
niger, Chromobacterium viscosum ve Rhizopus sp.’nin hücre dışı lipazlarının asidik
pH’ta aktif olduğu bildirilmiştir. P. nitroreducens’ dan pH 11’de aktif bir alkali lipaz
izole edildiği açıklanmıştır (Saxena et al. 1999). Deterjanlarda kullanılacak lipazların
alkali pH’larda aktif olması istenmektedir.
Lipazlar hem çamaşır deterjanlarında hem de bulaşık deterjanlarında kullanılmaktadır.
Lipaz temizliği artırmanın yanı sıra kireçlenmeyi de önlemektedir. Lipazların
temizlikle ilgili başka uygulamaları da vardır. Lipazlar,
- ağartma bileşeni olarak
- kuru temizleme çözücülerindeki yağ bileşenlerini parçalamada
- deri endüstrisinde temizleyici olarak
- lensler üzerindeki tortuları temizlemede kullanılan bir kontak lens
temizleme bileşeni olarak
- yağlarla tıkanmış olukların temizlenmesinde
- boşaltma borularının, lağım borularının yüzeyindeki organik atıkların
parçalanmasında
68
- hayvan gübrelerinin temizlenmesinde selülazlarla birlikte kullanılır
(Gandhi 1997).
2.6.4.5 Lipazın saflaştırılması
2.6.4.5.1 Saflaştırmanın önemi
Enzimlerin saflaştırılması, enzimin verimli ve başarılı kullanımına imkan sağlayan
önemli bir basamaktır. Farmasötik ve kozmetik gibi değerli kimyasalların üretiminde
enzimlerin kullanıldığı endüstrilerde, saf enzimlere ihtiyaç duyulduğu için enzimin
saflaştırılması oldukça önemlidir. Saflaştırma ayrıca, enzimin temel amino asit
dizininin ve üç boyutlu yapısının tanımlanmasında kullanılmaktadır. Saf lipazların X-
ışını çalışmaları, yapı-fonksiyon ilişkisinin saptanmasına ve lipazın kinetik
mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına olanak sağlamaktadır.
2.6.4.5.2 Protein saflaştırma yöntemleri
Ticari saflaştırma stratejilerindeki temel sınırlamalar; saflaştırma sonucunda az ürün
elde edilmesi, saflaştırmanın uzun zaman alması ve zahmetli oluşudur. Günümüzde
endüstriler, ucuz, hızlı, yüksek verim sağlayan, geniş ölçekli işlemler için uygun
saflaştırma stratejileri araştırmaktadır.
Protein saflaştırmada sıkça kullanılan klasik yöntemler çöktürme, filtrasyon ve
kromatografidir. Son zamanlarda bunlara membran prosesleri, immünosaflaştırma gibi
yeni teknikler de eklenmiştir (Saxena et al. 2003).
2.6.4.5.2.1 Çöktürme
Çöktürme, çoğunlukla saflaştırma prosedürünün ilk safhalarında, tamamen kaba bir
ayırma basamağı olarak yer almaktadır. Saflaştırma projelerinin yaklaşık %80’i bir
69
çöktürme basamağı kullanmaktadır; bunun %60’ı amonyum sülfat, %35’i etanol,
aseton veya bir asit (genellikle HCl) kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Çöktürme
aşaması, proteinlerin çözünürlük özeliklerinden yararlanılarak saflaştırılması işlemidir.
Proteinlerin çözünürlüğü sıcaklık, pH ve ortamda bulunacak nötral tuzun iyonik
gücünden etkilenmektedir. Ortamdaki tuzun iyonik gücü, tuzu oluşturan anyon ve
katyonun yükü ve tuz derişimi ile değişmektedir. Yüksek tuz derişimlerinde
proteinlerin hidratasyonu azalmakta ve bunun sonucu olarak protein çökmektedir.
Proteinlerin hidratasyonunun azalması, ortamda yüksek derişimde bulunan tuzun kendi
hidratasyonu için suyu tutması sebebiyledir. Çöktürme işlemi genellikle basamaklar
halinde uygulanır (fraksiyonel çöktürme). Bunun anlamı, iyonik gücü gittikçe artacak
şekilde farklı derişimlerde tuz çözeltileri kullanılarak yani ortama tuz basamak
basamak eklenerek, karışım içerisinde bulunan çeşitli proteinlerin birbirinden
ayrılmasıdır. Çökmüş proteinler, doğal yapılarını koruduklarından, denatüre
olmaksızın, uygun bir çözelti kullanılarak yeniden çözünür hale getirilirler. Çöktürme
işleminin, fazla kimyasal kullanımı, protein olmayan maddelerin
uzaklaştırılamamasında yetersiz kalması gibi birtakım dezavantajları vardır. Lipaz
aktivitesindeki artış, kullanılan amonyum sülfat çözeltisinin derişimine bağlıdır
(Saxena et al. 2003)
2.6.4.5.2.2 Diyaliz ve ultrafiltrasyon
Proteinleri daha küçük molekül ağırlığa sahip maddelerden ayırmak için diyaliz
yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntem yarı geçirgen bir membran içerisine konan protein
çözeltisi içerisinden küçük moleküllerin membranın ultramikroskopik gözeneklerinden
suyla veya tamponla membran dışına geçirilmesi temeline dayanmaktadır. Glukoz ve
NaCl gibi küçük moleküller membrandan geçerken büyük protein molekülleri diyaliz
membran gözeneklerinden geçemediği için içerde kalır. Ortam suyunun birkaç kez
değiştirilmesi ile küçük moleküllerin protein çözeltisi içerisinden uzaklaştırılması
mümkün hale gelmektedir.
Ultrafiltrasyon yöntemi de diyaliz tekniğine göre çalışır. İki yöntemde de proteinler
molekül büyüklüklerine göre ayrılırlar. Aradaki fark, ultrafiltrasyonda küçük
70
moleküllerin ortamdan uzaklaştırılması için hidrostatik basınç veya santrifüj gibi
kuvvetlerin kullanılmasıdır. Ultrafiltrasyon, diyalize göre daha hızlı ve daha yüksek
verimlilikte bir ayırma sağlamaktadır. Basınç sayesinde küçük moleküllerle birlikte bir
miktar sıvı kaybedildiği için protein daha derişik bir şekilde elde edilmektedir
(http://yunus.hacettepe.edu.tr, 2007).
2.6.4.5.2.3 Kromatografik yöntemler
Kromatografi; madde karışımlarının, sabit ve taşıyıcı faz arasında, büyüklük, şekil,
taşıdıkları yük, çözünürlük gibi özelliklerine göre dağılarak ayrılmalarıdır. Kolon
kromatografisi, proteinlerin saflaştırılmasında sıkça kullanılır. Kolon, proteinleri seçici
olarak adsorplayan bir maddeyle (sabit faz) doldurulmaktadır. Protein karışımı kolona
verildiğinde, tampon çözelti (taşıyıcı faz) ile yıkanan kolonda adsorbe edilmeyenler
önce, adsorbe edilenler daha sonra ayrılırlar.
Kolon kromatografi, ayırma mekanizmalarına bağlı olarak jel filtrasyon, iyon değişim,
afinite kromatografisi gibi türlere ayrılmaktadır.
İyon değişim kromatografisi protein saflaştırmada en fazla kullanılan kromatografik
yöntemdir. Proteinleri yük özelliklerine göre ayırmak için kullanılan bir yöntemdir.
Proteinler izoelektrik noktalarına (pI) göre farklı pH’taki ortamlarda farklı yükler
kazanırlar. Ortam pH’ı proteinin izoelektrik noktasından büyükse protein negatif yük
kazanırken, ortam pH’ı proteinin izoelektrik noktasından küçükse protein pozitif yük
kazanmaktadır. En sık kullanılan iyon değiştiriciler, anyon değiştirici olarak DEAE,
katyon değiştirici olarak CM grubudur. Kolon içine pH= 7 de pozitif yük taşıyan bir
selüloz türevi olan DEAE-selüloz (dietil aminoetil selüloz) konulduğunda, bu bileşiğe
negatif yük taşıyan proteinler bağlanırken diğer proteinler kolondan çıkmaktadır.
Kolonun içerisine pH=7’de negatif yük taşıyan CM-selüloz (karboksimetil selüloz)
konulduğunda ise, bu bileşiğe de pozitif yük taşıyan proteinler bağlanmakta, diğer
proteinler ise kolon dolgu maddesine bağlanmadan kolondan çıkmaktadır. Daha sonra
kullanılan tamponların iyonik kuvveti değiştirilerek kolon materyaline geçici olarak
bağlanmış olan bu proteinler kolonun dolgu maddesinden ayrılarak kolonu terk etmeye
71
başlarlar. Fraksiyon toplayıcısı ile küçük miktarlar halinde tüplerde toplanan proteinler
asidik ya da bazik özelliğine göre diğer proteinlerden ayrılmış olur. İyon değiştirici
kromatografi aynı zamanda amino asitlerin ve peptitlerin de birbirinden ayrılmasını
sağlamaktadır. Bu tip kromatografi özellikle molekül ağırlıkları birbirine çok yakın
olan molekülleri ayırmak için kullanılmaktadır.
Jel filtrasyon yöntemi kullanım sıklığı açısından iyon değişim kromatografisinden
sonra gelen saflaştırma metodudur. Proteinlerin molekül büyüklüğüne göre ayrılmasını
sağlar. Bu yöntemde proteinlerin birbirinden ayrılması, sabit fazdaki jelin oluşturduğu
gözeneklerin çapına bağlı olarak moleküllerin belirli derecede engellenmesine dayanır.
Proteinlerin kolonda kalma süresi molekül büyüklüğü ile ters orantılıdır. Sabit faz
olarak kullanılan sefadeks, biojel, agaroz gibi dolgu maddeleri kolona doldurulduktan
sonra uygun bir tampon ile yıkanmakta ve kararlı hale getirilmektedir. Daha sonra
protein çözeltisi tampon ile birlikte kolondan geçirildiğinde yer çekimine göre aşağı
doğru hareket eden çözelti içerisinde bulunan küçük protein molekülleri kolon dolgu
maddesinin küçük gözeneklerine girerken, büyük proteinler bu gözeneklere hiç
girmeden kolondan ilk çıkan moleküller halinde ayrılırlar. Jel filtrasyon yöntemi ile
büyük miktarda protein karışımı saflaştırılabilir; ancak ayrılma yavaş gerçekleşir.
Çok kompleks bir karışım içinde bulunan bazı proteinler, afinite kromatografisi
sayesinde tek basamakta oldukça saf halde elde edilirler. Afinite kromatografisi için
polisakkarit yapısındaki agaroz taneciklerine kimyasal bir reaksiyon ile bir enzimin
koenzimi bağlanır. Üzerine koenzim bağlanmış olan agaroz tanecikleri kolon dolgu
maddesi olarak kullanılır. Protein karışımı bu kolona verildiği zaman yalnız
ilgilendiğimiz enzim proteinleri koenzimin serbest ucuna spesifik olarak
bağlanmaktadır. Bu bağlanma, kovalent bir bağlanma değildir. Diğer proteinler,
koenzimin serbest ucuna bağlanma özelliğine sahip olmadıkları için kolondan ayrılırlar.
Daha sonra serbest koenzim içeren çözelti kolona verildiğinde agaroz taneciklerine
bağlı koenzime bağlanmış olan enzim molekülleri bu kez rekabetten dolayı çözelti ile
birlikte gelen serbest koenzime bağlanarak kolondan çıkarlar. Böylece koenzime
spesifik olan enzim proteini, diğer yüzlerce proteinden afinite kromatografisi ile tek
basamakta saflaştırılmış olmaktadır. Bununla birlikte, kullanılan materyallerin maliyeti
72
yüksek ise, çöktürme basamağından sonra afinite kromatografi yerine genellikle iyon
değişim ve jel filtrasyon kromatografileri tercih edilmektedir.
İyon değişim, jel filtrasyon ve afinite kromatografileri dışında protein saflaştırmada
kullanılan diğer kromatografik metotlar, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve
adsorpsiyon kromatografisidir. Hidrofobik etkileşim kromatografisinin enzim
saflaştırmada en sık kullanılan hidrofobik absorbentleri oktil ve fenil fonksiyonel
gruplarıdır. Fungal ve memeli lipazlarının saflaştırılmasında, lipazın glukoprotein yapısı
sebebiyle Konkanavalin A (Con A) ve heparin iyi sonuç vermektedir. Kullanım sıklığı
açısından hidrofobik etkileşim kromatografisinden sonra gelen adsorpsiyon
kromatografisinde, adsorbent olarak çoğunlukla hidroksiapatit kullanılmaktadır (Saxena
et al. 2003).
2.7 Debaryomyces hansenii Mayasından Lipaz Üretimi Debaryomyces (Torulaspora) hansenii yüksek tuz derişimlerine toleranslı bir maya
olduğu için (tuzluluk toleransı %24’e kadar) deniz mayası olarak da bilinen, gıda
endüstrisinde peynir üretiminde ve şarap imalatında kullanılan bir tür mayadır. Üretmiş
olduğu enzimlerin proteolitik ve lipolitik aktivitesi nedeniyle peynir üretiminde -
özellikle peynirin olgunlaştırılması aşamasında- kullanılan bir mikroorganizmadır. D.
hansenii’ye diğer maya türlerinden farklı olarak tüm peynir çeşitlerinde sıklıkla
rastlanmaktadır. D. hansenii’nin düşük sıcaklıklarda tuz varlığında çoğalabilmesi ve
laktik asiti parçalayabilme özelliği süt mamulleri üretimi ve salamuracılıkta kullanımına
imkan sağlamaktadır (http://www.ebi.ac.uk, 2007).
Literatürde Debaryomyces hansenii’den esteraz ve lipaz üretildiğine dair kısıtlı sayıda
çalışmalar yer almaktadır. D. hansenii’den üretilen esterazın izolasyonuna ve kısmi
karakterizasyonuna ilişkin 1995 yılında yayınlanan bir makalede, rokfor peyniri
yüzeyinden izole edilmiş mayadan ekstrakte edilmiş olan esterazın, Q Sepharose
kolonun kullanıldığı bir iyon değişim kromatografisi ve Sephacryl HR S200 kolonunun
kullanıldığı jel filtrasyon ile 224 kat saflaştırıldığı bildirilmektedir. Esteraz enziminin 80
kDa’luk monomerik bir enzim olduğu, tribütirin ve etil bütiratı pH=8 ve T=35oC
73
koşullarında maksimum aktivite ile hidroliz ettiği açıklanmıştır. Tribütirinin enzim
aktivitesine etkisi birkaç metal iyonu ve kimyasal varlığında denenmiştir. Üretilen
esteraz enzimi, kısa zincirli yağ asitlerinden metil ve etil esterlerini (C2-C5) iyi hidroliz
ederken, uzun zincirli yağ asitlerini (C6-C14) kısmen hidroliz ettiği bildirilmektedir.
Enzimin aromatik ve alifatik asetat esterlerini de hidroliz ettiği belirlenmiştir (Besancon
et al. 1995).
Tropikal ortamdan izole edilmiş maya ve maya benzeri türlerin hücre dışı enzim
aktivitelerinin incelendiği başka bir çalışmada, mikroorganizmaların amilaz, esteraz,
lipaz, proteaz, pektinaz, kitinaz ve selülaz aktiviteleri incelenmiştir. Deneyler, enzim
aktivitelerini belirlemek amacıyla mikroorganizmaların, enzimin aktivite göstermesi
için uygun bileşime sahip birbirinden farklı katı ortamlara aşılanmasıyla
gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, petri kaplarında aktivite gösterdiği
gözlenen mikroorganizmalar seçilerek, ürettikleri enzimlerin sıvı ortam koşullarında
farklı pH’lardaki enzim aktiviteleri incelenmiştir. Sonuç olarak 348 maya ve 46 maya
benzeri türün incelendiği çalışmada 18 adet Debaryomyces hansenii türünün katı
ortamda 16’sının lipaz, 4’ünün esteraz aktivitesi gösterdiği açıklanmıştır. Sıvı ortamda
aktiviteye pH etkisinin de incelendiği ve pH=5, 6.5 ve 8 olmak üzere dört pH değerinin
denendiği çalışmada, Debaryomyces hansenii’nin en yüksek esteraz aktivitesini
denenmiş olan iki maya türü için de (Z102, C10) nötral koşullarda (pH=6.5) gösterdiği
bildirilmiştir. pH=8.0’de esteraz enzimi hiç aktivite göstermemektedir (Buzzini and
Martini 2002).
Debaryomyces hansenii’den lipaz üretimine dair başka bir çalışmada, 155 maya ve
maya benzeri türün lipaz üretimine farklı pH ve farklı bileşimdeki ortamların etkisi
incelenmiştir. Üretim ortamı olarak tribütirat ve zeytin yağı olmak üzere iki farklı ortam
kullanılmıştır. Tribütirat içeren ortamda pH=5.5 ve pH=7, zeytin yağı içeren ortamda
ise pH=7 ve 9.5 denenmiş, her iki ortamda da T=27oC’ta çalışılmıştır. İncelenmiş
Debaryomyces cinsine ait sekiz farklı türden dördünün tribütirat içeren pH=5.5
ortamında, üçünün zeytin yağı içeren pH=7 ortamında, ikisinin zeytin yağı içeren
pH=9.5 ortamında, birinin ise tribütirat içeren pH=7 ortamında lipaz aktivitesi
gösterdiği bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara bakılarak farklı mikroorganizmalar
74
içerisinde en aktif türler seçilmiş ve bu türlerin pH=7 ve 27oC’ta zeytin yağının
kullanıldığı sıvı ortamda gösterdiği lipaz aktiviteleri karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak
denenmiş tüm ortam koşullarında Debaryomyces hansenii’nin diğer mikroorganizma
türleri ile karşılaştırıldığında çok düşük miktarlarda lipaz enzimi ürettiği bildirilmiştir
(Paškevičius 2001).
75
3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmada lipaz üretimi için mikrobiyal kaynak olarak süt mamulleri üretim tesisi yağlı
atığından izole edilen ve bir maya türü olan Debaryomyces hansenii kullanılmıştır.
Deneylerde kullanılan kimyasal ve biyokimyasal maddeler EK 1’de verilmiştir.
3.2 Yöntem
3.2.1 Mikroorganizma izolasyonu
Serum fizyolojik ile bir seri seyreltme yapılarak ekim için hazır duruma getirilen süt
mamulleri üretim tesisi yağlı atığından, petri kaplarındaki tribütirin agar (TBA) besi
yerine tek koloni ekim yapılmıştır. TBA besi yeri %0.5 pepton, %0.3 maya özütü, %1
tribütirin, %1.5 agar ve %1 glukoz içermektedir. Tribütirin agar gibi yağlı bir ortamda
çoğalan mikroorganizmaların lipaz üretme potansiyeline sahip olacağı düşünülmüştür.
Tribütirin agarda mayalarla birlikte bakteriler de çoğalabilmektedir. Çalışmada, sadece
mayaların çoğalması istenildiği için ortama ayrıca bakteri oluşumunu engelleyen
penisilin katılmıştır. Bunun için sterilize suda çözülen 1.000.000 IU’lık Penicillin G
kristalize potasyum besi yerine eklenmiş, daha sonra petri kaplarına paylaştırılan
penisilinli TBA’a yağlı atık örneğinden tek koloni ekimi yapılmıştır. Ekimin ardından
mikroorganizmaların çoğalması için petri kapları beş gün süreyle 30°C’ta inkübasyona
bırakılmışlardır. İnkübasyondan sonra çoğalan mikroorganizmalara basit boyama
yapılarak maya morfolojisi gözlenmiştir. Tek koloni ekiminin yapıldığı ortamdan
penisilin içeren başka bir petri kabına yayma yöntemiyle de ekim yapılarak zon
oluşumu gözlenmiştir. Tribütirin bir yağ asidi esteri olup ortamda şeffaf bir zon
gözlenmesi, mikroorganizmanın tribütirini kullandığını göstermektedir Bunun yanı sıra
paralel ekimin yapıldığı petri kaplarından birindeki büyük ve küçük kolonilerden iki
petri kabına daha ekim yapılarak 30oC’ta inkübasyona bırakılmıştır. Bu petri kaplarında
beşinci gün zon gözlenmiş; ancak mikroorganizmaların çoğalması için birkaç gün daha
76
beklenilmiştir. Bu arada büyük ve küçük koloniler için basit boyama yapılarak
morfolojiler arasında bir fark olup olmadığına bakılmıştır. Sonuç olarak atık örneğinin
tek tip maya içerdiğine karar verilmiştir. Zon oluşumu gözlendikten iki gün sonra
mikroorganizmalar çoğalmış ve penisilinsiz tribütirin agar içeren iki eğik tüpe ekim
yapılmıştır. Tüplere yapılan ekimin ertesi günü mayaların çoğaldığı gözlenmiştir.
Bundan sonra mikroorganizma belli zamanlarda tüpten tüpe ekim ile muhafaza
edilmiştir (stok tazeleme). İzolasyon çalışmaları Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi
Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuarı’nda yapılmıştır.
3.2.2 Mikroorganizma tür tayini
Mikroorganizma öncelikle morfolojik olarak tanımlanmış, sonrasında genetik çalışma
ile tür tayini yapılmıştır.
3.2.2.1 Mikroorganizmanın morfolojik tanımlaması
Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen mikroorganizmanın tür tayini
için mikroskop altındaki görüntüleri incelenmiştir. Morfolojik yapı, hem faz kontrast
mikroskobu hem de ışık mikroskobu altında gözlenmiştir. Faz kontrast mikroskobunda
mikroorganizmanın boyanmasına gerek yoktur ve hücre iç yapısı gözlenebilmektedir.
Faz kontrast mikroskobu kullanılarak morfolojik yapı aydınlatma çalışmaları Ankara
Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü laboratuarlarında
yapılmıştır. Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altında gözlenebilmesi için ise basit
boyama yapılmıştır. Basit boyama için, bir öze dolusu mikroorganizma iki damla çeşme
suyu ile seyreltilerek lam üzerine yayılmış, hava akımında kurutulmuş, alevle fikse
edilmiş, daha sonra üzerine bir damla kristal viyole damlatılarak bir dakika
beklenmiştir. Boya çeşme suyu ile uzaklaştırıldıktan sonra mikroorganizma ışık
mikroskobu altında görüntülenmeye hazır hale gelmiştir. Basit boyama ve ışık
mikroskobu kullanılarak morfolojik yapı aydınlatma çalışmaları Ankara Üniversitesi
Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuarı’nda yapılmıştır.
