ANKARA ÜNİVERSİTESİacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25049/burakderkus.pdf · EMREGÜL’e (Ankara...

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Anti-MİYELİN TEMELLİ PROTEİN TAYİNİ İÇİN İMPEDİMETRİK

İMMÜNOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ

Burak DERKUŞ

KİMYA ANABİLİM DALI

ANKARA 2012

Her Hakkı Saklıdır

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

Anti-MİYELİN TEMELLİ PROTEİN TAYİNİ İÇİN İMPEDİMETRİK İMMÜNOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ

Burak DERKUŞ

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. Emel EMREGÜL

Bu tez çalışmasında bir Multipl Skleroz (MS) oto-antikoru olan Anti-Miyelin Temelli Protein (Anti-Myelin Basic Protein, Anti-MBP)’in tayinine yönelik impedimetrik immünosensörler geliştirilmiştir. Biyouyuşabilirlikleri yüksek, biyokirlenmeleri az ve toksik olmamaları nedeniyle jelatin, kitosan ve aljinat doğal polimerleri ve bunların kombinasyonları kullanılarak hazırlanan platin elektrotlara MS’in biyobelirteçlerinden biri olan Miyelin Temelli Protein (Myelin Basic Protein, MBP) immobilize edilmiştir. Ayrıca yüksek yüzey alanları sayesinde immünosensörlerin duyarlılığını arttırmak ve tayin limitini düşürmek amacıyla titanyum dioksit (TiO2) nanopartikülleri kullanılmıştır. Jelatin/kitosan ve aljinat/kitosan kullanılarak hazırlanan immünosensörlerden istenilen impedimetrik yanıtlar alınamadığından çalışmaya jelatin, kitosan, aljinat ve jelatin/aljinat sistemleri ile devam edilmiştir. Polimer ve nanopartikül miktarları, çapraz bağlayıcı konsantrasyonları ve MBP konsantrasyonları Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) ve Çevrimsel Voltametri (CV) kullanılarak optimize edilmiş ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile yüzey karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. EIS, CV ve SEM ile yapılan karakterizasyon çalışmaları, MBP’nin taşıyıcı sistemlere etkin bir şekilde immobilize olduğunu göstermiştir. Tasarlanan immünosensörler düşük tayin limitlerine sahiptir ve geniş konsantrasyon aralıklarında doğrusal yanıt göstermektedir. TiO2 nanopartiküller kullanılarak hazırlanan immünosensörlerin daha düşük tayin limitlerine sahip oldukları görülmüştür. Geliştirilen immünosensörler MS’li hastalardan alınan Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS) ve serum’da Anti-MBP tayini için kullanılmış ve immünosensörlerin gerçek biyolojik örneklere uygulanabilirliği test edilmiştir. Ölçümler, serum Anti-MBP düzeyinin BOS Anti-MBP düzeyinden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kasım 2012, 152 sayfa Anahtar Kelimeler: Jelatin, Kitosan, Aljinat, TiO2 nanopartikül, Multipl Skleroz, Miyelin Temelli Protein, İmpedans Spektroskopisi, İmmünosensör.

ii

ABSTRACT

Master Thesis

DEVELOPMENT of IMPEDIMETRIC IMMUNOSENSOR for DETERMINATION of Anti-MYELIN BASIC PROTEIN

Burak DERKUŞ

Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Chemistry

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Emel EMREGÜL

In this thesis, impedimetric immunosensors were developed for detection of Anti-Myelin Basic Protein (Anti-MBP) which is a Multiple Sclerosis (MS) auto-antibody. Myelin Basic Protein (MBP), one of the MS biomarkers, was immobilized onto platinum electrodes prepared using gelatin, chitosan and alginate natural polymers, and combinations of them due to their high biocompatibility, low biofouling and non-toxicity. Titanium dioxide (TiO2) nanoparticles were also used to increase sensitivity and decrease detection limit by means of their high surface area. Because of couldn’t obtained the desired impedimetric responses from the immunosensors prepared using gelatin/chitosan and alginate/chitosan, experiments were continued with gelatin, chitosan, alginate and gelatin/alginate systems. Amounts of polymers and nanoparticles, crosslinker concentrations and MBP concentrations were optimized using Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Cyclic Voltammetry (CV), and surface characterization was carried out with Scanning Electrone Microscopy (SEM). Characterization studies carried out with EIS, CV and SEM showed that MBP was immobilized on the carrier systems efficiently. The designed immunosensors have low detection limits and show a lineer respons for a broad ranges of concentration. It has been shown that the immunosensors prepared using TiO2 nanoparticles have less detection limits. The developed immunosensors were used for detection of Anti-MBP in Cerebrospinal Fluid (CSF) and serum obtained from MS patients and applicability of immunosensors in real biological samples were tested. Measurments have showed that serum Anti-MBP levels are higher than CSF’s. November 2012, 152 pages Key Words: Gelatin, Chitosan, Alginat, TiO2 nanoparticle, Multiple Sclerosis, Myelin Basic Protein, Impedance Spectroscopy, Immunosensor.

iii

TEŞEKKÜR

Tez çalışmam sırasında ve tezimin hazırlanmasında bana her konuda yardımcı olan,

bilgisini, tecrübesini, hoşgörüsünü esirgemeyen değerli hocam Sayın Doç. Dr. Emel

EMREGÜL’e (Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü),

Çalışmalarım sırasında bilgisinden ve pozitif enerjisinden faydalandığım hocam Sayın

Prof. Dr. Kaan Cebesoy EMREGÜL’e (Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü),

Okuduğum ve okuyacağım süre boyunca beni maddi ve manevi her türlü yönden

destekleyen sevgili annem, babam ve kardeşlerime,

Çalışmalarım için gerekli biyolojik örneklerin temininde her türlü kolaylığı sağlayan

Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Nöroloji A.B.D.’ndan Sayın Prof. Dr. Canan

YÜCESAN’a,

Çalışmalarıma katkılarından dolayı Prof. Dr. Ali SINAĞ (Ankara Üniversitesi, Kimya

Bölümü) ve ekibine,

Sürekli desteklerini hissettiğim sevgili dostlarım Utku KARAKAYA, Selin GEREKÇİ

ve Gizem ÖZBEK’e,

Teşekkür eder ve sevgilerimi sunarım.

Burak DERKUŞ

Ankara, Kasım 2012

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET ................................................................................................................................ i

ABSTRACT .................................................................................................................... ii

TEŞEKKÜR .................................................................................................................. iii

SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................ vii

ŞEKİLLER DİZİNİ ....................................................................................................... x

ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... xv

1. GİRİŞ .......................................................................................................................... 1

2. KURAMSAL TEMELLER ....................................................................................... 4

2.1 Elektrokimya ............................................................................................................ 4

2.1.1 Elektriksel çift tabaka ........................................................................................... 5

2.2 Dönüşümlü Voltametri (CV) .................................................................................... 8

2.2.1 Tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı ........................................... 12

2.2.2 Tersinmez reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı ...................................... 13

2.2.3 Yarı-tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı ................................... 14

2.3 Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) ............................................... 15

2.4 Biyosensörler .......................................................................................................... 21

2.4.1 Biyoreseptörler .................................................................................................... 21

2.4.1.1 Biyokatalitik esaslı biyosensörler .................................................................... 22

2.4.1.2 Biyoaffinite esaslı biyosensörler ....................................................................... 22

2.4.2 İleticiler (Transduserler) .................................................................................... 23

2.4.3 İmmünosensörler ve immünosensörlerin sınıflandırılması .............................. 24

2.4.3.1 Optik immünosensörler .................................................................................... 26

2.4.3.2 Piezoelektrik immünosensörler........................................................................ 26

2.4.3.3 Termal (Kalorimetrik) immünosensörler ....................................................... 27

2.4.3.4 Elektrokimyasal immünosensörler ................................................................. 27

2.4.3.4.1 Amperometrik immünosensörler ............................................................... 28

2.4.3.4.2 Kondüktometrik immünosensörler ............................................................ 29

2.4.3.4.3 Potansiyometrik immünosensörler ............................................................. 30

2.4.4 Antikorlar ............................................................................................................ 30

2.4.4.1 Antikor-Antijen bağlanma gücü ..................................................................... 32

v

2.4.4.2 Antijen–Antikor bağlanma kinetiği ................................................................ 33

2.5 Biyolojik Materyallerin İmmobilizasyonu ........................................................... 34

2.5.1 Taşıyıcıya bağlama yöntemi ................................................................................ 34

2.5.1.1 Fiziksel adsorpsiyon .......................................................................................... 35

2.5.1.2 İyonik bağlanma ................................................................................................ 35

2.5.1.3 Kovalent bağlama ............................................................................................ 36

2.5.2 Çapraz bağlama ................................................................................................. 36

2.5.3 Tutuklama yöntemi ............................................................................................ 37

2.5.3.1 Kafes tipi (Polimer matriks içine tutuklama) ................................................ 37

2.5.3.2 Mikrokapsülleme ............................................................................................. 38

2.6 Nanosensörler ........................................................................................................ 38

2.7 Multipl Skleroz (MS) ............................................................................................ 39

2.7.1 Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS) ............................................................................... 49

2.8 Çalışmada Kullanılan Biyomoleküller, Taşıyıcı Sistemler, Nanopartiküller

ve Çapraz Bağlayıcılar ........................................................................................... 50

2.8.1 Myelin Basic Protein (MBP) .............................................................................. 50

2.8.2 Taşıyıcılar ............................................................................................................ 52

2.8.2.1 Jelatin ................................................................................................................ 52

2.8.2.2 Kitosan .............................................................................................................. 53

2.8.2.3 Aljinat ................................................................................................................ 54

2.8.3 TiO2 nanopartiküller .......................................................................................... 55

2.8.4 Çapraz bağlayıcılar ............................................................................................. 55

2.9 Kaynak Araştırması ............................................................................................... 57

3. ÇALIŞMANIN AMACI .......................................................................................... 64

4. MATERYAL ve YÖNTEM ..................................................................................... 65

4.1 Materyaller ............................................................................................................. 65

4.1.1 Kullanılan kimyasal maddeler ........................................................................... 65

4.1.2 Kullanılan cihazlar .............................................................................................. 65

4.1.3 Kullanılan elektrotlar ......................................................................................... 66

4.1.4 Kullanılan çözeltiler ............................................................................................ 66

4.2 Yöntem .................................................................................................................... 67

vi

4.2.1 İmmobilizasyon jellerinin hazırlanması ............................................................. 67

4.2.2 İmmünosensörlerin hazırlanması ....................................................................... 68

4.2.3 SEM mikrograflarının alınması ......................................................................... 69

4.2.4 Optimizasyon çalışmaları ................................................................................... 69

4.2.4.1 Polimer optimizasyonları ................................................................................ 69

4.2.4.2 TiO2 optimizasyonu .......................................................................................... 70

4.2.4.3 Çapraz bağlayıcı optimizasyonları ................................................................. 70

4.2.4.4 MBP optimizasyonları ..................................................................................... 71

4.2.4.5 İmmünosensör cevabına Anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi ................. 71

4.2.5 Tekrar üretilebilirlik ve raf ömrü ...................................................................... 72

4.2.6 Film kalınlıkları ................................................................................................... 72

4.2.7 İmmünosensörlerin elektrokimyasal davranışları ............................................ 72

4.2.8 Kalibrasyon grafiklerinin çizilmesi .................................................................... 73

4.2.9 Geliştirilen immünosensörlerin BOS ve serumda denenmesi ......................... 73

5. BULGULAR .............................................................................................................. 74

5.1 SEM Mikrograflarının Değerlendirilmesi ........................................................... 74

5.2 Optimizasyon Çalışmaları ...................................................................................... 77

5.2.1 Polimer miktarının immünosensör cevabına etkisi .......................................... 78

5.2.2 TiO2 miktarının immünosensör cevabına etkisi ................................................ 80

5.2.3 Çapraz bağlayıcı konsantrasyonunun immünosensör cevabına etkisi .......... 83

5.2.4 MBP konsantrasyonunun immünosensör cevabına etkisi ............................ 86

5.2.5 İmmünosensör cevabına anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi...................90

5.3 Tekrar Üretilebilirlik ............................................................................................. 96

5.4 İmmünosensörlerin Ömrü ................................................................................... 101

5.5 Film Kalınlıkları .................................................................................................. 105

5.6 Geliştirilen İmmünosensörlerin Elektrokimyasal Davranışları ..................... 108

5.7 Kalibrasyon Grafikleri ......................................................................................... 115

5.8 BOS ve Serum Çalışmaları .................................................................................. 131

6. TARTIŞMA ve SONUÇ ........................................................................................ 135

KAYNAKLAR ............................................................................................................ 142

ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................ 152

vii

SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ

µA Mikroamper

µM Mikromolar

µmol Mikromol

∆φ Potansiyel düşüşü

Ω Ohm

φ Faz açısı

ω Açısal frekans

Ag/AgCl Gümüş/Gümüş klorür

Anti-MBP Anti-Miyelin Basic Protein

Au Altın

Aq Çözelti

BDM Bochris, Devanathan ve Muller modeli

BOS Beyin-Omurilik Sıvısı

BSA Bovin Serum Albumin

C Kapasitans

Cdl Çift tabaka kapasitansı

CFU Koloni oluşturan ünite

cm2 Santimetre kare

CV Döngüsel Voltametri

E Potansiyel

EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimit

ELISA Enzim-bağlı immünosorbant assay

EIS Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi

F Faraday sabiti

Fe Demir

Fe(CN)64-/3 Potasyum ferrosiyanid ve potasyum ferrisiyanid

fg Femptogram

GC Camsı karbon

H2O2 Hidrojen Peroksit

viii

HRP Yabanturbu peroksidaz

I Akım yoğunluğu

IgG Immünoglobülin G

IHP İç Helmholtz Tabakası

IUPAC Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği

İTO İndiyum Kalay Oksit

KCl Potasyum klorür

L Litre

m Metal

MBP Miyelin Basic Protein

mmol Milimol

mmol L-1 Milimolar

MPA Merkaptopropiyonik Asit

MRG Manyetik Rezonans Görüntüleme

MS Multipl Skleroz

MSS Merkezi Sinir Sistemi

Na Sodyum

NaCl Sodyum klorür

ng Nanogram

NHS N-hidrokissüksinimit

O2 Moleküler Oksijen

OHP Dış Helmholtz Tabakası

pg Pikogram

Pt Platin

QCM Kuvarz kristal mikrobalans

R Direnç

Rct Yük transfer direnci

Rs Çözelti direnci

RIA Radyo-immünoassay

ROP Reaktif Oksijen Partikülleri

s Saniye

SAM Kendiliğinden Düzenlenen Tek Tabaka

ix

SEM Taramalı Elektron Mikroskobu

t Süre

TEM Geçirmeli Elektron Mikroskobu

TiO2 Titanyum Dioksit

U Ünite

q Yük yoğunluğu

V Volt

Z İmpedans

x

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Elektrod/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel değişimi ...................................... 5

Şekil 2.2 Helmholtz çift tabaka modeli.. ....................................................................... 6

Şekil 2.3 Gouy-Chapman-Stern elektriksel çift tabaka modelinin şematik gösterimi ve elektrod/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü ..................................... 7

Şekil 2.4 BDM modelin şematik gösterimi ve Elektrod/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü ........................................................................................... 7

Şekil 2.5 Dönüşümlü voltametri tekniklerinde potansiyel taramasının zamanla değişimi ........................................................................................................ 10

Şekil 2.6 1 mM Dopamin’in yalın GC ve 2-benzo[c]sinolin modifiye GC’li dönüşümlü voltamogramı ............................................................................ 11

Şekil 2.7 Tersinir O + ne ↔ R reaksiyonunun CV voltamogramı .............................. 12

Şekil 2.8 Tersinmez bir elektrot reaksiyonunda CV ile farklı tarama hızlarında anodik ve katodik pik potansiyellerinin birbirinden uzaklaşması. ……………….. 14

Şekil 2.9 İmpedimetrik sisteme uygulanan sinüsoidal uyarı ve alınan cevap ............. 16

Şekil 2.10 φ faz açısı ile ayrılmış ve akım-potansiyel değişimini gösteren fazör ......... 18

Şekil 2.11 Tipik bir Nyquist impedans grafiği ............................................................. 18

Şekil 2.12 Randles devresi ............................................................................................ 19

Şekil 2.13 Bode grafiği .................................................................................................. 21

Şekil 2.14 Bir biyosensörün genel gösterimi ................................................................. 21

Şekil 2.15 İmmünosensörlerin çalışma prensibinin şematik gösterimi ......................... 28

Şekil 2.16 IgG molekülünün şematik gösterimi ............................................................. 31

Şekil 2.17 Antijen-Antikor bağlanmasında etkili olan kuvvetler .................................. 32

Şekil 2.18 Taşıyıcıya bağlama yönteminin şematik gösterimi ..................................... 35

Şekil 2.19 Çapraz bağlama yönteminin şematik gösterimi .......................................... 36

Şekil 2.20 Kafes tipi tutuklama yönteminin şematik gösterimi ................................... 38

Şekil 2.21 Mikrokapsül tipi tutuklama yönteminin şematik gösterimi ........................ 38

Şekil 2.22 MS’in immünpatogenezi .............................................................................. 43

Şekil 2.23.a Sinir hücresinin, b. Miyelin kılıfın, c. Miyelin proteinlerinin şematik gösterimi ....................................................................................................... 50

Şekil 2.24 Jelatin polimerinin zincir yapısı ................................................................... 52

Şekil 2.25 Kitin ve Kitosanın moleküler yapıları .......................................................... 54

Şekil 2.26 Bifonksiyonel glutaraldehitin bağlanması .................................................... 56

xi

Şekil 2.27 NHS/EDC çapraz bağlama mekanizması ..................................................... 57

Şekil 4.1 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün üretim prosesi ................................ 69

Şekil 5.1.a. Jelatin, b. Jelatin-MBP, c. Jelatin-TiO2, d. Jelatin-TiO2-MBP filmlerinin SEM mikrografları .................................................................. 74

Şekil 5.2.a. Kitosan, b. Kitosan-MBP, c. Kitosan-TiO2, d. Kitosan-TiO2- MBP filmlerinin SEM mikrografları ........................................................... 75

Şekil 5.3.a. Aljinat, b. Aljinat-MBP, c. Aljinat-TiO2, d. Aljinat-TiO2- MBP elektrodlarının SEM filmlerinin ......................................................... 76

Şekil 5.4.a. Jelatin/Aljinat-TiO2, b. Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP filmlerinin SEM mikrografları ....................................................................................... 77

Şekil 5.5 Jelatin miktarının immünosensör cevabına etkisi ........................................ 78

Şekil 5.6 Kitosan miktarının immünosensör cevabına etkisi ...................................... 79

Şekil 5.7 Aljinat miktarının immünosensör cevabına etkisi ........................................ 79

Şekil 5.8 Jelatin/Aljinat oranının immünosensör cevabına etkisi ............................... 80

Şekil 5.9 TiO2 nanopartikül miktarının Jelatin-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 81

Şekil 5.10 TiO2 nanopartikül miktarının Kitosan-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 81

Şekil 5.11 TiO2 nanopartikül miktarının Aljinat-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 82

Şekil 5.12 TiO2 nanopartikül miktarının Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 83

Şekil 5.13 Glutaraldehit konsantrasyonunun Jelatin-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 84

Şekil 5.14 Glutaraldehit konsantrasyonunun Kitosan-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 85

Şekil 5.15 NHS/EDC konsantrasyonunun Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 85

Şekil 5.16 Glutaraldehit konsantrasyonunun Jelatin/Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 86

Şekil 5.17 MBP konsantrasyonunun Jelatin immünosensör cevabına etkisi ................ 87

Şekil 5.18 MBP konsantrasyonunun Kitosan immünosensör cevabına etkisi ............. 88

Şekil 5.19 MBP konsantrasyonunun Aljinat immünosensör cevabına etkisi ................ 89

Şekil 5.20 MBP konsantrasyonunun Jelatin/Aljinat immünosensör cevabına etkisi .... 89

Şekil 5.21 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 90

Şekil 5.22 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 91

xii

Şekil 5.23 Anti-MBP inkübasyon süresinin Kitosan-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 92

Şekil 5.24 Anti-MBP inkübasyon süresinin Kitosan-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 93

Şekil 5.25 Anti-MBP inkübasyon süresinin Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi ............................................................................................................. 94

Şekil 5.26 Anti-MBP inkübasyon süresinin Aljinat-TiO2-MBP eimmünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 94

Şekil 5.27 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin/Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi .............................................................................................. 95

Şekil 5.28 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi ..................................................................... 95

Şekil 5.29 Jelatin-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği ..................... 96

Şekil 5.30 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği ............ 97

Şekil 5.31 Kitosan-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği ................... 98

Şekil 5.32 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği .......... 98

Şekil 5.33 Aljinat-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği .................... 99

Şekil 5.34 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği .......... 99

Şekil 5.35 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği ........................................................................................................ 100

Şekil 5.36 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği ........................................................................................................ 100

Şekil 5.37 Jelatin-MBP immünosensörünün kullanım süresi ..................................... 101

Şekil 5.38 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi ............................ 102

Şekil 5.39 Kitosan-MBP immünosensörünün kullanım süresi ................................... 102

Şekil 5.40 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi .......................... 103

Şekil 5.41 Aljinat-MBP immünosensörünün kullanım süresi ..................................... 103

Şekil 5.42 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi ............................ 104

Şekil 5.43 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi ................ 104

Şekil 5.44 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi ................ 105

Şekil 5.45 Jelatin ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi ............................ 106

Şekil 5.46 Kitosan ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi .......................... 107

Şekil 5.47 Aljinat ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi ........................... 107

Şekil 5.48 Jelatin/Aljinat ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi ................ 108

Şekil 5.49 Jelatin immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği108

xiii

Şekil 5.50 Jelatin immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı.. ............................. 109

Şekil 5.51 Kitosan immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği ......................................................................................................... 111

Şekil 5.52 Kitosan immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı ............................. 111

Şekil 5.53 Aljinat immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği, ........................................................................................................ 112

Şekil 5.54 Aljinat immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı .............................. 112

Şekil 5.55 Jelatin/Aljinat immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği………………………………………………………………. ……113

Şekil 5.56 Jelatin/Aljinat immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı .................. 114

Şekil 5.57 Geliştirilen immünosensörlere ait Randles devresi .................................... 114

Şekil 5.58 Jelatin-MBP immünosensörüne 0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması ............................................ 115

Şekil 5.59 Jelatin-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 116

Şekil 5.60 Jelatin-MBP immünosensörünün düşük (0.975-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 116

Şekil 5.61 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörüne 0.4875-2500 ng.mL-1 konsntrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması ............................................ 117

Şekil 5.62 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 118

Şekil 5.63 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (0.4875-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 118

Şekil 5.64 Kitosan-MBP immünosensörüne 0.4875-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması ............................................ 119

Şekil 5.65 Kitosan-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 120

Şekil 5.66 Kitosan-MBP immünosensörünün düşük (0.4875-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 120

Şekil 5.67 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörüne (0.1213-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması .................... 121

Şekil 5.68 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 122

Şekil 5.69 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (0.1213-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 122

Şekil 5.70 Aljinat-MBP immünosensörüne 1.95-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması .......................................... 123

xiv

Şekil 5.71 Aljinat-MBP immünosensörünün yüksek (250-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 123

Şekil 5.72 Aljinat-MBP immünosensörünün düşük (1.95-125 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 124

Şekil 5.73 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörüne 0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması .......................................... 124

Şekil 5.74 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (250-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 125

Şekil 5.75 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (0.975-125 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 125

Şekil 5.76 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörüne 3.90-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması .......................................... 126

Şekil 5.77 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün düşük (3.90-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 126

Şekil 5.78 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün düşük (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 127

Şekil 5.79 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörüne 1.95-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması .................. 128

Şekil 5.80 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (1.95-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ............................................ 128

Şekil 5.81 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-

1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği ......................................... 129

Şekil 5.82 Düşük konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) Yapay BOS ile elde edilen kalibrasyon grafiği ..................................................................................... 133

Şekil 5.83 Düşük konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) yapay serum ile elde edilen kalibrasyon grafiği ..................................................................................... 133

Şekil 5.84 Yüksek konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) Yapay BOS ile elde edilen kalibrasyon grafiği ..................................................................................... 134

Şekil 5.85 Yüksek konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) Yapay serum ile elde edilen kalibrasyon grafiği ..................................................................................... 134

xv

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1 Biyosensör tasarımında kullanılan iletim sistemleri .................................. 23

Çizelge 2.2 Schumacher Kriterleri ................................................................................ 49

Çizelge 2.3 Poser kriterlerine göre MS sınıflandırılması .............................................. 49

Çizelge 5.1 Geliştirilen immünosensörlerinçalışma koşulları ve performansları(1) .. 130

Çizelge 5.2 Geliştirilen immünosensörlerinçalışma koşulları ve performansları(2) .. 131

1

1. GİRİŞ

IUPAC’a göre elektrokimyasal biyosensör, elektrokimyasal bir iletici ile doğrudan

birleştirilmiş biyokimyasal bir reseptör kullanılarak, analitik bilgileri spesifik olarak

kantitatif ya da yarı kantitatif bir şekilde sunabilen, herhangi başka bir sistemden

bağımsız cihaz olarak tanımlanmıştır (Thevenot vd. 1999). Teknolojinin gelişim süreci

boyunca ucuz, basit, hızlı, spesifik ve duyarlı analitik cihazlara ihtiyaç duyulmasının bir

sonucu olarak biyosensörler çevre, klinik, tarım, gıda ve savunma amaçlı uygulamalarda

farklı maddelerin, kalitatif ve kantitatif tayini için önemini koruyan ve gelişimini

sürdüren bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır (Andreescu ve Sadik 2004).

İmmünosensörler, biyospesifik tanıyıcı element olarak immünoaktif maddelerin

kullanıldığı bir biyosensör tipidir ve uygun antijen ile antikorun kompleks oluşumu

esasına dayanır. Antikor-antijen reaksiyonu son derece seçicidir (Parkinson ve Pejcic

2005). İmmünosensör teknolojisi klasik immünotest (immünoassay) yaklaşımından

ortaya çıkmıştır. İlkeleri 1959 yılında Yalow ve Berson tarafından atılan

immünosensörler, insan kanındaki insülin-bağlayıcı antikorların tayini için

radyoimmünotest geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Antijen veya antikorların sensör

yüzeyine immobilizasyonuyla üretilen immünosensörler, genel olarak ölçüm prensibine

göre sınıflandırılırlar. Elektrokimyasal (potansiyometrik, amperometrik,

kondüktometrik, impedimetrik vb.), optik, piezoelektrik, akustik ve termometrik tanıyıcı

elementler immunosensörler için sensör platformları olarak kullanılır.