77
3.2.2.2. Mikroorganizmanın genetik tanımlaması
Çalışmada mikroorganizmanın tür tanımlaması için 5.8S rRNA ve 26S rRNA analizleri
yapılmıştır. Ökaryotlarda 5.8S rRNA ve 26S rRNA genleri kromozomda çok iyi
korunan bölgelerdir. Bununla birlikte, türden türe farklılık gösteren dizinler de
içermektedirler. Türe özgü olan bu karakteristik dizinlerin tanımlanması,
mikroorganizmanın türünün belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Çalışılan
mikroorganizmanın tür tayini için uygulanan yöntemler; kullanılacak primerlerin
saptanması, DNA izolasyonu, PCR ve sekans analizlerini kapsamaktadır.
i) Primerlerin saptanması
5.8S rRNA ve 26S rRNA dizilerini PCR yöntemiyle çoğaltabilmek amacıyla öncelikle
her bölge için uygun primerler belirlenmiştir. Bu amaçla yapılan literatür araştırması
sonucunda 5.8S rRNA için seçilen primerler: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’
(F1), 5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’ (R1) (Fernàndez-Espinar et al. 2000);
26S rRNA için seçilen primerler: 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’
(F2), 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’ (R2) (Takashi et al. 2002) şeklindedir.
ii) DNA izolasyonu
DNA izolasyonu için NucleoSpin Tissue (Macherey Nagel) DNA izolasyon kiti
kullanılmıştır. İzolasyon yapılırken kitin kullanım kılavuzunda yer alan protokol
izlenmiştir. DNA izolasyonunda izlenen protokolün içeriğinde yer alan basamaklar
aşağıda verilmiştir :
DNA izolasyonu için örnekler hazırlanırken 3 ml’lik üretim ortamı 10 dk 5000 g’de
santrifüjlenir, çöken hücre 1 ml 10 mM EDTA (pH=8) çözeltisi ile yıkanır. Üst faz
atılarak hücreler santrifüjle yeniden çöktürülür. Ön-liziz işlemi için, pellet 600 µl
sorbitol çözeltisi içinde çözülür (1.2 M sorbitol çözeltisi; 10 mM CaCl2; 0.1 M Tris-
HCl, pH=7.5; 35 mM β-merkaptoetanol). Liziz için 100 µl 50 U litikaz veya zimolaz
enzimi eklenir ve örnek 30oC’ta 30 dk inkübe edilir. Bu basamakta amaç maya hücre
78
duvarının parçalanmasını sağlamaktır. Bu esnada sferoplast oluşumu (hücre duvarının
parçalanarak stoplazmik zara yapışması) mikroskopla kontrol edilebilir. Karışım 10 dk
2000 g’de santrifüjlenerek üst faz atılır. Pellet halindeki sferoplastlar kite ait 180 µl liziz
tamponunda (Buffer T1) çözülür. 25 µl Proteinaz K çözeltisi (20 mg/ml) eklenen
karışım kuvvetlice vortekslenir. Örnek ön-liziz tamamlanana kadar 56oC’ta en az 1-3
saat inkübe edilir. İnkübasyon boyunca ara ara vortekslenir ya da çalkalamalı su
banyosu kullanılır. Liziz işlemi için örnekler vortekslenir ve üzerlerine 200 µl kite ait
B3 tamponu eklenir (Buffer B1 + Buffer B2 = Buffer B3). Örnekler vortekslendikten
sonra 70oC’ta 10 dk inkübe edilir, sonrasında örnekler yavaşça tekrar vortekslenir. Bu
aşamadan sonra DNA’nın membrana bağlanma koşulları ayarlanır. Bu amaçla örneklere
210 µl etanol eklenerek (%96-100) vortekslenir. DNA’nın silika membrana bağlanması
basamağında, her örnek için bir NucleoSpin Tissue kolonu, 2 ml’lik toplama tüplerine
yerleştirilir. Örnek kolona yüklenir. 11000 g’de 1 dk santrifüj edilir. Toplama tüpündeki
sıvını tamamı atılır ve kolon boş toplama tüpüne geri yerleştirilir. Eğer örnek tam
çökmemişse, yani membran üstünde hala sıvı varsa, santrifüj basamağı tekrarlanır.
Bundan sonraki basamak silika membranın yıkanmasıdır. İki yıkama yapılır. Birinci
yıkamada kolona, kite ait BW tamponundan 500 µl (yıkama tamponu) eklenir. 11000
g’de 1 dk santrifüj edilir. Toplama tüpündeki sıvı atılarak kolon, toplama tüpüne geri
yerleştirilir. İkinci yıkamada kolona, kite ait B5 tamponundan (derişik yıkama tamponu)
600 µl eklenip 11000 g’de 1 dk santrifüj edilir. Toplama tüpündeki sıvı atılarak kolon,
toplama tüpüne geri yerleştirilir. Silika membranın kurutulması için ise kolon 11000
g’de 1 dk santrifüj edilir. Bu basamakta kalan etanol uzaklaştırılır. Son olarak yüksek
saflıkta DNA izolatı için, NucleoSpin Tissue kolon tüpleri 1.5 ml’lik temiz
mikrosantrifüj tüplerine konulur. Üzerlerine 100 µl ısıtılmış (70oC) kite ait elüsyon
tamponu (B5) eklenir. Oda sıcaklığında 1 dk inkübe edilir. 11000 g’de 1 dk
santrifüjlenir. Santrifüj sonrası kolon tüpler atılır. 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerindeki
saf DNA, PCR işlemi için saklanır. DNA izolasyonu Ankara Üniversitesi Mühendislik
Fakültesi Gıda Mühendisliği laboratuarlarında yapılmıştır.
79
iii) PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu)
DNA izolasyonunun ardından; PCR, PCR pürifikasyonu, DNA dizi analizi, dizileme
reaksiyonları için etanol/EDTA/sodyum asetat çöktürmesi ve sekans analizleri Ankara
Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuarı Genombilim Birimi’nde
yapılmıştır.
Öncelikle izole edilmiş DNA’nın derişimi ve saflığı NanoDrop (ND-1000
Spectrophotometer) cihazında spektrofotometrik olarak incelenmiştir. 260 ve 280 nm
dalga boylarında ölçülen absorbans değerleri birbirine oranlandığında bulunacak
değerin (A260/280) 2’ye yakın olması istenmektedir. 1.7’den düşük değerlerde DNA
izolasyon işlemi tekrarlanmalıdır; çünkü çözelti içindeki fazla miktarda protein PCR
verimini azaltmaktadır. Daha sonra DNA, RNA kontaminasyonu olup olmadığını
gözlemek amacıyla %1’lik agaroz jelde yürütülmüştür (Sky-Plus Electrophoresis; 120
V, 5-10 dakika). Önceden sipariş edilen primerler (F1, R1, F2, R2) sulandırılarak PCR
için hazırlık yapılmıştır. Optimizasyon aşamasında MgCl2’nin (Taq polimeraz
aktivatörü) farklı derişimleri (1, 1.5, 2 mM) ve farklı sıcaklıkların (50, 55, 60oC)
denenmesine karar verilmiştir.
İncelenecek gen bölgesi, DNA polimeraz enzimi kullanılarak PCR uygulamaları ile in
vitro ortamda çok sayıda kopyalanabilmektedir. PCR ile spesifik DNA dizileri
laboratuar ortamında, primer adı verilen oligonükleotid diziler yardımıyla
çoğaltılmaktadır. Reaksiyon; saf DNA, DNA polimeraz, oligonükleotid primerler ve
enzimin kopyalama işleminde kullanacağı serbest deoksiribonükleotid trifosfatlar
(dNTP : dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ile gerçekleştirilir. Polimeraz zincir reaksiyonunun
bileşenleri EK 2’de verilmiştir. Kopyalama işlemi DNA’nın 94-95oC’a kadar
ısıtılmasıyla başlamaktadır. Bu sıcaklıkta kalıp DNA’nın her iki sarmalı birbirinden
ayrılmakta (denatürasyon-ayrılma) ve primerlerin iki sarmal arasına girebilmesi
sağlanmaktadır. Sıcaklık aniden düşürülerek, çoğaltılacak kalıbın belli dizilerine
komplementer (tamamlayıcı) olarak tasarlanmış primerlerin hedef bölgeleri tanıması
(bağlanma-annealing) sağlanır. Kullanılacak bağlanma sıcaklığı, primerlerin Tm
değerlerinin (çift iplikli nükleik asit moleküllerinde baz çiftlerinin yarısının ortadan
80
kalkmasına yol açan sıcaklık) 2-4oC altında bir sıcaklık değeridir. Ortamda polimeraz
varlığında 70-75oC’ta her iki primer, 5’ uçlarından 3’uçlarına doğru uzatılmaktadır
(uzama-extension). Bu üç basamağın defalarca tekrarlanması sonrasında her bir döngü
sonunda kalıp DNA iki katına çıkar. Bu basamaklar 30-40 kez tekrarlanırsa kalıp DNA
teorik olarak 230-240 kez çoğaltılmış olur. Böylece incelenecek bölgenin milyarlarca kez
çoğaltılmasıyla PCR ürününün (amplikon) kolay analiz edilmesi olanaklı hale gelir.
Yüksek sıcaklığa dayanıklı DNA polimerazların (Taq polimeraz ve benzerleri)
bakterilerden elde edilmesi sayesinde her döngüde reaksiyona tekrar enzim eklenmesi
gerekliliği ortadan kalkmış ve tüm basamaklar ısı döngü aygıtları (thermal cycler)
yardımıyla kolaylıkla yapılabilir hale gelmiştir. Çalışmada 29 döngü kullanılarak kalıp
DNA’nın denatürasyonu 95oC, primerlerin uzaması 72oC’ta gerçekleştirilmiştir. PCR
için uygun bağlanma sıcaklığını belirlemek için 50, 55, 60oC olmak üzere üç farklı
sıcaklık denenmiştir. PCR işlemi için Bio-Rad DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal
Cycler (Gradient Cycler) PCR cihazı kullanılmıştır.
PCR’ın ardından jel elektroforez yapılarak sekans için en iyi koşullar belirlenmeye
çalışılmıştır. Bu amaçla %2’lik agaroz jel kullanılmıştır. Sekans analizleri için uygun
koşullar belirlendikten sonra, PCR pürifikasyon ve DNA dizi analiz protokolleri
izlenmiştir. PCR pürifikasyonu; primer artıkları, enzim ve fazla dNTP’yi ortamdan
uzaklaştırarak DNA’nın istenilen bölgesini saf olarak elde etmek amacıyla
yapılmaktadır. DNA dizi analiz protokolünde ise sekans cihazında çift iplik
okunamadığı için tek primer (F veya R) kullanılarak sekans PCR’ı yapılmaktadır.
Sonrasında dizileme reaksiyonları için etanol çöktürmesi yapılıp sekans analizlerine
geçilmiştir. Sekans analizleri için kapiler sistem otomatik sekans cihazı (CEQ 8000,
Beckman Coulter Genetic Analysis System) kullanılmıştır. Sekans analiz cihazı
sonuçları kromatogram şeklinde baz dizilimlerini vermektedir. Bu baz dizilimleri
“National Center for Biotechnology Information”in web sayfasındaki BLAST programı
(blastn) kullanılarak (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) gen bankası veri tabanıyla
karşılaştırılmıştır.
81
3.2.3 Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamlarının hazırlanışı
Mikroorganizmadan lipaz üretiminde öncelikle petri kaplarında çoğaltılan saf
mikroorganizma, agar içeren eğik tüplere aktarılmış, belli sürelerle tüpten tüpe
ekimlerle stok tazeleme yapılmış, sonra mikroorganizma katı agar içeren tüplerden sıvı
ön çoğalma ortamına, ön çoğalma ortamından da 1/10 aşılama oranı ile daha büyük
hacimli lipaz üretim ortamına aktarılmıştır.
3.2.3.1 Agar ortamı
Kültürlerin uzun süre saklanması için katı besi yerleri kullanılır ve sıvı besi yerlerine
katılaştırıcı madde ilavesi ile hazırlanır. Katılaştırıcı madde olarak agar
kullanılmaktadır. Agar 90-95oC’ta eriyip 40-42oC’ta yeniden katılaşan, deniz
yosunlarından elde edilen bir maddedir. Mikroorganizmaların çoğalmada kullanacağı
besi yeri olarak yağlı bir ortam olan TBA seçilmiştir. Tribütirin agar ortamı %0.5
pepton, %0.3 maya özütü, %1 tribütirin, %1.5 agar ve %1 glukozdan oluşmaktadır.
Hazırlanan katı ortam 121oC’ta 20 dakika sterilizasyonun ardından (ALP CL-40M
Sterilizatör) laminer akış kabininde (Biolab Faster BHG 2004-S) tüplere paylaştırılarak
tüpler eğik duracak şekilde agarın donması beklenmiştir. Tüplerin eğik oluşunun sebebi
mikroorganizmanın çoğalacağı yüzey alanını artırmaktır. Sonra tüplerdeki katı ortama
laminer akış kabininde steril koşullara dikkat edilerek ekim yapılmış ve
mikroorganizma 30oC’ta t=24 saat inkübasyona bırakılmıştır (Shel Lab S16R-2
İnkübatör).
3.2.3.2 Ön çoğalma ortamı Mikroorganizmaların fazla miktarlarda üretimi için fermantasyon çalışmalarında sıvı
besi yerleri kullanılır. Ön çoğalma ortamı, mikroorganizmanın lipaz üretim ortamına
aktarılmadan önce çoğaltıldığı sıvı ortamdır. Bu çalışmada, ön çoğalma ortamı katı besi
yeri ile aynı bileşimdedir. Sadece agar içermemektedir ve katı besi yeri damıtık su ile
hazırlanırken ön çoğalma ortamının hazırlanışında tampon kullanılmıştır. Çalışmalarda
82
tampon olarak geniş bir pH aralığını kapsayan (yaklaşık 2.6-7.6). 0.1 M sitrik asit
monohidrat-0.2 M Na2HPO4 tamponu kullanılmıştır. Deterjan katkısı olarak lipaz
üretiminin incelendiği bu çalışmada, sitrik asit tamponunun kullanılmasının bir sebebi
de sodyum sitratların deterjan endüstrisinde sıklıkla kullanılışıdır. Ön çoğalma
ortamının pH’ı üretim ortamının pH’ı ile aynıdır. Ön çoğalma ortamı T=30oC’ta,
N=150 rpm koşullarında t=24 saat çalkalamalı hava banyosunda (Edmund Bühler SM-
30 İnkübatör; Shel Lab S16R-2 İnkübatör) inkübe edilmiştir. t=24. saatte 10 ml’lik ön
çoğalma ortamlarında yeteri kadar çoğalmış hücreler, lipaz üretim ortamlarına steril
koşullarda 1/10 oranında aktarılmıştır.
3.2.3.3 Lipaz üretim ortamı
Lipaz üretim ortamı, mikroorganizmanın çoğalırken lipaz ürettiği ortamdır. Bu ortam
mikroorganizma için uygun karbon, azot kaynaklarını ve iyonları içermektedir. Üretim
ortamının bileşimi ve sıcaklık, pH gibi enzim üretim koşulları, incelenmek istenen
parametre olarak değişmektedir.
3.2.4 Hücre parçalama
Mikroorganizma, ürettiği lipazı hücre dışına da salgılayabilir (hücre dışı lipaz) veya
hücre içinde de tutabilir (hücre içi lipaz). Eğer hücre içi lipaz ile ilgileniliyorsa lipaza
ulaşabilmek için mikroorganizmanın hücre duvarının parçalanması gerekir. Hücre
duvarını parçalamak için kimyasal, fiziksel ve enzimatik olmak üzere farklı yöntemler
mevcuttur. Çalışmada, hücre parçalamada kullanılan fiziksel yöntemlerden biri olan
cam boncuklarla hücre parçalama yöntemi uygulanmıştır. Cam boncuklarla hücrenin
tam olarak parçalanıp parçalanmadığını anlamak amacıyla parçalama sonrası hücreler
mikroskop altında incelenmiştir. Cam boncukla parçalandığı düşünülen hücrelere,
metilen mavisi ile basit boyama yapılarak mikroorganizmanın mikroskop (OLYMPUS
CX21FS1) altındaki görüntüsü incelenmiş ve mikroorganizmanın hücre bütünlüğünün
bozulduğu gözlenmiştir. Cam boncukla hücre parçalama işleminde öncelikle 12000
g’de (10000 rpm) 4oC’ta 10 dk süreyle santrifüj edilerek çöktürülen hücre, 10 mM Tris-
83
HCl tamponu (pH=8) ile en az iki kez yıkanmıştır. Her yıkama, hücre çöktürülüp sıvı
kısım atılarak gerçekleştirilmiştir. En son hücre 1.5 ml Tris-HCl tamponunda çözünmüş
ve parçalayıcı cihaza ait konik dipli tüpe alınıp üzerine tüp dolana kadar cam boncuklar
ilave edildikten sonra 30 s’lik 8 periyotta parçalanmıştır. Cihaz (Mini-Beadbeater
Biospec Products), 42000 rpm’de çalıştırılmıştır. Parçalayıcı cihazdan alınan tüpler
açığa çıkan ısı nedeniyle enzim aktivitesinin etkilenmemesi için buzda bekletilmiştir.
Parçalanan hücre, 12000 g’de (10000 rpm) 4oC’ta 10 dk süreyle santrifüj edilerek
çöktürülmüş ve böylece üst faz hücre kalıntılarından arındırılarak analize hazır hale
getirilmiştir.
3.2.5 Lipaz saflaştırması
Lipaz enzimi saflaştırılmasında kullanmak üzere 200 ml toplam hacimli (her biri 100’er
ml olmak üzere 250 ml’lik iki erlende), %1 Triton X-100, %0.5 pepton ve %0.3 maya
özütü içeren ortamda (pH=4.5, T=30oC) lipaz üretimi gerçekleştirilmiş; üretim ortamı
en yüksek lipolitik aktivitenin gözlendiği 48. saatte 12000 g’de (10000 rpm) 4oC’ta 20
dk santrifüj edilerek hücrelerden arındırılmıştır. Hücrelerden arındırılmış ortam,
Amicon Ultra 15 (Millipore) ultrafiltrasyon tüpleri kullanılarak 4oC’ta, 4000 g’de (6000
rpm) 40 dakika süreyle santrifüj edilerek 5 kDa molekül ağırlığının altındaki
moleküllerin ortamdan uzaklaşması sağlanmıştır. Santrifüjden sonra filtrenin üzerinde
kalan yüksek molekül ağırlıklı proteinleri içeren kısımlar ise bir sonraki saflaştırma
basamağı için toplanmıştır.
Bir sonraki saflaştırma basamağı kromatografik yöntemle ayırmadır. Çalışmada
saflaştırma amacıyla, proteinlerin izoelektrik noktalarına göre farklı yüklenmeleri
özelliği ile ayırmanın sağlandığı anyon değişim kromatografisi seçilmiştir. Bu amaçla
Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuarı Proteombilim
Birimindeki Bio-Rad Duo Flow Anyon Değişim Kromatografi Cihazı ve Bio-Rad Uno
Q1 kolon kullanılmıştır. 1 ml örnek, 1 ml/dk akış hızı ile kolona yüklenmiştir.
Anyon değişim kromatografisinde Tampon A ve Tampon B olarak isimlendirilen iki
ayrı tampon kullanılmıştır. Tampon A, pH=8.3 olan 20 mM Tris-HCl tamponudur.
84
Tampon B ise pH=8.3 olan 20 mM Tris-HCl + 1 M NaCl tamponudur. Tampon A ve
Tampon B kromatografik ayırma esnasında belli oranlarda karıştırılarak bir tuz derişim
gradyeni oluşturulur. Sürekli artan tuz derişim gradyeninin oluşturulmasındaki amaç,
kolona tutunmuş proteinlerin kademeli olarak fraksiyonlar şeklinde kolondan
ayrılmasını sağlamaktır. Tampon B’deki Cl- iyonları, kolona tutunmuş (-) yüklü
iyonların yerini almakta ve böylece negatif yüklü proteinlerin kolondan ayrılması
sağlanmaktadır. Saflaştırma işleminde öncelikle, A tamponu ile birlikte kolondan
geçirilen örnek içerisindeki, (+) yüklendiği için (+) kolona tutunamayan proteinler (pI >
pH=8.3) gradyen oluşturulmadan önce fraksiyonlar halinde toplanmıştır. Gradyen
oluşturulduktan sonra ise pI < pH=8.3 olan (-) yüklenmiş proteinler (+) kolona
tutunarak ayırma sağlanmıştır. Fraksiyonların toplanması için Bio-Rad Fraction
Collector kullanılmıştır. Toplanan her bir fraksiyonun hacmi 0.4 ml’dir.
3.2.6 TCA çöktürmesi
Kromatografik yöntemle ayrılan proteinlerin SDS-PAGE analizlerinin yapılabilmesi
için -örneklerin protein derişimlerinin düşük olması nedeniyle- proteinleri deriştirmek
amacıyla TCA çöktürmesi yapılmıştır. Bu amaçla 1 ml örnek üzerine 100 µl %100 TCA
konulmuş, 15 s vortekslenen örnekler 15 dk buzda bekletilmiştir. 10 dk 4oC’da 14000
rpm’de santrifüj edilen örneklerin üstte kalan sıvısı atılarak proteinler pellet halinde
çöktürülmüştür. Pelleti yıkamak amacıyla üzerine 500 µl %100 soğuk aseton
konulmuştur. 10-15 s vortekslemenin ardından 14000 rpm’de 5 dk santrifüj edilen
örneklerdeki proteinler çökelti halinde elde edilmiştir. TCA çöktürmesi Biyoteknoloji
Enstitüsü Merkez Laboratuarı Proteombilim Birimi’nde yapılmıştır.
3.2.7 SDS-PAGE yöntemi
Saflaştırma basamaklarının ardından elde edilen enzimin saflığını göstermek ve
mikroorganizmanın ürettiği proteinlerin molekül ağırlıklarını yaklaşık olarak belirlemek
amacıyla SDS-PAGE analizleri yapılmıştır.
85
SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez), yüklü
moleküllerin elektrik alan altındaki (+/-) farklı davranışlarından yararlanarak yapılan bir
ayırma işlemidir. Protein analizlerinde matriks olarak poliakrilamit jel kullanılır.
Proteinler, molekül ağırlıklarına ve yüklerine göre elektriksel alanda farklı uzaklıklara
hareket ederler. SDS-PAGE denature edici ajan olarak SDS’in (sodyum dodesil sülfat)
kullanıldığı bir ayırma yöntemidir. SDS-PAGE’de örnek proteinler SDS ve
merkaptoetanol ile birlikte kaynatılarak denatüre edilir. Böylece protein molekülü
primer forma dönüşür. Merkaptaetanol proteinin üç boyutlu yapısındaki disülfit
bağlarını koparır, (-) yüklü SDS, proteinlerin kuaterner, tersiyer ve sekonder yapılarını
bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır. Tüm
proteinler SDS nedeniyle (-) yüklendiği için SDS-PAGE’de ayırma sadece proteinin
molekül ağırlığına göre olur. Elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi molekül
ağırlıklarına bağlıdır. Daha küçük olanlar, daha hızlı yürür (Laemmli 1970).
SDS-PAGE dikey tipte bir elektroforez şeklidir. Poliakrilamit jel, akrilamit ve bis-
akrilamit monomerlerinin çapraz bağlanması ile oluşur. Polimerizasyon için katalizör
olarak TEMED (Tetra Etil Metilen Diamin) kullanılır. TEMED polimerizasyonu
başlattığı için karışıma en son eklenir. Katalizörün işlev görmesi için gerekli sülfat,
serbest radikal kaynağı olan amonyum persülfattan (APS) sağlanır. Tampon olarak Tris-
HCl tamponu kullanılır. Sürekli jellerde ayırma için tek tip jel kullanılırken, sürekli
olmayan jellerde ayırma jeli (running gel/separating gel) ve yığma jeli (stacking gel)
olmak üzere iki tip jel kullanılır. Yığma jeli tamponu ile ayırma jeli tamponlarının
pH’ları farklıdır. Yığma jeli tamponunun pH’ı daha düşüktür. Bunun nedeni
proteinlerin kazandıkları (+) yük ile daha yavaş hareket etmelerini sağlayarak
başlangıçta bir ayırma sağlamaktadır. Ayırma jeline farklı zamanlarda ulaşan proteinler
bu jelde daha hızlı hareket ederler ve ayırma daha iyi sağlanır. Proteinlerin farklı
jellerdeki koşma hızları sadece tampon pH’ı ile ilgili değildir. Ayırma jeli genellikle
%10-12’lik, yığma jeli ise %4-6’lıktır. Yüzde artıkça gözenek çapı azalır, protein daha
hızlı hareket eder. Jelde yürütülmüş proteinlerin molekül ağırlığını tayin etmede, jele
örneklerle birlikte yüklenen, molekül ağırlıkları bilinen proteinleri içeren standartlar
(marker) kullanılır. Jelin boyanması için farklı boyalar (Coomassie Brillant Blue, Sypro
86
Ruby, Sypro Orange, gümüş boya vb) kullanılabilir (http://yunus.hacettepe.edu.tr,
2007). SDS-PAGE için kullanılan aparatların şematik gösterimi Şekil 3.2’de verilmiştir.
Çalışmada, yürütme jeli için %10’luk, yığma jeli için %4’lük akrilamit jel
hazırlanmıştır. İndirgeme ajanı (reducing agent) ve yükleme tamponundan (loading
buffer) oluşan Laemmli tamponunda çözünen örnekler her kuyucuğa 25’er µl
yüklenmiştir. Bu karışım denatüre edici kimyasal ve izleme boyası içermektedir.
Protein bantlarının gözlemesi için Bio-Rad Silver Stain Plus gümüş boyama kitinin
gümüş boyama metodu kullanılmıştır. Gümüş boyama yönteminin duyarlılığı
Coomassie Blue’ya göre 100 kat fazladır. Boyama için, elektroforez sonrasında jel,
fiksasyon çözeltisine (fixative enhancer solution; %10 fixative enhancer concentrate,
%50 metanol, %10 asetik asit, %30 bidistile su) konulmuş ve 20 dk fiksasyon
çözeltisinde çalkalanmıştır. Sonra 10 dk bidistile suda, 10 dk bitiminde suyu
değiştirilerek 20 dk tekrar bidistile suda tutulmuştur. Daha sonra jel, gümüş boyama
çözeltisine (%35 bidistile su, %5 Silver Complex Solution (SCS), %5 Reduction
Moderator Solution (RMS), %5 Image Development Reagent (IDR) ve kullanmadan
hemen önce eklenen %50 Development Accelerator Reagent) alınmış ve 20 dk boya
çözeltisinde hafifçe çalkalanarak bekletilmiştir. 15 dk sonunda bantların görünmesi
beklenmektedir; ancak bu süre daha kısa sürmüştür. %5’lik asetik asit çözeltisi ile
boyama işlemi durdurulmuştur. Jel asetik asit çözeltisinde en az 15 dk bekletilmiştir. En
son jel yıkama amacıyla 5 dk bidistile suda tutulmuştur.
87
Şekil 3.1 SDS-PAGE aparatlarının şematik olarak gösterimi
3.3 Analizler
Çalışmada yapılan analizler; spektrofotometrik ve titrimetrik olmak üzere iki ayrı
yöntemle lipolitik aktivite tayini, proteaz aktivitesi tayini, hücre ve protein
derişimlerinin belirlenmesidir. Aktivite ve protein derişimleri yardımıyla spesifik
aktivite, zamana karşı hücre derişim değerlerinden yararlanılarak da mikroorganizma
özgül çoğalma hızları hesaplanmıştır.
3.3.1 Spektrofotometrik yöntemle lipaz aktivitesi Tüm üretimlerde lipaz aktivitesi spektrofotometrik olarak belirlenmiştir.
Spektrofotometrik olarak lipaz aktivitesi tayin edilirken, p-nitrofenil palmitatın (PNFP)
enzimatik hidrolizi sonucu oluşan p-nitrofenolün (PNF) absorbansta yarattığı
değişiklikten yararlanılmıştır. Lipaz üretim ortamı 12000 g’de (10000 rpm) 4oC’ta 10
Cam levhalar Boşluk yapıcı
Negatif Elektrot
Pozitif Elektrot
Yürütme Jeli kuyucuklar
Tampon
Örneklerin yüklendiği kuyucuklar
Ayırma Jeli Büyük MA’lı Proteinler Küçük MA’lı Proteinler
Tampon
88
dk santrifüjlenerek (Hettich Zentrifugen Rotina 35R) hücre çöktürülmüş, üstte kalan
sıvıdan 1 ml alınarak 1 ml PNFP çözeltisi (etanol ile hazırlanmış; %0.5 a/h) ile oda
sıcaklığında 5 dk süreyle karıştırılarak hidroliz tepkimesi gerçekleştirilmiştir. Tepkime
2 ml 0.5 N Na2CO3 çözeltisi ile sonlandırılmıştır. Karışım 12000 g’de (10000 rpm), oda
sıcaklığında 10 dk santrifüj edilmiş ve üstteki sıvının λ=404 nm’de spektrofotometrik
okuması yapılmıştır. Bu yöntemle tanımlanan 1 Ünite (U) lipaz aktivitesi, bir dakikada
1 µmol PNF açığa çıkarmak için gerekli enzim miktarıdır. (Hung et al. 2003). Aktivite
tayini için örnek hesaplama EK 3’te verilmiştir.
3.3.2 Titrimetrik yöntemle lipaz aktivitesi
Çalışmada titrimetrik olarak lipaz aktivitesi tayini, sadece en iyi koşullarda enzim
üretimi yapılırken kullanılmıştır. Titrimetrik olarak lipaz aktivitesi belirlenirken substrat
olarak zeytin yağı kullanılmıştır. Küçük bir cam balona konulan 500 µl zeytin yağı, 2.5
ml 0.1 M pH=7.2 fosfat tamponu ve 100 µl hücresi çöktürülmüş lipaz üretim ortamı, su
banyosunda 37oC’ta 30 dk karıştırılmıştır. Reaksiyon etanol/aseton karışımından (h/h)
(1:1) 2.5 ml eklenerek sonlandırılmıştır. Karışım indikatör olarak 2 damla fenolftalein
eklenerek 0.1 N NaOH ile titre edilmiştir. Enzim aktivitesi harcanan NaOH miktarından
yola çıkılarak hesaplanmıştır. Bu yöntemle tanımlanan 1 Ünite (U) lipaz aktivitesi, bir
dakikada 1 µmol yağ asidi açığa çıkaran enzim miktarıdır (Cernia et al. 2002, Wei et al.
2004). Aktivite tayini için örnek hesaplama EK 4’te verilmiştir.
3.3.3 Proteaz aktivitesi
Proteaz aktivitesi, substrat olarak kazein kullanılarak enzimatik hidroliz sonucunda açığa
çıkan hidrolizat absorbansının, spektrofotometrik olarak ölçülmesiyle belirlenmiştir. Bu
amaçla %0.037 EDTA (a/h), %0.5 kazein (a/h) içeren, pH=10 borat tamponu ile
hazırlanan çözeltiden 2 ml alınarak hücresi çöktürülmüş 1 ml lipaz üretim ortamı ile 100
rpm’de, 37oC’ta 20 dk süreyle bir reaksiyon gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon 2 ml %10
TCA (a/h) ile durdurulmuştur. 15 dakika buzda bekletilen karışım 12000 g’de (10000
rpm), 4oC’ta 10 dk santrifüjlenerek üstte kalan sıvının λ=275 nm’de spektrofotometrik
89
okuması yapılmıştır. Bu yöntemle tanımlanan 1 Ünite (U) proteaz aktivitesi, bir dakikada
4 nmol tirozin açığa çıkaran enzim miktarıdır (Moon and Parulekar 1991). Çalışmada
kullanılan kalibrasyon grafiği EK 5, örnek aktivite hesabı EK 6 ile verilmiştir.
3.3.4 Hücre derişimi
Hücre derişimleri λ=600 nm’de spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. Bu amaçla
öncelikle kuru hücre kalibrasyon doğrusu oluşturulmuş ve bu doğrudan yararlanılarak
lipaz üretim ortamından alınmış örneklerin λ=600 nm’de absorbansları okunarak hücre
derişimleri hesaplanmıştır. Okunan absorbansların 1.00 değerini geçmesi durumunda
örnekler belli oranlarda seyreltilmiştir (%90, %99 vb). Kalibrasyon doğrusu
oluşturulurken, öncelikle lipaz üretim ortamında çoğaltılmış hücreler 12000 g’de (10000
rpm), 4°C’ta 10 dakika süreyle santrifüj edilmiş, üstteki sıvı dökülmüş, çökelek bir
miktar damıtık suda çözündükten sonra aynı koşullarda yeniden santrifüj edilmiştir.
Santrifüj işlemine çökeleğin üzerindeki sıvı berraklaşana kadar devam edilmiştir. İki kez
santrifüj yeterli olmuştur. Saf suyla yıkama işleminin ardından tüplerin dibindeki çökelek
halindeki hücreler bir petri kabının üzerine alınıp, hücrelerin kuruması için etüvde
45°C’ta yaklaşık 1 gün bekletilmiştir. Kuru hücreden 1 mg/ml’lik stok çözelti
hazırlanmış, stok çözelti seyreltilerek farklı derişimde hücre süspansiyonları
oluşturulmuştur. Kalibrasyon doğrusu, farklı derişimlerdeki kuru hücre
süspansiyonlarının UV spektrofotometrede 600 nm’de absorbansları okunarak
oluşturulmuştur. Çalışmada kullanılan kalibrasyon grafiği EK 7’de verilmiştir.
3.3.5 Protein derişimi
Protein derişimlerinin belirlenmesi için Bradford yönteminden yararlanılmıştır (Bradford
1976). Oldukça hassas olan bu yöntem (5-100 µg/ml), organik bir boyanın proteinlerin
asidik ve bazik grupları ile etkileşerek renk oluşturmasını esas almaktadır. Daha önceden
hazırlanıp süzülmüş olan 5 ml Bradford çözeltisi (%0.01 (a/h) Coomassie Brilliant Blue
G-250, %5 (h/h) etanol (%95’lik), %10 fosforik asit (%85’lik), %84.99 damıtık su)
üzerine hücresi çöktürülmüş 100 µl lipaz üretim ortamı eklenerek karışım
90
vortekslenmiştir. 10 dk beklendikten sonra karışım yine vortekslenmiş ve λ=595 nm’de
spektrofotometrik okuma yapılmıştır. Boya normal şartlarda 465 nm’de maksimum
absorbans verirken, proteine bağlandığı zaman 595 nm’de maksimum absorbans
vermektedir. Mavi rengin oluşmasında proteinin amino asit bileşimi (özellikle arjinin
gibi bazik amino asitler ve aromatik amino asitler) önemlidir. Çalışmada kullanılan
kalibrasyon doğrusu EK 8’de verilmiştir. Kalibrasyon doğrusu Bovine Serum
Albumin’in (BSA) farklı derişimleri kullanılarak hazırlanmıştır.
3.3.6 Bitkisel yağ analizleri
Ticari olarak sağlanan bitkisel yağların, gaz kromatograf cihazı kullanılarak yağ asidi
bileşimleri belirlenmiştir (Çizmeci vd. 2005). Analizler, yağ asitleri metil esterlerine
dönüştürüldükten sonra gerçekleştirilmiştir (Anonymous 1987) ve sonuçlar EK 9’da
çizelge şeklinde verilmiştir Bitkisel yağ analizleri Ankara Üniversitesi Mühendislik
Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümünde yapılmıştır.
3.4 Verilerin Değerlendirilmesi
Elde edilen deneysel verilerden yararlanılarak spesifik aktivite ve özgül çoğalma hızları
hesaplanmıştır.
3.4.1 Spesifik aktivite
Spesifik aktivite üretilen protein başına enzim aktivitesi olarak tanımlanmaktadır.
Çalışmada, ölçülen protein derişimleri ve aktivite değerlerinden yararlanılarak örneklerin
spesifik aktiviteler hesaplanmıştır.
spesifik aktivite =(U/ml)*(ml/mg protein)……………………………………..(3.1)
91
3.4.2 Mikroorganizmanın özgül çoğalma hızları
Çalışmada, sabit hacimli sistemlerde sıvı faz hücre çoğalma eşitliği düzenlenerek,
ölçülen mikroorganizma derişimlerinin de kullanılmasıyla her bir ortam için özgül
çoğalma hızları bulunmuştur.
Hücre çoğalma hızı :
Zamana karşı ölçülen hücre derişimlerinden t’ye karşı ln(Cx/Cxo) değerleri grafiğe
geçirilir. Eşitlik (3.4)’e göre grafik bir doğru vermelidir. Doğrunun eğimi özgül çoğalma
hızını (µ) verir. Eşitlik (3.4), üstel çoğalma evresindeki veriler için geçerlidir.
)2.3........(......................................................................xx
x Cdt
dCr µ==
)3.3.........(......................................................................0∫∫ =tC
C x
x dtCdCx
xo
µ
)4.3(..........................................................................................ln tCC
xo
x µ=
92
4. BULGULAR
4.1 Mikroorganizma İzolasyon ve Tanımlama
Çalışmada kullanılan mikroorganizmanın mikroskop altındaki görüntüleri
incelendiğinde, yuvarlak, boyutları 10.5-17.5 µm arasında değişen, üzüm salkımı
şeklinde koloniler oluşturmuş ve tomurcuklanarak çoğalan ökaryot hücreler
gözlenmiştir. Bakteriyoloji laboratuarlarında sıkça kullanılan 100X immersiyon
objektifiyle ışık mikroskobundan (Leica DM LB2) alınan görüntü Şekil 4.1’de
verilmektedir.
Şekil 4.1 Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü Mikroorganizmanın morfolojisi itibariyle bir maya olduğu anlaşıldıktan sonra mayanın
türünü belirlemek için genetik çalışmalar yapılmıştır. NanoDrop cihazında, izolasyonu
yapılan DNA’da protein kontaminasyonu olmadığı belirlenmiştir. DNA’nın 260 nm’de
ölçülen absorbansına karşılık gelen yoğunluğu, 50 ng/µl’nin üzerinde olduğu için
DNA’nın PCR’da kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. DNA agaroz jelde
yürütüldüğü zaman da PCR için yeteri kadar saf olduğu gözlenmiştir. PCR
optimizasyonunda, primer çiftleri (F1R1 ve F2R2) kullanılarak farklı sıcaklıklar (50, 55,
60oC) ve farklı MgCl2 derişimleri (1, 1.5, 2 mM) ile elde edilen PCR ürünleri %1’lik
93
jelde yürütülmüştür. Sonuç olarak denenmiş tüm sıcaklıklar iyi sonuç vermiştir.
MgCl2’nin 1 mM’lık derişiminin kullanımının uygun olmadığı görülmüş; F2 ve R2
primerleri kullanılarak yapılan PCR için 1.5 mM’lık MgCl2 derişimi de iyi sonuç
vermemiştir. Agaroz jel görüntüsü EK 10’da verilmektedir. PCR optimizasyonunun
ardından PCR pürifikasyonu yapılmış ve ürünler bir kez daha jelde (%2’lik jel, 120 V)
yürütülerek saf oldukları görülmüştür. Etanol çöktürmesinin ardından dizileme
reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Sekans cihazından alınan analiz sonuçları baz dizinleri
şeklinde EK 10’da verilmektedir. Elde edilen baz dizinleri, “National Center for
Biotechnology Information”in web sayfasındaki BLAST programı (blastn) kullanılarak
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) gen bankası veri tabanıyla karşılaştırılmış ve
mikroorganizmanın Debaryomyces hansenii olarak bilinen bir maya türü ile yüksek bir
uyumluluk gösterdiği belirlenmiştir. Blast sonuçları EK 11’de verilmektedir.
4.2 Lipaz Üretiminde Önemli Parametreler
Lipaz üretiminde ortamdaki karbon ve azot kaynakları, iyonlar, ortam pH ve sıcaklığı
önemli parametreler olup yapılan çalışmalarda her bir parametrenin enzim aktivitesi ile
protein ve mikroorganizma derişimleri üzerine etkisi belirlenerek lipaz üretimi için en
uygun koşullar saptanmıştır.
4.2.1 Karbon kaynaklarının etkisi
Üretim ortamına konulan karbon kaynakları, lipaz üretiminde en önemli parametreyi
oluşturmaktadır. Yağların karbon kaynağı olarak kullanılmasının lipaz üretimini
indükleyeceği düşüncesiyle öncelikle bitkisel yağlar karbon kaynağı olarak denenmiştir.
Bu amaçla Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde; zeytin yağı, ayçiçek yağı,
mısır yağı, soya yağı, keten yağı ve iki çeşit susam yağı ve fındık yağı olmak üzere
sekiz farklı bitkisel yağ kullanılmıştır. Etkisi incelenen bitkisel yağlar içerisinde en
yüksek lipolitik aktiviteyi verenlerin farklı derişimleri de denenmiştir. Farklı bitkisel
yağların lipolitik aktivite üzerine etkilerinin farklı olmasının sebebinin bitkisel yağların
bileşimlerindeki yağ asitleri ve esterleri arasındaki farklılık olduğu düşünülmüş ve
94
bitkisel yağlarda bulunan belli başlı yağ asidi ve esterlerinin aktivite üzerindeki etkileri
de ayrıca incelenmiştir. En yüksek lipolitik aktivitenin elde edildiği yağ asidi ve
esterlerinin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine etkisi de araştırılmıştır. Çalışmada,
bitkisel yağlar, yağ asidi ve esterlerine ek olarak gliserol, glukoz, peynir altı suyu,
Triton X-100 gibi farklı karbon kaynaklarının da enzim aktivitesine etkisi gözlenmiştir.
Karbon kaynaklarının lipolitik aktiviteye etkisinin incelendiği tüm deneyler, pH=4.5,
T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında, azot kaynağı olarak %0.5 pepton ve %0.3 maya
özütü birlikte kullanılarak, 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında
gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim ortamlarından belirli zaman aralıklarıyla steril
koşullarda 2’şer ml örnek alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak hücre
dışı lipolitik aktivite tayini, protein ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için
analizlenmiştir.
4.2.1.1 Bitkisel yağların etkisi
Bitkisel yağlardan zeytin yağı, ayçiçek yağı, mısır yağı, fındık yağı, keten yağı, soya
yağı ve iki farklı susam yağının %1 derişimlerinin Debaryomyces hansenii’den lipaz
üretiminde hücre dışı lipolitik aktiviteye, protein derişimine, mikroorganizma
çoğalmasına ve spesifik aktiviteye etkileri incelenmiştir.
%1 derişiminde kullanılan yağlar içerisinde en yüksek lipolitik aktivite (0.0128 U/ml)
soya yağı içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.2). Soya yağını, susam yağı (2), susam
yağı (1), mısır yağı, zeytin yağı, ayçiçek yağı, fındık yağı ve keten yağı izlemektedir.
Lipaz aktiviteleri zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermiştir. En yüksek lipolitik
aktiviteler genellikle 48. saatte gözlenmekle birlikte, fındık yağı (24. st), soya yağı (40.
st), keten yağı (40. st) ve ayçiçek yağı (120. st) içeren ortamlar istisna gösterirler.
%1 derişimde bitkisel yağ içeren ortamlardaki protein derişimlerinin zamanla değişimi
incelendiğinde en yüksek protein miktarının, %1 susam yağı (1) içeren ortamda olduğu
görülmektedir (Şekil 4.3). Susam yağı (1)’i, mısır yağı, fındık yağı, ayçiçek yağı, susam
yağı (2), soya yağı, zeytin yağı ve keten yağı izlemektedir. Zamana karşı protein eğrileri
önce bir artış, sonra bir azalma göstermektedir.
95
Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye etkisi incelendiğinde, en yüksek
spesifik aktivitenin lipolitik aktivitelerde olduğu gibi soya yağı içeren ortamda
gözlendiği görülmektedir (Şekil 4.4). Spesifik aktiviteler için sıralama, aktiviteler ile
aynıdır. Sadece protein miktarlarından gelen farklılık nedeniyle fındık yağı içeren
ortamda spesifik aktivite, ayçiçek yağı içeren ortamdaki spesifik aktiviteden yüksektir.
En yüksek spesifik aktivitelere, aktivitelerle hemen hemen aynı saatlerde ulaşılmaktadır
%1 derişimdeki bitkisel yağlardan susam yağı (2), soya yağı, mısır yağı, keten yağı ve
fındık yağını içeren ortamlarda mikroorganizma derişimlerinin zaman ile değişimi
incelenmiştir (Şekil 4.5). Mikroorganizma en fazla karbon kaynağı olarak soya yağı
içeren ortamda çoğalmıştır. Hücre çoğalması açısından soya yağı içeren ortamı mısır ve
fındık yağlarını içeren ortamlar izlemektedir. Zeytin yağı, ayçiçek yağı ve susam yağı
(2) içeren ortamlarda ise hücre derişimleri sadece deney sonunda ölçülmüştür. Buna
göre 120. saatte zeytin yağı içeren ortamdaki hücre derişimi 8.892 mg/ml, ayçiçek yağı
içeren ortamdaki hücre derişimi ise 10.639 mg/ml’dir. Susam yağı (1) içeren ortamda
ise 72. saatteki hücre derişimi 6.254 mg/ml’dir. En yüksek hücre derişimine ayçiçek
yağı içeren ortamda ulaşılmıştır.
96
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0 20 40 60 80 100 120 140
zaman,st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%1 Soya %1 Mıs ır %1 Susam (1) %1 Susam (2)%1 Ayçiçek %1 Zeytin %1 Keten %1 Fındık
Şekil 4.2 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.1
0 20 40 60 80 100 120 140
zaman,st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%1 Soya %1 Mısır %1 Susam (1) %1 Susam (2)%1 Ayçiçek %1 Zeytin %1 Keten %1 Fındık
Şekil 4.3 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
97
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 20 40 60 80 100 120 140
zaman,st
Sesi
fik li
paz
aktiv
itesi
,U/m
g
%1 Soya %1 Mısır %1 Susam 1 %1 Susam 2%1 Ayçiçek %1 Zeytin %1 Keten %1 Fındık
Şekil 4.4 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imle
ri, m
g/m
l
%1 Susam (2) %1 Soya %1 Mısır %1 Fındık %1 Keten
Şekil 4.5 Bazı bitkisel yağların %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
Bitkisel yağlar içerisinde en yüksek aktivite değerlerini sağlayan soya yağı, susam yağı
(2) ve mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye etkisi ayrıca incelenmiştir.
98
Soya yağı derişiminin etkisi
Soya yağının %1 derişimine ek olarak %0.5 ve %1.5’lik derişimleri ortama eklenmiş ve
zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri izlenmiştir.
En yüksek lipolitik aktiviteye %1 soya yağı içeren ortamda ulaşılmıştır (Şekil 4.6). %1
Soya yağı içeren ortamı sırasıyla %1.5 ve %0.5 soya yağı içeren ortamlar izlemektedir.
Soya yağının %0.5’lik derişimi lipolitik aktivite için yetersiz kalmakta; %1.5’luk
derişimi ise substrat inhibisyonu yaratmaktadır. Tüm derişimler için en yüksek
aktiviteler 40. saatte gözlenmiştir.
Mikroorganizmanın dışarı salgıladığı toplam protein miktarları karşılaştırıldığında en
yüksek protein derişimi %0.5 soya yağı içeren ortamda gözlenmiş, bunu %1.5 soya yağı
ve %1 soya yağı içeren ortamlar izlemiştir (Şekil 4.7).
En yüksek spesifik aktivite %1 soya yağı içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.8). %1
Soya yağı içeren ortamı, aktivitede olduğu gibi sırasıyla %1.5 ve %0.5 derişimdeki soya
yağlarını içeren ortamlar izlemektedir. En yüksek spesifik aktiviteler %1 ve %1.5’luk
derişimler için 40. saatte, %0.5’lik derişim için 48. saatte gözlenmiştir
Zamana karşı hücre derişimlerinden yararlanılarak her bir ortam için hücre çoğalma
eğrileri oluşturulmuştur (Şekil 4.9). %1.5 Soya yağı için mikroorganizmanın gecikme,
üstel çoğalma evresi ve durgunluk evresi olmak üzere üç çoğalma evresi de
görülebilmektedir. En fazla hücre çoğalması %1 soya içeren ortamda olmuştur.
99
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%0,5 Soya %1 Soya %1,5 Soya
Şekil 4.6 Soya yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%0,5 Soya %1 Soya %1,5 Soya
Şekil 4.7 Soya yağının farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
100
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%0,5 Soya %1 Soya %1,5 Soya
Şekil 4.8 Soya yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman ,st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%0,5 Soya %1 Soya %1,5 Soya
Şekil 4.9 Soya yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
101
Susam yağı (2) derişiminin etkisi
Kullanılan iki çeşit susam yağından biri olan ve susam yağı (2) olarak isimlendirilen
bitkisel yağın %1 derişiminin yanı sıra %0.5 ve %1.5’lik derişimlerinin de kullanıldığı
ortamlarda zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişiminin değişimi izlenmiştir.
En yüksek lipolitik aktivite %1 susam yağı (2) içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.10).
%1 Susam yağı (2) içeren ortamı %0.5 ve %1.5 susam yağı (2) içeren ortamlar
izlemektedir. Susam yağı (2)’nin %0.5’lik derişimi lipolitik aktivite için yetersiz
kalmakta, %1.5’luk derişimi ise inhibisyon etkisi yaratmaktadır. Tüm derişimler için en
yüksek aktiviteler 48. saatte gözlenmiştir.