İmmünosensörlerin çoğu optik ya da elektrokimyasal esaslıdır. Elektrokimyasal

immünosensörlerde belirleme, genel olarak ya elektroaktif işaretleyiciler kullanılarak ya

da çoğunlukla glukoz oksidaz gibi enzimlerle işaretleme yoluyla yapılmıştır. Ölçüm

prensibine göre sınıflandırılmış olan bu immünosensörler, ayrıca doğrudan ve doğrudan

olmayan olarak da sınıflandırılmaktadır (Martin 2001).

İmmünosensörler çabuk ve yüksek duyarlılıklı immünolojik yanıt verebilmeleri

dolayısıyla tanı alanında oldukça ilgi çeken bir konudur. Antikorların, ilgili antijenlerine

olan yüksek affinite ve seçicilikleri, onların radyoimmünotest ve enzim-bağlı

2

immünosorbant test (Enzym-Linked Immunosorbant Assay, ELISA) gibi amaçlara

yönelik oldukça yaygın olarak kullanılmalarını sağlamıştır. Bu nedenle fotometrik,

kromatografik ve diğer dedeksiyon teknikleri kullanılarak klasik ELISA formatında pek

çok immünosensör geliştirilmiştir (Kalab ve Skadal 1997, Rishpon ve Ivnitsky 1997).

Geliştirilen bu immünosensörlerin optik olanları ticari olarak da kullanılabilirken

(Byfield ve Abuknesha 1994) elektrokimyasal olanları henüz kullanılamamaktadır.

Nanoteknolojinin biyosensörlere uyarlanmasıyla ortaya çıkan ve oldukça yeni ve

popüler bir konu olan nanobiyosensörler, son yıllarda üzerinde oldukça yoğun olarak

çalışılan bir konudur. Nanopartiküllerin en büyük özellikleri olan yüksek yüzey

alanı:hacim oranı sayesinde nanopartiküllerle modifiye edilmiş elektrotların yüzey

alanları artmakta ve daha etkin immobilizasyon yapılabilmektedir. Nanopartiküller

ayrıca elektron transfer hızını da arttırarak duyarlılığı arttırmakta ve tayin limitini

düşürmektedir. Metal oksitler, sülfürler, nanokristaller ve nanotüpler tanısal alanda

oldukça yaygın olarak kullanılan nanopartiküllerdir.

Multipl Skleroz (MS) son yıllarda tüm dünyada sıklıkla rastlanılan otoimmün bir

hastalıktır. Dünyada 3 milyon, Türkiye’de ise yaklaşık 40 bin MS hastası olduğu

bilinmektedir. Bu hastaların durumu gün geçtikçe kötüleşmekte ve birçoğununki ölümle

sonuçlanmaktadır. Bugün için bilinen kesin bir tedavisi olmamakla birlikte yapılan

terapiler ile semptomlar giderilmeye ve yaşam kalitesi arttırılmaya çalışılmaktadır.

Hastalığın teşhisi %100 doğrulukta yapılamadığından terapiler hemen

uygulanamamaktadır. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), MS’in teşhisi için en

fazla kullanılan yöntem olsa da bu ancak %90’lık bir kesinlik sağlayabilmektedir. MRG

bulgularının Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS) ve laboratuvar analizleriyle desteklenmesi

gerekmektedir. Erken teşhis MS’te de oldukça önemlidir.

Bu tez çalışmasında MS’e neden olan oto-antikorlardan Anti-Miyelin Temelli Protein

(Anti-Myelin Basic Protein, Anti-MBP)’in tayinine yönelik impedimetrik

immünosensörlerin tasarımı üzerinde çalışılmıştır. Taşıyıcı sistemler olarak jelatin,

kitosan, aljinat; bunların kombinasyonları ve titanyum dioksit (TiO2) nanopartikülleriyle

3

karışımından oluşan nanotaşıyıcılar kullanılmıştır. Bu malzemeler ile modifiye edilen

platin elektrotlar üzerine MS’in biyo-belirteçlerinden Miyelin Temelli Protein (Myelin

Basic Protein, MBP) immobilize edilmiştir. Polimer miktarları, nanopartikül miktarları,

çapraz bağlayıcı konsantrasyonları, MBP konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri

Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) ve Döngüsel Voltametri (CV) ile

optimize ve karakterize edilmiş, ayrıca Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning

Electron Microscope, SEM) ile yüzey karakterizasyonu yapılmıştır. Kuvarz Kristal

Mikrobalans (Quartz Crystal Microbalance, QCM) kullanılarak film kalınlıkları

hesaplanmıştır. Ayrıca raf ömrü ve tasarlanan immünosensörlerin yanıt süreleri de

belirlenmiştir. Geliştirilen immünosenörlerden en düşük tayin sınırına sahip olanı ile

BOS ve serum çalışmaları yapılarak immünosensörlerin biyolojik örneklere

uyarlanabilirliği üzerine çalışılmıştır.

4

2. KURAMSAL TEMELLER

2.1 Elektrokimya Dinamik elektrokimya reaksiyonların hızları, mekanizmaları ve elektrot ile analit

molekülü arasındaki elektron transfer süreçleri üzerine detaylı inceleme yapmaya

olanak sağlamaktadır (Fisher 1996). Reaksiyonları etkileyen bu dinamikler potansiyel,

elektrot yüzeyinin yapısı ve doğası, çözeltideki türlerin reaktiviteleri ve bunların kütle

aktarımları gibi faktörlerden oluşmaktadır. Tüm bu faktörler yük transfer prosesinin

gerçekleştiği hızı değiştirerek reaksiyon dinamiklerini etkilerler. Bu nedenle söz konusu

faktörler iyi analiz edilmelidir.

Eğer metalik bir elektrot (m) çözelti (aq) içerisindeki reaktant molekülleri gibi bir

elektron kaynağına konursa elektrot/çözelti ara-yüzeyinde bir yük transferi

gerçekleşecektir.

Fe3+ (aq) + e- ↔ Fe2+ (aq) (2.1)

Bu reaksiyon bir süre sonra dengeye ulaşır ve elektrot/çözelti ara-yüzeyindeki elektron

transferi iki faz arasında potansiyel farkı yaratarak net bir yük ayrımı ile sonuçlanır

(Fisher 1996). Elektrot/çözelti ara-yüzeyindeki potansiyel düşüşü ∆φm/s:

∆φm/s = φm – φs (2.2)

φm metal potansiyeli ve φs ise çözelti potansiyelidir. Şekil 2.1’de Elektrot/çözelti ara-

yüzeyindeki potansiyel değişimi gösterilmiştir.

5

Şekil 2.1 Elektrot/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel değişimi

2.1.1 Elektriksel çift tabaka

İki faz arasında potansiyel farkı oluşturan yük transfer ayrımı, paralel kapasitörler

arasında biriken yükler gibi düşünülebilir. Polarizasyon potansiyelinin uygulanması ile

elektrot yüzeyindeki yük kontrol edilebilir ve elektrot/çözelti arasındaki elektrostatik

etkileşim arttırılabilir.

Elektrik çift tabaka için ilk ve en basit model 1879 yılında Helmholtz tarafından

önerilmiştir. Bu modele göre metal elektrot yüzeyindeki fazla yük, çözeltideki tek

tabaka halindeki karşıt yükler tarafından nötralize edilir. Yüklerin elektrostatik güç ya

da çözeltideki dipollerin yeniden düzenlenmesi ile bu şekilde yeniden dağılımı,

elektriksel olarak nötral bir yüzeyin oluşmasını sağlar.

qm = - qs (2.3)

qm metal yüzey üzerindeki yük yoğunluğunu; -qs ise monomoleküler çözelti

tabakasının yük yoğunluğunu göstermektedir. Helmholtz, elektrot ile çözeltideki iyonlar

arasında solvasyon tek tabakasının olabileceğini, böylelikle elektrot tarafından çekilen

elektronların ara-yüzeye, bu iyonların solvasyon kabukları tarafından sınırlanan bir

mesafeye kadar yaklaşabileceklerini farzetmiştir. Bu nedenle, iyonların yeniden-

6

düzenlenmesi ile oluşan potansiyel düşüşü lineerdir ve yalnızca Dış Helmholtz Tabakası

(Outher Helmholtz Plane, OHP) denilen, elektrot yüzeyi ile bu tek-tabaka arasındaki

bölgede gözlenir.

Şekil 2.2 Helmholtz çift tabaka modeli

Gouy and Chapman 1910 yılında yaptıkları bağımsız çalışmada Helmholz’un çift

tabaka kuramına iyonların Brown hareketini de ekleyerek yeni bir görüş öne

sürmüşlerdir. Eğer çözeltideki iyonlar serbestçe dolaşabiliyorlarsa OHP için uygun

değillerdir. Bu nedenle bir iyon ve metal yüzey arasındaki elektrostatik etkileşim etkisiz

hale gelir ve yük bir difüzyon tabakasına dağılır. Potansiyel düşüşü elektrot yüzeyine

yakın bölgelerde gerçekleşir fakat OHP’de meydana gelmez.

1924 yılında Stern tarafından geliştirilen yeni bir model ise önceki iki modelin birleşimi

şeklindedir. Gouy-Chapman-Stern modeli, çözünmüş iyonların boyutlarını ve dahası her

bir iyonun su molekülleri ile sarılı olduğunu göz önünde bulundurmaktadır. Bu nedenle

iyonlar elektrot yüzeyine yaklaşamamakta ve elektrot yüzeyi ile OHP arasında Gouy-

Chapman modelinde olduğu kadar belirgin bir potansiyel düşüşü meydana

getirememektedirler.

7

Şekil 2.3 Gouy-Chapman-Stern elektriksel çift tabaka modelinin şematik gösterimi ve elektrot/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü

1947 yılında Grahame, çözünemeyen ya da solvasyon kabuğunu kaybetmiş bir iyonun

çözünebilen bir iyona göre elektrot yüzeyine daha fazla yaklaşabileceğini göstererek

Stern’in modelini geliştirmiştir. Dolayısıyla elektrot ile direkt olarak temasta olan

iyonlar spesifik olarak adsorplanır ve İç Helmholtz Tabakasını (Inner Helmholtz Plane,

IHP) oluşturur. Diğer taraftan çözünen iyonlar non-spesifik olarak adsorplanır ve OHP

bölgesini oluşturur.

Son olarak 1963’te Bochris, Devanathan ve Muller çözücü olarak suyu model alarak bir

görüş ileri sürmüşlerdir (BDM modeli). Bu su moleküllerinin dipolleri elektrot

yüzeylerine yakınlıkları nedeniyle sabitlenmiş bir sıradadırlar. Bu model günümüzde

geçerliliğini koruyan ve elektriksek çift tabakayı tanımlayan modeldir.

Şekil 2.4 BDM modelin şematik gösterimi ve elektrot/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü

8

2.2 Dönüşümlü Voltametri (Cyclic Voltammetry, CV) Elektroanalitik metotların hepsinde elektrot/çözelti sistemine elektriksel etki yapılarak

sistemin verdiği cevap ölçülür. Bu cevap sistemin özellikleri hakkında bilgi verir. Genel

olarak bütün elektrokimyasal tekniklerde akım, potansiyel ve zaman parametreleri

bulunur ve bu parametreler tekniğin adını belirler. Voltametri, kronoamperometri ve

kronokulometri gibi tekniklerde sırası ile potansiyel-akım, zaman-akım ve zaman-yük

parametreleri arasındaki ilişki anlatılmaktadır.

Elektroanalitik metotlar genel olarak net akımın sıfır olduğu denge durumundaki statik

metotlar ve denge durumundan uzakta net akımın gözlendiği dinamik metotlar olmak

üzere ikiye ayrılır. Elektroanalitik tekniklerin çok büyük bir kısmı net akımın sıfır

olmadığı dinamik metotlardır ve bunlar da potansiyel kontrollü veya akım kontrollüdür.

Akım kontrollü teknikler kronopotansiyometri ve kulometrik titrasyonlar olmak üzere

iki kısımda incelenir. İyon seçici elektrotların kullanıldığı metotlar akımın sıfır olduğu

statik elektroanalitik metotlardır.

Voltametride deneyler üçlü elektrot sisteminde gerçekleştirilmektedir. Üç elektrottan

birisi zamanla potansiyeli değiştirilen indikatör elektrot veya çalışma elektrotudur.

Voltametride çalışma elektrodu olarak civa, platin, altın, paladyum, karbon elektrot

(grafit, karbon pasta elektrot, camsı karbon, karbon cloth elektrot) gibi elektrotlar

yaygın olarak kullanılmaktadır. Elektrot sistemindeki ikinci elektrot, potansiyeli deney

süresince sabit kalan referans elektrottur. Referans elektrot genellikle gümüş/gümüş

klorür (Ag/AgCl) veya doymuş kalomel elektrottur. Elektrot sistemindeki üçüncü

elektrot ise karşıt veya yardımcı elektrottur. Karşıt elektrot olarak ise genellikle platin

(Pt) elektrot kullanılır.

Voltametride akım, çalışma elektrodu üzerinde maddelerin indirgenmesi veya

yükseltgenmesi sonucunda oluşur. İndirgenmeden dolayı oluşan akıma katodik akım,

yükseltgenmeden dolayı oluşan akıma ise anodik akım denir.

9

Difüzyon kontrollü akım, çalışma elektroda uygulanan potansiyel, polarogramın sınır

akımı bölgesinde ise ve elektron aktarım hızı elektrot yüzeyine gelen elektroaktif

maddeyi hemen indirgeyecek veya yükseltgeyecek kadar büyük ise elektrot yüzeyine

difüzyonla gelen elektroaktif madde miktarı ile belirlenir. Elektrot yüzeyinde oluşan

akım, birim yüzeye gelen madde miktarı ile orantılıdır. Akım:

i = nFAq(0,t) (2.4)

q(0,t), elektrodun birim yüzeyine t anında gelen madde miktarıdır. Fick kanunları olarak

ifade edilen diferansiyel denklemlerin genişleyen küresel elektrot için çözülüp q

değerinin yukarıdaki eşitlikte yerine konulmasıyla İlkoviç eşitliği elde edilir:

id = 0,732nFCD1/2m2/3t1/6 (2.5)

Bu eşitlikte terimlerin açıklamaları aşağıdaki gibidir.

i: akım, A;

n: aktarılan elektron sayısı, mol e-/mol;

F: Faraday sabiti, mol/mol e-;

C: ana çözeltideki elektroaktif madde konsantrasyonu, mol/cm3;

D: difüzyon katsayısı, cm2/s;

m: akış hızı, g/s;

t: zaman, s.

Dönüşümlü voltametri tekniği elektrokimyasal teknikler içinde en yaygın kullanılan

tekniktir. Bu teknikte potansiyel, zamanla doğrusal olarak değiştirilir. Uygulanan

potansiyelin zamanla değişim grafiği şekil 2.5’de verilmiştir. Potansiyel taraması bir E1

başlangıç potansiyeli ve E2 potansiyeli arasında yapılırsa metot doğrusal taramalı

voltametri adını alır (LSV). Eğer E2 potansiyeline ulaştıktan sonra aynı tarama hızıyla

ilk tarama yönüne göre ters yönde tarama yapılırsa metodun adı dönüşümlü voltametri

olur. Ters taramada potansiyel E1’de sonuçlanabileceği gibi farklı bir E3 potansiyeline

de götürülebilir. İleri taramada indirgenme olmuşsa ters taramada yükseltgenme

meydana gelir. LSV analitik çalışmalar için uygun bir metotdur. Fakat elektrot

10

mekanizmalarının incelenmesinde, adsorpsiyon olayının araştırılmasında ve kinetik

çalışmalarda CV tekniği daha çok kullanılır.

Şekil 2.5 Dönüşümlü voltametri tekniklerinde potansiyel taramasının zamanla değişimi

Elektroda hızlı bir potansiyel taraması uygulandığı zaman potansiyel, standart

indirgenme potansiyeli değerine yaklaşınca madde indirgenmeye başlar. Potansiyel

negatifleştikçe elektrot yüzeyindeki maddenin indirgenme hızı ve buna bağlı olarak da

akım artar. İndirgenme hızı yeterince büyükse akımı, elektrot yüzeyine difüzyonla gelen

madde miktarı kontrol eder. Zamanla difüzyon tabakası kalınlaşacağından difüzyon hızı

azalır ve akım da azalmaya başlar.

CV’de elde edilen pik, akımının büyüklüğü, elektroaktif maddenin konsantrasyonu,

aktarılan elektron sayısı, elektrot yüzey alanı ve difüzyon katsayısı ile değişir.

Dönüşümlü voltametri tekniğinin avantajlarından birisi de yöntemin değişik tarama

hızlarında uygulanabilmesidir. Böylece elektrot tepkimesi ile oluşan ara ürünlerin

kararlılıkları ile ilgili konular belirlenebilmektedir. Ara ürünlerin yanısıra adsorbsiyon,

difüzyon ve elektron aktarım reaksiyonuna etki eden kimyasal reaksiyon olaylarını da

belirlemek mümkündür. Ayrıca ileri ve geri tarama piklerinden reaksiyon mekanizması

hakkında fikir edinilebildiği gibi ileri yönde tarama ile kinetik veriler de bulunabilir

11

Bu teknikte, modifiye edilen elektrot sisteme çalışma elektrodu olarak bağlanmakta ve

çözelti ortamındaki elektroaktif türlerin modifiye yüzeydeki davranışları

incelenmektedir. Bu teknik ilk olarak modifikasyon işleminin gerçekleşip

gerçekleşmediği hakkında bilgi verir. Ayrıca modifiye yüzeyin elektroaktif ya da iletken

özelliğe sahip olup olmadığı, yüzeye bağlanan grupların uygulanan potansiyel ile

indirgenip yükseltgendiği, çeşitli türlere duyarlı veya seçici olup olmadığı CV ile kısa

sürede anlaşılabilir. Bu karkterizasyon tekniğinde çeşitli redoks probların

elektrokimyasal davranışlarından faydalanılır. Redoks problar, yalın elektrot yüzeyinde

tersinir ve çok yüksek hızda elektron transferi gerçekleştiren maddelerdir. En çok

kullanılan redoks problara bu tez çalışmasında kullanılan potasyum ferrosiyanid

(K3[Fe(CN)]6)’in yanı sıra dopamin, ferrosen, askorbik asit örnek gösterilebilir. Bu

redoks problardan birinin çözeltisi hazırlandıktan sonra uygun potansiyel aralığında

önce çıplak elektrot çalışma elektrodu olarak kullanılarak, sonra da modifiye elektrot

kullanılarak CV’si alınır. Bu voltamogramlar karşılaştırılarak modifiye edilmiş yüzeyin

elektrokimyasal özellikleri belirlenebilir. Şekil 2.6’daki voltamogramda görüldüğü gibi

çıplak camsı karbon (GC) elektrot yüzeyinde dopamin molekülü oldukça tersinir bir

voltamogram verirken 2-benzo[c]sinolin diazonyum tuzu ile modifiye edilmiş GC

yüzeyi dopaminin elektron transferini azaltmıştır (Turan vd. 2008). Bu durum 2-

benzo[c]sinolin diazonyum tuzunun GC yüzeyine bağlandığını gösterir.

Şekil 2.6 1 mM Dopamin’in yalın GC ve 2-benzo[c]sinolin modifiye GC’deki

dönüşümlü voltamogramı (Turan vd. 2008)

12

2.2.1 Tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı

Elektrot reaksiyonu O + ne- ↔ R şeklinde ise ve başlangıçta çözeltide yalnız O

maddesi bulunuyor, ayrıca elektron aktarımı dışında herhangi bir kimyasal reaksiyon

bulunmuyor ve elektrot yüzeyinde adsorpsiyon olayı meydana gelmiyor ise i – E grafiği

pik şeklinde gözlenir ve tarama hızı arttıkça pik yüksekliği artar. Dönüşümlü

voltametride akımın maksimum olduğu noktadaki pik potansiyeli Ep olarak adlandırılır.

Potansiyel taraması geriye doğru yapıldığı zaman tarama hızlı ise elektrot yüzeyinde

yeteri kadar R bulunacağından Eo değerinden itibaren daha pozitif potansiyellerde R

yükseltgenmeye başlayacaktır. Bu nedenle ters taramada anodik pik oluşacaktır. Ters

tarama esnasında Eo değerine kadar O indirgenmeye yani R oluşmaya devam edecektir.

Ters taramada potansiyel pozitifleştikçe Nernst eşitliğine göre R yüzey konsantrasyonu

azalacak ve yeteri kadar pozitif değerlerde sıfıra gidecektir. Ancak deney sırasında

yüzeyde oluşan R, çözeltiye doğru difüzleneceğinden ters tarama akımı katodik

akımdan biraz daha düşük olacaktır.

Tersinir O + ne- ↔ R reaksiyonunun CV voltamogramı şekil 2.7’de gösterilmiştir.

Şekil 2.7 Tersinir O + ne- ↔ R reaksiyonunun CV voltamogramı (Turan vd. 2008)

13

Tersinir bir elektrot reaksiyonunun pik akımı 25°C sıcaklıkta aşağıdaki eşitlikle

gösterilir (2.6). Bu eşitliğe Randles – Sevcik eşitliği adı verilir.

(ip)ter = 2,69 x 105n3/2AD0C0υ1/2 (2.6)

Bu eşitlikteki terimlerin anlamları aşağıdaki gibidir;

ip: Pik akımı, A; Do: O türünün difüzyon katsayısı, cm2/s; v: Tarama hızı, V/s; Co: O türünün ana çözelti konsantrasyonu, mol/cm3; Tersinir durumda Ep tarama hızına bağlı değildir. Bir tersinir indirgenme reaksiyonunda

Ep ile E1/2 arasındaki ilişki şu şekildedir.

Ep = E1/2 – 1.1. RTnF (2.7)

CV tekniği ile sistemin tersinirlik testi yapılabilir. Bunun için sistemin bazı kriterlere

uyması gerekmektedir. Bu kriterler şunlardır:

1. İp - ν1/2 grafiği doğrusal olmalıdır.

2. Epk - Ep

a =59/n mV veya Ep-Ep/2 = 57/n mV olmalıdır.

3. Ep, tarama hızı ile değişmemelidir.

4. ipa/ip

k =1 olmalı ve bu oran tarama hızı ile değişmemelidir.

5. Ep’den daha negatif potansiyellerde akım, t-1/2 ile orantılı olmalıdır.

2.2.2 Tersinmez reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı

Tersinmez sistemlerde elektron aktarım hızı yeteri kadar büyük olmadığından elektrot

yüzeyinde Nernst eşitliği geçerli değildir. Tersinmez durumlarda tarama hızı çok düşük

ise, elektron aktarım hızı kütle aktarım hızından daha yüksektir ve sistem tersinir gibi

gözlenebilir. Tarama hızı arttıkça kütle aktarım hızı elektron aktarım hızı ile aynı

seviyeye gelir. Bu durum tarama hızı arttıkça anodik ve katodik pik potansiyellerinin

14

birbirinden uzaklaşması ile belli olur (Şekil 2.8). Tamamen tersinmez sistemlerde

anodik pik gözlenmez. Anodik pik gözlenmeyişi her zaman sistemin tersinmez

olduğunu ispatlamaz. Elektron aktarım basamağını takip eden çok hızlı kimyasal bir

reaksiyon varlığında yani oluşan ürün, hızlı bir şekilde başka bir maddeye

dönüştüğünde de anodik pik gözlenmeyebilir.

Şekil 2.8 Tersinmez bir elektrot reaksiyonunda CV ile farklı tarama hızlarında anodik ve katodik pik potansiyellerinin birbirinden uzaklaşması (Turan vd. 2008) v; a. 0,13 V/s, b. 1,3 V/s, c. 4 V/s, d. 13 V/s

Dönüşümlü voltametri ile tersinmez bir reaksiyonun tanınma kriterleri:

1. Anodik pik gözlenmez

2. ipk, tarama hızının karekökü ile doğru orantılı olarak değişir.

3. Epk kayması tarama hızındaki 10 kat artmada 30/αcnα kadardır.

4. |Ep-Ep/2| = 48/(αcnα) mV’dur.

2.2.3 Yarı-tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı

Yarı tersinir reaksiyonlarda akım, difüzyon hızı ve elektron aktarım hızı ile birlikte

kontrol edilir. Dönüşümlü voltametride bir reaksiyonun yarı tersinirlik kriterleri;

15

1. İp, ν1/2 ile artar ancak doğrusal değildir.

2. Epk, tarama hızı ile değişir. Bu değişme genellikle tarama hızının artması ile

negatif değerlere kayma yönündedir.

3. ipa/ip

k =1 olmalıdır. (α=0.5 ise)

4. Epk - Ep

a farkı düşük tarama hızlarında 59/n’e yaklaşmalıdır.

2.3 Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS)

Önceki bölümlerde anlatıldığı gibi çift tabaka, elektrolit iyonlarının biriktiği bölgedir.

Bunun anlamı, ara yüzeyin yükü depolayabilme kabiliyetine sahip olması ve bu özelliği

sayesinde bir kapasitör gibi davranabilmesidir. Paralel basit bir kapasitörün bütünleşik

kapasitansı:

C = q/E (2.8)

q, kapasitör düzlemleri arasına E potansiyel farkı uygulandığı durumdaki yük miktarını

göstermektedir. Elektrokimyasal hücrelerde çift tabakanın kalınlığı, uygulanan

potansiyel farkı ile orantılıdır. Bu değişken kapasitans değeri, alternatif akım impedans

spektroskopisi (Alternating current impedance spectroscopy, AC-Impedance

Spectroscopy) ile ölçülebilmektedir. Bu yöntem ile elektrokimyasal hücreye sinüsoidal

sinyal pertubrasyonları uygulanır ve farklı elektrokimyasal süreçlere karşı oluşan akım

analizlenir.