Toplam protein miktarları karşılaştırıldığında en yüksek protein derişimi %0.5 susam
yağı (2) içeren ortamda gözlenmiş, bunu sırasıyla %1.5 ve %1 susam yağı (2) içeren
ortamlar izlemiştir (Şekil 4.11).
En yüksek spesifik aktivite %1 susam yağı (2) içeren ortamda gözlenmiştir (Şekil 4.12).
%1 Susam yağı (2) içeren ortamı sırasıyla %1.5 ve %0.5 derişimdeki susam yağı (2)
içeren ortamlar izlemektedir. En yüksek spesifik aktiviteler %1.5 derişim için 24. saatte,
%0.5 derişim için 40. saatte, %1 derişim için 56. saatte gözlenmiştir.
Zamana karşı hücre derişimlerinden yararlanılarak her bir ortam için hücre çoğalma
eğrileri oluşturulmuştur. En fazla hücre çoğalması %0.5 susam yağı (2) içeren ortamda
olmuştur (Şekil 4.13).
102
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%0,5 Susam (2) %1 Susam (2) %1,5 Susam (2)
Şekil 4.10 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%0,5 Susam (2) %1 Susam (2) %1,5 Susam (2)
Şekil 4.11 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
103
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%0,5 Susam (2) %1 Susam (2) %1,5 Susam (2)
Şekil 4.12 Susam yağı (2)’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg)
etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%0,5 Susam (2) %1 Susam (2) %1,5 Susam (2)
Şekil 4.13 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
104
Mısır yağı derişiminin etkisi
Mısır yağının %1 derişiminin yanı sıra %0.5 ve %1.5 olmak üzere farklı derişimleri de
denenmiş ve zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri izlenmiştir.
Mısır yağı derişiminin lipolitik aktivite üzerine etkisi incelendiğinde, en yüksek
aktivitenin %1 mısır yağı içeren ortamda olduğu görülmüştür (Şekil 4.14). %1 Mısır
yağı içeren ortamı %0.5 ve %1.5 mısır yağı içeren ortamlar izlemektedir. %0.5 Mısır
yağı lipolitik aktivite için yetersiz kalmakta; %1.5’luk derişimi ise substrat inhibisyonu
yaratmaktadır. Tüm derişimler için maksimum aktiviteler 48. saatte gözlenmiştir.
Hücre dışına salgılanan protein miktarları karşılaştırıldığında en yüksek protein derişimi
%0.5 mısır yağı içeren ortamda gözlenmiş, bunu %1 mısır yağı ve %1.5 mısır yağı
içeren ortamlar izlemiştir (Şekil 4.15).
En yüksek spesifik aktivite %1 mısır yağı içeren ortamdadır (Şekil 4.16). %1 Mısır yağı
içeren ortamı, aktivitede olduğu gibi sırasıyla %0.5 ve %1.5 derişimdeki mısır yağı
içeren ortamlar izlemektedir. En yüksek spesifik aktiviteler %1 derişim için 40. saatte,
%0.5 ve %1.5 derişim için 48. saatte gözlenmiştir.
Hücre çoğalma eğrileri incelendiğinde, mikroorganizmanın en çok %0.5 mısır yağı
içeren ortamda çoğaldığı görülmüştür. Bunu sırasıyla %1 ve %1.5 derişimde mısır yağı
içeren ortamlar izlemektedir (Şekil 4.17).
105
0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%0,5 Mısır %1 Mısır %1,5 Mısır
Şekil 4.14 Mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%0,5 Mısır %1 Mısır %1,5 Mısır
Şekil 4.15 Mısır yağının farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
106
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%0,5 Mısır %1 Mısır %1,5 Mısır
Şekil 4.16 Mısır yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%0,5 Mısır %1 Mısır %1,5 Mısır
Şekil 4.17 Mısır yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
107
Bitkisel yağların karşılaştırılması
Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda bitkisel
yağlar içerisinde en iyi karbon kaynağının %1 soya yağı olduğu görülmektedir. En
yüksek aktiviteye daha kısa sürede ulaşılması da bitkisel karbon kaynağı olarak soya
yağının tercih edilmesinde etkili olmuştur. %1 Soya yağını sırasıyla %1 ve %0.5 susam
yağı (2) izlemektedir. Şekil 4.18 ve 4.19’da çalışmada kullanılan farklı tür ve
derişimdeki bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek aktivite ve spesifik aktivite
değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Bitkisel yağların lipolitik aktivite üzerine
farklı etkiler göstermesinin sebebinin yağın bileşimini oluşturan yağ asitleri olduğu
düşünülmüştür.
Mikroorganizmanın farklı bitkisel karbon kaynakları içeren ortamlar için hesaplanmış
olan özgül çoğalma hızları (µ) Çizelge 4.1’de verilmektedir. Buna göre
mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı %1.5 soya yağı içeren ortama aittir.
Mikroorganizma çoğalması açısından da bitkisel yağlar arasında soya yağının,
diğerlerine göre daha iyi sonuç verdiği görülmektedir.
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
%0,5 S
oya
%1 Soy
a
%1,5 S
oya
%0,5 Mısı
r
%1 Mısı
r
%1,5 Mısı
r
%1 Sus
am 1
%0,5 S
usam
2
%1 Sus
am 2
%1,5 S
usam
2
%1 Ayç
içek
%1 Zey
tin
%1 Kete
n
%1 Fındık
En y
ükse
k lip
oliti
k ak
tivite
ler,
U/m
l
Şekil 4.18 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
108
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
%0,5 S
oya
%1 Soy
a
%1,5 S
oya
%0,5 Mısı
r
%1 Mısı
r
%1,5 Mısı
r
%1 Sus
am
%0,5 S
usam
2
%1 Sus
am 2
%1,5 S
usam
2
%1 Ayç
içek
%1 Zey
tin
%1 Kete
n
%1 Fındık
En y
ükse
k sp
esifi
k lip
az a
ktiv
itele
ri, U
/mg
Şekil 4.19 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağlar ile
elde edilen en yüksek spesifik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Çizelge 4.1 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağları içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları
Bitkisel Yağlar ve Derişimleri Özgül Çoğalma Hızları (µ), h -1
% 0.5 Soya yağı 0.0523
%1 Soya yağı 0.0506
%1.5 Soya yağı 0.0601
%0.5 Mısır yağı 0.0496
%1 Mısır yağı 0.0498
%1.5 Mısır yağı 0.0492
%0.5 Susam yağı (2) 0.0378
% 1 Susam yağı (2) 0.0386
%1.5 Susam yağı (2) 0.0385
109
4.2.1.2 Yağ asidi esterlerinin etkisi Bitkisel yağlar yapılarında başka bileşenler de içermelerine rağmen esasen gliserinin
yağ asitleri ile birleşmesi sonucunda oluşan trigliseritlerden yani yağ asidi esterlerinden
oluşurlar. Çalışmada Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde yağ asidi esterlerinin
hücre dışı lipolitik aktivite ile protein ve hücre derişimlerine etkisini incelemek
amacıyla triasetin (C2:0), tribütirin (C4:0), trioktanoin (C8:0), tripalmitin (C16:0),
tristearin (C18:0) ve trioleinin (C18:1) %1 derişimleri kullanılmıştır. Daha sonra
kullanılan yağ asidi esterleri içerisinde lipolitik aktivite üzerinde en iyi sonuç alınan yağ
asidinin %0.5’lik derişimi denenmiştir. Kullanılan yağ asidi esterlerinin basit formülleri
Çizelge 4.2’de verilmektedir.
Çizelge 4.2 Kullanılan yağ asidi esterleri ve basit formülleri Basit Formül Yağ asidi karbon sayısı Yağ asidi esteri
C9H14O6 C2 Triasetin
C15H26O6 C4 Tribütirin
C27H50O6 C8 Trioktanoin
C51H98O6 C16 Tripalmitin
C57H110O6 C18:0 Tristearin
C57H104O6 C18:1 Triolein
Yağ asidi esterlerinin %1 derişimleri karşılaştırıldığında, en yüksek hücre dışı lipolitik
aktiviteye (0.0148 U/ml) 24. saatte %1 tristearin içeren ortamda ulaşıldığı
görülmektedir (Şekil 4.20). Bunu sırasıyla triolein (48. saat), tripalmitin (40. saat),
trioktanoin (40. saat), tribütirin (24. saat) ve triasetin (24. saat) izlemektedir. Lipaz
aktiviteleri zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermiştir
En yüksek protein derişimi trioktanoin içeren ortamdadır. Zamana karşı protein eğrileri
de aktivitelerde olduğu gibi önce bir artış, sonra bir azalma göstermektedir (Şekil 4.21).
En yüksek spesifik aktivitelerin gözlendiği ortamlar sırasıyla tristearin (24. saat),
triolein (48. saat), tripalmitin (40. saat), trioktanoin (40. saat), tribütirin (24. saat) ve
110
triasetin (24. saat) içeren ortamlar olup en yüksek aktivitelerin gözlendiği ortamlarla
aynı sıralamayı göstermektedir (Şekil 4.22).
Yağ asidi esterlerinin %1 derişimini içeren ortamlardaki hücre çoğalma eğrileri
incelendiğinde ise en iyi çoğalmanın %1 trioktanoin ve %1 triolein içeren ortamlarda
gerçekleştiği görülmektedir. %1 Trioktanoin içeren ortamda mikroorganizma durgunluk
evresine daha kısa sürede ulaşmaktadır (Şekil 4.23).
00.0020.0040.0060.0080.01
0.0120.0140.016
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein
Şekil 4.20 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
111
00.010.020.030.040.050.060.070.080.09
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein
Şekil 4.21 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
Şekil 4.22 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg)
etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin
%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein
112
0123456789
10
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Hücr
e de
rişi
mi,
mg/
ml
%1 triasetin %1 tribütirin %1 trioktanoin
%1 tripalmitin %1 tristearin %1 triolein
Şekil 4.23 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Tristearin derişiminin etkisi
Gerek lipolitik aktivite, gerek spesifik aktivite açısından en iyi sonucu veren %1
tristearinin %0.5’lik derişiminin de karbon kaynağı olarak etkisi incelenmiştir. %1
Tristearin içeren ortamda hem daha yüksek aktivite elde edilmiş, hem de bu aktiviteye
daha kısa sürede (24. saat) ulaşılmıştır (Şekil 4.24). Protein derişimleri açısından ise
%0.5 tristearin içeren ortamdaki protein miktarı daha fazladır (Şekil 4.25). En yüksek
spesifik aktivite %1 tristearin içeren ortamda 24. saatte gözlenmiştir. %0.5 Tristearin
içeren ortamda ise en yüksek spesifik aktiviteye 40. saatte ulaşılmış olup değer olarak
%1 tristearin içeren ortamda ulaşılandan daha azdır (Şekil 4.26). Hücre çoğalmaları
bakımından karşılaştırma yapılırsa, %0.5 tristearin içeren ortamda mikroorganizma daha
fazla çoğalmıştır (Şekil 4.27).
113
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%1 tristearin %0,5 tristearin
Şekil 4.24 Tristearinin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
00.005
0.010.015
0.020.025
0.030.035
0.040.045
0.05
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%1 triasetin %0,5 tristearin
Şekil 4.25 Tristearinin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
114
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%1 tristearin %0,5 tristearin
Şekil 4.26 Tristearinin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%1 tristearin %0,5 tristearin
Şekil 4.27 Tristearinin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
115
Yağ asidi esterlerinin karşılaştırılması
Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda yağ asidi
esterleri içerisinde en iyi karbon kaynağının %1 tristearin olduğu görülmektedir. En
yüksek aktiviteye kısa sürede (24. saat) ulaşılması da %1 tristearinin tercih edilmesinde
etkili olmuştur. Şekil 4.28 ve 4.29’da deneylerde kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ
asidi esterleri ile elde edilen en yüksek aktivite ve spesifik aktivite değerleri
karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Mikroorganizmanın farklı yağ asidi esterleri içeren
ortamlar için hesaplanmış olan özgül çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.3’te verilmektedir.
Buna göre mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı, maksimum protein
derişiminin de gözlendiği %1 trioktanoin içeren ortama aittir. Triasetin içeren ortamda
hücre çoğalması çok yavaş gerçekleşmiştir.
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
%1 tria
setin
%1 trib
ütirin
%1 trio
ktano
in
%1 trip
almitin
%1 tris
tearin
%1 trio
lein
% 0,5 t
ristea
rin
En y
ükse
k li
polit
ik a
ktiv
itele
r, U
/ml
Şekil 4.28 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterleri
ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
116
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
%1 tria
setin
%1 trib
ütirin
%1 trio
ktano
in
%1 trip
almitin
%1 tris
tearin
%1 trio
lein
%0,5 tri
steari
n
En y
ükse
k sp
esifi
k lip
az a
ktiv
itele
ri, U
/mg
Şekil 4.29 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Çizelge 4.3 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları
4.2.1.3 Yağ asitlerinin etkisi
Yağları birbirinden farklı kılan, yapılarında bulunan yağ asitlerindeki çeşitliliktir. Doğal
yağlarda bulunan yağ asitleri genellikle 12-18 karbon atomlu düz zincirli karboksilik
Yağ Asidi Esteri ve Derişimi Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1
%1 Triasetin 0.0033
%1 Tribütirin 0.0486
%1 Trioktanoin 0.0537
%1 Tripalmitin 0.0416
%1 Tristearin 0.0315
%0.5 Tristearin 0.0487
%1 Triolein 0.0465
117
asitlerdir. Bir yağın içerdiği yağ asitlerinin uzunluğu ve doymamışlığı onun özelliklerini
belirler. Yağ asitlerinin doymamış olması yapısında çift bağların bulunması demektir.
Çalışmada Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde bazı doymuş ve doymamış yağ
asitleri ile asetik asitin hücre dışı lipolitik aktivite, protein derişimi ve hücre derişimi
üzerine etkileri % 1 derişimleri için incelenmiştir. Daha sonra doymuş yağ asitlerinden
iyi sonuç veren iki çeşit yağ asidinin derişim etkisi incelenmiştir. Çizelge 4.4’te
deneylerde kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları ve molekül formülleri
verilmiştir.
Çizelge 4.4 Kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları ve molekül formülleri Yağ Asitleri Molekül Formülü Karbon Sayısı
Asetik asit CH3-COOH C2
Palmitik asit CH3-(CH2)14-COOH C16
Stearik asit CH3-(CH2)16-COOH C18
Oleik asit CH3-(CH2)7CH=CH-(CH2)7COOH C18:1
Linoleik asit CH3-(CH2)4CH=CH-CH2CH=CH(CH2)7-COOH C18:2
Yağ asitlerinin %1 derişimleri karşılaştırıldığında, en yüksek lipolitik aktivitenin
(0.0164 U/ml) %1 oleik asit içeren ortamda gözlendiği görülmektedir (Şekil 4.30).
Bunu sırasıyla palmitik asit, asetik asit, linoleik asit ve stearik asit izlemektedir. Lipaz
aktiviteleri tüm yağ asitleri için zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermiştir. Asetik
asit dışındaki tüm asitleri içeren ortamlarda en yüksek aktiviteler 24. saatte
gözlenmiştir. Asetik asit içeren ortamda ise maksimum aktivite 40. saattedir.
En yüksek protein derişimi en yüksek aktivitenin gözlendiği %1 oleik asit içeren
ortamda, en az protein derişimi ise en az aktivitenin gözlendiği %1 stearik asit içeren
ortamda ölçülmüştür (Şekil 4.31). Protein derişimleri de aktivitelerde olduğu gibi
zamanla önce bir atış, sonra azalma göstermektedir.
En yüksek spesifik aktivitelerin gözlendiği ortamlar sırasıyla oleik asit, stearik asit,
asetik asit, palmitik asit ve linoleik asit içeren ortamlardır (Şekil 4.32). Stearik asit
118
haricinde tüm yağ asitleri en yüksek spesifik aktivitelerini 24. saatte göstermektedirler.
%1 Stearik asit içeren ortamda ise en yüksek lipolitik aktivite 40. saatte gözlenmiştir.
Yağ asitlerinin %1 derişimini içeren ortamlardaki hücre çoğalma eğrileri incelendiğinde
en iyi çoğalmanın %1 oleik asit ve %1 linoleik asit içeren ortamlarda gerçekleştiği
görülmektedir. %1 Palmitik asit ve stearik asit içeren ortamlar için hücre derişimleri
durgunluk evresine geçtiği zaman, %1 oleik, %1 linoleik ve %1 asetik asit içeren
ortamlarda mikroorganizma derişimleri azalmaya başlamıştır (Şekil 4.33).
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%1 Asetik asit %1 Palmitik asit %1 Stearik asit
% 1 Oleik asit %1 Linoleik asit
Şekil 4.30 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
119
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Prot
ein
deriş
im, m
g/m
l
%1 Asetik asit %1 Palmitik asit %1 Stearik asit% 1 Oleik asit %1 Linoleik asit
Şekil 4.31 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
s, U
/mg
%1 Asetik asit %1 Palmitik asit %1 Stearik asit% 1 Oleik asit %1 Linoleik asit
Şekil 4.32 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
120
0
2
4
6
8
10
12
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%1 Asetik asit %1 Palmitik asit %1 Stearik asit% 1 Oleik asit %1 Linoleik asit
Şekil 4.33 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Stearik asit ve palmitik asit derişimlerinin etkisi
Doymuş yağ asitleri olan stearik asit ve palmitik asitin %0.5 derişiminin etkisi ayrıca
incelenmiştir. %1 Palmitik asit içeren ortamda %0.5 palmitik asit içeren ortama göre
hem daha kısa sürede (24. saat) hem de daha yüksek değerde bir aktivite (0.0082 U/ml)
gözlenmiştir (Şekil 4.34). Stearik asitin ise %0.5 derişimini içeren ortamda %1 derişim
içeren ortama göre daha yüksek bir aktivite (0.0043 U/ml) gözlenmiştir; ancak en
yüksek aktiviteyi gösterme süresi %1 derişim için 24 saat, %0.5 derişim için ise 40
saattir. Aktivitelerde önce bir artış, sonra bir azalma vardır. Protein derişimleri
karşılaştırıldığında palmitik asit ve stearik asitin %0.5 derişimlerini içeren ortamlar, %1
derişimleri içeren ortamlara göre daha fazla protein içermektedirler (Şekil 4.35). Tüm
derişimler için protein miktarları önce artmakta, sonra azalmaktadır. En yüksek spesifik
aktiviteler hem palmitik asit, hem stearik asit için %1 derişimleri içeren ortamlarda
gözlenmiştir (Şekil 4.36). Hücre çoğalmaları bakımından karşılaştırma yapılırsa, %0.5
derişimde palmitik asit ve stearik asit içeren ortamlarda, %1 derişimlere göre
mikroorganizma daha fazla çoğalmıştır (Şekil 4.37).
121
0
0.001
0.0020.003
0.004
0.005
0.0060.007
0.008
0.009
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%1 Palmitik asit %1 Stearik asit% 0,5 Palmitik asit %0,5 Stearik asit
Şekil 4.34 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine (U/ml)
etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%1 Palmitik asit %1 Stearik asit %0,5 Palmitik %0,5 Stearik asit
Şekil 4.35 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
122
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
leri,
U/m
g
%1 Palmitik asit %1 Stearik asit%0,5 Palmitik asit %0,5 Stearik asit
Şekil 4.36 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%1 Palmitik asit %1 Stearik asit%0,5 Palmitik asit %0,5 Stearik asit
Şekil 4.37 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml)
etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
123
Yağ asitlerinin karşılaştırılması
Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda yağ
asitleri içerisinde en iyi karbon kaynağının %1 oleik asit olduğu görülmektedir. Şekil
4.38 ve 4.39’da deneylerde kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen
en yüksek aktivite ve spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir.
Mikroorganizmanın farklı yağ asitleri içeren ortamlar için hesaplanmış olan özgül
çoğalma hızları ise Çizelge 4.5’de verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en
yüksek özgül çoğalma hızı, maksimum aktivite ve maksimum spesifik aktivitenin de
gözlendiği %1 oleik asit içeren ortama aittir. En az aktivitenin gözlendiği %1 stearik asit
içeren ortamda hücre çoğalması da en az gerçekleşmiştir.
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
%1 Ase
tik as
it
%1 Palm
itik as
it
%1 Stea
rik as
it
% 1 Olei
k asit
%1 Lino
leik a
sit
%0,5 P
almitik
asit
%0,5 S
tearik
asit
En y
ükse
k li
polit
ik a
ktiv
itele
r, U
/ml
Şekil 4.38 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile
elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
124
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
%1 Ase
tik as
it
%1 Palm
itik
%1 Stea
rik
% 1 Olei
k
%1 Lino
leik
%0,5 Palm
itik
%0,5 Stea
rik
En y
ükse
k sp
esifi
k lip
az a
ktiv
itele
ri, U
/mg
Şekil 4.39 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile
elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü Çizelge 4.5 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları
4.2.1.4 Gliserolün etkisi Trigliseritleri parçalayarak yağ asidi ve gliserol oluşumunu sağlayan lipaz enziminin
üretildiği ortamda, Debaryomyces hansenii’nin gliserolü de karbon kaynağı olarak
kullanıp kullanmadığını araştırmak amacıyla gliserolün %1 derişimi denenmiştir.
Yağ Asiti ve Derişimi Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1
%1 Asetik asit 0.0341
%1 Palmitik asit 0.0382
%0.5 Palmitik asit 0.0440
%1 Stearik asit 0.0288
%0.5 Stearik asit 0.0417
%1 Oleik asit 0.0594
%1 Linoleik asit 0.0429
125
%1 Gliserol içeren ortamın, hücre dışı lipaz aktivitesi, protein derişimi ve spesifik lipaz
aktivitesine etkisi Şekil 4.40’ta yer almaktadır. Mikroorganizmanın gliserolü karbon
kaynağı olarak kullandığı ve %1 gliserol içeren ortamdaki en yüksek aktivite değerinin
(0.0058 U/ml), bitkisel yağlardan %1 susam yağı (1), yağ asitlerinden %1 asetik asit,
yağ asidi esterlerinden ise %1 trioktanoin içeren ortamlarda elde edilen en yüksek
aktivite değerlerine yakın bir değer olduğu belirlenmiştir. Aktivite değeri diğer karbon
kaynakları ile karşılaştırılabilecek seviyede iken, spesifik aktivite değeri %1 ayçiçek
yağı içeren ortama yakın bir değer olup, denenmiş tüm yağ asidi ve esterlerini içeren
ortamların yanında düşük kalmaktadır. Mikroorganizmanın hücre çoğalma eğrisi ise
Şekil 4.41’de verilmiştir. %1 Gliserol içeren ortamdaki özgül çoğalma hızı 0.0738 st -1
olarak hesaplanmıştır ki, bu değer denenen tüm bitkisel yağları, yağ asidi ve esterlerini
içeren ortamlardakinden yüksek bir değerdir.
00.010.020.030.040.050.060.070.080.09
0.1
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
ak
tivite
si,U
/mg
pr
otei
n de
rişim
i, m
g/m
l
0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
Protein derişimi, mg/ml Spesifik lipaz aktivitesi, U/mgLipaz aktivitesi, U/ml
Şekil 4.40 %1 Gliserol içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
126
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
Şekil 4.41 %1 Gliserol içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.1.5 Glukozun etkisi
Glukoz canlı mikroorganizmada glukoliz yolizinde enerji eldesinde ve hücre gelişimi
için gerekli primer metabolitlerin oluşumunda kullanılmaktadır. Çalışmada, metabolik
yolizlerinde kullanılan ve mikroorganizmanın çoğalmasında etkili olabileceği düşünülen
glukozun Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde hem hücre çoğalmasına hem de
lipolitik aktiviteye etkisi incelenmiştir. Glukozun %1 derişiminin katı agar ve ön
çoğalma ortamına eklenmesi, mikroorganizma derişimini beş katına çıkarmıştır. Bunun
sonucu olarak TBA besi ortamına %1 glukoz eklenmesine karar verilmiştir. Lipaz
üretim ortamındaki lipolitik aktivite ve hücre derişimlerine karbon kaynağı olarak
glukoz etkisi ise %0, %0.25, %0.5 ve %1 olmak üzere dört farklı derişim için
incelenmiştir. En yüksek lipolitik aktivite (0.0149 U/ml) glukoz içermeyen ortamda elde
edilmiştir (Şekil 4.42). Bunu sırasıyla, %0.25, %0.5 ve %1 glukoz içeren ortamlar
izlemektedir. Glukozun hücre derişimlerine etkisi ise deney sonundaki (87. saat) hücre
derişimleri karşılaştırılarak değerlendirilmiştir (Şekil 4.43). Buna göre en yüksek hücre
derişimi %0.25 glukoz içeren ortamda gözlenmiş olup, bunu %0, %0.5 ve %1 derişimde
glukoz içeren ortamlar izlemektedir.