İmpedans terimi ilk kez 1886 yılında elektrik mühendisi, matematikçi ve fizikçi olan ve

kompleks sayıları elektrik devrelerine uyarlayan Oliver Heaviside tarafından dile

getirilmişir (Josephs 1971). İmpedans ölçüm metodları elektrot kinetiği, çift tabaka

çalışmaları, bateriler, korozyon, katı faz elektrokimyası ve biyoelektrokimya gibi pek

çok elektrokimya dalında yaygın olarak kullanılmıştır. EIS, frekans düzleminde

elektriksel bilgiler sağlayan bir karakterizasyon tekniğidir (Mcdonald 1987, Bard ve

Faulkner 1980). Bu teknik ile bir elektrokimyasal hücrede meydana gelen süreç

kapasitör ve rezistörler kullanılarak modellenebilir. Eşdeğer devre kullanılarak deneysel

16

spektrumlar ilgili teorik eğrilerine rahatlıkla oturtulabilmekte ve elektriksel parametre

verileri elde edilebilmektedir. EI genelde elektrokimyasal hücreye AC potansiyeli

uygulanarak ve hücreden geçen akım belirlenerek ölçülür. Uygulanan sinüsoidal

pertubrasyon Et:

Et = E0 · Sin (ωt) (2.9) Et, t anındaki potansiyel; E0, sinyal genliği ve ω=2πf açısal frekanstır. (f frekans, Hertz)

Bu potansiyele karşı oluşan cevap, potansiyel ile aynı frekansta fakat farklı genlik ve faz

açısına sahip zaman bağımlı bir AC akım sinyalidir. İmpedimetrik sisteme uygulanan

sinüsoidal uyarı ve alınan cevap grafiği şekil 2.9’da gösterilmiştir.

It = I0 · Sin (ωt + φ) (2.10)

Şekil 2.9 İmpedimetrik sisteme uygulanan sinüsoidal uyarı ve alınan cevap

Ohm yasasına benzetmeye çalışmak gerekirse bir sistemin impedansı:

Z= 00

( ) ( )( ) ( )

t

t o

E E Sin t Sin tZI I Sin t Sin t

ω ωω φ ω φ

= =+ + (2.11)

Bu eşitlikten impedansın genlik (Z0) ve faz kayması (φ)’na bağlı olarak türetildiği

görülebilir. Bu, impedansın bir vektör gibi değerlendirilebilmesine olanak sağlar.

Sadece R direncinden oluşmuş basit bir sisteme ohm yasası uygulanırsa, akım ve

uygulanan potansiyel arasında:

17

i = E/R (2.12)

ve faz açısı sıfırdır. Kapasitör için de aynı ilişki kurulabilir:

i = (∆E/Xc).Sin(ωt + π/2) (2.13)

R yerine Xc (kapasitif rezistans) konur ve faz açısı π/2’dir. Bu eşitlik:

E = -jXci (2.14)

J yerine değeri (= √-1 ) konursa kompleks düzelmede sinüsoidal cevap elde edilir. Bir

kapasitör ve rezistörün seri bağlanmış durumu için toplam potansiyel düşmesi, her bir

elementin toplanmasıyla:

E = ER + EC = i (R – jXc) (2.15)

ve

E = iZ (2.16)

Z impedansı verir. İmpedans, devre tarafından önlenen akım göçünün ölçülebilmesini

sağlar. Bu durumdan sonra akım, voltaj ile 90° lik faz açısı yapmayacaktır. Faz açısı:

tanϕ=Xc/R=1/ωRC (2.17)

R ve – jXc aynı zamanda gerçek ve sanal impedans olarak Z´ve Z´´şeklinde de

gösterilebilir. Z ise gerçek ve sanal impedansın toplamıdır. Meydana gelen akım da aynı

frekansta salınım yapmaktaysa da voltajdan farklı genlik ve açıdadır. Bu süreç, dönen

bir vektör (rotating vector) üzerinde ya da kompleks bir düzlemde fazör üzerinde

(Armand diagramı) gösterilebilir:

18

Şekil 2.10 φ faz açısı ile ayrılmış ve akım-potansiyel değişimini gösteren fazör

Z = Zr + jZi (2.18)

Bu yöntemde faz-içi bileşen (Zr) sistemin direnci ile ilgiliyken faz-dışı bileşen (Zi) daha

çok yalıtkan tabakaların oluşumu ile ilgilidir. Farklı birçok grafik arasından

impedimetrik verilerin gösterimi için en fazla sanal impedansın gerçek impedansa karşı

grafiğe geçirilmesi ile elde edilen Nyquist Grafiği kullanılmaktadır. Bu grafikteki her

bir nokta farklı bir frekans değerine aittir.

Şekil 2.11 Tipik bir Nyquist impedans spektrum grafiği

19

Şekil 2.11 tipik bir Nyquist grafiğini ve ilgili elektriksel devresini göstermektedir. Bu

impedans spektrum profili R1 direncine (a) ait değerle başlayan ve (b) değeriyle biten,

toplamı R1 + R2 olan bir yarım daire şeklindedir. R1 değeri çözelti direncini gösterirken

R2 direnci yük transfer direnci (Rct)’ni göstermektedir. Kapasitörün kapasitans değeri

spektrumun sanal impedans kısmının maksimum değerine eşittir. Elektrokimyasal

sistemlere ait çoğu impedans spektrumu bu tip diyagramlara oturtulabilir. Spektrumun

doğrusal olan son kısmı ise düşük frekansta taranan ve elektrot yüzeyi-çözelti arasında

kütle aktarımıyla ilgili olan bölgedir.

Zw = σ(ω)−1⁄2(1 − j) (2.19)

Eşitlikteki ω açısal frekans, σ ise warburg katsayısıdır.

İmpedimetrik ölçümlerin ilk anlarında yüksek frekans (düşük enerji) pertübrasyonları

uygulanarak çözelti deirenci (Rs) ölçülür. Daha sonra frekans azalır, enerji yavaş yavaş

artar ve tarama bölgesi elektrot yüzeyine doğru kayar. Bu kısımda direnç en fazla

olduğu için Nyquist grafiklerde kapasitif direnç en üst değerlerde gözlenir. Frekans en

düşük, enerji en yüksek halini aldığında elektromanyetik dalgalar elektrot içerisine

girerek Nyquist grafiğinde difüzyonun olarak gözlenen doğrusal kısmı oluştururlar. Bu,

şekil 2.12‘de görülen Randles devresi yardımı ile açıklanabilir. Randles devresi elektrot

yüzeyindeki çift tabakanın rezistörüne (Re) paralel bağlanmış kapasitörden (C) ve onlara

seri olarak bağlanmış çözelti direncinden meydana gelir. Warburg impedansı (W) ise

elektroda frekans bağımlı difüzif transportu göstermektedir.

Şekil 2.12 Randles devresi

20

Bode grafiğinin Nyquist grafiğine göre daha fazla avantajı vardır. Bode grafiğinde

ölçümler uzun zaman almaz, düşük frekanslarda polarizasyon direnci (Rp) belirlenebilir.

Nyquist grafiği yüksek frekanslarda verilerin ekstrapolasyonunda daha etkilidir. Veriler

dağınık olduğu zaman Bode grafiği, tam yarım daire seklindeyse Nyquist grafiği tercih

edilir Frekans elektrokimyasal sistemin davranışına bağlıdır. Elektrokimyasal sistem

Bode grafiğiyle Nyquist grafiğine nazaran daha iyi belirlenebilir. Bazı elektrokimyasal

reaksiyonlar, bir derece belirleme basamağından daha fazla olabilir. Her bir basamak

sistem-impedans bileşenini temsil eder ve tam sabit dereceyi verir. Ac impedans verileri

tek basamağı ayırabilir ve tek reaksiyon derecesi ya da bekleme zamanı hakkında bilgi

verir. Bode grafiğinin Nyquist grafiğinden üstün avantajları vardır. Grafikte frekansın

logaritması kullanılır. Grafik çok geniş frekans aralığında verilir. Bode grafiğinde

frekans logaritmik olarak apsiste verilir (Şekil 2.13). Böylelikle geniş impedans alanı bu

apsise yerleştirilir. Bu durum Bode grafiğinin bir avantajıdır. İmpedans kuvvetle

frekansa bağlıdır.

log |Z| ve logω eğrileri Rp ve R0 değerleridir. Yüksek frekanslarda ohmik direnç

impedanstan üstündür ve log(R0) yüksek frekanstaki horizontal eğriden okunur. Düşük

frekanslarda, polarizasyon direnci log (R0 + Rp)’yi verir. Bu değer düşük frekanstaki

horizontal yaydan okunabilir. Orta frekanslarda, grafik düz çizgi şeklindedir ve bunun

eğimi -1’dir. Bu çizginin log |Z| ekstrapolasyonunda apsis ω= 1 (log ω= 0, ƒ= 0,16 Hz)

çift tabaka kapasitansı (Cdl) ile ilişkisi şu şekildedir (ω=2πf):

|Z| = 1/Cdlω (2.20)

Çift tabaka kapasitansı Cdl şu eşitlikle hesaplanır:

ωθmax=[(1/CdlRp)(1+Rp/R0)]1/2 (2.21)

21

Şekil 2.13 Bode grafiği

2.4 Biyosensörler Biyosensörler, bir biyoreseptör ve bir transduser sisteminden oluşmaktadır. Bir

biyosensörün genel yapısı şekil 2.14’te görülmektedir (Urban 2000).

Şekil 2.14 Bir biyosensörün genel gösterimi (Urban 2000)

2.4.1 Biyoreseptörler

Biyosensörlerin yapısında görev alan biyoreseptörler, biyosensör teknolojisinde

spesifikliğin anahtarıdır ve analitlerin ilgili kısımlarının sensöre bağlanmasından

22

sorumludur. Biyoreseptörler farklı formlarda olabilirler ve biyosensörler kullanılarak

analiz edilen çok sayıda farklı analit kadar yine çok sayıda farklı biyoreseptör vardır. Bu

biyoreseptörler başlıca; antikor/antijen, enzimler, nükleik asitler/DNA, hücresel

yapılar/hücreler olmak üzere sınıflandırılır (Vo-Dihn ve Cullum 2000). En yaygın

kullanılan biyoreseptörler enzimler ve antikorlardır.

Biyosensörler, kullanılan biyoreseptör türüne göre, biyokatalitik esaslı ve biyoafinite

esaslı olmak üzere iki şekilde gruplandırılabilir (Thevenot vd. 1999).

2.4.1.1 Biyokatalitik esaslı biyosensörler Bu tip biyosensörler, biyosensörün biyolojik ortamında bulunan makromoleküller

tarafından katalizlenen bir reaksiyon temeline dayanır. Böylece sensör yüzeyinde

bulunan biyokatalizör sayesinde substratın sürekli bir tüketimi sağlanır. En yaygın

kullanılan biyokatalitik biyoreseptörlere enzimler, hücreler ve dokular örnek

gösterilebilir (Thevenot vd. 1999).

2.4.1.2 Biyoaffinite esaslı biyosensörler Bu tip biyosensörler, biyosensörün biyolojik yapısında bulunan makromoleküller ile

analitin etkileşmesi temeline dayanır. Genellikle bir dengeye ulaşılır ve böylece analit,

kendisiyle kompleks oluşturan immobilize materyal tarafından daha fazla tüketilmez

(Thevenot vd. 1999). Biyoafinite esaslı biyosensörlerde en çok kulanılan biyoreseptörler

antikorlar/antijenler ve reseptör hücrelerdir. Biyoreseptör olarak antijen/antikor çiftinin

kullanıldığı biyosensörler “immünosensör” olarak adlandırılır. İmmünosensörlerde

reseptör tabakaya immobilize edilmiş spesifik bir antikora, antijenin (analit)

bağlanmasıyla immünokimyasal bir reaksiyon meydana gelir. Bu reaksiyon son derece

spesifik bir reaksiyondur ve genellikle bağlanma ve afinite sabiti çok büyük

olduğundan, bu gibi sistemler ya tersinir değildir (tek kullanımlık biyosensörler) ya da

gerekli tampon çözeltiler kullanılarak kompleksin çözünmesi yoluyla sistemin tekrar

kullanımı sağlanabilir (Thevenot vd. 1999).

23

2.4.2 İleticiler (Transduserler) İleticiler, biyoaktif tabakada meydana gelen reaksiyonu tayin edilebilir bir sinyale

çeviren fiziksel bir elementtir. Çevirici yüzeyi, reseptör immobilizasyonu için uygun

olmalıdır. İdealde çevirici yalnız başına analiti izlemek için yeterli değildir fakat analit

konsantrasyonunun azalması veya ürün oluşumu gibi biyokimyasal olayları algılar.

Potansiyel değişimi, elektron transferi, ışığın ürün veya analit tarafından yayılması veya

absorbe edilmesi, sıcaklık veya kütle değişimi gibi olaylar çevirici tarafından

belirlenebilir. Çizelge 2.1’de ileticilerin prensipleri ve biyosensör yapımında kullanılan

uygun sinyal çıktıları özetlenmiştir (Hou 2005).

Çizelge 2.1 Biyosensör tasarımında kullanılan iletim sistemleri

Elektrokimyasal biyosensörler, potansiyometrik, amperometrik ve kondüktometrik

olarak sınıflandırılabilir (Thevenot vd. 1999, Telefoncu 1999, Hou 2005).

Potansiyometrik biyosensörlerde, elektrot potansiyelinin belirlenmesi doğrudan analit

konsantrasyonunu tanımlamaktadır. pH veya tek değerli iyonlara duyarlı cam

elektrotlar, anyon veya katyonlara duyarlı iyon seçici elektrotlar potansiyometrik

biyosensörlerde kullanılan temel sensörlerdir. Amperometri genel anlamda belli bir

24

potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümü esasına dayanır. Söz konusu akım yoğunluğu

çalışma elektrodunda yükseltgenen ya da indirgenen elektroaktif türlerin

konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tanımlanır. İkinci elektrot referans elektrot

olarak iş görür. İlgili türlerin konsantrasyonlarının belirlenmesinde akım

yoğunluklarından yararlanılır. Kondüktometrik biyosensörlerde; elektriksel alanın

varlığında bir çözeltide elektrik yükü, iyonlar tarafından taşınır. Çözeltinin iletkenliği

çözeltideki tüm iyonik türlerin katkısıyla oluşur. Optik biyosensörler iletici sistem

olarak optik lifler üzerine uygun bir yöntemle uygun bir molekülün immobilize

edilmesiyle hazırlanan aygıtlardır. Etkileşim sonucu meydana gelen kimyasal ya da

fizikokimyasal bir değişimin ölçümünü esas alır. Örneğin optik lifin üzerine enzim

immobilizasyonu ile hazırlanan enzim sensörleri, absorpsiyon, floresans,

biyolüminesans gibi temel ilkeler çerçevesinde çalışır. Piezoelektrik sensörler en genel

anlamda karakteristik rezonans frekansındaki farklanmayı belirleyerek bir piezoelektrik

kristal yüzeyinde toplanan örneğin kütlesinin ölçülmesi esasına göre çalışan gravimetrik

aygıtlardır. Sensörün seçiciliği, kristal yüzeyindeki madde ile spesifik etkileşime sahip

analitin birikimiyle ilişkilidir. Sensör yüzeyinde bir madde adsorblandığı veya biriktiği

zaman piezoelektrik kristalin rezonans frekansındaki değişimin ölçülmesiyle sonuca

ulaşılır. Termal biyosensörler (kalorimetrik) enzim termistörleri ya da entalpimetrik

enzim sensörleri olarak da adlandırılırlar. Temel ilkesi, bir enzimatik reaksiyondaki

entalpi değişiminden yararlanarak substrat konsantrasyonunun belirlenmesidir.

2.4.3 İmmünosensörler ve immünosensörlerin sınıflandırılması

İmmünosensörler, biyospesifik duyar element olarak immünoaktif maddelerin

kullanıldığı bir biyosensör tipidir ve uygun antijen ile antikorun kompleks oluşumu

esasına dayanır. Antikor-antijen reaksiyonu son derece seçicidir (Parkinson ve Pejcic

2005).

İmmünosensör teknolojisi klasik immünotest yaklaşımından ortaya çıkmıştır. Antijen

veya antikorların sensör yüzeyine immobilizasyonuyla üretilen immünosensörler, genel

olarak ölçüm prensibine göre sınıflandırılırlar. Elektrokimyasal (potansiyometrik,

25

amperometrik, kondüktometrik), optik, piezoelektrik, akustik ve termometrik duyar

elementler immunosensörler için sensör platformları olarak kullanılır.

İmmünosensörlerin çoğu optik ya da elektrokimyasal esaslıdır. Elektrokimyasal

immünosensörlerde belirleme, genel olarak ya elektroaktif işaretleyiciler kullanılarak ya

da enzim işaretleme yoluyla yapılmıştır. Ölçüm prensibine göre sınıflandırılmış olan bu

immünosensörler, ayrıca doğrudan ve doğrudan olmayan şeklinde sınıflandırılmaktadır

(Martin 2001).

Doğrudan immünosensörler, sinyalde fiziksel değişim meydana getiren antikor-antijen

kompleksi oluşturmak için tasarlanır. Elektrotlar, membranlar, piezoelektrik materyaller

veya optikçe aktif yüzey materyalleri doğrudan immünosensör yapımı için yeterli

duyarlılıktadır. Çözeltide hedef analit vardır ve duyarlı matriks üzerinde bulunan antikor

ya da antijen komplementeri ile etkileşir. İmmünokompleks formu, hedef analitin

ölçülmesine olanak sağlayan elektrot potansiyeli, membran potansiyeli, gerçek

piezofrekans veya optik özellikler gibi yüzeyin fiziksel özelliklerini değiştirir. Bununla

beraber yüzeyde moleküllerin spesifik olmayan adsorpsiyonundan kaynaklanan

potansiyel problemleri de mevcuttur (Martin 2001).

Doğrudan olmayan immünosensörler, bağlanma olayının gözlenebilmesi için antikor ya

da antijene konjuge edilen işaretleyiciler esasına dayanır. İşaretleyici olarak enzimler,

elektrokimyasal aktif moleküller ve lipozomlar kullanılarak yüksek duyarlılıkta iletim

sağlanır (Martin 2001).

İmmünosensörlerde karşılaşılan yaygın bir durum, bu sensörlerin tersinmez özellikte

olmasıdır. Bu nedenle bir immünosensör çoğunlukla tek bir kez kullanılabilmektedir.

Son zamanlarda bazı araştırmacılar, yenilenebilir sensör yüzeyinin geliştirilmesi

yönünde çalışmaktadır (Parkinson ve Pejcic 2004).

Dört tip immunosensör sistemi vardır; elektrokimyasal (potansiyometrik, amperometrik,

kondüktometrik, impedimetrik vb.), optik, mikrogravimetrik (piezoelektrik) ve

26

termometrik. Bütün bu immünosensör sistemleri ya direkt immunosensör olarak ya da

indirekt immunosensör olarak çalışabilir (Luppa vd. 2001).

2.4.3.1 Optik immünosensörler

Optik immünosensörler, immünoreaktantlar vasıtasıyla ışığın emisyonunun ya da

absorbsiyonunun ölçülmesi esasına dayanır. Fiber optik sensörler, genellikle fiberin

distal ucu üzerinde uygun duyarlı tabakaya sahip olan bir fiber optik iplik içerir. Işık

toplam iç yansıma yoluyla fiber boyunca ilerler. Reaktant ve ışık arasındaki etkileşim

absorbansın, lüminesansın, polar izolasyonun veya kırılma indisinin değişimi olarak

ölçülebilir. İmmünosensör teknolojisinde en yaygın kullanılan optik sistem SPR

(surface plazmon rezonans) temelli cihazlardır. Bir SPR immünosensör immobilize bir

antikor tabakasıyla modifiye edilen klasik bir SPR cihazdır. Antijen, immobilize

antikora bağlandığında SPR cihazı, antikorların bulunduğu bir metal tabaka üzerine

düşen ışığın absorbsiyon açısındaki bir değişim olarak kırma indisindeki ani değişimi

tayin eder (Marty vd. 1998, Parkinson ve Pejcic 2005).

Optik ileticiler biyosensör ailesinin ticari olarak en fazla tüketilenidir. Optik

biyosensörler patojen tayininde ve hastalıkların teşhisinde dikkate değer bir ilgiye

sahiptir. Optik esaslı analiz sistemleri arasında SPR ticari olarak en popüler olanıdır.

Piyasada mevcut olan en önemli iki sistemden birisi olan BIAcoreTM en büyük Pazar

konumundadır. Kullanım kolaylığı olduğundan ve alışılagelmiş cihazlar olduğundan

laboratuvar araştırmalarında yaygın olarak kullanılırlar.

2.4.3.2 Piezoelektrik immünosensörler

Piezoelektrik sensörler, doğal frekanstaki kristal rezonantların salınımı prensibiyle

çalışan kütle duyarlı aygıtlardır. Piezoelektrik materyaller, bağımlı frekans karakterli

akustik dalgaları geçirme ve üretme yeteneğine sahiptir. Kuvarz en yaygın kullanılan

piezoelektrik materyal olmakla beraber lityumniobat da (LiTaO3) kullanılmaktadır.

27

Biyolojik madde ile kaplanan piezoelektrik bir sensör yüzeyi, virüs ya da bakteri içeren

bir çözeltiye yerleştirildiğinde, ajanların antikor bağlı yüzeye tutunması kristal

kütlesinde bir artmaya neden olur ve bu frekans değişimiyle uyumlu bir yükseltiye

sebep olur. QCM ve BW (bulk wave, yığın dalga)/SAW (surface acustic wave, yüzey

akustik dalga) olmak üzere başlıca iki tür kütle sensörü vardır.

Piezoelektrik iletim metodunun kullanımı kolaydır ancak pahalı yöntemdir ve direkt

analizlerde tercih edilir. Kristal rejenerasyonu, nispeten yüksek inkübasyon zamanı,

düşük seçicilik, proteinlerin veya diğer biyomateryallerin nonspesifik bağlanmaları,

yıkama işleminden sonra kaplı materyalin kaybı, immobilizasyonda ve kaplamada

karşılaşılan zorluklar gibi problemler bu tekniğin bilinen sınırlamalarıdır.

2.4.3.3 Termal (Kalorimetrik) immünosensörler Çoğu kimyasal ve biyokimyasal proses, ısının absorbsiyonunu ve üretilmesini içerir. Bu

ısı değişimi, ya bir termistörle ya da bir termofille ölçülebilir ve var olan maddenin

miktarıyla ilgilidir. Bir termistör bir metal oksit, bir termofil bir silikon-altın materyal

içerir. Cihaz, biyoreseptör ile kaplanır ve bu, analit ile etkileşime girdiğinde, bir sıcaklık

değişimi olarak kaydedilen bir ekzotermik reaksiyon meydana gelir. Kalorimetrik esaslı

bir biyosensör kullanılarak farklı moleküllerin enzimatik reaksiyonlarının mümkün

olabileceğini belirlemişlerdir. Bu teknolojinin en belirgin avantajı, türbit örneklerde

kullanılabilir olması, kolay minyatürize edilebilmesi ve direkt sistemde kullanılabilir

olmasıdır. Bu avantajlarına rağmen, literatürde kalorimetrik immünosensörler üzerine

çok az çalışma vardır. Son zamanlarda, antikor antijen reaksiyonu ve DNA

hibridizasyon tayini için kalorimetrik iletim sistemlerinin kullanıldığı birkaç çalışma

mevcuttur (Parkinson ve Pejcic 2005).

2.4.3.4 Elektrokimyasal immünosensörler

Yapılan literatür araştırmalarında elektrokimyasal temelli sensör platformlarının

diğerlerine oranla daha yaygın kullanıldığı açıkça görülmektedir. Stefan vd. (2010)

28

tarafından yapılan bir yayında elektrokimyasal immünosensörlerin klinik analizlerde

popülaritesinin gittikçe arttığı ve bunun özellikle sensör tasarımı gelişiminden

kaynaklandığı belirtilmiştir.

Elektrokimyasal bir immünosensörün çalışma prensibi şekil 2.15’de gösterilmiştir.

Biyoreseptör tabakada, antikorların immobilize olduğu elektrokimyasal bir

immünosensör sisteminde, örnek çözeltisi içerisinde, immobilize antikorlara spesifik

olan antijen yanında spesifik olmayan başka maddeler de vardır. Kompleks oluşumu

reaksiyonu, biyoreseptör tabakada antikorlar ve sadece bu antikorlara spesifik olan

antijenler arasında gerçekleşir. Kompleks oluşumundan dolayı, biyoreseptör tabakada,

bağlanma olmadan önceki durum ile bağlanma olduktan sonraki durum arasında bir

değişiklik meydana gelir. Bu değişim elektrokimyasal iletici tarafından ölçülebilir

sinyal haline getirilir ve değerlendirilir.

Şekil 2.15 İmmünosensörlerin çalışma prensibinin şematik gösterimi

2.4.3.4.1 Amperometrik immünosensörler

Amperometrik immunosensörler, sabit voltajda (potansiyelde) bir elektrokimyasal

reaksiyon yardımıyla oluşan akımın ölçülmesi temeline dayanır. Tipik bir örnek, bir

29

elektrot yüzeyine immobilize edilen glikoz oksidaz enzimiyle, üretilen (hidrojen

peroksit) ya da tüketilen (oksijen) türlerin elektrokimyasal tayinini yapmak için

kullanılan glikoz biyosensördür. “Yaban turpu” peroksidaz (HRP), oksidoredüktaz veya

alkalen fosfataz (AP) gibi elektrokimyasal aktif maddeler, amperometrik

immünosensörlerde işaretleyici olarak kullanılabilir (Martin 2001).

Amperometrik iletimin muhtemel sınırlaması, elektroaktif bileşenlerden kaynaklanan

girişim etkileridir ve bu bazen yanlış akımın okunmasına sebep olabilir. Bununla

bereber bu problemler, farklı polimerlerle kaplı elektrotların kullanılmasıyla büyük

oranda bertaraf edilebilir (Parkinson ve Pejcic 2005). Dolaylı olmayan duyar bir sisteme

sahip olması, amperometrik bir immunosensör için diğer bir dezavantaj olmasına

rağmen bu durum mükemmel bir duyarlılıkla telafi edilir (Luppa vd. 2001).

2.4.3.4.2 Kondüktometrik immünosensörler Kondüktometrik esaslı biyosensörler, iletkenlik ile biyotanıma olayı arasındaki ilişkiyi

kullanır. Çoğu reaksiyon iyonik türlerin konsantrasyonundaki bir değişimini içerir ve bu

çözeltide elektriksel iletkenliğin veya akım akısının değişimine neden olabilir. Bir

kondüktometrik biyosensör, belli uzaklıkta bulunan iki metal elektrot (genellikle platin

veya gümüş) içerir. Normalde elektrotlara, aralarındaki akım akısının

sürdürülebilmesini sağlayan bir alternatif akım voltajı uygulanır. Bir biyotanıma olayı

boyunca iyonik bileşim değişir ve bir ohmmetre (ya da multimetre), metal elektrotlar

arasındaki iletkenlik degişimini ölçmek için kullanılır. Son zamanlarda yapılan bazı

çalışmalar, farklı ”food borne” patojenlerin (örn: escherichia coli 0157:H7, salmonella)

hızlı tayininin (<10 dk) bu teknikle yapılabileceğini göstermektedir. Diğer

elektrokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında tekniğin en büyük dezavantajı

duyarlılığın diğerlerine göre düşük olmasıdır. Bu problemi önlemek için son zamanlarda

biyolojik sensör fonksiyonları gösteren, iyon kanallı iletken immünosensörler

tanımlanmıştır.

30

2.4.3.4.3 Potansiyometrik immünosensörler

Potansiyometrik sistemler iyon seçici elektrottaki, iyonik bir reaksiyon nedeniyle oluşan

potansiyel değişimini ölçer. Çalışma elektrotunun elektrot yüzeyi seçicilik için modifiye

edilmiştir. Potansiyel farkı, çalışma elektrodu ile referans elektrot arasında akımın

geçmediği bir anda ölçülür. Ölçülen potansiyel farkı Nernst eşitliği ile ifade edilir ve

tanımlanan iyonun aktivitesine bağlıdır. Nernst eşitliği bütün potansiyometrik

ileticilerin temel prensiplerini oluşturur.

0 lnRTE E x i

nFα= +

(2.22)

E = Çalışma elektrodu potansiyeli

E° = Standart elektrot potansiyeli

R = Gaz sabiti, 8,314 J.mol-1.K-1

T = Sıcaklık, Kelvin ( 0 0C için 273,15 K)

F = Faraday sabiti = ( 96486 J.volt-1 )

n = Alınan-verilen elektron sayısı veya membrandaki aktif iyon yüküdür.

Potansiyometrik immünosensör sistemlerin önemli dezavantajı, antikor-antijen

bağlanmasından dolayı oluşan potansiyel değişiminin çok küçük olması ve Nernst

eşitliğine uygun davranmaması olarak ifade edilmektedir (1-5 mV) (Martin 2001).

2.4.4 Antikorlar

Antikor, spesifik bir antijeni tanıma özelliği kazanmış olan biyomoleküldür ve “Ab” ile

simgelenir. Antijen ise bir immün yanıta neden olan ve vücut tarafından yabancı olarak

tanınan herhangi bir moleküler maddedir ve “Ag” ile simgelenir. İmmünoglobulinler,

serum proteinlerinin globuler-globulin kesiminde bulunan proteinlerdir ve toplam

plazma proteinlerinin % 20’sini oluştururlar. İmmünoglobülinler; immünoglobulin G

(IgG), immünoglobulin M (IgM), immünoglobulin A (IgA), immünoglobulin D (IgD),

31

immünoglobulin E (IgE) olmak üzere beş ana gruba ayrılır. IgG serumdaki

immünoglobulinlerin yaklaşık % 80’ini oluşturur ve virüslerle savaşta ön planda rol alır

(Kılıçturgay 2003). Bu sınıflar yapısal olarak boyut, yük, aminoasit bileşimi ve

karbonhidrat içeriği açısından farklı olan glikoproteinlerle ilgilidir (Martin 2001).

İmmunoglobulin molekülü, ağır ve hafif zincirlerden oluşan Fab (antigen binding

fragments) parçasından, antijenle spesifik olarak birleşir (Şekil 2.16). Antikorun antijen

ile birleştiği yüzeyin büyüklüğü, 8-12 aminoasit veya 3-6 glikoz moleküllük bir

determinant grubunu kavrayacak kadardır. Antikorun antijen ile birleştiği bu bölge

“paratop” olarak adlandırılır (Telefoncu 1999).

V: değişken, C: sabit bölgeleri tanımlar. Her bölge zincirin bir globuler bölgesidir ve

yaklaşık 108- 110 aminoasitten oluşur. IgG molekülü iki hafif (L), iki ağır (H) zincirden

oluşur. Hafif zincirler iki globüler bölge içerirken ağır zincirler bir değişken globuler

bölge yanında 3 sabit globuler bölge içerir. IgG molekülünün ağırlığı 150 kD’dur

(Telefoncu 1999).

Şekil 2.16 IgG molekülünün şematik gösterimi

Antikorlar girişim etkileri varlığında uygun bir antijenin tanınmasına imkân veren

yüksek derecede spesifikliğe sahip olduğundan, biyolojik tanıma elementi olarak çok

fazla tercih edilir. Antikorlar, düşük molekül ağırlıklı haptenlerden bakteri gibi büyük

hacimli maddelere kadar geniş bir alanda antijeni tanıma yeteneğine sahiptir.

32

Antijenlerin sadece epitop ya da antijenik determinant denilen spesifik bölgeleri bu

immün cevaba neden olur. Epitop ayrıca, uygun antikor için bağlanma bölgesi olarak

görev yapar (Martin 2001). Aynı antijene cevap veren heterojen antikorlar poliklonal

olarak adlandırılır. Monoklonal antikor teknolojisi, homojen antikorların büyük bir

miktarının üretilmesi için olanak sağlar. Bu antikorlar, bir antijenin aynı epitopuna

cevap verirler. Böylece, monoklonal antikorlar, verilen bir antijen için, aynı afinite ve

spesifikliğe sahiptir. Genelde, monoklonal antikorlar, poliklonal antikorlardan daha

yüksek bir spesifikliğe sahiptir, fakat daha düşük afinite gösterirler. Bununla birlikte,

poliklonal antikorların yüksek heterojen doğası büyük bir dezavantajdır (Marti 2001).

2.4.4.1 Antikor-Antijen bağlanma gücü

Herhangi bir biyomoleküler reaksiyon boyunca var olan kuvvetler antikor ve antijen

arasındaki etkileşimin kararlılığını sağlamaktan sorumludur. Bu kuvvetler; hidrojen

bağları, elektrostatik etkileşimler, Van der Waals etkileşimleri ve hidrofobik

etkileşimlerdir (Şekil 2.17).

Şekil 2.17 Antijen-Antikor bağlanmasında etkili olan kuvvetler

Elektrostatik etkileşimler, polaritesi yüksek moleküller arasında dipol-dipol

etkileşimleri veya yüklü moleküller arasında ya itici ya da çekici kuvvetler olabilirler.

33

Proteinlerde polipeptit omurgasının karbonil grupları ve polar aminler kalıcı dipollere

yol açar. Ayrıca polar ve yüklü zincir bölgeleri dipollere katkıda bulunur. Hidrojen

bağları elektrostatik etkileşimlerin bir alt grubu olarak düşünülür. Hidrojen bağları

elektronegatifliği yüksek bir proton alıcı üzerindeki bağlanmamış bir çift elektron ile

elektronegatifliği yüksek bir proton verici arasında meydana gelir. Amin grupları proton

verici olarak görev yapar ve karbonil grupları bir proton alıcı olarak iş görür. Bu

hidrojen bağları ve elektrostatik etkileşimler bağlanmanın gücüne katkıda bulunurlar ve

sulu çözeltide bu etkileşimler, moleküller arası kararlılık için oldukça fazla katkıya

sahiptirler (Martin 2001).

Van der Waals kuvvetleri, elektrostatik etkileşimlerden daha zayıf dipoller arasında

meydana gelir. Yakın moleküllerin elektrik alanları bu kuvvetlerden sorumlu geçici

dipollerin oluşumuna sebep olur. Bu etkileşimler kısmen zayıf olmasına rağmen, birçok

etkileşimden meydana geldiği için toplam bağlanma şiddetinin % 50’sini oluşturabilir

(Martin 2001).

Hidrofobik etkileşimler, polar olmayan moleküller ve su arasında meydana gelen itici

güçlerdir. Termodinamik kararlılığın sağlanmasında, polar olmayan bölgeler entropinin

etkisiyle bir reaksiyon bölgesinde bulunuyorsa, moleküller arası kararlılığın ve

bağlanma şiddetinin artmasına yol açarlar.

2.4.4.2 Antijen–Antikor bağlanma kinetiği

Çözeltide antikor-antijen arasında gelişen etkileşimlerin temel termodinamik prensibi;

Ab + Ag /ka kd←⎯⎯→ AbAg

Ab, serbest antikoru, Ag serbest antijeni, AbAg antijen antikor kompleksini gösterir ve

ka ve kd sırasıyla birleşme (assosiasyon) ve ayrışma (dissosiasyon) sabitidir.

34

[ ][ ]ka AbAgKkd Ab Ag

= = (2.23)

İmmünosensörlerde kullanılan antikorlar ve antijenler tipik olarak bir katı yüzey üzerine

immobilize edilirler. İmmobilizasyon antikorun (veya antijenin) yapısına göre

değişebilir ve böylece bağlanma kinetiğini etkileyebilmektedir (Martin 2001).

2.5 Biyolojik Materyallerin İmmobilizasyonu

Biyolojik materyallerin bir elektrot yüzeyine başarılı bir şekilde tutturulması

biyosensörlerin geliştirilmesinde en kritik adımdır. İmmobilizasyon aşamasının

kimyasal işlem süreci, bir biyosensörün performansında son derece etkili olduğundan bu

durum beklenen bir sonuçtur. İmmobilizasyon adımlarının başarılı olması biyosensörün,

çalışma ve saklama süresi, cevap zamanı, tekrarlanabilirlik gibi özelliklerinin istenilen

kriterlere uygunluğunu etkilemektedir (Andreescu ve Sadik 2004).

İletici ve elektrot yüzeyinin yapısına, biyoreseptörlerin kimyasal yapısı ve fiziksel

durumuna bağlı olarak birçok immobilizasyon yöntemi kullanılmaktadır. Enzimler için

uygulanan immobilizasyon yöntemleri, protein yapısındaki biyoreseptörler için de

uygulanabilmektedir.

2.5.1 Taşıyıcıya bağlama yöntemi

Enzim immobilizasyonunda kullanılan en eski yöntemdir. Bu metotta

immobilizasyondan sonraki aktivite ve taşıyıcıya bağlı enzimin miktarı taşıyıcının

yapısına bağlıdır. Biyomolekül immobilizasyonunda kullanılan taşıyıcılara örnek

olarak; silika jel, bentonit, aktif karbon, selüloz, dekstran, jelatin, polistiren türevleri,

poliakril amid verilebilir. Taşıyıcıya bağlama yöntemi şematik olarak şekil 2.18 ’de

gösterilmiştir.

35

Şekil 2.18 Taşıyıcıya bağlama yönteminin şematik gösterimi

2.5.1.1 Fiziksel adsorpsiyon

Suda çözünmeyen bir taşıyıcı yüzey üzerine proteinlerin fiziksel adsorpsiyonu temeline

dayanır. Bu yöntemde enzimde konformasyon değişikliği çok azdır ya da yoktur ve

fiziksel adsorpsiyon genellikle reaktif gerektirmez, sadece minimum aktivasyon adımı

gerektirir. Diğer yöntemlere göre basit ve ucuz bir yöntemdir. Bütün bu avantajların

yanı sıra proteinler pH, iyonik şiddet değişimlerinden etkilendiği için desorbe olurlar ve

spesifik olmayan bir yöntemdir (Kim 2004).

2.5.1.2 İyonik bağlanma

Bu metot, yüzeyinde iyon değiştirme yeteneğine sahip gruplar bulunduran, suda

çözünmeyen taşıyıcılara proteinlerin iyonik bağlanması esasına dayanır. Şartlarının

kovalent bağlanmaya göre daha kolay olması bu yöntemi avantajlı kılar. Ayrıca

biyomolekülün aktif bölgesinde ve konformasyonunda küçük çapta değişiklikler olur ve

bu yöntem yüksek aktiviteye sahiptir. Buna karşın, iyonik bağlama yöntemde pH

değişimleri olan veya yüksek iyonik şiddetli çözeltilerde biyomolekülün taşıyıcıdan

kopması meydana gelebilir (Kim 2004).

36

2.5.1.3 Kovalent bağlama

Suda çözünmeyen taşıyıcılara proteinlerin kovalent bağlanma yoluyla bağlanması

esasına dayanır. Proteinlerin taşıyıcıya kovalent bağlanmasında dikkat edilecek önemli

nokta, bağlanmanın protein aktivitesi için zorunlu gruplar üzerinden olmaması ve

bağlanma sırasındaki sterik engellemeler nedeni ile bu grupların rahatsız edilmemesidir.

Bunun bir sonucu olarak aktif molekülde aktivite kaybı meydana gelebilir. Kovalent

bağlanma diğer yöntemlere göre karmaşık işlemler içerir ve pahalıdır. Kovalent

bağlanma kullanılarak hazırlanan bir biyosensör, sıcaklık, pH, iyonik şiddet

değişikliklerine karşı dirençlidir. Ayrıca bağlanma metodu ve taşıyıcı materyallerin

seçiciliğinden dolayı kovalent bağlanma yöntemi geniş bir seçim aralığına imkân sağlar

(Tischeriand ve Wedekind 1999).

2.5.2 Çapraz bağlama

Bu metot, bir ya da daha fazla fonsiyonel gruplar kullanılarak taşıyıcı ile biyomolekül

arasında kovalent bağlanma esasına dayanır. En çok kullanılan çapraz bağlama

reaktifleri glutaraldehit, karbonildiimidazol, heterosiklik halojenürler vb. maddelerdir.

Çapraz bağlama yöntemi şematik olarak şekil 2.19’da gösterilmiştir.

Şekil 2.19 Çapraz bağlama yönteminin şematik gösterimi

Bu yöntemde biyomolekül kuvvetli bir şekilde bağlandığından desorpsiyon çok

düşüktür. Çapraz bağlama diğer metotlardan birisiyle konjugasyonda kullanılır. Bu

yöntem ile biyomolekül immobilizasyonu farklı şekillerde yapılır (Telefoncu 1999);

37

•Biyomolekülün yalnız bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu,

•Biyomolekülün ikinci bir protein varlığında bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu,

•Biyomolekülün suda çözünen bir taşıyıcıda adsorbsiyonundan sonra bifonksiyonel

reaktif ile reaksiyonu,

•Biyomolekülün bifonksiyonel reaktif tarafından aktive edilmiş polimer taşıyıcı ile

reaksiyonu.

Çapraz bağlama reaksiyonu nispeten sert koşullarda gerçekleştiğinden bazı durumlarda,

proteinin aktif bölgesinde önemli bir şekilde değişikliklere sebep olur.

2.5.3 Tutuklama yöntemi

Bu yöntemin esası protein molekülünü belirli bir ortamda durmaya zorlamaktır.

Biyomolekül bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Tutuklama yöntemi,

mikrokapsülleme ve polimer matriks içine kafesleme olmak üzere iki şekilde

gerçekleştirilir. Bu yöntemi kovalent bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan

ayıran en önemli özellik, biyomolekülün fiziksel ya da kimyasal olarak herhangi bir

taşıyıcıya bağlanmamış olmasıdır (Tischeriand ve Wedekind 1999).

2.5.3.1 Kafes tipi (Polimer matriks içine tutuklama)

Bu yöntem yüksek derecede çapraz bağlı bir polimerde, protein moleküllerinin çapraz

bağ arasında tutuklanması esasına dayanır (Şekil 2.20). Polimer matriks içerisine

tutuklama yöntemi, çok kolay uygulanması, gerçek bir fiziksel yöntem oluşu ve çok az

miktarda biyomolekül ile gerçekleştirilmesi yönünden avantajlı bir yöntemdir. Ayrıca

kimyasal bir bağlanma olmadığından yüklü taşıyıcıya gerek duyulmamaktadır.

İmmobilizasyon işlemi sırasında inaktivasyonun deney koşullarına çok sıkı bağımlı

oluşu ve immobilize biyomolekülün ancak küçük moleküllü substratlara karşı iyi

aktivite göstermesi bu yöntemin dezavantajıdır (Tischeriand ve Wedekind 1999).

38

Şekil 2.20 Kafes tipi tutuklama yönteminin şematik gösterimi

2.5.3.2 Mikrokapsülleme

Bu yöntem, biyomoleküllerin yarı geçirgen bir membran içinde tutuklanması esasına

dayanır (Şekil 2.21). Mikrokapsüllerin büyüklüğü 1-100 µm arasında değişmektedir

(Tischeriand ve Wedekind 1999).

Şekil 2.21 Mikrokapsül tipi tutuklama yönteminin şematik gösterimi

2.6 Nanosensörler

Nanoteknolojinin tanısal amaçla kullanımı, yüksek duyarlılık gerektiren ve ekonomik

olarak da uygun olan sistemlerin geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Yeni nano-tanısal

malzemelere örnek olarak kuantum noktacıklar, altın nanopartiküller ve kantileverler

örnek olarak gösterilebilir. Kadmiyum selenid gibi yarı-iletken malzemelerin nano

ölçekli kristalleri olan kuantum noktacıklar (Quantum Dots, QD’s) laboratuvar

39

tanısında kullanılan ve iddialı olan yeni tekniklerdir. Son yıllarda özellikle kanserin

erken, pratik ve ekonomik teşhisine yönelik pek çok çalışma yapılmaktadır.

Nanopartiküllerin en büyük avantajları yüksek yüzey alanı:hacim oranıdır. Elektrotlar

nanopartiküllerle modifiye edildiklerinde hem elektrodun yüzey alanını arttırarak

immobilizasyon verimini arttırmakta hem de elektron aktarım hızını arttırarak daha

düşük tayin limitlerine inilebilmesine olanak sağlamaktadırlar. Oksit nanopartiküller

genelde yüksek biyouyuşabilirliklerinden dolayı biyomolekülleri immobilize etmek

için kullanılırken yarı iletken nanopartiküller elektrokimyasal analizlerde etiketleme

ajanı olarak kullanılırlar (Luo vd. 2006). Enerji band boşluğuyla (3.2 eV’luk) bilinen en

iyi yarı-iletken nanopartiküller olan TiO2 nanopartiküller birçok elektrokimyasal

uygulamada kullanılmaktadır (Bao vd. 2008, Wang 2011; Wang vd. 2011)

Bu tez çalışmasında da üstün özellikleri nedeniyle 10-30 nm çapındaki TiO2

nanopartiküller kullanılmıştır.

2.7 Multipl Skleroz (MS)

MS, merkezi sinir sistemi (MSS) beyaz cevherinin karmaşık, tekrarlayıcı, sıklıkla

ilerleyici seyirli inflamatör ve demiyelinizan hastalığıdır (Noseworthy vd. 2000). Bu

hastalığa ait klinik ve patolojik tanımlama ilk kez 1868 yılında Charcot tarafından

yapılmıştır. Hastalığın yaygınlığı 0.5-1/1000’dir ve 18-50 yaşları arasında, kadınlarda

erkeklere göre daha sık olarak görülür (Victor vd. 2001). MS hastalığında, beyin ve

spinal kord (omurilik) beyaz cevherinde ortaya çıkan inflamatör plaklar çok odaklı

norolojik eksikliklerle kendini gösteren, hastalanma ve iyileşme dönemlerinin birbirini

izlediği ataklara neden olur. Plaklar karakteristik olarak çok sayıda ve değişik

yaşlardadır. Her atakta birkaç akson yıkıma uğrar, sonraki ataklar da aynı traktusu

(demeti/alanı) etkilerse, toplam bir etki ile akson kaybı kalıcı hale gelir ve nörolojik

fonksiyonlarda ilerleyici kayba yol açar. Başlangıç şikayetleri sıklıkla güçsüzlük, duyu

kayıpları, uyuşma, çift görme ve yürüme güçlüğüdür. Hastalığın ilerlemesiyle miksiyon

40

(idrar boşaltma) ve defekasyon (dışkı boşaltma) kontrolünün kaybı, körlük, felçler ve

bilinç kaybına kadar giden tablolar ortaya çıkabilir.

MS nöropatolojisinin çok farklı (heterojen) değişimler sonucu ortaya çıktığı kabul

edilmektedir. MS’te inflamasyon ağırlıklı akut bir süreç yanında, nöronal (aksonal)

kayıp ve gliozisle (astrositlerin tümöral olmayan üremesi) sonuçlanan kronik

değişiklikler birlikte ya da ayrı ayrı izlenmektedir. Yıllarca santral sinir sistemi

immünolojik olarak “immüno ayrıcalıklı (immunprivileged)” bir yapı olarak

düşünülmüştür. Beyin ve bağışıklık konusundaki bilgilerin gelişmesine paralel olarak

MSS’nin bu “korunmuş” yapısının şartlı bir durum olduğu görülmüştür. Belli patolojik

şartlarda önceden immün cevap göstermeyen beyin dokusunun inflamatör bir ortama

dönüştüğü ve kendi dokusu ile “yabancı-immün” hücreler arası iki yönlü bir iletişim

başlattığı düşünülmektedir. Bu ilişki sadece MS gibi bir otoimmün hastalık için değil

travmatik beyin zedelenmesi, MSS infeksiyonları ya da nörodejeneratif hastalıklar için

de geçerli görünmektedir. Patolojik olarak değişmiş beyin dokusu major

histokompatibilite kompleksi (MHC) moleküllerini belirginleştirmekte, lokal

sitokinlerini üretmekte, aktive olmuş T hücreleri kan beyin bariyerini geçerek MSS’ne

girebilmektedir (Idiman 2004). MHC yerine insan lökosit antigen ‘Human Leucocyte’

(HLA) terimide kullanılmaktadır.

Normalde proinflamatör (Th1) ve antiinflamatör (Th2) sitokinler arasinda ince bir denge

söz konusudur. MS'da bu dengenin proinflamatör sitokinler lehine bozulması sonucunda

demiyelinizasyon meydana gelmektedir. Serumda bulunan otoimmün antikorlar çapraz

reaksiyona neden olarak MS oluşumuna neden olabilirler. Diğer taraftan kendine ait

(self) toleransa sebep olan neden, eş zamanlı olarak diğer otoantikorların serumda

bulunmasına hatta diğer bir otoimmün hastalığın oluşmasına neden olabilir. Bu

düşünceden hareketle, çeşitli otoantikorlarla yapılan çalışmalarda, MS hastalarında

otoantikor düzeyi normal popülasyona oranla yüksek tespit edilmiştir. Yine yapılan

çalışmalar, bazı sistemik hastalıklardaki gen lokuslarının, MSS tutulumuyla olan ilgisini

açıkça göstermiştir. Çapraz reaksiyon, genetik yatkınlık ya da eş zamanlılık, nedeni ne

olursa olsun MS hastalarında otoantikor düzeyleri normal popülasyona oranla yüksek

çıkabilmektedir.

41

Hastalığın en önemli özelliği heterojen olmasıdır. Klinik gösterge, tedavi cevabı ve

patoloji bulguları başta olmak üzere birçok yönden hastalar arasında büyük farklılıklar

vardır. Bu farklılıklar, MS'in tek bir hastalık olmayıp bir sendrom olarak görülme

eğiliminin oluşmasına neden olmuştur. Yapılan çok sayıda çalışmaya rağmen etiyolojisi

tam olarak aydınlatılabilmiş değildir. Genel olarak kabül gören görüş, genetik ve

çevresel faktörlerin karşılıklı ve karmaşık etkileşimlerinin etiyolojiden sorumlu

olduğudur. Ayrıca bu dönemde MRG’nin klinik kullanıma girmesi ve daha sonra yeni

tekniklerin geliştirilmesi; hastalığın tanısına, seyrinin izlenmesine ve tedavi etkinliğinin

değerlendirilmesine olanak sağlamıştır.

Epidemiyolojisi: 1.Cinsiyet: Hastalık kadınlarda daha sık olup kadın/erkek oranı 2:1 olarak saptanmıştır.

Birincil İlerleyen MS (PPMS)'te 1:1 oranındadır.

2.Yaş: Hastalık genç erişkin yaşlarda görülür. Çocuklarda ender olup hastalığın en sık

görüldüğü aralık 30-33 yaşlarında olmaktadır. Hastaların %90'ında başlama yaşı 15-50

yaş arasıda olup (%70 hastada 20-40 yaş arası, %10 daha erken, %20 daha geç), %l'den

az kısmında başlama yaşı 10 yaş altı veya 60 yaş üzerindedir.

3.Irk: MS yaygınlığı ülkelere göre değişmektedir. Son yıllarda yaygınlığın artış

gösterdiği ifade edilmektedir. Hastaların %90'dan fazlası beyaz ırktandır. Asyalı ya da

Afrika kokenli Amerikalılarda seyrek görülür. Afrika yerlileri, Macar Çingeneleri,

Eskimolar, Kızılderililer ve Avustralya aborjinlerde nadirdir. Özellikle 40 yaşından

daha genç olan erişkinlerde en sık izlenen nörolojik hastalıktır. Bizim ülkemizde MS

yaygınlığı ve oluş derecesi (insidansı) bilinmemektedir, ama klinik gözlemlere göre son

yıllarda hasta sayısında artış mevcuttur (Tunalı 2004).

Etiyolojik ve patogenetik mekanizmalar: Epidemiyolojik çalışmalar, MS'e genetik olarak yatkın bir bireyin olasılıkla prepubertal

(ergenlik öncesi) dönemde spesifik ya da nonspesifik bir ajanla karşılaşması sonucu bir

immün aktivasyonun oluştuğunu düşündürmektedir. Genetik çalışmalar bu yatkınlığın

olasılıkla 6. kromozomun kısa kolunda lokalize HLA.-DR DQ bölgesine yakın genlerle

ilişkili olduğunu göstermektedir. Birincil enfeksiyondan yıllar sonra yeni bir enfeksiyon

42

bu otoimmun olayı tetiklemekte ve MSS'ne sınırlı ve spesifik bir otoimmün hastalığın

ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Bir başka görüş ise, MSS'de zaman zaman

alevlenmelerle yeni demiyelinizasyonlara yol açan bir viral infeksiyon ya da T hücre

aktivitesinin olduğudur. Bilinen tek gerçek, miyelin proteinleri MBP, Miyelin

Oligodendrosit Glikoprotein (MOG), Miyelin-bağımlı Glikoprotein (MAG), Proteolipid

Protein (PLP) başta olmak üzere MSS'nin birçok yapı taşının (S 100beta, stres

proteinleri) bu immün atağın hedefi olduğudur (Idiman 2004).