127
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0 20 40 60 80 100
zaman st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%0 glukoz %0.25 glukoz %0.5 glukoz %1 glukoz
Şekil 4.42 Glukozun farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
0123456789
10
%0 glukoz %0,25 glukoz %0,50 glukoz %1 glukoz87. s
aatte
ki h
ücre
der
işim
leri,
mg/
ml
Şekil 4.43 Glukozun farklı derişimlerinin deney sonunda (87. saat) hücre derişimine etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.1.6 Peyniraltı suyu etkisi
Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen Debaryomyces hansenii’den
lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak peyniraltı suyunun lipolitik aktiviteye etkisini
128
araştırmak amacıyla, enzim üretim ortamına peyniraltı suyunun %1 derişimi
konulmuştur.
Şekil 4.44’de karbon kaynağı olarak kullanılan %1 peyniraltı suyunun hücre dışı
lipolitik aktivite, protein derişimi ve spesifik aktiviteye etkileri yer almaktadır.
Sonuçlar, %1 peyniraltı suyu içeren ortamda gözlenen en yüksek aktivite değerinin
(0.0120 U/ml), bitkisel karbon kaynakları içerisinde en iyi sonuç veren %1 soya yağı
içeren ortamda gözlenen en yüksek aktivite değeri kadar (0.0128 U/ml) yüksek bir
değer olduğunu göstermektedir. Peyniraltı suyu gibi doğal bir karbon kaynağı olan %1
soya yağı içeren ortamda da, %1 peyniraltı suyu içeren ortamda da en yüksek aktivite
değerine 40. saatte ulaşılmaktadır. Spesifik aktivite açısından ise %1 peyniraltı suyu
içeren ortam ile ulaşılan en yüksek spesifik aktivitenin (0.2853 U/mg), %1 soya yağı
içeren ortamdakine göre (0.3591 U/mg) az olduğu görülmektedir. %1 Peyniraltı suyu
içeren ortamdaki protein derişimi zamanla önce bir artış göstermekte, sonra azalmakta
olup bu ortamda gözlenen en yüksek protein derişimi %1 soya yağı içeren ortamdakine
göre daha fazladır. Peyniraltı suyunun hücre çoğalmasına etkisi Şekil 4.4’de
gösterilmiştir. Mikroorganizmanın %1 peyniraltı suyu karbon kaynağı olarak
kullanıldığı zaman hesaplanan özgül çoğalma hızı 0.0473 st-1 olup, diğer karbon
kaynakları ile karşılaştırıldığında ortalama bir değerdir.
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l Pr
otei
n de
rişim
i, m
g/m
l
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si,
U/m
g
Lipaz aktivitesi, U/ml Protein derişimi, mg/ml Spesifik aktivite, U/mg
Şekil 4.44 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi
pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
129
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
Şekil 4.45 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.1.7 Triton X-100 etkisi
Çalışmanın amaçlarından biri, doğadan izole edilmiş Debaryomyces hansenii’den
üretilen lipazın deterjan katkısı olarak kullanım potansiyelini araştırmak olduğu için
karbon kaynağı olarak non-iyonik bir surfaktan olan Triton X-100’ün etkisi de
incelenmiştir. Triton X-100’ün lipaz üretimine etkisini incelemek için ortama Triton X-
100’ün %1 derişimi, indükleyici olarak etkisini incelemek için ise ortama karbon
kaynağı olarak en iyi sonuç veren soya yağının %1 derişimi ile birlikte %0.5 Triton X-
100 kullanılmıştır.
%1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların hücre dışı
lipolitik aktiviteye etkisi Şekil 4.46’da gösterilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde %1
Triton X-100 içeren ortamda elde edilen en yüksek değer (0.0212 U/ml), denenmiş
karbon kaynakları içerisinde en yüksek aktivite değeri olduğu görülmektedir. %1 Soya
yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamda ise %1 soya yağı içeren ortama göre düşük bir
aktivite (0.0081 U/ml) gözlenmiştir. %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton
X-100 içeren ortamların her ikisinde de en yüksek aktivitelere 48 saat sonra ulaşılmıştır.
130
Her iki ortamda da aktiviteler önce bir artış, sonra bir azalma göstermektedir. Protein
derişimleri her iki ortamda da oldukça yüksektir (Şekil 4.47). Protein derişimleri yüksek
olduğu için diğer karbon kaynakları ile ulaşılan spesifik lipaz aktiviteleri ile
karşılaştırıldığında her iki ortamda da düşük değerler gözlenmektedir. Özellikle %1
Triton X-100 içeren ortamda çok yüksek bir lipolitik aktivite değeri gözlemesine
rağmen, denenmiş karbon kaynakları içerisinde en düşük spesifik lipaz aktivitesine
sahip ortam %1 Triton X-100 içeren ortamdır. %1 Soya yağı ile birlikte %0.5 Triton X-
100 içeren ortam için en yüksek spesifik lipaz aktivitesi değeri, %1 soya yağı içeren
ortam için bulunan değerin yaklaşık yarısıdır. Şekil 4.48’de ortamların, spesifik lipaz
aktivitesine etkisi görülmektedir. Mikroorganizma çoğalmasına ortamların etkisi
incelendiğinde, %1 soya yağı ile birlikte %0.5 Triton X-100 içeren ortamda hesaplanan
özgül çoğalma hızının 0.0833 st-1 değeri ile denenmiş karbon kaynakları içerisinde
bulunan en yüksek değer olduğu görülmektedir. %1 Triton X-100 içeren ortam için
hesaplanan 0.0566 st-1 değeri de diğer karbon kaynakları ile karşılaştırıldığında yüksek
bir değerdir. Karbon kaynağı olarak %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı ile %0.5 Triton
X-100 içeren ortamlarda elde edilen hücre çoğalma eğrileri Şekil 4.49’da verilmiştir.
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
ler,
U/m
l
%1 Soya yağı+%0.5 Triton-X-100 %1 Triton-X-100
Şekil 4.46 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
131
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
1
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,m
g/m
l
%1 Soya yağı+%0.5 Triton-X-100 %1 Triton-X-100
Şekil 4.47 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların
protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
00.020.040.060.080.1
0.120.140.160.180.2
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%1 Soya yağı+%0.5 Triton-X-100 %1 Triton X-100
Şekil 4.48 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların
spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
132
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50 60 70 80
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,m
g/m
l
%1 Soya yağı+%0.5 Triton-X-100 %1 Triton-X-100
Şekil 4.49 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların
hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü 4.2.2 Azot kaynaklarının etkisi
Lipaz üretiminde önemli parametrelerden biri de ortamdaki azot kaynaklarıdır. Azot
kaynaklarının Debaryomyces hansenii’den lipaz üretimine etkisini incelemek amacıyla
farklı tür ve derişimlerdeki organik veya inorganik azot kaynakları tek başına veya
gruplar halinde denenmiştir. Bu amaçla seçilen azot kaynakları ve derişimleri; %0.5
pepton + %0.3 maya özütü, %1 pepton + %0.3 maya özütü, %0.5 pepton, %0.3 maya
özütü, %1 üre, %0.5 pepton + %0.5 malt özütü, %0.5 pepton + %0.5 arjinin, %0.5
pepton + %0.5 lizin, %0.5 maya özütü, %1 maya özütü, %1 soya unu, %1 mısır unu,
%1 buğday unu, %5 pepton, %5 üre, %5 amonyum sülfat, %0.25 soya unu, % 0.5 soya
unu, %1.5 soya unu şeklindedir. Azot kaynaklarının lipolitik aktiviteye etkisinin
incelendiği tüm deneyler, pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm koşullarında, karbon kaynağı
olarak lipolitik aktivite açısından bitkisel yağlar arasında en iyi sonucu veren %1 soya
yağı kullanılarak 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında
gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim ortamlarından belirli zaman aralıklarıyla steril
koşullarda 2’şer ml örnek alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak lipolitik
aktivite ile protein ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.
133
Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0124 U/ml) 24. saatte azot
kaynağı olarak %1 soya unu içeren ortamda ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.50). %1
Soya unu içeren ortamdaki lipaz aktivitesini sırasıyla, %0.5 maya özütü (24. saat), %5
pepton (24. saat), %0.5 pepton + %0.3 maya özütü (40.saat) %0.3 maya özütü (24.
saat), %0.5 pepton ve %0.5 malt özütü (24. saat), %0.5 soya unu (24. saat), %5 üre (24.
saat), %1 üre (40. saat), %1 maya özütü (24. saat), %1.5 soya unu (24. saat), %0.25
soya unu (24. saat), %0.5 pepton (48. saat), %0.5 pepton ve %0.5 lizin (48. saat), %0.5
pepton ve %0.5 arjinin (40. saat), %5 amonyum sülfat (24. saat) içeren ortamlardaki
lipaz aktiviteleri izlemektedir. %1 Mısır unu ile %1 buğday unu içeren ortamlarda
aktivite gözlenmemiştir. Aktivitelerde zamanla önce bir artış, sonra bir azalma
görülmektedir.
Protein derişimleri karşılaştırıldığında, mikroorganizmanın hücre dışına en fazla protein
salgıladığı azot kaynağının %1 maya özütü olduğu görülmektedir. En düşük protein
derişimi ise azot kaynağı olarak %0.25 soya unu kullanıldığında gözlenmiştir (Şekil
4.51).
Spesifik lipaz aktiviteleri karşılaştırıldığında, en yüksek spesifik lipaz aktivitesinin lipaz
aktivitelerinde olduğu gibi %1 soya unu içeren ortamda olduğu görülür (Şekil 4.53). %1
Soya unu içeren ortamı sırasıyla %0.5 ve %0.3 maya özütü ile %5 üre içeren ortamlar
izlemektedir (Şekil 4.52). Azot kaynağının mikroorganizma derişimine etkisi
incelendiğinde, en fazla çoğalmanın %1.5 soya unu içeren ortamda, en az çoğalmanın
ise %5 üre içeren ortamda olduğu görülmektedir.
134
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
%0,5 pepton+ %0,3 maya özütü %1 pepton+ %0,3 maya özütü%0,5 pepton %0,3 maya özütü%1 üre %0,5 pepton+ %0,5 malt özütü%0,5 pepton+%0,5 arjinin %0,5 pepton+%0,5 lizin%0,5 maya özütü %1 maya özütü%1 soya unu %1 buğday unu%1 mısır unu %5 üre%5 amonyum sülfat %0,25 soya unu%0,5 soya unu %1,5 soya unu%5 pepton
Şekil 4.50 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı
135
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0 10 20 30 40 50 60 70zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
%0,5 pepton+ %0,3 maya özütü %1 pepton+ %0,3 maya özütü%0,5 pepton %0,3 maya özütü%1 üre %0,5 pepton+ %0,5 malt özütü%0,5 pepton+%0,5 arjinin %0,5 pepton+%0,5 lizin%0,5 maya özütü %1 maya özütü%1 soya unu %1 buğday unu%1 mısır unu %5 pepton%5 üre %5 amonyum sülfat%0,25 soya unu %0,5 soya unu%1,5 soya unu
Şekil 4.51 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı
136
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
%0,5 pepton+ %0,3 maya özütü %1 pepton+ %0,3 maya özütü%0,5 pepton %0,3 maya özütü%1 üre %0,5 pepton+ %0,5 malt özütü%0,5 pepton+%0,5 arjinin %0,5 pepton+%0,5 lizin%0,5 maya özütü %1 maya özütü%1 soya unu %1 buğday unu%1 mısır unu %5 pepton%5 üre %5 amonyum sülfat%0,25 soya unu %0,5 soya unu%1,5 soya unu
Şekil 4.52 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının spesifik lipaz aktivitesine
(U/mg) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı
137
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 10 20 30 40 50 60 70zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
%0,5 pepton+ %0,3 maya özütü %1 pepton+ %0,3 maya özütü%0,5 pepton %0,3 maya özütü%1 üre %0,5 pepton+ %0,5 malt özütü%0,5 pepton+%0,5 arjinin %0,5 pepton+%0,5 lizin%0,5 maya özütü %1 maya özütü%1 soya unu %1 buğday unu%1 mısır unu %5 pepton%5 üre %5 amonyum sülfat%0,25 soya unu %0,5 soya unu%1,5 soya unu
Şekil 4.53 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı Azot kaynaklarının karşılaştırılması
Lipolitik aktivite ve spesifik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda en iyi azot
kaynağının %1 soya unu olduğu görülmektedir. En yüksek aktiviteye kısa sürede (24.
saat) ulaşılması da %1 soya ununun tercih edilmesinde etkili olmuştur. Şekil 4.54 ve
4.55’te deneylerde kullanılan farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen en
yüksek aktivite ve spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir.
Mikroorganizmanın farklı azot kaynakları içeren ortamlar için hesaplanmış olan özgül
çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.6’da verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en
138
yüksek özgül çoğalma hızı %1.5 soya unu içeren ortamda, en düşük özgül çoğalma hızı
ise %5 üre içeren ortamda gözlenmiştir.
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
%0,5 pe
pton+
%0,3
may
a özü
tü
%1 pep
ton+ %
0,3 m
aya ö
zütü
%0,5 pe
pton
%0,3 m
aya ö
zütü
%1 üre
%0,5 pe
pton+
%0,5
malt
özütü
%0,5 pe
pton+
%0,5 ar
jinin
%0,5 pe
pton+
%0,5 liz
in
%0,5 m
aya ö
zütü
%1 may
a özü
tü
%1 soy
a unu
%5 pep
ton
%5 üre
%5 amon
yum sü
lfat
%0,25 s
oya u
nu
%0,5 so
ya un
u
%1,5 so
ya un
u
%1 buğ
day u
nu
%1 mısı
r unu
En y
ükse
k lip
oliti
k ak
tivite
ler,
U/m
l
Şekil 4.54 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen en yüksek lipolitik
aktiviteler (U/ml) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
139
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
%0,5 pe
pton+
%0,3
may
a özü
tü
%1 pep
ton+ %
0,3 m
aya ö
zütü
%0,5 pe
pton
%0,3 m
aya ö
zütü
%1 üre
%0,5 pe
pton+
%0,5
malt
özütü
%0,5 pe
pton+
%0,5 ar
jinin
%0,5 pe
pton+
%0,5 liz
in
%0,5 m
aya ö
zütü
%1 may
a özü
tü
%1 soy
a unu
%5 pep
ton
%5 üre
%5 amon
yum sü
lfat
%0,25 s
oya u
nu
%0,5 so
ya un
u
%1,5 so
ya un
u
%1 buğ
day u
nu
%1 mısı
r unu
En y
ükse
k sp
esifi
k lip
az a
ktiv
itele
ri, U
/mg
Şekil 4.55 Farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz
aktiviteleri (U/mg) pH=4.5, T=30oC, N=150 rpm, azot kaynağı; %0.5 pepton + %0.3 maya özütü
140
Çizelge 4.6 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarını içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları Azot Kaynağı ve Derişimi Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1
%0.25 Soya unu 0.0912
%0.5 Soya unu 0.0949
%1 Soya unu 0.1326
%1.5 Soya unu 0.1342
%1 Buğday unu 0.1134
%1 Mısır unu 0.0925
%5 Pepton 0.0836
%1 Pepton ve %0.3 Maya özütü 0.0484
%0.5 Pepton ve %0.3 Maya özütü 0.0403
%5 Amonyum sülfat 0.0266
%0.3 Maya özütü 0.0262
%0.5 Maya özütü 0.0250
%1 Maya özütü 0.0227
%0.5 Pepton + %0.5 Malt özütü 0.0206
%0.5 Pepton + %0.5 Arjinin 0.0189
%1 Üre 0.0118
%0.5 Pepton 0.0099
%0.5 Pepton + %0.5 Lizin 0.0073
%5 Üre 0.0067
4.2.3 pH etkisi
Enzimatik tepkimelerin hızı, hidrojen iyonu derişimine göre farklılık göstermektedir.
Enzimin en fazla aktivite gösterdiği pH değeri, optimum pH’ıdır. pH’ı optimum değerde
sabit tutmak veya en azından elverişli durumda tutmak amacıyla tampon çözeltiler
kullanılır. Optimum pH; kullanılan tamponun cinsi, substratın yapısı ve enzimin elde
edildiği kaynakla ilişkilidir. Çalışmada, Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde
pH’ın lipolitik aktiviteye etkisi incelenirken; pH= 3.5, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5
141
değerlerindeki sitrik asit monohidrat ve disodyum hidrojen fosfat ile hazırlanan tampon
çözeltileri kullanılmıştır. Tüm deneyler, T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında,
lipolitik aktivite açısından doğal karbon kaynaklarından bitkisel yağlar arasında en iyi
sonucu veren %1 soya yağı kullanılarak, azot kaynağı olarak ise en iyi sonucu veren %1
soya unu kullanılarak 250 ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında
gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim ortamlarından belirli zaman aralıklarıyla steril
koşullarda 2’şer ml örnek alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak lipolitik
aktivite tayini, protein ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.
Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0284 U/ml) 64. saatte pH=6.5
ortamında ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.56). pH=6.5 ortamındaki lipaz aktivitesini
sırasıyla, pH= 7.0 (88. saat), pH=6.0 (72. saat) ve pH=7.5 (88. saat) ortamlarındaki
lipaz aktiviteleri izlemektedir. Aktivitelerde genel olarak önce bir artış, sonra bir azalma
görülmektedir; aktivitelerdeki azalma düşük pH’larda daha belirgindir.
Protein derişimleri karşılaştırıldığında, mikroorganizmanın hücre dışına en fazla protein
salgıladığı ortam pH değerinin 7.0 olduğu görülmektedir. En düşük protein derişiminin
ise pH=3.5’ta olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.57). Spesifik lipaz aktiviteleri
karşılaştırıldığında ise en yüksek spesifik lipaz aktivitesinin protein derişimlerine bağlı
olarak pH=3.5 ortamında olduğu görülür. pH=3.5 ortamını sırasıyla pH=4.5 ve pH=4.0
ortamları izlemektedir (Şekil 4.58).
Ortam pH’ının mikroorganizma derişimine etkisi incelendiğinde, en fazla çoğalmanın
pH=5.5 ortamında, en az çoğalmanın ise pH=3.5 ortamında olduğu görülmektedir (Şekil
4.59).
142
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
ler ,
U/m
l
pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5
Şekil 4.56 Farklı ortam pH’larının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 20 40 60 80 100
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5
Şekil 4.57 Farklı ortam pH’larının protein derişimine (mg/ml) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
143
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 20 40 60 80 100
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5
Şekil 4.58 Farklı ortam pH’larının spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
pH=3,5
Şekil 4.59 Farklı ortam pH’larının hücre derişimine (mg/ml) etkisi T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
144
Ortam pH’larının karşılaştırılması
Lipolitik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda optimum ortam pH’ının
pH=6.5 olduğu görülmektedir. Yüksek aktivitelerin gözlendiği yüksek ortam pH’ları
arasında en yüksek aktiviteye kısa sürede (64. saat) ulaşılması da pH=6.5’un tercih
edilmesinde etkili olmuştur. Şekil 4.60 ve 4.61’de farklı ortam pH’larında aktivite ve
spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Mikroorganizmanın farklı
pH’lardaki ortamlarda hesaplanmış olan özgül çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.7’de
verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı pH=5.0
ortamında, en düşük özgül çoğalma hızı ise pH=3.5 ortamında gözlenmiştir.
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5 pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5
En y
ükse
k lip
oliti
k ak
tivite
ler,
U/m
l
Şekil 4.60 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
145
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
pH=3,5 pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5 pH=6 pH=6,5 pH=7 pH=7,5En y
ükse
k sp
esifi
k lip
az a
ktiv
itele
ri, U
/mg
Şekil 4.61 Farklı ortam pH’ları ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri
(U/mg) T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
Çizelge 4.7 Farklı ortam pH’larında hesaplanan özgül çoğalma hızları
Ortamın başlangıç pH’ı Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1
3.5 0.0616
4.0 0.0692
4.5 0.1017
5.0 0.1035
5.5 0.0920
6.0 0.0840
6.5 0.0774
7.0 0.0772
7.5 0.0769
4.2.4 Sıcaklık etkisi
Sıcaklığın Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde lipolitik enzim aktivitesine
etkisinin incelendiği çalışmalarda, T=25oC, 30oC, 35 oC ve 40oC olmak üzere dört farklı
146
sıcaklık denenmiştir. Tüm deneyler, optimum pH olarak belirlenen pH=6.5 başlangıç
değerinde, T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında, lipolitik aktivite açısından doğal
karbon kaynaklarından bitkisel yağlar arasında en iyi sonucu veren %1 soya yağı
kullanılarak, azot kaynağı olarak ise en iyi sonucu veren %1 soya unu kullanılarak 250
ml’lik erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Deneylerde
üretim ortamlarından belirli zaman aralıklarıyla steril koşullarda 2’şer ml örnek
alınmıştır. Alınan örnekler, spektrofotometrik olarak lipolitik aktivite tayini, protein ve
hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.
Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0284 U/ml) 64. saatte
T=30oC’ta ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.62). T=30oC’taki lipaz aktivitesini sırasıyla,
T=25oC (64. saat), T=35oC (40. saat) ve T=40oC’taki (24. saat) lipaz aktiviteleri
izlemektedir. Aktivitelerde zamanla önce bir artış, sonra bir azalma görülmektedir
Protein derişimleri karşılaştırıldığında, mikroorganizmanın hücre dışına en fazla protein
salgıladığı sıcaklığın T=30oC olduğu görülmektedir. En düşük protein derişiminin ise
T=40oC’ta olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.63).
Spesifik lipaz aktiviteleri karşılaştırıldığında ise en yüksek spesifik lipaz aktivitesinin
protein derişimlerine bağlı olarak T=40oC’ta olduğu görülür. Bunu sırasıyla T=35, 30 ve
25oC izlemektedir (Şekil 4.64). Ortam sıcaklığının mikroorganizma derişimine etkisi
incelendiğinde, lipolitik aktivite ve protein derişimlerinde olduğu gibi en fazla
çoğalmanın T=30oC’ta, en az çoğalmanın ise T=40oC’ta olduğu görülmektedir (Şekil
4.65).
147
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0 20 40 60 80 100
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
T=25 T=30 T=35 T=40
Şekil 4.62 Farklı sıcaklıkların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 20 40 60 80 100
zaman, st
Pro
tein
der
işim
i, m
g/m
l
T=25 T=30 T=35 T=40
Şekil 4.63 Farklı sıcaklıkların protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
148
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 20 40 60 80 100
zaman, st
Spe
sifik
lipa
z ak
tivite
si, U
/mg
T=25 T=30 T=35 T=40
Şekil 4.64 Farklı sıcaklıkların spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
T=25 T=30 T=35 T=40
Şekil 4.65 Farklı sıcaklıkların hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
149
Ortam sıcaklıklarının karşılaştırılması
Lipolitik aktivite değerleri göz önünde bulundurulduğunda optimum ortam sıcaklığının
T=30oC olduğu görülmektedir. Bu sıcaklıkta üretilen lipazın aktivitesini daha uzun süre
koruyabilmesi de T=30oC’ın tercih edilmesinde etkili olmuştur. Şekil 4.66 ve 4.67’de
farklı ortam sıcaklıklarında aktivite ve spesifik aktivite değerleri karşılaştırmalı olarak
verilmiştir. Mikroorganizmanın farklı sıcaklıklarda hesaplanmış olan özgül çoğalma
hızları (µ) ise Çizelge 4.8’de verilmektedir. Buna göre mikroorganizmanın en yüksek
özgül çoğalma hızı T=30oC’ta, en düşük özgül çoğalma hızı ise T=40oC’ta gözlenmiştir.