Nöropatologlar tarafından aktif MS lezyonlarının ayrıntılı ve dikkatli incelenmesi bu

hastalıkta lezyon paterni ve lezyon formasyon mekanizmaları arasında büyük

farklılıklar olduğunu göstermiştir. Lassmann (2002) 150 den çok aktif MS lezyonunun

patolojisini analiz ederek bu konuda yanıtlanmamış pek çok soruyu yanıtlamıştır.

Hastalığın erken döneminde elde edilen beyin biyopsileri kadar hızla ilerleyen akut MS,

Devic Hastalığı, Balo'nun Konsantrik Sklerozu ya da klinik ve patolojik olarak aktif MS

beyin otopsi örnekleri bu konuda çok önemli ipuçları vermektedir. Her nekadar aktif

MS lezyonları, T hücre ve makrofaj egemenlikli inflamatör reaksiyon gösteriyorsa da

demiyelinizasyon miyelin protein ekspresyonu, yayılım ve plak büyüklüğü,

oligodendroglia (OG) zedelenme örneği ve aktif kompleman depolanması acısından

farklılıklar gösterir. Bu temel özellikler açısından dört farklı paternde MS patolojisi

oluştuğu saptanmıştır (Şekil 2.22). Bu çok ayrıntılı çalışmalar MS' in düşünüldüğünden

de karmaşık bir hastalık olduğunu ortaya koymaktadır

43

Şekil 2.22 MS’in immünpatogenezi (Trends in Molecular Medicine Vol.7, No:3 Mart 2001) MS’te demiyelinizasyon ve doku yıkım mekanizmaları: İmmun sistem, organizmayı infeksiyonlara ve diğer dış etkenlere karşı savunmakla

görevli özelleşmiş işlevleri bulunan hücreler ve moleküllerden oluşur. Organizmayı

enfeksiyondan koruyup yabancı maddelerin ortadan kaldırılmasını sağlayan

mekanizmaların kendisi doku hasarı ve hastalık yaptığında otoimmün hastalıklar ortaya

çıkar. İmmün yanıt doğal ve adaptif olmak üzere iki türlüdür. Doğal immünitenin ana

bileşenleri fiziksel ve kimyasal bariyerler, fagositik hücreler, doğal katil hücreler,

kompleman gibi kan proteinleri ve sitokinlerdir. Adaptif immün yanıt ise antijene özgü

B ve T lenfositlerinin yanı sıra lenfosit aktivasyonu için antijen sunan hücrelerin ve

antijenleri ortadan kaldıran efektör hücrelerin varlığına dayanır. Doğal immüniteyi

oluşturan elemanlar tekrarlayan infeksiyonlara aynı yanıtı verirken adaptif immünite

antijene özgüdür ve antijenle tekrarlayan karşılaşmalar bu özgünlüğü artırır

44

(immünolojik hafıza). Patojenlerin ortadan kaldırılmasında doğal ve adaptif immünite

birlikte çalışır. Yabancı antijenlerin T ve B lenfositleri tarafından tanınması immün

yanıtın önemli bir bölümünü oluşturur. T hücreleri T hücre reseptörü taşırlar ve antijen

sunan hücrelerin MHC molekülleri ile sundukları antijenleri tanırlar. B hücreleri antijen

için B hücre reseptörü (BCR) görevini yapan yüzey immünoglobulini ile ayırt edilirler.

TCR ve BCR repertuvarı çok geniştir; T ve B lenfositler sayısız yabancı antijene karşı

yanıt oluşturabilirler. Bu durum antijenle tetiklendikten sonra genişleyen bir hücre

klonunun organizmaya ait peptidler dahil çok sayıda epitopla reaksiyon verebileceği

anlamını taşımaktadır. Normal koşullarda otoantijenlere karşı yüksek afiniteli

reseptörleri olan hücreler immün repertuvardan çıkarıldıklarından ya da aktive

edilmediklerinden kişinin kendi dokularına karşı yanıt oluşmaz. Otoantijenlere karşı bu

seçici cevapsızlık “kendine ait-tolerans” olarak tanımlanır ve normal immün sistemin

ana özelliklerinden biri olarak bilinir. Tolerans gelişiminin ana mekanizmaları apoptoz

yoluyla delesyon, fonksiyonel inaktivasyon (anerji) ve düzenleyici T hücreleri ile

baskılanmadır. Tolerans bozulduğu zaman immün sistem yabancı ve otoantijen ayrımını

yapamaz; otoreaktif lenfositler aktive olur, klonal genişlemeye uğrar ve otoantikor

üretirler.

Hastalığın seyri: 1996 yılında yayınlanan uluslar arası bir çalışmanın sonuçları hastalığın 4 kategoride

toplanabileceğini ortaya koydu. Bunlar;

1. Relaps (atak) ve remisyonlar (iyileşme) ile giden MS (Relapsing-Remitting MS,

RRMS): Akut ataklar ve bunları izleyen tam ya da tama yakın düzelme dönemleri ve

ataklar arasında hastalığın stabil kalması ile karakterize en sık rastlanan formdur. İleriki

ataklar tahmin edilemeyen aralar ile ortaya çıkar. Her bir ataktan sonra hastaya ait

özürlülük giderek artar. İlerleyen dönemde bu tipin ikincil ilerleyen forma dönebilme

eğilimi vardır.

45

2. Birincil İlerleyen MS (Primer Progressive MS, PPMS): Genellikle iyileşmelerin

kaydedilmediği, başlangıçtan itibaren hastalığın ilerlemesi ile karakterize olan formdur.

En ağır formunda MS birkaç yıl içinde ölüm ile sonuçlanabilir. Tam tersine daha kronik

yavaş ilerleyici formlarında iyi huylu gidiş benzeri bir seyir olmaktadır.

3. İkincil İlerleyen MS (Seconder Progressive MS, SPMS): Erken dönemli relaps

ve remisyonlar ile giden klinik form ortalama 5-6 yıl sonra sıklıkla bu forma

dönüşebilmektedir. Ataklardan tam düzelme olmaksızın her bir atakta eklenen özürlerle

hastanın kısıtlanması giderek artmaktadır.

4. Ataklı İlerleyen MS (Relapsing Progressive MS, RPMS): Hastalığın

başlangıcından itibaren giderek ilerleyen ve arada akut relapsların da tabloya eklendiği

formdur.

En sık rastlanan formu relaps ve remisyonlarla seyreden formudur (%85). Relaps sıklığı

hastadan hastaya değişiklik gösterir. Bu hastaların önemli bir yüzdesinde sonradan

ilerleyen forma dönüşüm söz konusudur (ikincil ilerleyen form). Hastaların %50'sinde

10 yıl, %90'ında 25 yıl içersinde ikincil ilerleyen MS gelişir. Hastaların %10 kadarında

ise seyir başlangıçtan itibaren ilerleyicidir. Geri kalan %5’inde ise ataklı ilerleyen seyir

söz konusudur. Bu 4 ana form dışında varyantlar tanımlanmıştır. Bunlar;

1) Benign MS: Hastaların %20’sinde iyi huylu gidiş söz konusudur. Bu tabloda ilk

belirtiler başladıktan 10 yıl sonra hastalarda tam iş gücü mevcut olup bağımsız hareket

edebilmektedirler.

2) Spinal tutulumla giden şekli: Bu formda başlangıçtan beri spinal kord

tutulumuna ait belirtiler mevcut olup daha çok ilerleyici gidiş söz konusudur. Medulla

spinalis lezyonlarının varlığı prognostik açıdan olumsuz kriter sayılmaktadır.

3) Nöromyelitis optika (Devic sendromu): Akut transvers miyelit (subakut

gelişimli, motor, duyusal ve otonomik sinirler ve omuriliğin fonksiyon bozukluğu) ve eş

zamanlı veya kısa süre sonra takip eden optik nevrit (sinir enflamasyonu) ile ortaya

çıkan bir tablodur. Pek çok hastada MS’den ayırt edilemeyecek relaps ve remisyonlarla

46

giden bir şekli olabileceği gibi omurilik bulguları kalıcı olabilir. MS’e göre optik nevrit

prognozu da olumsuz olup ciddi görme kayıpları ile sonlanabilir.

4) Marburg şekli: MS’e ait bu ender ve malin form bilinç bozuklukları, ileri

derecede görme kaybı, dizartri (sinirlerden ileri gelen dil ve konuşma bozuklukları),

disfaji (yutma güçlüğü), solunum yetmezliğine ait ilerleme ile ortaya çıkan; akut

dissemine ensefalomyelitten ayrımı oldukça güç olan bir formdur.

5) Tek taraflı kitle lezyonları (Tümefaktif MS): MS plaklarının çoğunun çapı 2

mm’den daha azdır. Bazen ödem nedeniyle beyin absesi gibi kitle etkisi yapar.

6) Balo’nun konsantrik sklerozu: Nadir akut MS varyantlarından biri olup tipik

patolojik bulguları (konsantrik bantlar) görülür. Yakın tarihte yapılan immünopatolojik

çalışmalarda oligodendrogliopati ve oligodendrotik apoptoz görülmüştür. Filipinler’de

ve Çin’de daha fazla görülmektedir.

MS için tipik belirtiler: Duyusal belirtiler: MS hastaları tarafından en çok tanımlanan belirtilerdir. Sensorial

belirtiler algılama bozuklukları, iğnelenme ve zaman zaman yanmalar şeklinde

tanımlanan rahatsızlık hissini (disestezi) içerir ve bunlar objektif bozukluklar

olmaksızın günler, haftalar veya aylarca süreklilik gösterebilir.

Motor belirtiler: MS hastalarında en sık rastlanan belirti ekstremitelerde kuvvet kaybı

parezi ya da pleji durumudur. Hastalarda birinci motor nöron tipi, alt ekstremitelere ait

giderek artan kuvvetsizlik ve sertleşme, paraparezi sık izlenen şikayetlerdir.

Görme ile ilgili belirtiler: Optik nevrit, MS’te başlangıç belirtileri arasında sık

görülebilen bir belirti olup bir gözde ani görme kaybı ve ağrı ile birlikte genellikle tek

taraflı başlar. Kranial MRG’de dörtten fazla demyelinizan lezyon varlığı veya BOS

oligoklonal band varlığı MS’e dönüşme riskini artırıcı faktörler olarak bulunmuştur.

47

Spinal kord belirtileri: MS tanısı alan hastaların çoğunda spinal kord tutulumuna bağlı

bulgulara rastlanır. Her iki alt ekstremitede artmış tonusla birlikte spastik paraparezi,

artmış tendon refleksleri ve iki taraflı eksantör plantar cevap, mesaneye ait fonksiyon

bozuklukları sık rastlanılan bulgulardır.

Hafıza kaybı: MS’da bozulmuş kognitif işlemler nadir değildir. Bu durumda hastalar

sıklıkla verbal fonksiyonlarda kayıp ağırlıklı bir hafıza problemi gösterirler. Vakaların

yaklaşık %50’sinde görülen demans, RRMS formunda progresif forma göre daha az

birliktedir. Periventriküler bölgedeki beyaz cevherin demiyelinizasyonu bu hastalarda

konuşma sırasında uygunsuz gülme ve yersiz ağlama gibi duygusal patlamalarına sebep

olur.

Depresyon: Depresyon ve bipolar efektif bozukluk MS’le yakından ilişkilidir. Hatta

bazı vakalarda MS belirtilerine öncülük edebilir.

Lhermitte Bulgusu: Başın eğilmesi sonucu omurga boyunca ekstremitelere yayılan

elektriklenme gibi bir his ortaya çıkabilir. Bu fenomene Lhermitte bulgusu denir.

Yorgunluk: Hastaların çoğunda merkezi yorgunluk (fatigue) vardır. Başlangıcı ani ve

şiddetlidir. Hastalar çok basit işleri bile yapamazlar.

MS'de kesin tanı büyük önem taşır. Çünkü doğru tanı hem hastalığın seyrine etkili

olabilen immün modülatör ve immünsupressif tedavilerin uygulanmasına ve hem de

hastanın hastalığın tabiatı ve yapılabilecekler konusunda bilgilendirilmesine olanak

sağlar. MS esas itibariyle klinik bir tanıdır. Tanı; semptom ve bulgularla hastalığın

klinik seyri dikkate alınarak konmaktadır. MRG, nörofizyolojik testler ve BOS

incelemesi tanıya ulaşmada önemli katkılar sağlar. Ancak kesin tanı koydurtacak bir

labaratuvar bulgusu yoktur (Paty vd. 1988, Offenbacber vd. 1993). İlk kayda değer

kriterler tanımlaması Schumacher ve arkadaşları tarafından 1965 yılında yapılmıştır.

Uyan kriterlerin sayısına göre MS "Klinik kesin, olası (Probable) ve olabilir (possible)"

olmak uzere sınıflandırıldı. Kriterler lezyonların zaman ve alan içersindeki dağılımları

dikkate alınarak tarif edilmiştir (Çizelge 2.2).

48

Çizelge 2.2 Schumacher Kriterleri

1. Hastalık başlama yaşı 10-50 arası olması

2. Nörolojik muayenede objektif bulguların tespit edilmiş olması

3. MSS’de beyaz cevher tutulumunu gösteren bulgular

4. Zaman içerisinde dağılım

a. En az 24 saat süren ve arası en az 1 ay olan 2 ya da daha fazla atak

b. En az 6 ay devam etmekte olan ve progresyon gösteren klinik seyir

5. Alan içerisinde dağılım (yeni plakların multifokal oluşu)

6. Tanı yönünden MS’ten daha iyi açıklamanın olmaması.

Tanıya büyük katkı sağlayan diğer bir yöntem de BOS incelemesi olup intratekal IgG

yapımındaki artışın göstergesi olan IgG indeksi artışı (veya IgG sentez hızındaki artış)

ve oligoklonal bantların varlığının gösterilmesidir.

1983 yılında Poser başkanlığında toplanan komite yukarda sözü edilen tanı yöntemlerini

de içine alacak şekilde MS'de tanı kriterlerini yeniden tanımladı (Poser vd. 1983).

Çizelge 2.3 Poser kriterlerine göre MS sınıflandırılması

49

2.7.1 Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS)

BOS, beynin koroid pleksusu tarafından üretilen bir sıvıdır. Toplam hacmi yetişkinlerde

140-170 ml kadardır. BOS’un protein içeriğinin %80’den fazlası plazmanın

ultrafiltratından kaynaklanır ve prealbumin, albumin ve transferin gibi küçük moleküler

ağırlıklı proteinlerden zengindir. Beyin kapiller hücreleri, periferik kapiller hücrelerden

farklı olarak “tight-junction” denilen sıkı bağlantılarla bağlanmıştır. Kesintisiz bir bazal

membrana sahip olan bu endotel hücreleri kanla beyin arasında kan-beyin bariyeri adı

verilen özel bir bariyer oluşturur. Bu bariyerden bileşikler moleküler ağırlıkları,

proteinlere bağlanma ve lipide çözünürlükleriyle ilişkili olarak geçebilirler.

Karbonmonoksit, nöroaktif ilaçlar ve alkol gibi lipide kolay çözünen maddeler BOS’a

kolaylıkla girebilir.

BOS örneği genellikle lomber ponksiyon ile elde edilir. BOS, su gibi renksiz ve şeffaf

bir sıvıdır, viskositesi de suyun viskositesine benzer. BOS’un bulanık görünmesi,

protein ve lipid konsantrasyonundaki artışa ya da enfeksiyona bağlı olabilir. BOS’un

görünümü bazen pembe, turuncu veya sarı olabilir, ksantokromi olarak adlandırılır.

Ksantokromi genellikle eritrosit yıkımından kaynaklanır. Serum bilirubin ve protein

konsantrasyonlarındaki artışlar ile karoten ve melanin varlığıda ksantokromiye neden

olur. Kanlı görünüm intrakraniyel kanamanın göstergesi olabildiği gibi ponksiyon

işleminden de kaynaklanabilir.

BOS’da en sık yapılan biyokimyasal test, protein tayinidir. BOS normal koşullarda çok

az protein içerir ve bunun %80’den fazlası plazmadan kaynaklanır. BOS proteininin

çoğunu albumin oluşturur. Serum proteinlerinin BOS proteinlerine oranı 200:1’dir. BOS

proteini için normal değer 15-45 mg/dL’dir. BOS’da protein düzeylerinin artması kan

beyin bariyeri hasarı, merkezi sinir sisteminde immünglobulin sentezinin artması veya

sinir dokusu dejenerasyonuna bağlı olabilir.

MS’te klinik prezantasyon atipik olduğunda ve/veya MRG yeterli destek

sağlamadığında BOS bulguları önem taşımaktadır. Bu tetkik, lezyonların otoimmün ve

50

inflamatör özelliklerinin göstergesidir. Lezyonların zamansal ve alansal dağılımı

konusunda bilgi vermez. Konsantre BOS örneğinde (tercihan izoelektrik fokuslama

yöntemi ile) yapılan elektroforezde oligoklonal bantların varlığının gösterilmesi ve/veya

IgG indeksinde artış tanıya katkı sağlayan bulgulardır. Ayrıca hafif lenfositik pleositoz,

(<50/mm3) bulunabilir.

2.8 Çalışmada Kullanılan Biyomoleküller, Taşıyıcı Sistemler, Nanopartiküller ve

Çapraz Bağlayıcılar

2.8.1 Miyelin Basic Protein (MBP)

MBP, MSS’deki sinirlerin (Şekil 2.23) miyelinizasyon prosesinde oldukça önemli olan

14-21 kDa’luk stoplazmik bir proteindir. MSS’nin miyelin kılıfı daha çok sinirlerin

etrafında sarılı olarak bulunan ve oligodendrositlerin uzantısından meydana gelen bir

membrandan oluşur (Arroyo ve Scherer 2000).

Şekil 2.23 a. Sinir hücresinin, b. Miyelin kılıfın, c. Miyelin proteinlerinin şematik gösterimi (Min vd. 2009)

51

MBP, 1971 yılında miyelin membrandan izole edilmesiyle tanımlanmıştır. Knock-out

türü farelerde MBP eksikliğinde MSS’nde miyelinizasyon miktarında azalmalar

gözlenmiş, tremor ve ataklarla karakterize ilerleyici hastalıkların meydana geldiği ve

bunların ölümle sonuçlandığı görülmüştür (Min vd. 2009). MSS’deki miyelinler

ağırlıkça yaklaşık %70 oranında lipitlerden meydana gelir. Miyelinde pek çok protein

bulunmasına rağmen en fazla bulunan proteinler arasında MBP ve PLP gösterilebilir

(Kramer vd. 2001). Miyelin, direnci 5000 faktör oranında arttırırken kapasitansı 50

faktör oranında azaltarak impulsların sinir liflerine doğru çok hızlı bir şekilde

ilerlemesini sağlar. Miyelin aynı zamanda elektrik akımının aksondan ayrılmasını da

önlemektedir. Memeli MSS’deki miyelinlenmemiş sinirler ve miyelinlenmiş aksonların

rejenere olamadığı da literatürde yer almaktadır (Baumann ve Pham-Dinh 2001).

İnsanlarda MBP ile ilgili genin, MSS’nde bulunan proteinlerle ve hematopoetik

hücrelerle de ilgili olan 18. Kromozom üzerinde bulunduğu bilinmektedir (Min vd.

2009).

18.5 kDa’luk klasik MBP başta olma üzere diğer tüm klasik izoformları da Ca(2+)-

kalmodulin, aktin, tubulin ve SH3-düzlemi içeren proteinlere bağlanma

eğilimindedirler. Bu eğilim, miyelinizasyon prosesinde ve modellenmesinde sinyal

olarak kullanılabilmektedir. Bu proteinler intrinsik olarak düzenlenerek etkin bir

bağlanma yüzeyi oluştururlar.

Sinirleri yalıtan bu miyelin kılıfın kaybı (demiyelinizasyon), MS, transvers miyelit,

adrenolökodistrofi ve felç gibi pek çok nörodejeneratif otoimmün hastalığın

habercisidirler (Lamers vd. 2003). Serebrovasküler kaza olarak da bilinen felç

sonucunda beynin bir kısmına kan akışı engellenmekte ve nöronal fonksiyonlar anında

durmaktadır. Yeterli oksijeni alamayan beyin hücreleri ölmekte ve beyin işlevini

yitirmektedir. Felçin dolaylı bir sonucu ise miyelin yıkımı sonucu BOS’ta MBP artışıdır

(Lamers vd. 2003).

MBP’ye karşı oluşan hedeflenmiş immün yanıt, ölümcül rabies viral hastalık modeli

kullanılarak araştırılmıştır. MBP eksplantlarının alınıp yapay besin ortamında

52

çoğaltılmasıyla yapılan çalışmalar, MBP’nin kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini

arttırdığını ve immün hücrelerin kan-beyin bariyerinden daha kolay geçebildiğini

göstermiştir. Silver-haired bat rabies virus (SHBRV) ile yapılan bir başka çalışmada ise

bu virüs ile enfekte farelere MBP uygulandığında, MBP uygulanmayan kontrol grubuna

oranla %20-30 oranında daha fazla ölümün gerçekleştiği gözlenmiştir (Min vd. 2009).

MBP’nin BOS’taki normal düzeyi 4 ng.mL-1’den düşüktür. Bu düzeyin 4-8 ng.mL-1

arasında seyretmesi MSS travması, kronik miyelin yıkımı ya da önceden gerçekleşmiş

bir MSS travmasının iyileşmesini gösterirken 9 ng.mL-1 den yukarıdaki değerler ise

aktif demiyelinizasyonu göstermektedir (Lamers vd. 2003).

2.8.2 Taşıyıcılar

2.8.2.1 Jelatin

Jelatin, hayvan kemik, bağ doku, bağırsak ve organlarındaki kollojenlerin kısmi

hidrolize edilmesi ile üretilir. Farklı zincir uzunlukları içeren polipeptit bir yapıdır, suda

ve organik çözücülerde çözünmez, ancak su çeker. Bu özelliğinden dolayı kıvam

artırıcı, jelleştirici, film oluşturucu bir maddedir.

Jelatin, 3000 ile 20000 arasında değişen molekül ağırlığına sahip, kollojen hidroliz

ürünlerinin heterojen bir karışımıdır. Polipeptit bağında sıralı şekilde lisin-prolin-prolin

ve glisin-prolin-hidroksiprolin amino asitlerinin tekrarı ile oluşan lineer bir polimerdir

(Şekil 2.24).

Şekil 2.24 Jelatin polimerinin zincir yapısı

53

Jelatinin en belirgin özelliği, sıcaklığa bağlı geri dönüşümü olan jel oluşturma özelliğine

sahip olmasıdır. Çözeltiden jele, jelden çözeltiye dönüşme işlemi, çok kısa bir sıcaklık

aralığında gerçekleşir ve bu işlem tekrarlanabilir bir dönüşüm işlemidir. Bu özelliği,

jelatinin sayısız uygulamada kullanılmasına olanak verir. Ayrıca çapraz bağlayıcılarla

birlikte kullanıldığında tersinir olmayan jel oluşturma özelliğine de sahiptir. Jelatinin

bir diğer önemli özelliği de köpük oluşturma ve oluşan bu köpüğü uzun süre muhafaza

etme özelliğidir. Böylece ürünlerin hacimlerinin de artmasını sağlar. Kolloidal yapıyı

koruma gücü yüksek olan jelatin, emülsiyonların ve süspansiyonların oluşumunu

kolaylaştırır ve örneğin dondurmada ve dondurulmuş tatlılarda buz kristallerinin

oluşumunu engeller.

Jelatin yapısındaki aminoasit molekülleri, sulu ortamda kutuplu iyonlar gibi davranırlar.

Karboksil (-COOH), hidroksil (-OH) ve amin (-NH2) fonksiyonel gruplarına sahiptir.

Jelatin, izoelektrik nokta altında pozitif (+) özelliktedir Jelatinin yapısı 100ºC gibi

yüksek sıcaklıklarda bozulur. Bunun sonucunda da jelatin, kıvam arttırıcı ve jelleştirici

gibi özelliklerini kaybeder. 2.8.2.2 Kitosan

Kitosan, kitinin N-deasetillenmiş türevidir (Şekil 2.25). Ancak bu asetilasyon neredeyse

hiçbir zaman tamamlanamamaktadır. Kitin, selülozdan sonra dünyada en çok bulunan

ikinci doğal biyopolimerdir. Aynı zamanda doğal olarak en çok “amino şeker” içeren

polisakkarittir. Doğada bol bulunuşu, kitin ve onun bir türevi olan kitosanın kendilerine

özgü kimyaları ile birleştiğinde pek çok potansiyel uygulamaları ortaya çıkmaktadır.

Kitin, kabukluların, böcek dış iskeletlerinin, mantar hücre duvarlarının, mikrofauna ve

planktonun bir bileşeni olarak bulunmaktadır. Kimyasal olarak β(1-4)2-acetamido-2-

deoxy-D-glucose (veya N-asetil glukozamin) tekrarlanan birimlerinden oluşan bir

polimerdir (Kumar ve Majeti 2000).

54

Şekil 2.25 Kitin ve Kitosanın moleküler yapıları

Kitin ve kitosanın ticari olarak ilgi görmeleri yüksek oranda (% 6.89) azot

içermelerindendir (sentetik selüloz için bu oran % 1.25’dir.). Bu yüksek azot oranı kitini

yararlı bir şelat ajanı yapar. Günümüzde kullanılan polimerlerin pek çoğu sentetik

malzemelerdir. Fakat bunların biyouyuşabilirlikleri ve biyobozunabilirlikleri, selüloz,

kitin, kitosan gibi doğal polimerlere nazaran oldukça sınırlıdır. Bu doğal polimerlerin de

reaktiviteleri ve işlenebilirlikleri sınırlıdır. Bu konuda kitin ve kitosan uygun

fonksiyonel malzemeler olarak tavsiye edilmektedirler. Çünkü bu doğal polimerler,

biyouyuşabilirlik, biyobozunabilirlik, toksik olmama, adsorpsiyon gibi mükemmel

özelliklere sahiptirler. Kitosan; biyouyuşabilirlik, antibakteriyal, antifungal ve

antitumoral etki, hemostatik, ağır metal, protein ve yağ absorbsiyonu, biyodegradasyon

gibi özellikler nedeniyle birçok alanda yaygın kullanım alanına sahiptir. Bu kullanım

alanlarının başında kontrollü ilaç salımı, biyosensör uygulamaları, hücre kültürü, gıda

ve su arıtım sistemleri yer almaktadır.