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
T=25 T=30 T=35 T=40
En
yüks
ek li
polit
ik a
ktiv
itele
r, U
/ml
Şekil 4.66 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
150
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
T=25 T=30 T=35 T=40
En y
ükse
k sp
esifi
k lip
az a
ktiv
itele
ri,
U/m
g
Şekil 4.67 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz
aktiviteleri (U/mg) pH=6.5, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
Çizelge 4.8 Farklı ortam sıcaklıklarında hesaplanan özgül çoğalma hızları
Ortam sıcaklığı, oC Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1
25 0.0769
30 0.0774
35 0.0663
40 0.0486
4.2.5 Metal iyonları etkisi
Enzimlerin katalitik etkileri, enzime bağlı ya da serbest olarak bulunan bazı metal
iyonları tarafından artırılmakta veya azaltılmaktadır. Bazı metal iyonları enzimlerin
protein kısmını aktif durumdan inaktif duruma getirirken, bazıları proteinleri denatüre
etme özelikleri ile enzimler üzerinde inhibitör etkisi yaratabilmektedir. Çalışmada,
Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde iyonların enzim aktivitesi ve hücre
çoğalmasına etkisini incelemek amacıyla, +1 ve +2 değerlikli katyonların (monovalent
ve divalent iyonlar) klor ve sülfat tuzları kullanılmıştır. Bu amaçla NaCl, LiCl, KCl,
151
MgCl2, CaCl2, ZnCl2, Na2SO4, K2SO4, MgSO4’ün 1 mM derişimleri denenmiştir. Bu
değer belirlenirken literatürdeki çalışmalar incelenmiş ve metal tuzlarının genellikle 1
mM ve 10 mM derişimlerinin kullanıldığı görülmüştür. Ağır metal iyonlarının enzimi
genellikle inhibe ettiği bilindiği için Fe+2, Fe+3, Hg+2,Cu+2, Ag+1 gibi iyonların etkisi
incelenmemiştir. Metal tuzları seçilirken, aktivite üzerine sadece katyon değil anyon
etkisinin de incelenmesi amacıyla aynı katyonun farklı anyonlarla oluşturduğu bileşikler
seçilmiştir. Tüm deneyler, optimum pH olarak belirlenen pH=6.5 başlangıç pH’ında,
T=30oC, N=150 rpm çalkalama hızında, lipolitik aktivite açısından doğal karbon
kaynaklarından bitkisel yağlar arasında en iyi sonucu veren %1 soya yağı kullanılarak,
azot kaynağı olarak ise en iyi sonucu veren %1 soya unu kullanılarak 250 ml’lik
erlenlerdeki 100 ml’lik üretim ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim
ortamlarından, 48. saatte steril koşullarda 2’şer ml örnek alınarak spektrofotometrik
olarak lipolitik aktivite tayini ve hücre derişimlerinin belirlenmesi için analizlenmiştir.
48. saatte örnek alınmasının nedeni, sıcaklık deneyleriyle birlikte metal tuzları dışında
en iyi tüm koşulların belirlendiği deneylerde en yüksek aktivitenin gözlendiği 64. saat
ile 48. saatteki aktivite değerlerinin birbirine çok yakın olup 48. saatin metal tuzlarının
etkisini gözleyebilmek için uygun bir saat oluşudur.
Sonuçlar incelendiğinde, en yüksek lipaz aktivitesine (0.0437 U/ml) KCl içeren ortamda
ulaşıldığı görülmektedir (Şekil 4.68). Kontrol amacıyla bu gruba eklenen iyon
içermeyen ortamdaki aktiviteyle karşılaştırıldığında bazı metal tuzlarının aktiviteyi
artırdığı, bazılarının ise azalttığı görülmektedir. Metal tuzlarından sırasıyla; KCl >
K2SO4 > MgCl2 > Na2SO4 lipolitik aktiviteyi artırırken, NaCl > ZnCl2 > MgSO4 > LiCl
> CaCl2 lipolitik aktiviteyi azaltmaktadır.
Metal tuzlarının mikroorganizma derişimine etkisi incelendiğinde, en fazla çoğalmanın
MgCl2, en az çoğalmanın ise en yüksek aktivitenin gözlendiği KCl içeren ortamda
olduğu görülmektedir (Şekil 4.69). Lipolitik aktivitede olduğu gibi bazı metal tuzları
hücre derişimini artırırken, bazıları hücre derişimini azaltmaktadır. MgCl2 ve ZnCl2
dışındaki tüm metal tuzları hücre derişimini azaltıcı etki göstermiştir.
152
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0.05
iyons
uzNaC
lKCl
LiCl
ZnCl2
MgCl2
CaCl2
Na2SO4
K2SO4
MgSO4
Lipo
litik
akt
ivite
ler,
U/m
l
Şekil 4.68 Farklı metal tuzlarının 1 mM’lık derişimlerini içeren ortamların 48. saatteki lipaz aktiviteleri (U/ml) pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
18.5
19
19.5
20
20.5
21
21.5
22
22.5
23
iyons
uzNaC
lKCl
LiCl
ZnCl2
MgCl2
CaCl2
Na2SO4
K2SO4
MgSO4
Hüc
re d
eriş
imle
r, m
g/m
l
Şekil 4.69 Farklı metal tuzlarının 1 mM derişimlerini içeren ortamların 48. saatteki hücre derişimleri (mg/ml) pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya
unu
Metal tuzları arasında en iyi sonucu veren potasyum klorürün 1, 5, 10 ve 15 mM olmak
üzere farklı derişimlerinin zamanla lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri
153
izlenmiştir. En yüksek lipolitik aktivite (0.0538 U/ml) 10 mM KCl içeren ortamda
gözlenmiştir. 10 mM KCl içeren ortamı 5, 1, 15 mM KCl içeren ortamlar izlemektedir.
Tüm derişimler için maksimum aktiviteler 40. saatte gözlenmiştir (Şekil 4.70).
Mikroorganizmanın dışarı salgıladığı toplam protein miktarları karşılaştırıldığında en
yüksek protein derişimi lipolitik aktivitede olduğu gibi 10 mM içeren ortamda
gözlenmiştir. Protein derişimlerindeki sıralama lipolitik aktivite için olan sıralama ile
aynıdır (Şekil 4.71).
En yüksek spesifik lipaz aktivitesi 10 mM KCl içeren ortamda gözlenmiştir. 10 mM
KCl içeren ortamı, aktivitede olduğu gibi sırasıyla 5, 1, 15 mM derişimdeki KCl içeren
ortamlar izlemektedir. Tüm KCl derişimleri için maksimum spesifik aktiviteler 40.
saatte gözlenmiştir (Şekil 4.72).
Zamana karşı hücre derişimlerinden yararlanılarak her bir ortam için hücre çoğalma
eğrileri oluşturulmuştur. En fazla hücre çoğalması 10 mM KCl içeren ortamda olmuştur
(Şekil 4.73). Mikroorganizmanın KCl’nin farklı derişimlerini içeren ortamlarda
hesaplanmış olan özgül çoğalma hızları (µ) ise Çizelge 4.9’da verilmektedir. Buna göre
mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı10 mM KCl, en düşük özgül çoğalma
hızı ise 1 mM KCl içeren ortamda gözlenmiştir.
Sonuç olarak lipaz üretim ortamına KCl tuzunun 10 mM derişimi eklendiğinde lipolitik
aktivite, spesifik lipaz aktivitesi ve hücre derişimlerinde artış gözlenmektedir. Bunun
yanı sıra ortama KCl tuzunun eklenmesi, en yüksek aktivite ve spesifik aktivite
gösterme sürelerini kısaltmaktadır (40. saat).
154
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Lipo
litik
akt
ivite
, U/m
l
1 mM KCl 5 mM KCl 10 mM KCl 15 mM KCl
Şekil 4.70 KCl’nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
1 mM KCl 5 mM KCl 10 mM KCl 15 mM KCl
Şekil 4.71 KCl’nin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
155
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Spes
ifik
lipaz
akt
ivite
si, U
/mg
1 mM KCl 5 mM KCl 10 mM KCl 15 mM KCl
Şekil 4.72 KCl’nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imle
ri, m
g/m
l
1 mM KCl 5 mM KCl 10 mM KCl 15 mM KCl
Şekil 4.73 KCl’nin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi pH=6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
156
Çizelge 4.9 KCl’nin farklı derişimleri için hesaplanan özgül çoğalma hızları
KCl Derişimi, mM Özgül Çoğalma Hızı (µ), st -1
1 0.0674
5 0.0722
10 0.1106
15 0.0757
4.3 En İyi Koşullarda Lipaz Üretimi Debaryomyces hansenii’den lipaz üretimi için en iyi koşullar belirlendikten sonra bu
koşullarda (pH=6.5, T=30oC, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya
unu, 10 mM KCl içeren ortam), 250 ml’lik erlende 100 ml femantasyon ortamı
içerisinde N=150 rpm’de üretim yapılmış ve belli zaman aralıklarıyla üretim
ortamından alınan örneklerin spektrofotometrik ve titrimetrik yöntemle lipaz
aktiviteleri, proteaz aktivitesi, hücre ve protein derişimleri belirlenmiştir.
Hücre içi ve hücre dışı aktiviteler karşılaştırıldığında; hücre içinde titrimetrik lipaz
aktivitesi gözlenmezken, hücre dışında titrimetrik lipaz aktivitesi 24. saatte en yüksek
değere (0.1472 U/mg hücre; 3.3333 U/ml) ulaşmaktadır (Şekil 4.74). Titrimetrik
yöntemle bulunan hücre dışı lipaz aktiviteleri için, birim hacim başına aktivite değerleri
ile birim hücre miktarı başına aktivite değerlerinin zamanla değişim eğrileri paralellik
göstermektedir. Spektrofotometrik yöntemle belirlenen lipaz aktiviteleri
karşılaştırıldığında ise en yüksek hücre içi lipaz aktivitesi 24. saatte gözlenirken (0.0002
U/mg hücre), en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi 40. saatte (0.0020 U/mg hücre; 0.0496
U/ml) gözlenmiştir (Şekil 4.75). Spektrofotometrik yöntemle bulunan hücre dışı lipaz
aktiviteleri için de, birim hacim başına aktivite değerleri ile birim hücre miktarı başına
aktivite değerlerinin zamanla değişim eğrileri paralellik göstermektedir. Titrimetrik ve
spektrofotometrik olarak belirlenen lipaz aktivitelerinde zamanla önce bir artış, sonra bir
azalma vardır. Proteaz aktiviteleri incelendiğinde ise en yüksek hücre içi proteaz
aktivitesine (0.0352 U/mg hücre) 24. saatte ulaşılmaktadır (Şekil 4.76). Hücre içi proteaz
aktivitesinde ise zamanla önce bir artış sonra bir azalma varken, hücre dışı proteaz
157
aktivitesi bir artış gösterdikten sonra yaklaşık olarak sabit bir değere ulaşmıştır. Hücre
dışı proteaz aktivitesinin en yüksek değeri 0.1424 U/mg hücre (3.6888 U/ml) ’dir. Hücre
dışı proteaz aktivitesinde de hacim başına aktivite değerleri ile hücre miktarı başına
aktivite değerlerinin zamanla değişim eğrileri paralellik göstermektedir.
Şekil 4.77’de en iyi koşullarda zamana karşı hücre derişimleri ve hücre dışı protein
derişimleri verilmektedir. Mikroorganizma derişimi en fazla 25.92 mg/ml değerine
ulaşmış olup, en yüksek protein derişimi ise 0.3197 mg/ml’dir. En iyi koşullarda
mikroorganizmanın özgül çoğalma hızı 0.1107 st-1 olarak hesaplanmıştır.
00.020.040.060.08
0.10.120.140.16
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Titr
imet
rik li
paz
aktv
itesi
, U/m
g hü
cre
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Titr
imet
rik li
paz
aktiv
itesi
, U/m
l
hücre dışı lipaz (U/mg hücre) hücre içi lipaz (U/mg hücre)
hücre dışı lipaz (U/ml)
Şekil 4.74 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı titrimetrik lipaz aktiviteleri (U/mghücre) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
158
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
0 10 20 30 40 50 60zaman, st
Spek
trof
otom
etrik
lip
az
aktiv
itesi
, U/m
g hü
cre
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Spek
trof
omet
rik li
paz
aktiv
itesi
, U/m
l
hücre dışı lipaz (U/mg hücre) hücre içi lipaz (U/mg hücre)hücre dışı lipaz (U/ml)
Şekil 4.75 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı spektrofotometrik lipaz aktiviteleri (U/mghücre) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
00.020.040.060.08
0.10.120.140.16
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Prot
eaz
aktiv
itesi
, U/m
g hü
cre
00.511.522.533.54
Prot
eaz
aktiv
itesi
, U/m
l
hücre dışı proteaz (U/mg hücre) hücre içi proteaz (U/mg hücre)hücre dışı proteaz (U/ml)
Şekil 4.76 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı proteaz aktiviteleri (U/mghücre) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu
159
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
zaman, st
Hüc
re d
eriş
imi,
mg/
ml
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
Prot
ein
deriş
imi,
mg/
ml
Hücre derişimi Protein derişimi
Şekil 4.77 En iyi koşullarda hücre dışı protein ve hücre derişimleri (mg/ml) pH= 6.5, T=30oC, N=150 rpm, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu 4.4 Lipazın Üretim Ortamından Ayrılması ve Kısmi Saflaştırılması Saflaştırmada sorun yaratmaması adına un ve yağ içermeyen, yüksek protein derişimi ve
aktivite sağlayan bir karbon kaynağı olan Triton X-100, azot kaynağı olarak %0.5
pepton ve %0.3 maya özütü içeren ortamda (T= 30oC; pH=4.5) lipaz üretimi
gerçekleştirilmiştir. 200 ml üretim ortamı; öncelikle hücresinden arındırılmış, ultrafiltre
edildikten sonra iyon değişim kromatografisi ile fraksiyonlara ayrılmış, fraksiyonlardan
kromatogramda aynı piki verenler birleştirilerek lipolitik aktivite ve proteinlerine
bakılmıştır. Her saflaştırma basamağının sonunda (hücre çöktürüldükten sonra,
ultrafiltrasyondan sonra ve iyon değişim kolonundan geçirildikten sonra) üretim
ortamının hacmi, aktivite ve protein derişimi ölçülerek Çizelge 4.10 oluşturulmuştur.
160
Çizelge 4.10 Lipaz enzimi kısmi saflaştırma basamakları
Saflaştırma Hacim Toplam Toplam Spesifik Verim Saflaştırma
Basamağı (ml) Aktivite Protein Aktivite (%) Katı
(U) (mg) (U/mg)
Kültür üst faz 180 2.117 2.926 0.723 100 1
Ultrafiltrasyon 20 1.693 1.756 0.965 80 1.33
İyon Değişim 8.8 0.172 0.171 1.007 8.15 1.39
Kromatografisi
Çizelge 4.10’daki % verim toplam aktivitelerin, saflaştırma katı ise spesifik aktivitelerin
oranından yola çıkılarak hesaplanmıştır. Her saflaştırma basamağının sonunda toplam
hacim, toplam aktivite ve toplam protein miktarları azalmakta, spesifik aktiviteler
artmaktadır. Spesifik aktivitelerdeki artış saflaştırmanın iyi yapıldığının bir göstergesi
olup, verim saflaştırma esnasında zamanla aktivitelerdeki azalmaya bağlı olarak
düşmektedir.
124
Şekil 4.78 Anyon değişim kromatografisi sonucunda elde edilen kromatogram
141
İyon değişim kromatografi sonucunda elde edilen kromatogram incelendiğinde (Şekil
4.78), başlangıçta gradyen oluşturulmadan önce kolondan ayrılarak fraksiyonlar halinde
toplanan proteinler görülmektedir. Bunlar pI noktası tampon pH’ından yüksek olan ve
(+) yüklendiği için (+) yüklü olan kolona tutunamamış proteinlerdir. Tuz gradyeni
oluşturulduktan sonra kolonu terk eden proteinler ise pI noktası tampon pH’ından düşük
olduğu için (-) yüklenmiş olan ve (-) değerlerinin büyüklüğüne bağlı olarak kolondan
kademeli olarak ayrılan farklı pI değerlerine sahip proteinlerdir. Kromatogramda pik
vermiş olan [3-5], [20-21], [22-26], [48-55] ve [56-60] olmak üzere beş adet fraksiyon
grubu için SDS-PAGE yapılmış, ayrıca bunlardan hangisinin lipolitik aktiviteye sahip
olduğunun anlaşılması için spektrofotometrik olarak lipaz aktivitelerine bakılmıştır. Bu
fraksiyon grupları içerisinde kromatogramda 3 ve 5 numaralı fraksiyonları kapsayan
grupta ([3-5] fraksiyon grubu) diğerlerinden farklı olarak yüksek bir lipolitik aktivite
gözlenmiştir. SDS-PAGE sonuçlarında da aynı fraksiyon grubunun, diğer fraksiyon
gruplarında gözlenen bantlardan farklı başka bantlara da sahip olduğu görülmektedir.
Daha iyi bir jel görüntüsü elde etmek ve elde edilen bulguların doğruluğunu kontrol
etmek için önceden ayrılıp saklanmış olan örnekler ile tekrar iyon değişim
kromatografisi yapılmış, kromatogramda tuz gradyeni oluşturulmadan önce yine
diğerlerine göre çok büyük bir pik gözlenmiş ve lipaz olduğu düşünülen bu piki
oluşturan fraksiyonlar tekrar toplanarak diğer pik veren fraksiyon gruplarıyla birlikte
SDS-PAGE kuyucuklarına yüklenmiştir. SDS-PAGE sonuçlarına bakıldığı zaman
lipolitik aktivitenin gözlendiği kromatogramda en başta yer alan fraksiyon grubu için
36-28 kDa arasındaki üç bant belirgin olarak görülmektedir (Şekil 4.79).
M 1 2 3 4 5
Şekil 4.79 SDS-PAGE analizi sonuçları (M : Marker, 1: [3-5], 2: [20-21], 3: [22-26], 4: [48-55], 5: [56-60])
250 130 95 72 55 36 28
142
4.5 Kısmi Saflaştırılmış Lipazın Deterjan Katkı Maddeleri ile Kullanım
Potansiyeli
Kısmi olarak saflaştırılmış lipazın aktivitesine deterjan katkılarının etkisini incelemek
amacıyla ultrafiltrasyon sonrası üretim ortamına %1 derişimde SDS, Triton X-100,
H2O2, amilaz ve proteaz ile %0.25 derişimde EDTA eklenmiştir. N=100 rpm, T=45oC
koşullarında lipaz üretim ortamı bir saat süresince deterjan katkıları ile inkübe edilmiş;
inkübasyon sonrası lipaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Bir saat
sonrasındaki lipaz aktiviteleri inkübasyon öncesi lipaz aktivitelerine göre verilerek
farklı deterjan katkıları içeren ortamlarda ve katkı içermeyen ortamda lipazın
aktivitesinin yüzde kaçını koruduğu belirlenmiştir.
Sonuçlar incelendiğinde lipaz enziminin katkı içermeyen ortamda inkübasyon sonrası
aktivitesinin %91’ini, SDS içeren ortamda yarısını, amilaz içeren ortamda %83’ünü,
proteaz içeren ortamda %54’ünü, H2O2 içeren ortamda %56’sını ve EDTA içeren
ortamda %42’sini koruduğu görülmüştür (Çizelge 4.11). Triton X-100 içeren ortamda
aktivite düşmemiş; aksine yaklaşık iki katına çıkmıştır.
Çizelge 4.11 Saflaştırılmış lipaz enzimi aktivitesine deterjan katkıları etkisi Katkı Maddesi % Korunan Aktivite
Katkısız 91
%1 SDS 50
%0.25 EDTA 42
%1 Triton X-100 202
%1 Amilaz 83
%1 Proteaz 54
%1 H2O2 56
143
5. TARTIŞMA ve SONUÇ Mikroorganizma tanımlanması
Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen mikroorganizmanın 5.8S rRNA
ve 26S rRNA analizleri sonucunda türünün Debaryomyces hansenii olduğu
belirlenmiştir. Sekans analiz sonuçları değerlendirildiğinde çalışılan mikroorganizmaya
ait baz dizinleri ile Debaryomyces hansenii’ye ait baz dizinleri %100 uyum
göstermiştir. Böylelikle morfolojik olarak bir maya olduğu belirlenen
mikroorganizmanın türü moleküler seviyede de aydınlatılmıştır.
Lipaz üretimi için uygun koşulların belirlenmesi
Debaryomyces hansenii’den lipaz üretiminde en uygun ortam koşullarının belirlendiği
çalışmada, mikroorganizmanın temel besin kaynakları olan farklı tür ve derişimde karbon
ve azot kaynakları ile farklı sıcaklıklar, farklı ortam başlangıç pH’ları ve farklı türde
metal iyonlarının etkisi incelenmiştir. Öncelikle karbon kaynaklarının lipolitik aktivite ve
hücre çoğalmasına etkisi incelenmiş ve bu amaçla kolay ve ekonomik olarak elde
edilebilen bitkisel yağlar karbon kaynağı olarak denenmiştir. Doğal karbon
kaynaklarından bitkisel yağlar içerisinde en yüksek lipaz aktivitesini %1 soya yağı
vermiştir. Farklı derişimleri denenmiş olan tüm yağların %1.5’luk derişimleri aktivite
üzerinde inhibisyon etkisi yaratmış, %0.5 derişimler ise aktivite için yetersiz kalmıştır.
Maksimum özgül çoğalma hızı ise %1.5 soya yağı içeren ortamda gözlenmiştir. Bitkisel
yağların aktiviteye etkisi incelendiğinde genellikle mısır, susam, soya yağı gibi çoklu
doymamış yağların daha iyi sonuç verdiği görülmüştür.
Bitkisel yağların aktivite ve hücre çoğalması üzerindeki etkilerinin farklı oluşunun
nedeni olarak yapılarını oluşturan yağ asidi ve esterleri düşünülmüş, yağ asidi ve
esterlerinin lipolitik aktiviteye ve mikroorganizma çoğalmasına etkisi incelenerek yağlar
ile yapılarını oluşturan yağ asidi ve esterleri arasında bir korelasyon oluşturulmaya
çalışılmıştır. Bu amaçla denenen yağ asitleri içerisinde en yüksek aktiviteyi %1 oleik asit
vermiştir. Mikroorganizmanın en yüksek özgül çoğalma hızı da %1 oleik asit içeren
144
ortamdadır. Yağ asidi esterleri içerisinde ise en yüksek aktivite ise %1 tristearin içeren
ortamdadır. Bitkisel yağların bileşimini oluşturan yağ asitleri dikkate alındığı zaman
oleik asitçe zengin olan zeytin ve fındık yağlarının yüksek aktivite vermesi beklenirken
en iyi sonucu soya yağı vermiştir. Bu sonucun elde edilmesinde soya yağının yağ asidi ve
esteri dışında içerdiği diğer bileşenlerin de rolü olduğu düşünülmektedir. Yağlar sadece
içerdikleri yağ asitlerinin çeşidi ve yüzdesi ile değil proteinler, fosfolipitler, steroller,
vitaminler vb diğer bileşenler ile birlikte değerlendirilmelidir. Örneğin fındık yağı suda
çözünmeyen E vitamini açısından oldukça zengindir. Soya yağının aktivitesinin
diğerlerine göre yüksek oluşunun, yapısındaki linolenik asidin diğer yağlarla
kıyaslandığında fazla olmasının dışında lezitin içermesiyle de (Şenelt 1982) ilgili
olabileceği düşünülmektedir.
Yağ asitleri için genel bir değerlendirme yapılırsa, mikroorganizma doymuş yağ asidi
esterlerinde karbon sayısı yüksek olanları daha iyi kullanmaktadır. Doymuş yağ
asitlerinde de karbon sayısı fazla olanları tercih etmekle beraber, palmitik asit, stearik
asitten daha iyi sonuç vermiştir. Bunun sebebi olarak mikroorganizmanın karbon sayısı
daha yüksek olan stearik asidi parçalamasının daha zor olması gösterilebilir. Nitekim
palmitik asit ve stearik asitin %0.5 ve %1 derişimleri karşılaştırıldığında, palmitik asitin
%0.5 derişimi aktivite ve özgül çoğalma hızı için yetersiz kalırken, stearik asitin %1
derişimi inhibisyon etkisi yaratmaktadır. Genellikle yağ asitleri, esterlerine oranla daha
yüksek aktivite göstermektedir. Ayrıca, doymamış yağ asitlerinde çift bağ sayısı arttıkça
aktivite ve özgül çoğalma hızının azaldığı gözlenmiştir. Bu sonuçlara farklı yağ asidi ve
esterlerinin %1 derişimleri karşılaştırılarak varılmıştır.
Karbon kaynağı olarak bitkisel yağlara, yağ asidi ve esterlerine ek olarak gliserol,
peynir altı suyu, Triton X-100 ve glukoz da denenmiştir. Trigliseritleri parçalayarak yağ
asidi ve gliserol oluşumunu sağlayan lipaz enziminin üretildiği ortamda,
mikroorganizmanın gliserolü karbon kaynağı olarak kullanıp kullanmadığını araştırmak
amacıyla gliserolün %1 derişimi karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Sonuçlar %1
gliserolün %1 susam yağı (1) kadar iyi bir karbon kaynağı olduğunu göstermiş,
mikroorganizma özgül çoğalma hızı da diğer karbon kaynakları ile karşılaştırıldığında
oldukça yüksek bulunmuştur. Canlı mikroorganizmalar için oldukça önem taşıyan
145
glukozun hücre çoğalması ve aktiviteye etkisinin incelendiği deneylerde, glukozun
hücre çoğalması için gerekli olduğu, bu yüzden katı agar ve ön çoğalma ortamında
kullanılabileceği, ancak glukozun lipaz üretim ortamında kullanılmasının lipolitik
aktiviteyi azaltıcı etki göstermesi nedeniyle uygun olmayacağı sonucuna varılmıştır. D.
hanseneii, süt mamulleri üretim tesisinden izole edildiği için peynir altı suyunun karbon
kaynağı olarak kullanımının iyi sonuç vereceği düşüncesi, deney sonuçları ile
desteklenmiştir. %1 Peyniraltı suyu içeren ortamda mikroorganizmanın lipolitik
aktivitesi doğal yağlar arasında en iyi sonucun alındığı %1 soya yağı içeren ortamdaki
kadar yüksektir. Peyniraltı suyu içerdiği laktoz, serum proteinleri ve mineral maddeleri
ile mikroorganizma için iyi bir kaynaktır (http://foodwaste-milk.tripod.com/whey/,
2007). Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda belli başlı surfaktanlardan Triton X-
100’ün de iyi bir karbon kaynağı olduğu belirlenmiştir. Bu, Triton X-100’ün ara yüzey
alanını arttırması ve aromatik halka ve ona bağlı bir R grubunun oluşturduğu hidrofob
bir gruba sahip olması ile açıklanabilir. Ayrıca Triton X-100’ün hücre duvarı
geçirgenliğini arttırdığı ve bu sayede hücreye bağlı enzimler üzerine etki ettiği de
bilinmektedir (López et al. 2005). %0.5 Triton X-100’ün ise indükleyici olarak etkisi
gözlenememiştir, hatta inhibisyon etkisi yarattığı görülmüştür.
En yüksek lipolitik aktivite, karbon kaynağı olarak %1 Triton X-100 içeren ortamda
gözlense de, doğal bir karbon kaynağı olması nedeniyle bitkisel yağlardan %1 soya yağı
karbon kaynağı olarak kullanılarak en iyi azot kaynağının belirlenmesinin amaçlandığı
deneyler yapılmıştır. Azot kaynaklarından öncelikle, organik ve inorganik azot
kaynaklarının lipaz aktivitesi üzerine etkisini karşılaştırmak amacıyla %5 pepton, %5 üre
ve %5 amonyum sülfat içeren ortamlar kullanılmıştır. Ortamlardaki azot kaynakları ve
derişimleri, literatür çalışmaları esas alınarak belirlenmiştir (Shirazi et al. 1998, Saxena
et al. 1999, Sharma et al. 2001). En yüksek aktiviteler sırasıyla %5 pepton, %5 üre ve
%5 amonyum sülfat içeren ortamlarda gözlenmiştir. Bu çalışmadan elde edilen başka bir
sonuç, mikroorganizmanın ürettiği enzimin organik azot kaynaklarını kullandığı zaman
daha iyi lipolitik aktivite göstermesidir. Saccharomyces cerevisiae’dan lipaz üretimine
ortam koşullarının etkisinin araştırıldığı bir çalışma da, deney bulgularını destekler
niteliktedir (Shirazi et al. 1998). Daha sonraki deney setinde, ön çoğalma ortamlarında da
azot kaynağı olarak kullanılan %0.5 pepton + % 0.3 maya özütü, %0.5 pepton, %0.3
146
maya özütü, %1 pepton + %0.3 maya özütü içeren ortamlar denenmiştir. Aktiviteler en
yüksekten en düşüğe doğru sırasıyla, %0.5 pepton + % 0.3 maya özütü > %0.3 maya
özütü > %0.5 pepton > %1 pepton + %0.3 maya özütü şeklindedir. Spesifik aktivitelerde
de bu sıra değişmemektedir. Elde edilen sonuçlar değerlendirilecek olursa, peptonun tek
başına kullanımı hücre çoğalması için iyi sonuç vermekte, ancak lipolitik aktivite üzerine
maya özütü gibi etkili olamamaktadır. Maya özütünün tek başına kullanımı ile peptonla
birlikte kullanımı arasında aktiviteler açısından fazla bir fark yoktur. Bu durumda maya
özütü yüksek aktivite elde etmede tek başına bile kullanılabilir. Maya özütünün daha iyi
sonuç vermesi, peptondan biraz daha fazla azot içermesi ve yapısındaki ekstra iyonların
varlığından kaynaklanabilir (Çetin 1983). %1 Pepton aktivitede inhibisyon yaratmıştır.
Bunun yanı sıra maya özütünü yalnız kullanmak yerine peptonla birlikte kullanmak
mikroorganizmanın aktivite gösterme süresini uzatmaktadır. Bir sonraki deney setinde,
%1 üre, %0.5 pepton + %0.5 malt özütü, %0.5 pepton + %0.5 lizin, %0.5 pepton + %0.5
arjinin azot kaynağı olarak denenmiştir. Lizin ve arjinin amino asitlerdir. Ortamlar, en
yüksek aktivite elde edilenden en düşük aktivite elde edilene doğru sıralanırsa, %0.5
pepton + %0.5 malt özütü > %1 üre > %0.5 pepton + %0.5 lizin > %0.5 pepton + %0.5
arjinin olduğu görülür. Spesifik aktiviteler de aynı şekilde sıralanmaktadır. Amino
asitlerin tek başlarına kullanımı lipaz aktivitesinde de çoğalmada da iyi sonuç
vermemektedir. Malt özütü, özellikle mayaların agar besi ortamlarında azot kaynağı
olarak kullanılmaktadır; nitekim hücreler en çok pepton ve malt özütü içeren ortamda
çoğalmıştır. Bununla birlikte peptonla birlikte malt özütünün kullanımı aktivite gösterme
süresini kısaltmıştır. Üre tek başına kullanıldığı halde aktivitede iyi bir sonuç vermiştir,
ancak hücreler üre içeren ortamda iyi çoğalamamıştır. Ürenin %5 derişimi inhibisyon
yaratmıştır. Azot kaynaklarının denendiği son deney setinde, unlar ve aktivitede iyi
sonuç alınan maya özütünün farklı derişimlerini içeren ortamlar çalışılmıştır. Bu amaçla,
%0.5 maya özütü, %1 maya özütü, %1 soya fasulyesi unu, %1 beyaz buğday unu ve %1
mısır unu denenmiştir. Maya özütünün %0.3’lük derişimi lipazı aktivite gösterebilmesi
için yetersiz kalmış, %1’lik derişimi ise inhibisyon etkisi göstermiştir. Maya özütünün
%0.5 derişimi ise lipolitik aktivite açısından uygun bir derişim değeridir. Soya unu,
denenmiş tüm azot kaynaklarından daha yüksek bir lipaz aktivitesi ve hücre çoğalması
gözlenmesini sağlamıştır. Soya unundan sonra en yüksek aktivite veren ortamlar, %0.5
maya özütü ve %1 maya özütü içeren ortamlardır. Buğday ve mısır unları 40. saatte bile
147
aktivite gösterememiştir. Spesifik aktiviteler için de aynı sıralama geçerlidir. Hücre
çoğalması açısından ise, unların diğer azot kaynaklarından daha iyi olduğu
görülmektedir. Sonuç olarak Debaryomyces hansenii, karbon kaynağı olarak soya yağını
tercih ederken, azot kaynağı olarak da soya ununu tercih etmektedirler. Soya ununu
tercih etmelerinin nedeni, bu unun %40 gibi oldukça yüksek bir değerde azot içermesidir
(http://www.fao.org, 2006).
Lipaz aktivitesine ortam pH’ının etkisinin incelenirken karbon kaynağı olarak daha
önceki çalışmalar sonucunda en iyi aktivitenin gözlendiği %1 soya yağı, azot kaynağı
olarak ise %1 soya unu kullanılmıştır. Mayalar için düşük pH uygun olduğu için
öncelikle düşük pH’lar denenmiş, pH artırıldıkça lipolitik aktivitenin artması üzerine
daha yüksek pH’ların da denenmesine karar verilmiştir. Lipolitik aktiviteye karbon
kaynaklarının etkisinin incelendiği deneylere başlanmadan önce ise bir ön çalışma
yapılmış ve pH=4.5, 5.5 ve 6.5 arasında en uygunu daha kısa sürede aktivite gözlendiği
için pH 4.5 olarak belirlenmiştir. Bu kez en iyi karbon ve azot kaynakları ile sitrik asit
tamponu kullanılarak pH=3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 ve 6.0 denenmiştir. Sonuçlar
değerlendirildiğinde en iyi aktivitenin pH=6.0’da gözlendiği görülmektedir. pH arttıkça
aktivite gösterme süresi uzamaktadır. pH=3.5, 4.0, 4.5 için maksimum aktiviteler 24.
saatte gözlenirken, pH=5.0, 5.5 için 48. saatte, pH=6.0 için ise 72. saatte gözlenmiştir.
pH=6.0’da enzim hem daha yüksek aktivite göstermekte, hem de aktivitesini yüksek
aktivitesini uzun süre koruyabilmektedir. Mikroorganizma en fazla pH=6.0’da
çoğalmakla birlikte, en yüksek hücre çoğalma hızı pH=5.0’tedir. Spesifik aktiviteler
çoktan aza doğru, pH=3.5 > 4.5 > 4.0 > 6.0 > 5.0 > 5.5 olarak sıralanmaktadır. Sonuç
olarak yüksek pH’larda aktivite değerleri, düşük pH’larda ise spesifik aktivite değerleri
daha yüksek bulunmuştur. pH=6.0’daki aktivite, kendisinden sonra gelen pH=5.5’deki
aktivitenin iki katı kadardır. Bu durumda daha yüksek pH’ların da denenmesinin uygun
olduğu düşünülmüştür. Bundan sonraki deney setinde, pH=6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5
denenmiştir. Tampon olarak yine sitrik asit tamponu kullanılmıştır. Sonuçlar
değerlendirildiğinde en iyi aktivitenin pH=6.5’ta elde edildiği görülmektedir. Bu sonuçla
birlikte denenen bütün pH’lar arasında en yüksek enzim aktivitesini veren pH 6.5
olmuştur. pH arttıkça aktivite gösterme süresi uzamış; ancak enzim aktivitesini daha
uzun süre koruyabilmiştir. pH arttıkça spesifik aktiviteler ise azalmıştır. Denenen tüm
148
pH’lar arasında en yüksek spesifik aktiviteyi pH=3.5 vermiştir. Mikroorganizma
çoğalması açısından ortamları kıyaslarsak en iyi çoğalmanın pH=5.5’ta olduğunu
görürüz. pH=5.5’tan itibaren ortam pH’ı arttıkça çoğalmanın azaldığı gözlenmektedir.
Bununla birlikte en yüksek hücre çoğalma hızı pH=5.0’te gözlenmektedir. Sonuç olarak
bundan sonraki sıcaklık deneylerine pH=6.5 ile devam edilmesi uygun görülmüştür.
Lipaz aktivitesine sıcaklık etkisinin incelendiği çalışmalarda karbon kaynağı olarak daha
önceki çalışmalar sonucunda en iyi aktivitenin gözlendiği %1 soya yağı, azot kaynağı
olarak ise %1 soya unu kullanılmış ve pH=6.5 değerinde çalışılmıştır. T=30oC, 35oC ve
40oC’ın lipolitik aktivite ve hücre çoğalmasına etkisi incelenmiştir. Lipolitik aktivite
sonuçları göstermiştir ki, sıcaklık arttıkça aktivite düşmektedir. En yüksek aktivite değeri
T=30oC’ta gözlenmekle birlikte bu değere 64. saatte ulaşılabilmiştir. Bunu sırasıyla
T=35oC ve 40oC izlemekte; en iyi aktiviteler T=35oC’ta 40. saatte, T=40oC’ta ise 24.
saatte gözlenmektedir. T=30oC hem en yüksek aktivitenin gözlenebildiği sıcaklık, hem
de bu aktivitenin korunabildiği sıcaklık olarak diğer sıcaklıklara tercih edilebilir.
Bununla birlikte T=35oC ve 40oC da T=30oC’la karşılaştırıldığında daha kısa sürede
aktivitenin gözlenebildiği ve T=30oC’taki ile kıyaslandığında maksimum aktivitelerinin
düşük kalmaması açısından endüstriyel olarak enzim üretiminde çalışılabilecek koşullar
olarak görülmektedir. Aktivitenin yüksek olduğu sıcaklıkta protein derişimi de yüksek
olduğu için spesifik aktiviteler çoktan aza doğru T=40oC, 35oC ve 30oC sıcaklıklarda
gözlenmiştir. T=40oC’taki maksimum spesifik aktivite T=35oC’takinden yaklaşık iki,
T=30oC’takinden yaklaşık üç kat fazladır. Sıcaklığın hücre çoğalması üzerindeki etkisi
düşünüldüğünde, sıralama aktivitedeki sıralamayla aynıdır. En iyi çoğalma, çoğalma
eğrileri dikkate alınarak T=30oC’ta gözlenmiş olup, bu sıcaklığı 35oC ve 40oC
izlemektedir. T=40oC’taki hücre çoğalması diğer sıcaklıkların yanında oldukça düşük
kalmaktadır. Özgül çoğalma hızları karşılaştırıldığında da sıralama değişmemekte ve en
hızlı çoğalma mikroorganizmanın katıdaki çoğalma sıcaklığı olan T=30oC’ta
gözlenmektedir.
Lipaz aktivitesine farklı iyonların etkisinin incelendiği deneylerde, karbon kaynağı
olarak daha önceki çalışmalar sonucunda en iyi aktivitenin gözlendiği %1 soya yağı, azot
kaynağı olarak ise %1 soya unu kullanılmış; pH=6.5 ve T=30oC da çalışılmıştır. Bu
149
amaçla seçilen metal tuzları, NaCl, LiCl, KCl, MgCl2, CaCl2, ZnCl2, Na2SO4, K2SO4 ve
MgSO4’tür. Deneylerde bu metal tuzlarının 1 mM derişimleri kullanılmıştır. Daha önceki
deneylerde en yüksek aktivitenin gözlendiği saat olan 48. saatte üretim ortamlarından
örnekler alınarak hem lipaz aktivitelerine hem de hücre derişimlerine bakılarak iyonların
mikroorganizma çoğalma ve lipolitik aktiviteye etkisi belirlenmiştir. Aktivite sonuçları
karşılaştırıldığında bazı iyonların lipolitik aktiviteyi stimüle ederken, bazılarının inhibe
ettiği görülmektedir. KCl ve K2SO4 ile lipolitik aktiviteyi artırmaktadır. Özellikle KCl
aktiviteyi yaklaşık 1.5 katına çıkararak metal tuzları arasında en iyi sonucu vermiştir.
Metal tuzları arasında KCl’den sonra K2SO4 gelmekte olup o da aktiviteyi yaklaşık 1.2
katına çıkarmıştır. Lipolitik aktiviteyi artıran diğer tuzlar ise sırasıyla, MgCl2 ve
Na2SO4’tür. Bu tuzlar varlığında aktivite çok az bir artış göstermektedir. Aktivite
üzerinde inhibisyon yaratan tuzlar da vardır; bunlar arasında en fazla inhibisyon etkisi
gösteren tuz CaCl2’dir. CaCl2’den sonra en fazla inhibisyon yaratanlar sırasıyla, LiCl,
MgSO4, NaCl ve ZnCl2’dir. Tuzlar hücre çoğalması açısından karşılaştırıldığında ise
ZnCl2 ve MgCl2 içeren ortamlar dışındaki diğer tüm ortamlarda mikroorganizma
derişimlerinin kontrol amacıyla konulan ortamından az olduğu görülmüştür. Hücre en
fazla MgCl2 içeren ortamda, en az KCl içeren ortamda çoğalmaktadır. Lipolitik aktivite
sonuçları göstermiştir ki, potasyum lipaz aktivitesi açısından önemli bir katyondur. Soya
ununun potasyumca zengin oluşu (Çetin 1983) ve en yüksek aktivitelerin ortama azot
kaynağı olarak soya unu konulduğu zaman gözlenmesi de bir kez daha bu katyonun
mikroorganizmanın enzim üretimindeki önemini ortaya koymaktadır. En fazla
aktivitenin gözlendiği KCl içeren ortamda hücre çoğalmasının en az miktarda gözlenmiş
olması, mikroorganizmanın bu iyonu çoğalmadan başka faaliyetlerde kullandığını
göstermektedir. MgCl2 içeren ortamda hem yüksek lipolitik aktivite elde edilebilmekte,
hem de hücre çok çoğalmaktadır. Magnezyum TCA çevriminde enerji elde etmede
kullanıldığı için mikroorganizma için yaşamsal bir önem kazanmaktadır. MgCl2
düzlemsel bir tuz oluşturduğu için neden olduğu sterik etki de azdır. Ancak MgSO4
içeren ortam için aynı durum söz konusu değildir, bu bize katyonlar kadar anyonların da
aktivite ve hücre çoğalmasında etkili olduğunu göstermektedir. Na2SO4 tuzu aktivite ve
hücre çoğalmasında NaCl’den daha iyi sonuç vermektedir. Lityum güçlü bir alkalidir;
böyle bir ortamda enzim kararlı olamayabilir. LiCl içeren ortamda aktivitede düşüş
gözlenmiştir. Ağır metallere bir örnek oluşturan ZnCl2 beklendiği gibi enzim aktivitesini
150
inhibe etmiştir. +2 değerlikli katyonlar ikili tuz oluşturabilme yeteneğine sahiptir. Bu
sayede yağ- su ara yüzeyinde hidroliz sonucu oluşan yağ asitleriyle kompleks oluşturarak
yağ asitlerinin ara yüzeyden uzaklaşmasını sağlayıp lipazın serbestçe diğer yağ
moleküllerine etki etmesini kolaylaştırarak lipolitik aktiviteyi artırırlar (Sharon et al.
1998). Bu aşamada yağ asitlerinin uzaklaştırılması hız kontrol edici basamak olarak
düşünülmelidir. CaCl2 içeren ortamda lipolitik aktivitede inhibisyon gözlenmesi,
Ca+2’nin proteaz enzimi için kofaktör oluşuyla ilişkilendirilebilir. Genellikle +2
değerlikli katyonların klor tuzları hücre çoğalmasında daha etkilidir. +1 değerlikli
katyonların ise sülfat tuzlarını içeren ortamlar, klorür tuzlarını içeren ortamlardan hücre
çoğalmasının daha fazla gözlendiği ortamlardır. Metal tuzları arasında en yüksek
aktivitenin gözlendiği KCl’nin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine etkisinin
incelendiği deneylerde, 1 mM KCl derişimine ek olarak 5, 10, 15 mM’lık tuz derişimleri
denenmiş ve tuz toleranslı bir mikroorganizma (http://www.ebi.ac.uk, 2007) olduğu
bilinen D. hansenii için yüksek aktivite 10 mM KCl içeren ortamda gözlenmiştir.
Üretilen lipazın kısmi saflaştırılması ve deterjan katkı maddeleriyle birlikte kullanımı
D. hansenii’den lipaz üretimi için en uygun parametreler belirlendikten sonra en iyi
koşullarda lipaz üretimi gerçekleştirilerek zamanla hücre içi ve hücre dışı lipaz
aktiviteleri spektrofotometrik ve titrimetrik olarak belirlenmiş, bunun yanı sıra lipazı ve
kendini parçalama özelliği olan proteaz enziminin de zamanla aktivitesi izlenmiştir.
Sonuç olarak mikroorganizmanın ürettiği enzimlerin çoğunu dışarı salgıladığı
görülmüştür. Titrimetrik yöntemle hücre içi lipaz aktivitesi gözlenmemiştir. Titrimetrik
yöntemle substrat ve sıvı ara yüzeyinde etkin lipazın, spektrofotometrik yöntemle ise
substratın sıvıda çözünebildiği durumlarda substrata etki eden esterazın aktivitesi
ölçülmektedir (Bornscheuer 2002). Titrimetrik yöntemle en yüksek lipaz aktivitesi
gözlendikten sonra (24. saat) spektrofotometrik yöntemle en yüksek hücre dışı lipaz
aktivitesi gözlenmektedir (40. saat). Proteaz aktivitesi hücre içinde de hücre dışında da
gözlenmiş olup hücre içinde azalırken hücre dışında artıp sabitlenmektedir. Hücre dışı
proteaz aktivitesi artış gösterdikten sonra yaklaşık olarak sabit bir değere ulaştığı zaman,
spektrofotometrik yöntemle belirlenen hücre dışı lipaz aktivitesi düşmeye başlamıştır.
151
Lipolitik aktivite için en iyi koşullar belirlendikten sonra bu koşullarda (pH=6.5,
T=30oC, karbon kaynağı; %1 soya yağı, azot kaynağı; %1 soya unu, 10 mM KCl içeren
ortam) üretilen enzimin saflaştırılması için çalışmalar yapılmıştır. Bunun için öncelikle
enzim saflaştırmada sıkça kullanılan amonyum sülfat çöktürmesi yapılmıştır. Amonyum
sülfat çöktürmesi son hacim % 40 amonyum sülfat içerecek şekilde gerçekleştirilmiştir.
Amonyum sülfat çöktürmesinden sonra ortamdaki tuzu uzaklaştırmak amacıyla 20 saat
süreyle damıtık suya karşı diyaliz yapılmıştır. Diyaliz sonrası ultrafiltrasyon yapılarak 5
kDa’un altında molekül ağırlığına sahip moleküllerin ortamdan uzaklaştırılması
sağlanmıştır. Saflaştırma işlemlerinden sonra elde edilen ürünün çok viskoz oluşu, bize
en yüksek aktiviteyi veren soya unu içeren üretim ortamın saflaştırma aşamaları için
uygun bir ortam olmadığını göstermiştir. Bundan yola çıkılarak un içermeyen % 0.5
maya özütü ve %1 soya yağı içeren berrak bir ortamın enzim saflaştırmada
kullanılabileceği sonucuna varılmıştır (pH=4.5). Bu ortam için de öncelikle amonyum
sülfat çöktürmesi yapılmıştır. Amonyum sülfat derişimi % 20’den % 40’a, % 40’tan %
80’e çıkarılmıştır. Ortamın yağlı olması, protein derişiminin az olması sebebiyle protein
çöktürmesinde sorun yaşanmıştır. Gerek karbon kaynağı olarak yağ kullanıldığında
enzimin yüzeydeki yağla hidrofobik etkileşimi sonucunda çökmemesi ve genel olarak az
olan proteinin bu şekilde kaybedilmesi, gerekse amonyum sülfat çöktürmesi sonrası elde
edilen hacmin çok az olması nedeniyle bundan sonraki saflaştırma işlemlerinde
amonyum sülfat çöktürmesi yapılmamıştır.