2.8.2.3 Aljinat

Aljinat ilk olarak 1881 yılında İngiliz kimyacı E.E.C. Stanford tarafından

tanımlanmıştır. Doğada genel olarak kahverengi deniz alginde bulunmakla birlikte

Azotobacter vinelandil gibi toprak bakterilerinde de aljinata benzeyen hücre dışı

polimerik maddeler tnaımlanmıştır. Molekül olarak düz zincir yapıda (1 4) bağlı β-D

55

mannuronik asit ve α-L-gluronik asit ünitelerinden oluşan bir kopolimerdir. Aljinik

asidin en önemli özelliği sodyum gibi +1 değerlikli katyonların varlığında düşük

konsantrasyonlarda bile viskoz bir çözelti oluşturması; başta kalsiyum olmak üzere

baryum, aluminyum ve stronsiyum gibi +2 değerlikli katyonların varlığında ise suda

çözünmeyen bir jel oluşturmasıdır. Jel oluşumunun, polimer zincirindeki karboksil

gruplarının kalsiyum iyonları ile iyonik köprü oluşturması ile veya kalsiyum iyonlarının

her polimer çiftindeki hidroksil ve karboksil grupları ile şelat oluşturması ile olduğu

düşünülmektedir. Kalsiyum aljinat jelinin oluşması yumuşak koşullarda gerçekleştiği

için bu jel biyomateryallerin immobilizasyonu için oldukça uygundur.

2.8.3 TiO2 nanopartiküller

Bu tez çalışmasında Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü, Fizikokimya A.B.D.’ndan

Prof. Dr. Ali Sınağ ve ekibi tarafından sentezlenen TiO2 nanopartiküller kullanılmıştır.

TiO2 nanopartiküllerin biyouyuşabilirliği yüksektir ve 3.2 eV band boşluk enerjisi ile

bilinen en iyi yarı-iletkendir. Geçirmeli Elektron Mikroskobu (TEM) görüntüsü ve X-

ışınları fotoelektron spektoskopisi (XPS) spektrumları bu nanopartiküllerin ortalama 15

nm çapında olduğunu göstermiştir.

2.8.4 Çapraz bağlayıcılar

Çalışmamızda kullanılan çapraz bağlayıcılar amin (–NH2) ve (-OH) fonksiyonel

gruplarını içeren jelatin ve kitosan için glutaraldehit; karboksil (-COOH) fonksiyonel

grubunu içeren aljinat için ise N-hidroksisüksinimit/1-etil-3-(3-

dimetilaminopropil)karbodiimit (NHS/EDC)’dir.

Glutaraldehit biyokimyasal çalışmalarda sık sık kullanılan keskin kokulu, renksiz bir

sıvıdır. Biyokimyasal uygulamalarda amin-reaktif bifonksiyonel çapraz bağlayıcı olarak

kullanılır. Proteinlerin oligomerik yapıları bu uygulamalarla incelenir.

56

Glutaraldehit ile immobilizasyonun temel prensibi, serbest biyomoleküller ile

glutaraldehit homo çapraz bağlayıcı reaktifi kullanılarak çapraz bağlı biyomolekül

agregasyonları oluşturulur.

Glutaraldehitin her iki ucu da reaktiftir. Böylece birçok biyomolekülünün bir arada

bulunmasıyla çözünür yapı, çözünmez özellik kazanarak biyomoleküller güçlü bir

şekilde bağlanır (Şekil 2.26). Glutaraldehit ile çapraz bağlı agregasyon

immobilizasyonu, çapraz bağlı immobilizasyon çeşidinin bir alt kümesi olarak

düşünülebilir. Ayrıca zaman tasarrufu ve düşük maliyet imkanı sağlamaktadır.

Şekil 2.26 Bifonksiyonel glutaraldehitin bağlanması

Biyomoleküllerin taşıyıcı sistemlerine immobilizasyonu için kullanılan diğer bir reaktif

ise NHS/EDC karışımıdır. EDC molekülünün her iki ucunda bulunan amin grupları

sayesinde NHS ilavesi ile karboksil grubu içeren bir polimer ile bir biyomolekülü

birbirine bağlayabilmektedir (Şekil 2.27).

57

Şekil 2.27 NHS/EDC çapraz bağlama mekanizması

2.9 Kaynak Araştırması

İlkeleri 1959 yılında Yalow ve Berson tarafından atılan immünosensörler, insan

kanındaki insülin-bağlayıcı antikorların tayini için radyoimmünassay geliştirilmesine

olanak sağlamıştır. Bu dönemden sonra çeşitli immünolojik hastalıkların teşhisine

yönelik klinik amaçlı pek çok immünosensör geliştirilmiştir.

İmmünosensörler üzerine yoğun çalışmalar 1980’lerin ilk dönemlerinde başlamıştır.

Haga ve arkadaşları (1980) spin membran immünotest ve enzim immünotest

yöntemlerini kullanarak tiofilin antijeninin tayinine yönelik bir oksijen elektrot

geliştirmiştir. Sistemi amplifiye etmek için lipozomlar kullanılmış ve tiofilinin 4 × 10−9

M’a kadar tayini yapılabilmiştir. Boitieux ve arakdaşları (1984) kanda antijen tayini için

immünokimyasal tekniklerde izotop kullanımından kaynaklanan sorunları bertaraf

edebilmek için model antijen olarak hepatit B yüzey antijen’ini kullanarak bir

immünosensör geliştirilmiştir. Bu antijenin spesifik antikoru jelatin membrana

immobilize edilerek katı faz sandviç modeli şeklinde hazırlanan bu immünosensör ile

hedef antijenin düşük limitlerde ve hızlı tayini gerçekleştirilmiştir. Rishpon ve Rosen

(1989) LDH izoenzimin tayini için immünoelektrokimyasal bir teknik önermişlerdir. Bu

çalışmada izoenzim LDH5’e spesifik monoklonal antikor camsı karbon elektroda

kovalent olarak immobilize edilerek izoenzimin kanda tayini yapılmıştır. Parry ve

58

arkadaşları (1990) serumda, plazmada ve tüm kanda rubella antikorunun tayini için

optik bir immünosensör geliştirmişlerdir. Başka bir reaktif gerektirmeyen ve 10 dakika

gibi kısa bir sürede ölçüm yapabilen bu immünosensör ile 94% regresyon katsayısı 30

IU/mL tayin limiti ile ölçüm yapabilmişlerdir. Bright ve arkadaşları (1990) antikor ve

antijenlerin birbirine olan yüksek affiniteleri nedeniyle birbirinden zor ayrılmaları,

dolayısıyla da tek kullanımlık olarak kabul edilen immünosensörlerin rejenerasyonları

üzerine çalışmışlardır. Geliştirdikleri immünosensörü 4 ay boyunca saklamışlar ve 50

kez ölçüm yapabilmişlerdir. Mirhabibollahi ve arkadaşları (1990) saf kültür ve gıdalarda

Staphylococcus aureus tayini için amperometrik bir immünosensör geliştirmiştir.

Geliştirilen bu immünosensör ile 0.1 ng/mL seviyesinde geleneksel ELISA metodundan

20 kat fazla duyarlılıkta ölçüm yapılabilmiştir. Muratsugu ve arkadaşları (1993) bir akış

hücresi kullarak insan-serum albumini (Human Serum Albumin, HSA) tayini için

piezoelektrik bir immünosensör geliştirmişlerdir. Geliştirdikleri bu sistem ile 0.1-100

µg.mL-1 aralığında ölçüm yapabilmişlerdir. Bouvrette ve Luong (1995) yapay olarak

kirletilmiş gıda örneklerinde E.Coli teşhisi yapabilmek için akış enjeksiyonlu bir

immünoanaliz sistemi geliştirmişlerdir. Bu amaçla anti-E.Coli antikorları poröz

aminopropil cam boncuklara glutaraldehit ile kovalent olarak immobilize edilmiş ve

geliştirilen bu sistem ile 30 dakikadan kısa bir sürede 5 x 10(7) CFU/mL seviyesinde

E.Coli tayini yapılabilmiştir. Berggren ve Johansson (1997) insan koriyonik

gonadotropin hormon tayini yapabilmek için bu antijene spesifik antikoru kendiliğinden

düzenlenen tiyoktik asit filmine immobilize etimiş ve kapasitif bir immünosensör

geliştirmiştir. 1 pg.mL-1–1 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında doğrusal davranış gösteren

bu immünosensör 0.5 pg.mL-1 tayin limitine sahiptir ve direnç değişimi üzerine

kurulmuştur. Susmel ve ekibi (2000) insan sitomegalovirüs teşhisi yapabilmek için

piezoelektrik bir immünosensör hazırlamışlardır. Bu amaçla altın elektrot üzerinde

Protein A ve tiyol/poli L-lizin karışımından oluşan taşıyıcılar üzerine virüsün antijeni

immobilize edilmiş ve 2.5-5 µg/mL konsantrasyon aralığında doğrusal davranış gösteren

ve 1 µg/mL tayin limitine sahip bir sistem elde etmişlerdir. Darain ve arkadaşları 2003

yılında 5,2':5'2"-tertiyofen-3'-karboksilik asit iletken polimerini kullanarak IgG tayini

için düşük tayin limitlerine inmeyi hedeflemişlerdir. Avidin-biyotin kimyasının

kullanıldığı ve etiketleyici olarak yaban-turpu peroksit (HRP)’in kullanıldığı bu

sistemde 0.33 µg/mL seviyesinde IgG tayini yapılabilmiştir. Díaz-González ve

59

arkadaşları (2005) elektrot olarak referans, karşıt ve çalışma elektrodunun aynı şablon

üzerinde olduğu baskı devre screen-printed karbon elektrot kullanarak mikobakteryum

tüberküloz’un tayinine yönelik voltametrik bir immünosensör geliştirmiştir. Ag360

antijeninin bu elektrot üzerine immobilizasyonu ile hazırlanan bu sistem ile 1 ng.mL-1

seviyesinde tayin yapılabilmiştir. Messina ve ekibi (2008) mikrofluidik integre bir

biyoçip kullanarak inflamatör bir sitokin olan interlökin-6’nın serumda tayini için bir

sistem geliştirmişlerdir. Bu yöntem ile elektrokimyasal olarak 1.56 pg.mL-1 düzeyinde

interlökin-6 tayini yapılabilmiştir. Akter ve ekibi (2012) çok duvarlı karbon nanotüpleri

ve altın nanopartikülleri kullanarak prostat kanserinin biyobelirteci olan prostat spesifik

antijen tayinine yönelik elektrokimyasal nanoimmünosensör geliştirmişlerdir.

Geliştirilen bu elektrokimyasal sistemle 0.03 pg.mL-1 seviyesinde ölçüm yapılabilmiştir.

Özellikle 2000’li yılların başında nanoteknoloji çağının başlamasıyla çeşitli

nanoyapıların üretilmesi, farklı malzemelere uygulanıp nanomalzemeler üretilmesi ve

bu malzemelerin biyoteknolojide kullanılması oldukça popüler hale gelmiştir.

Nanomalzemelerin biyosensörlere de uygulanmasıyla daha duyarlı ve daha düşük tayin

limitlerinde ölçüm yapabilen, daha ekonomik ve hızlı sistemler geliştirilmiştir. Singh ve

arkadaşları (2008) 5,2':5',2''-tertiyofen-3'-karboksilik asit ile modifiye edilmiş elektrot

üzerinde altın nanopartikülleri biriktirerek anti-osteoproteogerin antikoru immobilize

etmiş ve amperometrik olarak 2.5-25 pg.mL-1 seviyelerinde osteoproteogerin tayini

yapmıştır. Sharma ve arkadaşları (2008) serumda plazmodyum falsiparum histidine

zengin protein 2 (PfHRP-2) için amperometrik bir immünosensör geliştirmişlerdir. Bu

amaç doğrultusunda screen-printed karbon elektrodu çok duvarlı karbon nanotüp ve

altın nanopartiküllerle modifiye etmişler ve üzerine anti- PfHRP-2 immobiliz etmişler.

Geliştirilen bu sistemle 8 ng.mL-1 düzeyinde PfHRP-2 tayini yapılabilmiştir. Jie ve ekibi

2008 yılında son yıllarda oldukça popülerolan, kontrollü salım sistemlerinden tanıya bir

çok alanda kullanılan ve spesifik dalga boylarında gösterdikleri geniş aralıklı ışımalar

sayesinde üstün özellikleri bulunan kuantum noktacıkları kullanarak bir immünosensör

geliştirmişlerdir. Bu amaçla altın nanopartiküllerle modifiye edilmiş elektrot üzerinde

sisteinin kendiliğinden düzenlenmesi sağlanmış ve bu taşıyıcıya insan anti-prealbumin

immobilize edilmiştir. İnsan prealbumin CdSe ile konjuge edildikten sonra ortama

gönderilmiş ve kemilüminesans ölçümlerle 1x10-11 g.mL-1 seviyesinde tayin yapılmıştır.

60

Chen ve ekibi (2010) polyon kompleks membranı altın ve demir nanopartiküllerle

modifiye ederek insan serumunda karsinoembriyonik antijen tayinine yönelik nano-

immünosensör tasarlamışlardır. Geliştirdikleri bu sistem ile 0.1-220 ng.mL-1

seviyelerinde tayin yapılabilmiştir.

Bu tez çalışmasında biyouyuşabilirliği yüksek ve iyi bir yarı-iletken olan TiO2

nanopartiküller kullanılmıştır. Yapılan kaynak taramasında TiO2 nanopartiküller

kullanılarak hazırlanan immünosensörler üzerine az sayıda çalışma görülmüştür. Shi ve

arkadaşları (2007) karsinoembriyonik antijen tayini için hidrofilik, non-toksik ve iletken

TiO2/altın nanopartikül çift tabakasını immobilizasyon matriksi olarak kullanmışlardır.

Bu amaçla altın elektrot, TiO2/altın nanopartikül filmi ile modifiye edildikten sonra

anti-CEA immobilizasyonunda gerekli ikinci altın tabakası için bir ara yüzey olarak

pozitif yüklü HRP ile kaplanmıştır. Geliştirilen immünosensör EIS ve CV ile

karakterize edilmiş ve 0.3-80 ng.mL-1 konsantrasyon göstermiştir ve 0.2 ng.mL-1’lık

tayin limitine sahiptir. Wang ve ekibi (2009) TiO2/CdS hibrit modifiye edilmiş ve

kitosanla kaplanmış indiyum-kalay oksit elektrot kullanarak tümör belirteç görevi gören

ve onkofetal bir glikoprotein olan α-fetoproteinin tayinine yönelik immünosensör

geliştirmişlerdir. İnkübasyon süresinin 60 dakika, 5 elektrot için yapılan tekrar

üretilebilirlik testlerinde %6 varyasyon katsayısının alındığı ve 30 günlük saklama

süresi sonunda %93’lük aktivite gösteren bu immünosensör ile 50 ng.mL-1-50 pg.mL-1

konsantrasyon aralığında doğrusal davranış görülmüş ve 40 pg.mL-1’e kadar tayin

yapılabilmiştir. An ve arkadaşları (2010) Parkinson hastalığı için çok önemli nöral bir

protein olan α-sinüklein üzerine çalışmışlardır. Yaptıkları çalışmada altın ile doplanmış

TiO2 nanotüpleri kullanarak bu proteinin tayinine yönelik fotoelektrokimyasal bir

immünosensör geliştirmişlerdir ve geliştirilen bu sistem ile 34 pg.mL-1 düzeyinde tayin

yapılabilmiştir.

80’li yıllarda başlayan immünosensör çalışmaları 90’lı yılların sonuna doğru yoğunluk

kazanmış ve 2000’li yılların başında bu çalışmalara farklı bir yöntem eklenmiştir.

Duyarlılığının oldukça yüksek olması ve düşük seviyelerde tayin yapılabilmesine

olanak sağlaması ile dikkat çeken elektrokimyasal impedans spektroskopisi, elektrot

61

yüzeyindeki direncin ölçümü temel alınarak immünosensörlere uyarlanmıştır. Tang ve

arkadaşları (2004) EIS tekniği ile Hepatit B yüzey antijenini tayin etmek amacıyla

koloidal altın ve polivinil bütiral ile modifiye edilmiş platin elektrot üzerine Hepatit B

yüzey antikornu immobilize etmiş ve 7.8 ng.mL-1 seviyesinde ölçüm yapmışlardır.

Balkenhohl ve Lisdat oto-immün bir hastalık olan çölyakın teşhisi için oldukça önemli

olan anti-transglutaminaz antikorunun serumdaki miktarının belirlenmesi için

poli(sodyum-4-stirensülfonik asit) ile modifiye edilmiş screen-printed altın elektrot

yüzeyine transglutaminaz immobilize etmiş ve impedimetrik bir immünosensör

geliştirmişlerdir. Tasarlanan sistem, 1:25-1:5000 seri seyreltme çalışmasında sigmoidal

bir sinyal değişimi göstermiştir. Chen ve arkadaşları (2008) polipirol, polipirolpropilik

asit ve altın nanopartiküllerin elektropolimerizasyonu ile yüksek stabilite ve poroziteye

sahip, hidrofilik ve etkin immobilizasyon kapasitesine sahip bir nanokompozit film

hazırlamışlar ve bu filme model antijen olarak insan interlökin-5’i immobilize ederek

klinik diagnoz, patoloji ve farmasötik araştırmalara yönelik bir immünosensör

geliştirmişlerdir. Geliştirilen bu sistem impedans spektroskopisi ile karakterize edilmiş

ve 1 fg.mL-1 düzeyinde ölçüm yapılabilmiştir. Wu ve arkadaşları (2009) fluorokinon

ailesinin en yaygın kullanılan antibiyotiği olan enroflaksazin‘in eser miktarda tayini için

11-merkapto-undekenoik asit ile modifiye edilmiş altın elektrot üzerine spesifik antijeni

immobilize ederek bir immünosensör tasarlamışlardır. Geliştirilen sensöre ait 1R//C

devresi kullanılarak direnç hakkında daha detaylı bilgiler alınmış ve 1 ng.mL-1

düzeyinde tayin yapılabilmiştir. Bourugia ve ekibi (2010) pulmoner emboli ve ven

trombozunun diagnozunda önemli bir element olan D-dimer üzerinde çalışmışlardır. Bu

amaçla karbon nanotüplerle modifiye mikroelektrot üzerine anti-D-dimer immobilize

ederek 40.1 kΩ μM(‐1) hassasiyetle 0.53 fM seviyesinde tayin yapmışlardır.

İmmünosensör geliştirme çalıştırmalarında iletken polimerler, nanomalzemeler,

kompozitler gibi çeşitli malzemeler taşıyıcı sistem olarak kullanılabilmektedir.

Biyouyuşabilirlikleri, toksik olmamaları ve biyokirlenmelerinin az olmaları dolayısıyla

üstün özellikleri bulunan ve in-vivo uygulamalar için en uygun malzemeler olan jelatin,

kitosan ve aljinat doğal polimerleri bu tez çalışmasında kullanılan taşıyıcı

polimerleridir. 1980’lerden beri yapılan immünosensör çalışmalarında bu taşıyıcılar

kullanılarak çok sınırlı sayıda çalışmalar yapılmıştır. Hua ve arkadaşları (2004) insan

62

serumunda α-1-fetoprotein (AFP) tayini için screen-printed elektrot kullanarak

immünosensör geliştirmişlerdir. Bu amaç doğrultusunda HRP ile etiketlenmiş anti-AFP,

kitosan membrana tutturulmuş ve elektroda immobilize edilmiştir. Hazırlanan bu sensör

ile 0.74 ng.mL-1 seviyesinde tayin yapılabilmiştir. Deng ve arkadaşları (2004) altın

elektrot üzerinde sisteamin SAM yapısı oluşturduktan sonra pozitif yüklü kitosan tek

tabakasını glutaraldehit ile bağlamış ve aljinat-faktör B antikor kompleksini ise aljinatın

negatif yükü sayesinde bu tabakaya immobilize etmiştir. Bu şekilde elektrostatik olarak

hazırlanan elektrodun, aljinat/kitosan kompozitinin direkt olarak glutaraldehitle

bağlanmasına göre yüksek cevap sinyali ve duyarlılığa sahip olduğu görülmüştür.

Hazırlanan bu immünosensör ile immünitede önemli bir rol oynayan ve eksikliğinde

ölüm oranının arttığı enfeksiyonlara yol açan faktör B’nin 0.1607-0.8 mg.L-1 arasında

tayini yapılabilmiştir. Khan ve Dayal (2009) kitosan ile polianilin hibrit iletken

biyopolimerini indiyum-kalay oksit üzerine kaplayarak okratoksin-A tayinine yönelik

impedimetrik bir immünosensör tasarlamışlardır. IgG immobilizasyonu ile geliştirilen

bu sensör ile 10 ng.mL-1 seviyesinde ölçüm yapılabilmiştir. Yang ve ekibi (2011) insan

koriyonik gonadotropin tayini için çok duvarlı karbon nanotüp-kitosan nanokompozit

filmi ve 3 boyutlu altın/TiO2 nanopartikül hibrit yapısı kullanarak anti-hCG’nin camsı

karbon elektroda immobilizasyonu ile bir immünosensör geliştirmiştir. Geliştirilen bu

sistem kullanılarak 0.08 mlU.mL-1’ye kadar ölçüm yapılabilmiştir. 30 günün sonunda

immünosensörün stabilitesinde %6.5’luk düşüş gözlenmiştir.

Yapılan kaynak araştırması sonucunda MS’in teşhisine yönelik immünosenösr

geliştirilmesi üzerine sadece 2 çalışma yaptığı görülmüştür. Bu çalışmaların ilkinde

Tsekenis ve arkadaşları (2008) screen-printed karbon elektrodu polianilin ile modifiye

etmişler ve avidin-biyotin etkileşimini kullanarak MBP’yi elektrot üzerine immobilize

ettikten sonra Anti-MBP göndererek impedimetrik ölçümler yapmıştır. IgG kullanarak

non-spesifik bağlanmalar çıkarıldıktan sonra düzeltilmiş kalibrasyon eğrileri elde

edilmiş ve 1 ng.mL-1 seviyesinde Anti-MBP ölçümü yapılabilmiştir. Yapılan diğer

çalışmada Bhavsar ve arkadaşları (2009) fazla ekspresyonu MS ile ilişkili olduğu

düşünülen bir serum sitokini olan interlökin-12’nin tayinine yönelik bir sistem

geliştirmişleridir. Baskı devre üzerine monoklonal antikorların immobilizasyonu ile

hazırlanan bu impedimetrik immünosensör ile fizyolojik seviyelerde yani 100 fM’dan

63

düşük düzeyde interlökin-12 tayini yapılabilmiştir. MS üzerine yapılan bu 2

immünosensör çalışmasında da geliştirilen sistemler gerçek örneklere uygulanmamıştır.

Bu tez çalışmasında jelatin, aljinat, kitosan doğal polimerleri, bu polimerlerin

karışımları ve bunlara nanopartiküllerin ilavesi ile hazırlanan matrikslere MBP’nin

immobilizasyonuyla hazırlanan immünosensörler impedans spektroskopisi ile

karakterize dilmiş ve ardından Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji A.B.D.’ndaki

MS tanısı almış hastalardan alınan BOS ve Kan örneklerinde hastalığa neden olan oto-

antikorun yani Anti-MBP’nin tayini için kullanılmıştır. Gerek TiO2 nanopartiküllerle

güçlendirilmiş doğal polimerlerin, gerekse düşük tayin limitlerine inilebilmesine olanak

sağlayan elektrokimyasal impedasn spektroskopisinin kullanılması ve en önemlisi bu

sensörlerin BOS ve seruma uyarlanması, bu tez çalışmasının önemini ve özgünlüğünü

ortaya koymaktadır.

64

3. ÇALIŞMANIN AMACI

Bu tez çalışmasının en önemli amacını, MS’e neden olan oto-antikorlardan Anti-MBP’i

pratik, ekonomik, hızlı ve doğru olarak tayin edecek MBP immünosensörünü

geliştirmek ve MRG bulgularına destek olarak MS teşhisinde kullanılması

oluşturmaktadır. Diğer pek çok hastalıkta olduğu gibi MS’in de erken teşhisi çok

önemlidir. Bu amaçla tez kapsamında kullanılacak polimerler olan jelatin, aljinat ve

kitosan; bunların karışımları ve daha düşük tayin limitlerine ve yüksek hassasiyetlere

ulaşmak amacıyla bu polimerlere TiO2 nanopartiküllerinin ilavesi ile hazırlanan

taşıyıcılara MBP immobilize edilerek elektrokimyasal impedans spektroskopisi,

dönüşümlü voltametri ve taramalı elektron mikroskopisi ile optimize ve karakterize

edilmiştir. Ayrıca hazırlanan bu filmlerin kalınlığı QCM ile ölçülmüştür. Geliştirilen

immünosensörlere ait kalibrasyon grafikleri çizildiken sonra çalışmanın 2. aşaması olan

BOS ve serum denemelerine geçilmiştir.

Çalışmanın önemli bir başka amacı ise pratikte beyin-omurilik sıvısı analizi gibi riskli

bir yönteme başvurmaksızın serumunda Anti-MBP düzeyinin in vitro koşullarda

doğrudan belirlenebilmesidir. Kontrol grubu yapay BOS ve yapay serumdur.

Kalibrasyon grafiği çiziminde kullanılan miktar kadar Anti-MBP, yapay BOS ve

seruma ilave edilerek yapay BOS ve serum için kalibrasyon grafikleri elde edilmiş ve

bu grafikler kullanılarak gerçek BOS ve serum numunelerindeki Anti-MBP miktarları

belirlenmeye çalışılmıştır. Çalışma tamamlandığında MS’e neden olan oto-

antikorlardan biri olan Anti-MBP’nin tayini için en uygun immünosensör sistemi

önerilmiştir.

65

4. MATERYAL ve YÖNTEM

4.1 Materyaller

4.1.1 Kullanılan kimyasal maddeler

Çalışmalarda kullanılan Myelin Basic Protein, Monoclonal Anit-Myelin Basic Protein,

human immunoglobulin G (hIgG), Bovin Serum Albumin (BSA), jelatin, kitosan,

aljinat, glutaraldehit (%25), N-hidrokissüksinimit (NHS), 1-etil-3-(3-

dimetilaminopropil)karbodiimit (EDC), sodyum klorür (NaCl), potasyum klorür (KCl),

sodyum bikarbonat (NaHCO3), glukoz, magnezyum sülfat (MgSO4), kalsiyum klorür

(CaCl2), potasyum ferrosiyanid ve potasyum ferrisiyanid (Fe(CN)64-/3-), hidroklorik asit

(HCl), aminoasetik asit, tris(hidroksimetil)aminometan Sigma (St Louis, MO,

USA)’dan; sodyum hidrojen fosfat dihidrat (NaH2PO4.2H2O) ve disodyum hidrojen

fosfat dodekahidrat (Na2HPO4.12H2O) Merck’den temin edilmiştir.

Kullanılan de-iyonize su, MilliPore kullanılarak ≥18.2 MΩcm direncinde olacak şekilde

elde edilmiştir.

Geliştirilen immünosensörlerin gerçek örneklerde denenmesi amacıyla kullanılan BOS

ve serum, 04-121-12 no’lu etik kurul kararı ile Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi,

Nöroloji A.B.D.’ndaki RRMS’li hastalardan temin edilmiştir.

4.1.2 Kullanılan Cihazlar

Çalışmalarda elektrokimyasal ölçümde “Gamry Instrument Impendace Analyzer-

Framework Version 5.50 software” kullanılmıştır. Ayrıca film kalınlıklarının

ölçümünde “SRS QCM200, 5 MHz Quartz Crystal Microbalance” sistemi

kullanılmıştır.

66

4.1.3 Kullanılan Elektrodlar

Elektrokimyasal hücre sisteminde karşıt, çalışma ve referans elektrotları tüm deneylerde

kullanıldı. Karşıt ve çalışma elektrotları yüzey alanı 1 cm2 olan platindir. Referans

elektrot Luggin kapiler içinde Ag/AgCl elektrotudur.

Çıplak Pt elektrotlar kullanılmadan önce 0,05 µm alümina ile temizlenmiştir. Daha

sonra kimyasal temizliği için H2SO4 (0,05 mol.L-1) çözeltisinde 100 mVs-1 tarama

hızında 0,3 ile +1,2 V arası dönüşümlü voltametrileri alınmıştır. Son olarak elektrotların

pH’ ı 7,4 olan fosfat tamponunda 100 mVs-1 tarama hızında -0,5 ile +0,5 V arası

dönüşümlü voltametrileri alınarak kullanıma hazır hale getirilmiştir. Kullanılan tüm Pt

elektrotların temizliği bu şekilde yapılmıştır.

Film kalınlığı ölçümünde 1.2 cm çapında, 5 MHz’lik altın disk elektrot kullanılmıştır.

4.1.4 Kullanılan Çözeltiler

0,1 M NaH2PO4.2H2O ve 0,1 M Na2HPO4.12H2O ayrı ayrı hazırlanmıştır. Fosfat

tamponu (0,05 mol.L-1, pH 7,4) bu çözeltiler kullanılarak hazırlanmıştır. Çalışmalarda

kullanılan diğer çözeltiler fosfat tamponu kullanılarak hazırlanmıştır.

Çapraz bağlayıcı glutaraldehit çözeltisi fosfat tamponu kullanılarak 0,125 mol.L-1 olarak

hazırlanmıştır. NHS için 2M; EDC için ise 1M’lık stok çözeltiler hazırlanarak istenilen

miktarlarda kullanılmıştır.

MS’in biyobelirteci olan MBP’den optimizasyon işlemleri için immobilizasyon

amacıyla 1 mg MBP/ 800 µl stok çözeltisinden 100 µg.mL-1 kullanılmıştır.

MBP’nin otoantikoru olan Anti-MBP’den %50’lik stok çözeltiden fosfat tamponunda

seri seyreltme yöntemi ile kullanılmıştır.

67

Elektrokimyasal ölçümlerin gerçekleştirilebilmesi için 10 ml’lik hücrede 5 mM olacak

şekilde Fe(CN)64-/3- çifti ve 0.1 M KCl kullanılmıştır.

İmmünosensörler hazırlandıktan sonra MBP immobilize olmamış matriksin fonksiyonel

gruplarına Anti-MBP’nin non-spesifik bağlanmasını önlemek amacıyla %0.1’lik BSA

kullanılmıştır. Ayrıca optimize immunosensörlere non-spesifik bağlanmaları tespit

etmek amacıyla hIgG kullanılmıştır. Kalibrasyon için Anti-MBP miktarları kadar hIgG

kullanılmıştır.

İmmünosensörlerin raf ömrünün araştırılmasında elüsyon çözeltisi olarak aminoasetik

asit (0.1 M, pH 3,0) kullanılmıştır.

Yapay BOS hazırlamak amacıyla 124 mM NaCl, 1.2 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 26

mM NaHCO3, 10 mM glukoz, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 saf suda çözülerek pH’ı

7.4’e getirilmiştir.

Yapay serum hazırlama amacıyla 4.037 g NaCl, 0.109 g KCl, 0.100 g KH2PO4, 0.185 g

CaCl2.2H2O ve 0.129 g MgSO4.7H2O 500 mL ultra saf suda çözüldü. Ardından IgG,

BSA ve tris(hidroksimetil)aminometan ilave edilerek hazırlanan serum -20 oC’de

saklanmıştır.

4.2 Yöntem

4.2.1 İmmobilizasyon jellerinin hazırlanması

Jelatin (%7,5) fosfat tamponu içinde yarım saat bekletilerek şişmesi sağlanmıştır. Daha

sonra jelatinin çözünmesi için, fosfat tamponu içeren jelatin sıcaklığı 50 oC olan sıcak

su banyosuna daldırılmış ve jelatin çözündükten sonra sıcaklık 32 oC’ye düşürülmüştür.

Fosfat tamponunda hazırlanmış MBP farklı konsantrasyonlarda eklenmiş ve

68

homojenizasyonun sağlanması için vortekslenmiştir. Son olarak, çapraz bağlayıcı

glutaraldehit ortama ilave edildikten sonra immobilizasyon jeli hazırlanmıştır.

Kitosan-MBP elektrodların hazırlanabilmesi için %2.5’luk kitosan stoğu çözünmenin

sağlanabilmesi için bir miktar HCl damlatarak hazırlanmış. İstenilen miktarlarda kitosan

eppendorfa alındıktan sonra jelatin ile aynı prosedür kullanılarak immobilizasyon jeli

hazırlanmıştır.

Aljinat çalışması için %1’lik stok aljinat çözeltisi hazırlanmış ve immobilizasyon jeli

kitosan ile aynı şekilde hazırlanmıştır. Aljinat çalışmasında çapraz bağlayıcı olarak

NHS/EDC kullanılmıştır.

Polimer kombinasyonlarının hazırlanması amacıyla istenilen oranlarda jelatin/aljinat,

jelatin/kitosan ve aljinat/kitosan karışımları hazırlanmıştır. Hazırlama prosedürleri tek

polimerler için yapılanlar ile aynıdır.

Nanopartikül destekli immünosensörlerin hazırlanması için polimerler veya polimer

karışımları eppendorflara alındıktan sonra TiO2 ilave edilmiş ve vortekslenerek

homojenize çözeltiler elde edilmiştir. Bu çözeltiler üzerine MBP ilave edilip

vortekslenmiş ve çapraz bağlayıcılar ilave edildikten sonra tekrar vortekslenerek

immobilizasyon jelleri hazır hale getirilmiştir.

4.2.2 İmmünosensörlerin hazırlanması İmmobilizasyon jeli hazırlandıktan sonra, Pt elektrotun her iki yüzeyine

immobilizasyon jeli (25 µL) damlatılarak, bir Pt elektrotta toplam 50 µL jel olacak

şekilde immobilizasyon işlemi yapılmıştır. İmmobilize Pt elektrotlar hazırlandıktan

sonra 2 saat kurumaya bırakılmış ve ardından bağlanmayan antijenlerin uzaklaştırılması

için içerisinde fosfat tamponu bulunan 3 ayrı tüpte 10’ar dakika bekletilmiştir. Son

olarak non-spesifik bağlanmaların önlenmesi için elektrotlar % 0.1’lik BSA’ya

69

daldırılmış ve yıkandıktan sonra ölçümler için hazır hale getirilmiştir. Jelatin-TiO2-

MBP immünosensörünün üretim prosesi şekil 4.1’de gösterilmiştir. Diğer elektrotlar da

aynı prosedür ile hazırlanmıştır.

Şekil 4.1 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün üretim prosesi

4.2.3 SEM mikrograflarının alınması

Polimer, MBP immobilize polimer, TiO2 ilaveli polimer ve MBP immobilize TiO2

ilaveli polimer filmlerinin morfolojileri SEM ile görüntülenmiş, MBP

immobilizasyonunun başarısı ve TiO2’nin etkisi incelenmiştir. SEM mikrografları,

Balıkesir Üniversitesi’nde alınmıştır.

4.2.4 Optimizasyon çalışmaları

4.2.4.1 Polimer optimizasyonları İmmobilizasyon şartlarının optimize edilmesinde ilk olarak değişik polimer oranları

denenmiştir.

Jelatin optimizasyonu amacıyla MBP (100 µg.mL-1) ve glutaraldehit (0.005 mol.L-1)

sabit tutularak % 4-14 aralığında jelatin miktarları denenmiştir.

70

Kitosan optimizasyonu amacıyla % 0.5-2.75 aralığında kitosan miktarları denenmiştir

ve MBP ile glutaraldehit miktarları jelatin çalışmasında kullanılan kadardır.

Aljinat optimizasyonu amacıyla MBP (100 µg.mL-1) ve NHS/EDC (0.0035 mol.L-1)

sabit tutularak % 0.2-1.3 aralığında aljinat miktarları denenmiştir.

Jelatin/Kitosan ve Aljinat/Kitosan polimer karışımları ile hazırlanan

immünosensörlerden impedimetrik sinyaller alınamadığından optimizasyonlar

yapılamamış ve immünosensörler geliştirilememiştir. Aljinat/Kitosan sisteminde ayrıca

homojen karışmama ve topaklanma problemi yaşanmıştır. Bu nedenle tez çalışmasında

polimer karışımı olarak sadece Jelatin/Aljinat sistemine yer verilmiştir. Polimer

oranının optimizasyonu amacıyla 0.5, 1, 2, 5 ve 10 oranında Jelatin/Aljinat taşıyıcıları

denenmiştir.

4.2.4.2 TiO2 optimizasyonu

Jelatin-TiO2 filminin optimizasyonu için optimum jelatin miktarının 1:10’u baz alınarak

geniş bir aralıkta TiO2 optimizasyonu yapılmıştır. Bu amaçla 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003

g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g ve 0.0008 g TiO2 denenmiştir. Jelatininkine

benzer şekilde kitosan için 0.00003 g, 0.00004 g, 0.00005 g, 0.00006 g, 0.00007 g;

aljinat için 0.00002 g, 0.00004 g, 0.00006 g, 0.00008 g ve 0.0001 g ve Jelatin/Aljinat

karışımı için 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g ve 0.0006 g TiO2 denenmiştir.

Elektrotlardan alınan cevaplar değerlendirilerek optimum nanopartikül miktarları

bulunmuştur.

4.2.4.3 Çapraz bağlayıcı optimizasyonları

MBP’nin Jelatin ve Jelatin-TiO2 taşıyıcı sistemlerine immobilizasyonu için çapraz

bağlayıcı olarak 0.0010, 0.0015, 0.0020, 0.0030; 0.0040 ve 0.0050 mol.L-1

konsantrasyonlarında glutaraldehit kullanarak immobilizasyonlar gerçekleştirilmiş ve en

uygun taşıyıcı oranı araştırılmıştır. Kitosan ve Kitosan-TiO2 taşıyıcı sistemlerine MBP

71

immobilizasyonu için çapraz bağlayıcı olarak 0.0010, 0.0020, 0.0030, 0.0040 ve 0,0050

mol.L-1 glutaraldehit denenmiştir. Aljinat ve Aljinat-TiO2 taşıyıcı sistemlerine MBP

immobilizasyonları için 0.0035, 0.007, 0.014, 0.02, 0.03, 0.04 mol.L-1 NHS/EDC çapraz

bağlayıcıları denenmiştir. Jelatin/Aljinat ve Jelatin/Aljinat-TiO2 taşıyıcı sistemlerine

MBP immobilizasyonları için ise 0.0010, 0.0015, 0.0020, 0.0030; 0.0040 ve 0.0050

mol.L-1 konsantrasyon aralığında glutaraldehit denenmiş ve optimum konsantrasyon

araştırılmıştır.

4.2.4.4 MBP optimizasyonları

Jelatin, Jelatin-TiO2, Kitosan, Kitosan-TiO2, Aljinat, Aljinat-TiO2, Jelatin/Aljinat,

Jelatin/Aljinat-TiO2 elektrotları 2, 20, 40, 100, 200, 400 ve 1000 µg.mL-1 MBP

immobilize edilerek hazırlanmış ve farklı MBP içeren immünosensörlerin impedimetrik

cevapları tespit edilmiştir.

4.2.4.5 İmmünosensör cevabına Anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi Geliştirilen Jelatin-MBP, Jelatin-TiO2-MBP, Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2-MBP,

Aljinat-MBP, Aljinat-TiO2-MBP, Jelatin/Aljinat-MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP

immunosensörler Anti-MBP ile inkübe edilmiştir. İmmunosensörlerden en iyi cevabın

tespiti için Anti-MBP’nin immunosensörlerle inkübasyon süresi optimize edilmiştir. Bu

amaçla geliştirilen Jelatin-MBP, Jelatin-TiO2-MBP, Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2-MBP,

Aljinat-MBP, Aljinat-TiO2-MBP, Jelatin/Aljinat-MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP

immunosensörler Anti-MBP ile 1, 5, 15, 30 ve 60 dakika inkübe edilerek impedimetrik

cevaplar ölçülmüş ve optimum inkübasyon süresi bulunmuştur.

72

4.2.5 Tekrar üretilebilirlik ve raf ömrü

Geliştirilen immünosensörlerin özellikle pratikte kullanımında büyük önem arzeden

tekrar üretilebilirliğin araştırılması amacıyla her bir immünosensör 20 kez seri olarak

hazırlanmış ve standart sapmalar hesaplanmıştır.

Hazırlanan immünosensörlerin raf ömrü araştırılmıştır. Her bir immünosensör kullanım

sonrası aminoasetik asit tamponla (0.1 M, pH 3) desorbe edilmiş, fosfat tamponunda

(0,05 mol.L-1, pH 7,4) yıkanmış, 4 0C’ta fosfat tamponunda saklanmış ve her gün

ölçüm alınmıştır. İmmünosensörlerin impedimetrik yanıtlarındaki düşüş

değerlendirilerek kullanım süresi belirlenmiştir.

4.2.6 Film kalınlıkları

Her bir polimerin film kalınlıkları QCM kullanılarak hesaplanmıştır. Bu amaçla

hazırlanan polimerler, 1.13 cm2’lik altın kuvarz kristal elektrotlara, elektrotların alanı

alanı göz önünde bulundurularak uygun miktarda ilave edilmiş ve frekans değişimleri

hesaplanmıştır. Hesaplanan frekans değişimleri Sauerbrey eşitliğinde yerine konarak

film kalınlıkları hesaplanmıştır (Marx 2003).

4.2.7 İmmünosensörlerin elektrokimyasal davranışları

Geliştirilen immünosensörlerin impedans grafikleri ve CV’leri karşılaştırılmış ve

antijen-antikor etkileşiminin tersinir olup olmadığı incelenmiştir. Elde edilen Nyquist

grafikleri göz önünde bulundurularak immünosensörlerin impedans devre modelleri

çizilmiştir.

73

4.2.8 Kalibrasyon grafiklerinin çizilmesi

Hazırlanan her bir elektrot için üst limit 2500 ng.mL-1, alt limit ise sinyal alınabilen en

düşük konsantrasyon olmak üzere geniş bir aralıkta Anti-MBP kullanılarak kalibrasyon

grafikleri çizilmiştir. Non-spesifik bağlanmaları denetlemek amacıyla kullanılan Anti-

MBP miktarları kadar hIgG kullanılarak çalışmalar tekrarlanmış ve non-spesifik

bağlanmalardan alınan sinyal kalibrasyon eğrisinden çıkartılarak gerçek kalibrasyon

grafikleri elde edilmiştir.

4.2.9 Geliştirilen immünosensörlerin BOS ve serumda denenmesi

Geliştirilen immünosensörlerden tayin limiti en düşük olanı, Ankara Üniversitesi, Tıp

Fakültesi, Nöroloji A.B.D.’ndaki RRMS’li hastalardan 04-121-12 no’lu etik kurul izni

ile alınan BOS ve serum örnekleri ile denenmiştir. Bu amaçla yapay BOS ve yapay

serum hazırlanmıştır. Kör olarak sadece yapay BOS ve yapay serum, kontrol numunesi

olarak ise Anti-MBP ilaveli yapay BOS ve yapay serum kullanılmış ve kalibrasyon

grafikleri çizilmiştir.

74

5. BULGULAR

5.1 SEM Mikrograflarının Değerlendirilmesi

İmmünosensörlerin tasarımı aşamasında Jelatin, Jelatin-MBP, Jelatin-TiO2, Jelatin-

TiO2-MBP; Kitosan, Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2, Kitosan-TiO2-MBP; Aljinat, Aljinat-

MBP, Aljinat-TiO2, Aljinat-TiO2-MBP ve Jelatin/Aljinat, Jelatin/Aljinat-MBP,

Jelatin/Aljinat-TiO2, Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP filmlerinin SEM mikrografları alınarak

MBP’nin taşıyıcı sistemlere immobilizasyonları fiziksel olarak denetlenmiş ve TiO2’nin

polimer film yüzey alanlarını arttırıp arttırmadığı incelenmiştir. Filmlerin morfolojileri

hakkında bilgi edinmek amacıyla alınan SEM görüntülerinin çalışma potansiyeli 10

kV’tır.

Şekil 5.1.a. Jelatin, b. Jelatin-MBP, c. Jelatin-TiO2, d. Jelatin-TiO2-MBP filmlerinin

SEM mikrografları

75

Şekil 5.1’de jelatin elektrotlarının SEM mikrografları gösterilmiştir. Sadece jelatin

filmine bakıldığında (Şekil 5.1A) mikro açıdan adacıklar şeklinde bir yapının oluştuğu;

makro açıdan ise film yapısında olduğu görülmektedir. Adacıkların oluşması, elektroda

kısmen doğrudan elektron transferinin gerçekleştiğini göstermektedir. Şekil 5.1B’de

MBP immobilize edilmiş jelatin film görülmektedir. Bu mikrografta MBP’ler açık bir

şekilde görülmekte ve görüntü, MBP’nin jelatin filmine immobilizasyonunu kanıtlar

niteliktedir. Yüzey alanını ve dolayısıyla immobilizasyon verimini arttıması ve elektron

transferini hızlandırması gibi üstün özellikleri nedeniyle kullanılan nanopartiküllerin

yüzey alanını arttırıcı etkisi şekil 5.1C’de açık bir şekilde görülmektedir. Şekil 5.1D’de

ise MBP’nin Jelatin-TiO2 elektroda immobilizasyonu gösterilmekte ve mikrograf

incelendiğinde homojen bir yapı görülmekedir.

Şekil 5.2 a. Kitosan, b. Kitosan-MBP, c. Kitosan-TiO2, d. Kitosan-TiO2-MBP filmlerinin SEM mikrografları

76

Şekil 5.2’de kitosan elektrotların SEM mikrografları görülmektedir. Şekil 5.2A’da

görülen kitosan filmi düz bir morfolojiye sahiptir. MBP’nin immobilizasyonu ile

pürüzlenen bu yüzeyde MBP’ler jel’e daha fazla gömüldüğü için jelatindeki kadar net

görülememektedir (Şekil 5.2B). TiO2’nin yüzey alanını arttırıcı etkisi Kitosan-TiO2

elektrotta da net olarak görülmekte (Şekil 5.2C) ve MBP’nin Kitosan-TiO2 üzerine

immobilizasyonuyla oldukça homojen bir yapı izlenmektedir (Şekil 5.2D).

Şekil 5.3.a. Aljinat, b. Aljinat-MBP, c. Aljinat-TiO2, d. Aljinat-TiO2-MBP filmlerinin SEM mikrografları

Şekil 5.3’te aljinat elektrotların mikrografları gösterilmiştir. Şekil 5.3A’da aljinatın

oldukça düzgün bir yüzey oluşturduğu görülmekte ve şekil 5.3B’de ise MBP’nin

başarılı bir şekilde immobilize edildiği açıkça görülmektedir. TiO2’nin ilave edilmesiyle

film yüzey alanı ciddi oranda artmış (Şekil 5.3C) ve Aljinat-TiO2 elektroduna MBP

immobilizasyonu ile oldukça homojen bir film oluşmuştur (Şekil 5.3D).

77

Genel olarak bakıldığında en düzgün film yapısının aljinat elektrotlarda olduğu

söylenebilir.

Şekil 5.4.a. Jelatin/Aljinat-TiO2, b. Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP filmlerinin SEM

mikrografları

Şekil 5.4’te Jelatin/Aljinat-TiO2 ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP filmlerinin SEM

mikrografları görülmektedir. Jelatin/Aljinat ve Jelatin/Aljinat-MBP filmlerinin SEM

görüntüleri verimsiz olduğu için tez çalışmasında verilmemiştir. Şekil 5.4A’da

Jelatin/Aljinat filminin düz yapısı ve nanoaprtiküllerin etkisi açık bi şekilde

görülebilmektedir. Şekil 5.4B’de ise bu sisteme immobilize olmuş MBP’ler

görülebilmektedir.

5.2 Optimizasyon Çalışmaları

Yapılan tüm optimizasyon ve kalibrasyon çalışmalarında sinyal olarak relatif impedans

kullanılmıştır.

Relatif impedans = [Rct(i) − Rct(0)] / Rct(0)

Rct(0), MBP immobilize elektrodun yük transfer direnci ve Rct(i) ise Anti-MBP inkübe

edilmiş elektrodun yük transfer direncidir. İmpedans ölçümleri elektrotların kararlı hale

geldiği 180 mV açık devre potansiyeli (OCP)’nde alınmıştır.

78

5.2.1 Polimer miktarının immünosensör cevabına etkisi

Anti-MBP’nin MBP’ye bağlanması için en uygun polimer miktarının bulunması

amacıyla polimer optimizasyonları yapılmıştır. Bu amaçla MBP (100 µg.mL-1) ve

glutaraldehit (0.005 mol.L-1) miktarları sabit tutulup farklı miktarlarda polimerler

denenerek polimer miktarlarına karşı relatif impedans grafikleri çizilmiş ve optimum

polimer miktarları bulunmuştur. Polimer optimizasyon çalışmalarında 15.625 ng.mL-1

Anti-MBP kullanılmıştır.

Şekil 5.5 Jelatin miktarının immünosensör cevabına etkisi

Jelatin optimizasyonu amacıyla % 4-14 aralığında jelatin denenmiş ve optimizasyon

grafiği şekil 5.5’te gösterilmiştir. Jelatin oranının artması, MBP’nin kuvvetlice

bağlanmasına neden olmuştur. Yüksek jelatin oranı, bağlanan MBP miktarının

artmasına, dolayısıyla immünosensör sinyalinin artmasına olanak sağlamıştır. Çok fazla

jelatin miktarı ise taşıyıcı gözeneklerinin küçülmesine neden olmuş ve bu sebeple

sinyalde düşüş gözlenmiştir. En uygun taşıyıcı oranı % 8 jelatin olarak belirlenmiştir.

Artan polimer miktarı ise taşıyıcı gözeneklerinin küçülmesine neden olmuş ve substrat

ve ürün giriş-çıkışlarını kısıtladığından sinyalde düşüş gözlenmiştir (Sungur vd. 2004,

Emregül 2005).

79

Şekil 5.6 Kitosan miktarının immünosensör cevabına etkisi

Kitosan optimizasyonu amacıyla % 0.5-2.75 aralığında kitosan denenmiş ve

optimizasyon grafiği şekil 5.6’da gösterilmiştir. En uygun taşıyıcı miktarı % 1 kitosan

olarak belirlenmiştir.

Şekil 5.7 Aljinat miktarının immünosensör cevabına etkisi

80

Aljinat optimizasyonu amacıyla % 0.2-1.3 aralığında aljinat denenmiş ve optimizasyon

grafiği şekil 5.7’de gösterilmiştir. En uygun taşıyıcı miktarı % 0.2 aljinat olarak

belirlenmiştir. Daha düşük aljinat konsantrasyonunda (<0.0001 g) hazırlanan

immünosensörler mekanik olarak dayanıklı olmadığı tespit edilmiştir.

Şekil 5.8 Jelatin/Aljinat oranının immünosensör cevabına etkisi

Jelatin/Aljinat oranının optimizasyonu amacıyla 0.5, 1, 2, 5 ve 10 oranında

Jelatin/Aljinat (toplam polimer miktarı %4) denenmiş ve optimizasyon grafiği şekil

5.8’de gösterilmiştir. Jelatin/Aljinat oranının 2 olduğu immünosensör ile en iyi cevap

alınmıştır ve optimum oran olarak seçilmiştir.

5.2.2 TiO2 miktarının immünosensör cevabına etkisi

MBP immobilizasyon verimini ve elektron transfer hızını arttırarak tayin sınırını

düşürmek için TiO2 nanopartiküller kullanılmıştır. Tasarlanan immünosensörlerden

maksimum verim alabilmek için TiO2 nanopartikül miktarı optimize edilmiştir.

81

Şekil 5.9 TiO2 nanopartikül miktarının Jelatin-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi

TiO2 nanopartikül miktarının optimizasyonu amacıyla Polimer:Nanopartikül oranı 10:1

temel alınarak geniş bir aralıkta optimizasyon çalışması yapılmıştır. Bu amaçla % 8

jelatin kullanılarak 0.0001, 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005, 0.0006, 0.0007 ve 0.0008 g

TiO2 ilavesi ile Jelatin-TiO2-MBP elektrotları hazırlanmış ve impedans yanıtları

araştırılarak optimum değer 0.0004 g TiO2 olarak bulunmuştur (Şekil 5.9).