Saflaştırmada, un ve yağ içermeyen, protein derişiminin ve aktivitenin yüksek olduğu,
karbon kaynağı olarak Triton X-100, azot kaynağı olarak %0.5 pepton ve %0.3 maya
özütü içeren lipaz üretim ortamına hücre çöktürme, ultrafiltrasyon ve iyon değişim
kromatografisi olmak üzere birkaç saflaştırma basamağı uygulandıktan sonra elde edilen
sonuçlar değerlendirildiğinde verimin zamanla aktivite kaybından dolayı azalmasının
dışında saflaştırma katının her basamakta arttığı görülmektedir ki, bu da saflaştırmanın
başarılı olduğunu göstermektedir.
Saflaştırmanın son basamağı olan iyon değişim kolonundan izoelektrik noktalarına göre
fraksiyonlar halinde çıkan proteinlerin aktivite tayinleri ve SDS-PAGE sonuçları
göstermiştir ki, mikroorganizmanın ürettiği lipaz izoelektrik noktası 8.3’ten büyük,
152
molekül ağırlığı 25-40 kDa arasında değişen bir lipazdır. SDS-PAGE sonuçlarında,
aktivite gösteren fraksiyon grubu için diğer fraksiyon gruplarından farklı olarak üç
değişik bant gözlenmesi, lipazın izoelektrik noktaları 8.3’ten büyük üç farklı izoformu
olabileceğini göstermektedir. Kısmen saflaştırılmış lipaz enzimi, anyon değişim
kromatografisi yerine katyon değişim kromatografisi yapılırsa tamamen saf bir enzim
elde edilebilir.
Kısmen saflaştırılmış olan lipazın deterjan katkısı olarak %1 derişimde SDS, proteaz,
amilaz, Triton X-100 ve H2O2 ile %0.25 EDTA varlığındaki kararlılığı
değerlendirildiğinde, deterjan katkıları varlığında aktivitesinin büyük çoğunluğunu
koruyabildiği için enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu
belirlenmiş, Triton X-100 içeren ortamda aktivitesinin daha da arttığı gözlenmiştir ki,
literatürde başka lipazlar için bunu destekleyen sonuçlara (Hemachander and
Puvanakrishnan 2000) rastlanmıştır.
153
KAYNAKLAR
Anonim. 2006. Web sitesi: http://www.fao.org, Erişim Tarihi: 22.08.2006.
Anonim. 2007. Web sitesi: http://yunus.hacettepe.edu.tr, Erişim Tarihi: 20.04.2007
Anonim. 2007. Web sitesi: http://foodwaste-milk.tripod.com/whey/, Erişim Tarihi:
21.07.07
Anonymous. 2005. Web sitesi: http://www.mapsenzymes.com, Erişim Tarihi:
26.10.2005
Anonymous. 2005. Web sitesi: http://www.housekeepingchannel.com, Erişim
Tarihi: 26.10.2005
Anonymous. 2006. Web sitesi: http://www.novozymes.com, Erişim Tarihi: 05.04.2006
Anonymous. 2007. Web sitesi: http://www.ebi.ac.uk, Erişim Tarihi: 04.06.2007
Anonymous, 1987. Standart Methods for Analysis of Oils, Fats and Derivates,
International Union of Pure and Applied Chemistry, 7 th ed. Blackwell
Scientific Publications, IUPAC Method 2.301.
Besancon, X., Ratomahenına, R. and Galzy, P. 1995. Isolation and partial
characterization of an esterase (EC 3.1.1.1) from a Debaryomyces hansenii
strain. Neth Milk Dairy J., 49; 97-110.
Bornscheuer, U. T. 2002. Microbial carboxyl esterases : classification, properties and
application in biocatalysis. FEMS Microbiology Reviews, 26; 73-81.
Bradford, M. M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding. Anal. Biochem., 72; 248-254
Buzzini, P. and Martini, A. 2002. Extracellular enzymatic activity profiles in yeast and
yeast-like strains isolated from tropical environments. Journal of Applied
Microbiology, 93; 1020-1025.
Cernia, E., Deflini, M., Cocco, E., Palocci, C. and Soro, S. 2002. Investigation of lipase-catalysed hydrolysis of naproxen methyl ester : Use of NMR spectroscopy methods to study substrate-enzyme interaction. Bioorganic Chemistry, 30; 276-284.
Chaplin, M. F. and Bucke, C. 1990. Enzyme Technology. Cambridge University Press,
p. 139-143, Cambridge-Great Britain.
154
Çetin, E. T. (edt.). 1983. Endüstriyel Mikrobiyoloji, 1. baskı. İstanbul Tıp Fakültesi
Vakfı-BAYDA Yayını, Fatih Gençlik Vakfı Matbaa İşletmesi, s.147.
Çizmeci, M., Musavi, A., Kayahan, M. and Tekin, A. 2005. Monitoring of Hydrogenation with Various Catalyst Ratios. J. Amer. Oil Chem. Soc., 82; 925-929. Fernández-Espinar, M.T., Esteve-Zarzoso, B., Querol, A. and Barrio, E. 2000. RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacers and the 5.8S rRNA gene region of the genus Saccharomyces : a fast method for species identification and the differentiation of flor yeasts. Antonie van Leeuwenhoek, 78; 87-97.
Gandhi, N.N. 1997. Review: Applications of Lipase. Journal of American Chemist’s
Society, 74; 621-634.
Gillis, A. 1988. Research discovers new roles for lipases. J. Am. Oil Chem. Soc., 65;
846-850.
Hemachander, C. and Puvanakrishnan, R. 2000. Lipase from Ralstonia pickettiias an
additive in laundry detergent formulations. Process Biochemistry, 35; 809-
814.
Hung, T., Gridhar, R., Chiou, S. and Wu., W. 2003. Binary immobilization of Candida
rugosa lipase on chitosan. J. Mol. Catal. B : Enzymatic, 26; 69-78.
Kirk, O., Borchert, T. V. and Fuglsang, C.C. 2002. Industrial enzyme applications.
Current Opinion in Biotechnology,13; 345-351.
Kumar, C. G., Malik, R. K. and Tiwari, M. P. 1998. Novel enzyme-based detergents:
An Indian perspective. Indian Institute of Science Issue, 75; 1312-1318.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685.
López, E., Deive, F. J., Longo, M. A. and Sanromán, M. A. November 15-18, 2005.
Effect of inducers on lipase production by Rhizopus oryzae, 10 th
Mediterranean Congress of Chemical Engineering, Barcelona Spain.
Maurer, K. 2004. Detergent Proteases. Current Opinion in Biotechnology 15; 330-
334.
Mitidieri S., Martinelli, A. H. S., Schrank, A. and Vainstein, M. H. 2006. Enzymatic
detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A
comperative study with commercial detergent formulations. Biosource
Technology, 97; 1217-1224.
155
Moon, S.H. and Parulekar, S. J. 1991. A parametric study of protease production in
batch and fed-batch cultures of Bacillus firmus, Biotechnol. Bioeng., 37; 467-
483.
Pandey, A., Benjamin, S., Soccol, C. R., Nigam, P., Krieger, N. and Soccol, V.T. 1999.
Review: The realm of microbial lipases in biotechnology. Biotecnol. Appl.
Biochem., 29; 119-131.
Paškevičius, A. 2001. Lipase activity of yeasts and yeast-like fungi functioning under
natural conditions. Biologija, 4; 16–18.
Saxena, R.K., Ghosh, P.K., Gupta, R., Davidson, W.S., Bradoo, S. and Gulati, R. 1999.
Microbial Lipases: Potential Biocatalysts for the future industry. Curr. Sci.,
77; 101-115.
Saxena, R.K., Sheoran, A., Giri, B. and Davidson, W. S., 2003. Purification strategies
for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods, 52; 1-18.
Schmid, R.D. and Verger, R. 1998. Lipases : Interfacial Enzymes with Attractive
Applications. Angew. Chem. Int. Ed., 37; 1608-1633.
Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee, U.C. 2001. Research review paper: Production,
purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology
Advances, 19; 627-662.
Sharon, C., Nakazato, M., Ogawa, H. and Kato, Y. 1998. Lipase-induced hydrolysis of
castor oil: effect of various metals. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology, 21; 292-295.
Shirazi, S.H., Rahman, S. R. and Rahman, M.M. 1998. Short communication:
Production of extracellular lipases by Saccharomyces cerevisiae. World
Journal of Microbiology&Biotechnology, 14; 595-597.
Svendsen, A. 2000. Review: Lipase protein engineering. Biochimica et
Biophysica Acta , 1543, 223-238.
Starace, C. A. 1983. Detergent Enzymes-Past, Present and Future. J. Am. Oil Chem.
Soc., 60; 1025-1027.
Şenelt, S. 1982. Natürel ve rafine ayçiçek yağlarının yağ asitleri bileşiminin gaz
kromatografik analiz yöntemi ile aydınlatılması ve rafinasyonun yağ asitleri
156
bileşimi üzerine etkisinin incelenmesi. Yüksek Lisans Tezi. Ankara
Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı, Ankara.
Takashi, S., Takashima, M., Shinoda, T., Suto, H., Unno, T., Tsuboi, R., Ogawa, H. and
Nishikawa A. 2002. New Yeast Species, Mallassezia dermatis, Isolated from
Patients with Atopic Dermatitis. Journal of Clinical Microbiology, 40; 1363-
1367.
Telefoncu, A. 1997. Enzimoloji Lisansüstü Yaz Okulu, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi
Baskısı, s. 249-306, Kuşadası-Türkiye.
Wei, D., Zhang, D. and Song., Q. 2004. Studies on a novel carbon source and
cosolvent for lipase production for Candida rugosa. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol., 31; 133-136.
Ünlü, A. E. 2004. Candida rugosa lipazının özellikleri ve enantiyoseçimliliğinin
artırılması. Seminer. Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı,
Ankara.
157
EKLER
EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler
EK 2 Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Bileşenleri
EK 3 Spektrofotometrik Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı
EK 4 Titrimetrik Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı
EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği
EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı
EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği
EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği
EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi
EK 10 5.8S rRNA ve 26S rRNA Analizi
EK 11 BLAST Sonuçları
158
EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler
Kimyasal / Biyokimyasal Madde Firma Katalog No
Agar Scharlau 07-004
Agaroz Merck 1.12239
Akrilamid Bio-Rad 161-0148
α-Amilaz Sigma A6380
Amonyum persülfat Bio-Rad 161-0700
Amonyum sülfat Sigma A4915
Asetik asit Merck 1.00063
Aseton Merck 1.00013
Brillant Blue G Sigma B0770
BSA Sigma A9647
Çinko klorür Merck 1.08816
D-(+)-glukoz monohidrat AppliChem A1343
DNA izolasyon kiti NucleoSpin Tissue 740952.50
Macherey-Nagel
EDTA Sigma E9884
Etanol Merck 1.11727
Fosforik asit Merck 1.00573
Gliserol Sigma G5516
Gümüş boyama kiti Bio-Rad 161-0449
(Silver Stain Plus)
Hidrojen peroksit Merck 1.08597
Hidroklorik asit Merck 1.00314
Kalsiyum klorür dihidrat AppliChem A4689
Kazein Sigma C5890
Linoleik Asit Sigma L1376
Litikaz (Arthobacter luteus’tan) Sigma L2524
Lityum klorür Merck 1.05679
L-arjinin Merck 1.01542
159
EK 1 (devam)
L-lizin monohidrat Merck 1.12233
Magnezyum klorür hegzahidrat Fluka 63065
Magnezyum sülfat heptahidrat Merck 1.05886
Malt özütü Scharlau 07-080
Marker Fermantas SM1811
Marker Invitrogen 10747-012
Maya özütü Scharlau 07-079
Oleik asit Sigma O1630
Palmitik asit Sigma P5585
Pepton Fluka 70171
Penisilin G kristalize potasyum İ.E. Ulagay ilaç Sanayi T.A.Ş.
Potasyum klorür Scharlau PO0200
Potasyum sülfat Merck 1.05153
p-nitrofenil palmitat Sigma N2752
Proteaz Sigma P5380
SDS AppliChem A2263
Sitrik asit monohidrat Merck M0242
Sodyum fosfat dibazik Fluka 71649
dodekahidrat
Sodyum hidroksit AppliChem A1551
Sodyum karbonat Scharlau SO0116
Sodyum klorür AppliChem A2942
Sodyum sülfat Merck 1.06643
Sodyum tetraborat dekahidrat Sigma S9640
Stearik asit Sigma S4751
TCA Merck 1.00810
TEMED Bio-Rad 161-0801
Triasetin Sigma T5376
Tribütirin Sigma T8626
Tristearin Sigma T5016
160
EK 1 (devam)
Trioktanoin Sigma T9126
Triolein Sigma T7752
Tripalmitin Sigma T5888
Triton X-100 Sigma T8787
Trisma-baz Sigma T6066
Üre Merck 1.08488
161
EK 2 Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Bileşenleri
Bileşenler Miktar
Damıtık su 37.7 µl, 36.7 µl , 35.7 µl
10x PCR Tamponu 5 µl
dNTP Karışımı 1 µl
Primer Karışımı 1 µl
MgCl2 (1 mM, 1.5 mM, 2mM) 2 µl , 3 µl , 4 µl
Taq DNA Polimeraz 0.3 µl
DNA Kalıp 2 µl
Toplam Miktar 50 µl
162
EK 3 Spektrofotometrik Aktivite Örnek Hesabı
PNFP + H2O lipaz PNF + palmitik asit
Bir ünite enzim (U), bir dakikada 1 µmol PNF açığa çıkarmak için gerekli enzim
miktarı olarak tanımlanmıştır.
Monokromatik ışın demetleri için geçerli olan Lambert-Beer Kanununa göre;
A = ε b C
∆A = ε b ∆C ( b = 1 cm, ε = 13290 L/mol.cm )
Burada ε, PNF’nin farklı derişimlerinin 404 nm’de absorbansları okunarak
oluşturulmuş (A-bC) grafiğinin eğiminden bulunmuştur.
Lambert-Beer denklemi aktivite tanımı için kullanılırsa :
TVLml
molmolcm
cmmolL
t1.
110.
101.1.
.13290
3
6 µ=
∆∆Α
∆t ( reaksiyon süresi ) = 5 dakika
VT ( toplam çözelti hacmi ) = 4 ml
mlLml
molmolcm
cmmolL
dk 41.
110.
101.1.
.13290
5
3
6 µ=
∆Α
moldk µ4.1013290
5 3=∆Α
=∆Α
dkmolµ.
13290.54.10. 3
Ünite
163
=∆Αdkmolµ.06,0. Ünite
Örnek hacmi 1 ml olduğu için Ünite = Ünite/ml’dir.
164
EK 4 Titrimetrik Aktivite Örnek Hesabı
Yağ asit esteri + H2O lipaz yağ asidi + gliserol
Bir ünite enzim (U), bir dakikada 1 µmol yağ asidi açığa çıkaran enzim miktarı olarak
tanımlanmıştır.
U/ml enzim = dkmlörnek
NaOHmlkörmlörnek NaOHharcananharcanan
30*),(1*1000*][*),,( )(−
U/ml enzim = dkml
Nmlkörmlörnek NaOHharcananharcanan
30*)1.0(
1*1000*)1.0(*),,( )(−
165
EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği
y = 0.7705xR2 = 0.9884
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Tirozin Derişimi
Abs
orba
ns (
275
nm )
166
EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı
Bir ünite enzim (U), bir dakikada 4 nmol tirozin açığa çıkaran enzim miktarı olarak
tanımlanmıştır.
U/ml enzim = (tirozin derişimi, µmol/ml) * F * (1000 nmol)
4 * 20 dk * 1 µmol
F= seyreltme faktörü=1
U/ml enzim = ((Absorbans / 0.7705 µmol) / (1 ml enzim)) * F * 1000 nmol)
4 * 20 dk * 1 µmol
U/ml enzim = Absorbans * 16.22
167
EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği
y = 0.5724xR2 = 0.9967
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Hücre derişimi, mg/ml
Abs
orba
ns (
600
nm )
168
EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği
153
EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi Esterleştirme Metodu (Anonymus 1987) Gaz Kromatografisi : ThermoQuest 2000 Dedektör : FID Kolon : Fused Silica Kapillar Kolon Teknoroma TRB-WaxOmega (30 mX0.25 mm I.D. ve 0.25 µm film kalınlığı) Taşıyıcı Gaz : He, 80 kPa Split Oranı : 1:85 Enjeksiyon Bloğu : 250oC
Kolon : 205oC Dedektör : 250oC
Palmitik
Asit
C16:0
Palmitoleik
Asit
C16:1
Stearik
Asit
C18:0
Oleik
Asit
C18:1
Linoleik
Asit
C18:2
Linolenik
Asit
C18:3
Araşidik
Asit
C20:0
Gadoleik
Asit
C20:1
Behenik
Asit
C22:0
Susam yağı (1) 7.163 0.130 3.733 31.716 55.733 0.065 0.333 0.209 0.918
Susam yağı (2) 5.959 0.108 3.632 35.995 53.032 0.115 0.297 0.189 0.673
Ayçiçek yağı 6.024 0.086 3.388 26.157 63.335 0.075 0.143 0.128 0.663
Soya yağı 13.798 0.136 3.396 25.059 51.208 5.623 0.313 0.248 0.219
Mısır yağı 12.199 0.172 1.822 27.679 56.777 0.859 0.296 0.194 0.002
Zeytin yağı 12.312 0.815 2.698 73.383 9.207 0.638 0.454 0.325 0.168
Keten yağı 6.348 0.130 4.234 18.851 14.540 55.035 0.166 0.243 0.453
Fındık yağı 5.789 0.221 2.448 78.273 13.150 0.119 0.000 0.000 0.000
154
EK 10 5.8S rRNA ve 26S rRNA ANALİZLERİ
PCR Optimizasyonu :
DNA Sekans Analiz Sonuçları :
F1R1-50-F TTGCCAGCGCTTAATTGCGCGGCGAAAAAACCTTACACACAGTGTTTTTTGTTGATGTACAAGAACTTTTGCTTTGGTCTGGACTAGAAATAGTGTTGGGCCAGAGGTTTACTGAACTAAACTTCAATA F1R1-50-R TCTTGAATTTAATCAACAAATTGACAATTAAATAAATAACAATTACAATATAAATATTGAAGTGTAGTTCAGTAAACCTCTGGCCCAAACTATTTCTAGTCCAGACCAAAGCAAAAGTTCTTGTAATAACAAAAAACACTTGTGTGGTAAGGTTTTTTCGCCGCGCAATTAAGCGCTAGGCAAAAAGAAT F1R1-55-F AAACCTTACACACAGTGTTTTTTGTTATTACAAGAACTTTTGCTTTGGTCTGGACTAGAAATAGTTTGGGCCAGAGGTTTACTGAACTAAACTTCAATATTTATATTGAATTGTTATTTATTTAATTGTCAATTTGTTGATTAAATTCAAAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCT CTTGG
50oC 55oC 60oC F1R1 F2R2 F1R1 F2R2 F1R1 F2R2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2 1 1.5 2
155
F1R1-55-R GAATTTAATCAACAAATTGACAATTAAATAAATAACAATTCAATATAAATATTGAAGTTTAGTTCAGTAAACCTCTGGCCCAAACTATTTCTAGTCCAGACCAAA F1R1-60-F GCGCGGCGAAAAAACCTTACACACAGTGTTTTTTGTGTATTACAAGAACTTGTTGCTTTGGTCTGGACTAGAAATAGTTTGGGCCAGAGGTTTACTGAACTAAACTTCAATATGTTATAT TGAATTGTTATTTATTGTAATTGTCAATTTGGTGTGATTAAATTCAAAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGGATCTCT F1R1-60-R GAATTTAATCAACAAATTGGACAATTGAAATAAATAACAATGTCAATATAAATATTGAAGTGTTAGTTCAGGTAAACCTCTGGCCCAAACTATTTCTAGTCCAGACCAAAGCAAAAGTTCTTGTAATAACAAAAAACACTGTGTGTAAGGTTTTT
F2R2-50-F CGGCGAGTGAAGCGGCAAATAGCTCAAATTTGAAATCTTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTGGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCTATGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATA TTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTGGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATGGTTGCGATCCTTTCCTTCTTGGTTGGGTTCCTCCCAGCTTACTGGGCCATCATCGGTATGGATGGTAGGATAATGACTAAGGAATGTGGCTCTACTTC F2R2-50-R GGTCTAGACAGGCAGTATGCAACCAAGGCTATAACACTCCACCGAAGTAGAGCCACATTCCTTAGTCATTATCCTACCATCCAAACCGATGCTGGCCCAGTAAGCTGCGAGGAACCCAACCAAGAAGGAAAGGATCGCAAAATACCAAGTCTGATCTCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCACTTTACATAGAATTGGGCATCTCATCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAGCCAACTCCAAAGTTACCTTCTTCAAATTACAACTCGGACACCGAAGGTGCCA
156
F2R2-55-F AAGCGGCAAAAGCTCAAATGTNGAAATCTGGCACCTTCGGTGTGCCGAGTTGTAATTTGGAAGAAGGTAACTTTGGAGTGTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTGCACAGAGGGTGAGAATGCCCGTGCGATGGAGATGCCCA F2R2-55-R ACAGGCAGTATCAACCAAGGCTATAACACTCCACCGAAGTAGAGCCACATTCCTTAGTCATTATCCTACCATCCAAACCGATGCTGGCCCAGTAAGCTGCGAGGAACCCAACCAAGAAGGAAAGGATCGCAAAATACCAAGTCTGATCTCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATGTTGACCAGCCCACTTAGGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCACTTTACATAGAATTGGGCATCTCATCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGAGCCAACTCCAAAGTTACCTTCTTCAAATCACAACTCGGACACCGAAGGTGCCAAATCTCAAAT F2R2-60-F TAACGGCGAGTGAAGCGGCAAATAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGGTTGTAATTTGAAGAAGGTAACTTTGGAGTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCTAGTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCGATCCTTTCCTTCTTGGTTGGGTTCCTCGCAGCTTACTGGGCCANCATCGGTTTGGATGGTAGGATAATGACTAAGGAATGTGGCTCTACTTCGGTGGAGTGTTATACCCTTGGTTGATACTGCCTGTCTAGACCGAGGACTGCGTCTTTTGACTAGGATGTGGGCATAATGATC F2R2-60-R AAAGACGCAGTCCTCGGTCTAGACAGGCAGTATCAACCAAGGCTATAACACTCCACCGAAGTAGAGCCACATTCCTTAGTCATTATCCTACCATCCAAACCGATGCTGGCCCAGTAAGCTGCGAGGAACCCAACCAAGAAGGAAAGGATCGCAAAATACCAAGTCTGATCTCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTGTAGTGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATGTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCACTTTACATAGGAATGTGGGCATCTCATCGCACGGGATGTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGAGCCAACTCCAAAGTTACCTTCTTCAAATCACAACTCGGACACCGAAGGTGCCAGATGTTCAAATGTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGT
157
EK 11 BLAST Sonuçları F1R1-55-F
158
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Banu Şükran ŞENGEL
Doğum Yeri : İzmir
Doğum Tarihi : 04.03.1981
Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu
Lise : Çankaya Yabancı Dil Ağırlıklı Lise, 1999
Lisans : Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi
Kimya Mühendisliği Bölümü, 2004
Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı, 2007
Yayınları
Şengel, B., Takaç, S., Dönmez, G. 5-8/09/2006. Mikrobiyal Kaynaklı Lipaz
Üretimine Karbon Kaynağı Olarak Bitkisel Yağların ve Glukozun Etkisi, 7. Ulusal
Kimya Mühendisliği Kongresi Bildiri Özetleri Kitabı, BT28.