Şekil 5.10 TiO2 nanopartikül miktarının Kitosan- TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi

82

TiO2 miktarının Kitosan-TiO2-MBP elektroduna etkisinin incelenmesi amacıyla % 1

kitosan kullanılarak 0.00003, 0.00004, 0.00005, 0.00006 ve 0.00007 g TiO2 ilavesi ile

elektrotlar hazırlanmış ve optimum miktar 0.00005 g TiO2 olarak bulunmuştur (Şekil

5.10).

Şekil 5.11 TiO2 nanopartikül miktarının Aljinat-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi

TiO2 miktarının Aljinat-TiO2-MBP elektroduna etkisinin incelenmesi amacıyla % 0.2

aljinat kullanılarak 0.00002, 0.00004, 0.00006, 0.00008 ve 0.0001 g TiO2 ilavesi ile

elektrotlar hazırlanmış ve optimum miktar 0.00004 g TiO2 olarak bulunmuştur (Şekil

5.11).

83

Şekil 5.12 TiO2 nanopartikül miktarının Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensör cevabına etkisi

TiO2 miktarının Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP elektroduna etkisinin incelenmesi amacıyla

2:1 oranında Jelatin/Aljinat (%4) kullanılarak 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005 ve 0.0006

g TiO2 ilavesi ile elektrotlar hazırlanmış ve optimum miktar 0.0005 g TiO2 olarak

bulunmuştur (Şekil 5.12).

Jelatin, kitosan, aljinat ve Jelatin/Aljinat polimerlerinin hepsinde çok düşük

nanopartikül miktarları yüzey alanını gerektiği kadar arttıramazken artan nanopartikül

miktarları ise polimer yüzeyini tamamen kaplayarak direnci arttırmakta ve elektron

transferini inhibe etmektedir.

5.2.3 Çapraz bağlayıcı konsantrasyonunun immünosensör cevabına etkisi

MBP’nin jelatin taşıyıcı sistemine immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak 0.01-

0.05 mol.L-1 konsantrasyon aralığında glutaraldehit kullanılarak immobilizasyonlar

gerçekleştirilmiş ve en uygun çapraz bağlayıcı konsantrasyonu araştırılmıştır (Şekil

5.13).

84

Şekil 5.13 Glutaraldehit konsantrasyonunun Jelatin-MBP immünosensör cevabına etkisi

Glutaraldehit konsantrasyonlarındaki artış ile MBP’nin taşıyıcıya bağlanması artmıştır.

Yüksek glutaraldehit konsantrasyonu, MBP inaktivasyonuna, sıkı bir jel oluşumuna

dolayısıyla da elektron aktarımının azalmasına ve buna bağlı olarak da duyarlılıkta

düşüşe neden olmuştur (Sungur vd. 2004, Emregül 2005). MBP’nin jelatine

immobilizasyonu için optimum glutaraldehit konsantrasyonu 0.003 mol.L-1 olarak

bulunmuştur.

MBP’nin kitosan taşıyıcı sistemine immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak 0.01-

0.05 mol.L-1 konsantrasyon aralığında glutaraldehit kullanılarak immobilizasyonlar


5.14). MBP’nin kitosan taşıyıcı sistemine immobilizasyonu için optimum glutaraldehit

konsantrasyonu 0.004 mol.L-1 olarak bulunmuştur.

85

Şekil 5.14 Glutaraldehit konsantrasyonunun Kitosan-MBP immünosensör cevabına etkisi

MBP’nin aljinat taşıyıcı sistemine immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak 0.0035-

0.04 mol.L-1 konsantrasyon aralığında NHS/EDC kullanılarak immobilizasyonlar


5.15). MBP’nin aljinat taşıyıcı sistemine immobilizasyonu için optimum NHS/EDC

konsantrasyonu 0.0035 mol.L-1 olarak bulunmuştur.

Şekil 5.15 NHS/EDC konsantrasyonunun Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi

86

MBP’nin Jelatin/Aljinat taşıyıcı sistemine immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak

0.01-0.05 mol.L-1 konsantrasyon aralığında glutaraldehit kullanılarak immobilizasyonlar


5.16). MBP’nin Jelatin/Aljinat taşıyıcı sistemine immobilizasyonu için optimum

glutaraldehit konsantrasyonu 0.004 mol.L-1 olarak bulunmuştur.

Şekil 5.16 Glutaraldehit konsantrasyonunun Jelatin/Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi

Jelatin-TiO2-MBP, Kitosan-TiO2-MBP, Aljinat-TiO2-MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-

MBP elektrotlarında kullanılan çapraz bağlayıcı konsantrasyonlarının Jelatin-MBP,

Kitosan-MBP, Aljinat-MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP elektrotlarında kullanılan

çapraz bağlayıcı konsantrasyonları ile aynı olduğu görülmüştür.

5.2.4 MBP konsantrasyonunun immünosensör cevabına etkisi

Tasarlanan immünosensörlerde tanıyıcı biyoelement olan MBP’nin optimizasyonu

amacıyla önceki çalışmalarda bulunan optimum polimer, nanopartikül ve çapraz

bağlayıcı oranları sabit tutularak farklı MBP konsantrasyonlarında immünosensorler

87

hazırlanmış ve impedimetrik yanıtlar incelenerek optimum MBP konsantrsayonları

bulunmuştur.

Şekil 5.17 MBP konsantrasyonunun Jelatin immünosensör cevabına etkisi

Jelatin taşıyıcı sistemine MBP immobilizasyonunda MBP optimizasyonu amacıyla % 8

jelatin ve 0.03 mol.L-1 glutaraldehit konsantrasyonu sabit tutularak 2-1000 µg.mL-1

konsantrasyon aralığında MBP kullanılarak elektrotlar hazırlanmış ve şekil 5.17’de

görülen relatif impedans-konsantrasyon grafiği elde edilmiştir. MBP’nin jelatin’e

immobilizasyonu için optimum MBP konsantrasyonu 20 µg.mL-1 olarak bulunmuştur.

Artan MBP yüklemesi taşıyıcı gözeneklerinde aşırı doygunlaşmaya neden olduğundan

elektron difüzyonunu engellemekte ve elektron transfer hızını azaltarak sinyali

düşürmektedir.

MBP’nin Jelatin-TiO2 sistemine immobilizasyonu amacıyla yapılana optimizasyon

çalışmasında da optimum MBP konsantrasyonu 20 µg.mL-1 bulunmuştur.

88

Şekil 5.18 MBP konsantrasyonunun Kitosan immünosensör cevabına etkisi

Kitosan taşıyıcı sistemine MBP immobilizasyonunda MBP optimizasyonu amacıyla %1

kitosan ve 0.004 mol.L-1 glutaraldehit kullanılarak 2-1000 µg.mL-1 konsantrasyon

aralığında MBP elektrotları hazırlanmış ve optimum MBP konsantrasyonu 100 µg.mL-1

bulunmuştur (Şekil 5.18). İmmobilizasyon için kullanılan MBP’nin kitosanda, jelatine

göre daha fazla ihtiyaç duyulmasının kitosanın oldukça fazla olan aktif gruplarından

kaynaklandığı düşünülmektedir.

MBP’nin Kitosan-TiO2 immunosensor immobilizasyonu için ise optimum MBP

konsantrasyonu 40 µg.mL-1 olarak tespit edilmiştir. Bu sonuç, TiO2 nanopartikülünün

immobilizasyon verimini arttırıcı özelliğini kanıtlar niteliktedir.

89

Şekil 5.19 MBP konsantrasyonunun Aljinat immünosensör cevabına etkisi

Aljinat taşıyıcı sistemine MBP immobilizasyonunda MBP optimizasyonu için % 0.2

aljinat ve 0.0035 mol.L-1 NHS/EDC konsantrsayonu kullanılarak 2-1000 µg.mL-1

konsantrasyon aralığında MBP elektrotları hazırlanmış ve optimum MBP

konsantrasyonu 40 µg.mL-1 bulunmuştur (Şekil 5.19). Aljinat-TiO2 taşıyıcı sistemi için

yapılan MBP optimizasyon çalışmasında da aynı sonuç elde edilmiştir.

Şekil 5.20 MBP konsantrasyonunun Jelatin/Aljinat immünosensör cevabına etkisi

90

Jelatin/Aljinat taşıyıcı sistemine MBP immobilizasyonunda MBP optimizasyonu için

2:1 oranında %4 Jelatin/Aljinat ve 0.004 mol.L-1 glutaraldehit kullanılarak 2-1000

µg.mL-1 konsantrasyon aralığında MBP elektrotları hazırlanmış ve optimum MBP

konsantrasyonu 40 µg.mL-1 bulunmuştur (Şekil 5.20). Jelatin/Aljinat-TiO2 taşıyıcı

sistemi için yapılan MBP optimizasyon çalışmasında da aynı sonuç elde edilmiştir.

5.2.5 İmmünosensör cevabına anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi Jelatin-MBP, Jelatin-TiO2-MBP, Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2-MBP, Aljinat-MBP,

Aljinat-TiO2-MBP, Jelatin/Aljinat-MBP,Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immunosensörlerden

en iyi cevabın tespiti için anti-MBP’nin immunosensörlerle inkübasyon süresi optimize

edilmiştir. Bu amaçla geliştirilen immunosensörler anti-MBP ile 1, 5, 15, 30 ve 60

dakika inkübe edilerek impedimetrik cevaplar ölçülmüş ve optimum inkübasyon süresi

bulunmuştur.

Şekil 5.21 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-MBP immunosensör cevabına etkisi

91

Anti-MBP’nin inkübasyon süresinin Jelatin-MBP immunosensör (% 8 jelatin, 20

µg.mL-1 MBP ve 0.03 mmol.L-1 glutaraldehit) cevabına etkisi araştırılmış ve optimum

sürenin 60 dakika olduğu görülmüştür (Şekil 5.21).

Şekil 5.22 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-TiO2-MBP immunosensör cevabına

etkisi

Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-TiO2 immunosensörü (% 8 jelatin, 0.0004 g

TiO2, 20 µg.mL-1 MBP ve 0.03 mmol.L-1 glutaraldehit) için optimizasyon grafiği şekil

5.22’de verilmiş ve 30 ile 60. dakikalarda yaklaşık olarak aynı cevap alındığından bu

elektrot için optimum süre 30 dakika kabul edilmiştir.

92

Şekil 5.23 Anti-MBP inkübasyon süresinin Kitosan-MBP immunosensör cevabına etkisi

Kitosan-MBP immunosensörüne (% 1 kitosan, 100 µg.mL-1 MBP ve 0.04 mmol.L-1

glutaraldehit) anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi araştırılmış ve optimum sürenin 60

dakika olduğu görülmüştür (Şekil 5.23).

Bu immunosensöre (40 µg.mL-1 MBP) 0.00005 g TiO2 ilavesi ile hazırlanan Kitosan-

TiO2-MBP immunosensöre ise anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi Jelatin-TiO2 de

olduğu gibi 30 ve 60. dakikalar için yaklaşık aynıdır ve optimum süre 30 dakikadır

(Şekil 5.24).

93

Şekil 5.24 Anti-MBP inkübasyon süresinin Kitosan-TiO2-MBP immunosensör cevabına etkisi

Aljinat-MBP immunosensörüne (% 0.2 aljinat, 40 µg.mL-1 MBP ve 0.0035 mol.L-1

NHS/EDC) anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi araştırılmış ve optimum sürenin 60

dakika olduğu görülmüştür (Şekil 5.25).

Bu immunosensöre nanopartikül (0.00005 g TiO2) ilavesi ile elde edilen Aljinat-TiO2-

MBP immunosensör ise optimum inkübasyon süresi diğer nanopartiküllü elektrotlarda

olduğu gibi 30 dakikadır (Şekil 5.26). Bu elektrotta diğer elektrotlara göre 30. dakikada

alınan sinyal daha yüksektir. Bu durumun, aljinatın yüksek hidrofilik özelliğinden

dolayı anti-MBP çözeltisi ile daha çabuk etkileşmesinden kaynaklandığı

düşünülmektedir.

Benzer şekilde Jelatin/Aljinat-MBP immunosensörünün (2:1 oranında %4’lük

Jelatin/Aljinat, 40 µg.mL-1 MBP, 0.004 mol.L-1 glutaraldehit) optimum anti-MBP

inkübasyon süresi 60 dakika (Şekil 5.27) ve bu immünosensöre 0.0004 g TiO2 ilavesi ile

hazırlanan Jelatin/Aljinat- TiO2-MBP immünosensörünün optimum anti-MBP

inkübasyon süresi ise 30 dakika bulunmuştur (Şekil 5.28).

94

Şekil 5.25 Anti-MBP inkübasyon süresinin Aljinat-MBP immunosensör cevabına etkisi

Şekil 5.26 Anti-MBP inkübasyon süresinin Aljinat-TiO2-MBP immunosensör cevabına etkisi

95

Şekil 5.27 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin/Aljinat-MBP immunosensör cevabına etkisi

Şekil 5.28 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immunosensör cevabına etkisi

96

5.3 Tekrar Üretilebilirlik

Geliştirilen immünosensörlerin pratik kullanımında büyük önem arzeden tekrar

üretilebilirlik çalışması amacıyla her bir immünosensörden 20’şer adet hazırlanmış ve

15.625 µg.mL-1 Anti-MBP ilavesi ile impedimetrik cevaplar değerlendirilmiştir.

Şekil 5.29 Jelatin-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Şekil 5.29, Jelatin-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiğini

göstermektedir. Hazırlanan elektrotlar birbirlerine çok yakın impedimetrik yanıtlar

vermişlerdir. Standart sapma %3.69’tur. Bu sonuç, tasarlanan immünosensörlerin pratik

olarak kullanımı için oldukça önemlidir.

97

Şekil 5.30 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Şekil 5.30’da Jelatin-TiO2-MBP elektrodunun tekrar üretilebilirlik grafiği gösterilmiştir.

Grafikten de görülebileceği gibi Jelatin-TiO2-MBP immünosensörlerinin üretimlerinde

Jelatin- MBP elektrotlarınkine göre büyük bir dalgalanma vardır. Bu durumun,

nanopartiküllerin her bir elektrot yüzeyinde farklı homojenlikte dağılmasından

kaynaklandığı düşünülmektedir. Standart sapma % 8.72’dir.

Benzer şekilde Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2-MBP, Aljinat-MBP, Aljinat-TiO2-MBP,

Jelatin/Aljinat-MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörlerinin tekrar

üretilebilirlik grafikleri şekil 5.31-şekil 5.36’da gösterilmiştir.

98

Şekil 5.31 Kitosan-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Standart sapma %5.24 bulunmuştur.

Şekil 5.32 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Standart sapma %7.26 bulunmuştur.

99

Şekil 5.33 Aljinat-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Standart sapma %2.95’tir.

Şekil 5.34 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Standart sapma % 5.86’dır.

100

Şekil 5.35 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Standart sapma % 3.79’dur.

Şekil 5.36 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği

Standart sapma % 4.12’dir.

101

5.4 İmmünosensörlerin Ömrü

İmobilizasyon koşulları optimize edildikten sonra MBP elektrotları geliştirilmiştir ve

elektrotların kullanım ömrü tespit edilmiştir. İmmünosensör her kullanım sonrası

aminoasetik asit tamponuyla (0.1 M, pH 3) desorbe edilmiş, fosfat tamponunda (0,05

mol.L-1, pH 7,4) yıkanmış, 4 0C’ta fosfat tamponunda saklanmış ve her gün ölçüm

alınmıştır. İmmünosensörlerin impedimetrik yanıtlarındaki düşüş değerlendirilerek

kullanım süresi belirlenmiştir.

Şekil 5.37 Jelatin-MBP immünosensörünün kullanım süresi

Jelatin-MBP elektrotu 14 günlük kullanım süresi boyunca aktivitesini korumuştur (Şekil

5.37). İmmünosensör cevabı 14. Günün sonunda % 76.6’ya düşmüştür. Jelatin üzerine

MBP immobilizasyonu biyolojik aktiviteyi büyük oranda koruyarak antijenin etrafında

biyouyumlu bir mikroçevre oluştursa da çoğunlukla antijenlerin denatürasyonunun bir

sonucu olarak immünosensörün aktivitesinde düşüş gözlenmiştir.

102

5.38 Jelatin-TiO2 immünosensörünün kullanım süresi

Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresinin Jelatin-MBP

elektrodununkinden daha kısadır (Şekil 5.38). İmmünosensör 6. Güne kadar kararlı bir

performans sergilemiş, bu süreden sonra performansında hızlı bir düşüş gözlenmiştir.

Elektrot yüzeyi incelendiğinde, Jelatin-TiO2-MBP filminin elektrot yüzeyinden

ayrılmaya başladığı gözlenmiştir. Bu durumun, nanoaprtiküllerin immobilize filmi

olumsuz yönde etkilediği düşünülmektedir. Jelatin-TiO2-MBP immunosensörünün 10.

günün sonunda impedimetrik yanıtı % 74.5’a düşmüştür.

5.39 Kitosan-MBP immünosensörünün kullanım süresi

103

Kitosan-MBP immünosensörü 14 günlük kullanım süresi boyunca aktivitesini %75

oranında korumuştur (Şekil 5.39), Kitosan-TiO2-MBP elektrodunun ise impedimetrik

yanıtı 10. günün sonunda %75.6’ya düşmüştür (Şekil 5.40).

Şekil 5.40 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi

Şekil 5.41 Aljinat-MBP immünosensörünün kullanım süresi

104

Şekil 5.42 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi

Aljinat-MBP immünosensörü 14 günlük kullanım süresi boyunca aktivitesini %77.8

oranında korumuştur (Şekil 5.41), Aljinat-TiO2-MBP elektrodunun ise impedimetrik

yanıtı 10. günün sonunda %75.5’e düşmüştür (Şekil 5.42).

Şekil 5.43 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün kullanım süresi

105

Şekil 5.44 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün kullanım süresi

Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörü 14 günlük kullanım süresi boyunca aktivitesini

%69.2 oranında korumuştur (Şekil 5.43), Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün

ise impedimetrik yanıtı 10. günün sonunda %68.9’a düşmüştür (Şekil 5.44).

5.5 Film Kalınlıkları

Polimer film kalınlıklarının hesaplanması amacıyla altın disk elektrotlar polimerler ile

modifiye edilerek QCM ölçümleri alınmıştır. Bulunan frekans değişimleri kullanılarak

Sauerbrey eşitliği (2.24) ile film kalınlıkları hesaplanmıştır.

22. .. .

o

q q

m ffA ρ η− ∆

∆ = (2.24)

.f fm q d∆ =

(2.25)

2

. . .2. .

q qf

f o

f Ad

fρ η

ρ−∆

=

(2.26)

106

f∆ : frekans değişimi, Hz

fd : film kalınlığı, cm

A : elektrot alanı (1.13 cm2),

qρ : kristal yoğunluğu (2.64 g.cm-3),

qη : kristalin kesme modülü (2.94x1011 g.cm-1.s-2),

fρ : polimer film yoğunluğu, g.cm-3

of : rezonans frekansı (5.000.000 Hz).

Şekil 5.45 Jelatin ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi

Şekil 5.45’te Jelatin film için polimer çözeltisi ekleme sonrası frekans değişim grafiği

gösterilmiştir. Jelatin ilavesi sonrası 73870 Hz’lik bir frekans düşüşü meydana

gelmiştir. Bu değer kullanılarak Sauerbrey eşitliği ile jelatin film kalınlığı:

2 3 11 1 2

3 2

73870 1.13 2.64 . 2.94.10 .2 0.08 . 5000000f

Hz cm g cm g cm sd

g cm

− − −

−

× × ×=

× ×

Jelatin film kalınlığı 180 µm bulunmuştur.

107

Şekil 5.46, 5.47 ve 5.48’de sırası ile kitosan, aljinat ve Jelatin/Aljinat film için altın

elektrodun frekans değişimi gösterişmiştir. Aynı formül kullanılarak kitosan film

kalınlığı 156 µm (polimer yoğunluğu 0.01 g.cm-3), aljinat film kalınlığı 170 µm

(polimer yoğunluğu 0.002 g.cm-3) ve Jelatin/Aljinat film kalınlığı 276 µm (polimer

yoğunluğu 0.04 g.cm-3) bulunmuştur.

Şekil 5.46 Kitosan ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi

Şekil 5.47 Aljinat ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi

108

Şekil 5.48 Jelatin/Aljinat ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi

Nanopartikül ilavesi ile film kalınlıklarında kayda değer bir değişimin olmadığı

görülmüştür.

5.6 Geliştirilen İmmünosensörlerin Elektrokimyasal Davranışları

Şekil 5.49 Jelatin immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği

a. Jelatin-TiO2 elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Jelatin-TiO2-MBP elektrot, d. Jelatin elektrot, e. Anti-MBP inkübe Jelatin-TiO2-MBP elektrot, f. Jelatin-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Jelatin-MBP elektrot

109

Şekil 5.49’da Pt elektrot üzerine yapılan jelatin modifikasyonu ve sonraki işlemler

sonucu impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği verilmiştir. Grafikten

görülebileceği gibi çıplak elektrot (b) jelatin ile modifiye edildikten sonra (d) impedans

çok fazla artmıştır. Bu artış, elektrot yüzeyine jelatinin başarılı bir şekilde kaplandığını

ve jelatinin yalıtıcı etkisini göstermektedir. Sisteme nanopartikül ilave edildiğinde ise

(a) yük transfer direnci, çıplak Pt elektrodununkinin altına inmiştir. Bu durum,

nanopartiküllerin yüzey alanını ve yük transfer hızını arttırıcı etkisini kanıtlar

niteliktedir. Nanopartiküllerin bu özelliği sayesinde daha düşük yük transfer direncine

yani tayin sınırına inilebilmiştir. Jelatin-TiO2 taşıyıcısına MBP immobilize edildiğinde

(c) ve Jelatin taşıyıcı sistemine MBP immobilize edildiğinde (f) eğrileri elde edilmiştir.

MBP immobilizasyonu sonucu impedansın artması, MBP’nin ekstra bir direnç

yaratmasından kaynaklanmakta ve MBP’nin immobilizasyonunu ispatlamaktadır. Bu

elektrotlara Anti-MBP inkübe edildiğinde MBP ve Anti-MBP bağlanması gerçekleşmiş

ve impedanslarda artış gözlenmiştir. Jelatin-MBP elektroduna Anti-MBP inkübasyonu

ile (g), Jelatin-TiO2-MBP elektroduna Anti-MBP inkübasyonu ile ise (e) eğrisi elde

edilmiştir.

Şekil 5.50 Jelatin immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı

a. Jelatin-TiO2 elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Jelatin-TiO2-MBP elektrot, d. Jelatin elektrot, e. Anti-MBP

inkübe Jelatin-TiO2-MBP elektrot, f. Jelatin-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Jelatin-MBP elektrot

110

Şekil 5.50’de Pt elektrot üzerine yapılan jelatin modifikasyonu ve sonraki işlemler

sonucu dönüşümlü voltamogramda meydana gelen değişimler gösterilmiştir. Çıplak

elektrottan (b) geçen akım yoğunluğu yaklaşık olarak 0.002 µA.cm-2 iken jelatin

modifikasyonu sonucu (d) 0.0012 seviyesine inmiştir. Akım yoğunluğundaki azalma,

jelatinin başarılı bir şekilde Pt elektrot yüzeyine kaplandığını göstermekteyse de çok

düşük düzeylere inmemesi, çözelti ile elektrot arasında halen bir miktar elektron

aktarımının gerçekleştiğini göstermektedir. Bu durum, Jelatin’in SEM mikrografında

görülen adacıklar şeklindeki mikro yapısından kaynaklandığı düşünülmektedir. Jelatin’e

MBP immobilize edildiğinde elektrottan geçen yük yoğunluğu daha da azalmıştır (f) ve

Anti-MBP inkübasyonu ile en alt seviyeye ulaşmıştır (g). Sisteme nanopartiküller dahil

edildiğinde elektrottan geçen yük yoğunluğu çıplak Pt’den fazladır (a). Jelatin-TiO2

elektrota MBP immobilize edildiğinde (c) ve Anti-MBP inkübe edildiğinde (e)

voltamogramı elde edilmiştir. Elde edilen bu CV sonuçları, impedans sonuçlarını

desteklemektedir.

Anodik ve katodik pik potansiyelleri kullanılarak hesaplanan formal potansiyeller

(E0′=(Ep,a + Ep,k)/2) Anti-MBP inkübe edilmiş Jelatin-MBP ve Jelatin-TiO2-MBP

elektrotlar için sırasıyla 205 ve 212 mV olarak hesaplanmıştır. Ayrıca pik ayrımları

(∆Ep = Ep,a − Ep,k) sırası ile 150 ve 105 mV olarak hesaplanmıştır. Bu sonuçlar, Anti-

MBP ile Jelatin-MBP ve Jelatin-TiO2-MBP arasındaki elektron transferinin tersinmeze

yakın olduğunu, fakat Jelatin-TiO2-MBP elektrodununkinin daha tersinir olduğunu

göstermektedir (Deng vd. 2008, Liu vd. 2008).

Benzer sonuçlar diğer elektrotlarda da gözlenmiştir. Kitosan elektrodun impedans ve

CV grafikleri şekil 5.51 ve 5.52’de, Aljinat elektrodun impedans ve CV grafikleri şekil

5.53 ve 5.54’te, Jelatin/Aljinat elektrodun impedans ve CV grafikleri ise şekil 5.55 ve

5.56’da gösterilmiştir.

111

Şekil 5.51 Kitosan immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği

a. Kitosan-TiO2 elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Kitosan-TiO2-MBP elektrot, d. Kitosan elektrot, e. Anti-MBP inkübe Kitosan-TiO2-MBP elektrot, f. Kitosan-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Kitosan-MBP elektrot

Şekil 5.52 Kitosan immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı

a. Kitosan-TiO2 elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Kitosan-TiO2-MBP elektrot, d. Kitosan elektrot, e. Anti-MBP inkübe Kitosan-TiO2-MBP elektrot, f. Kitosan-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Kitosan-MBP elektrot

112

Formal potansiyeller Anti-MBP inkübe edilmiş Kitosan-MBP ve Kitosan-TiO2-MBP

elektrotlar için sırasıyla 200 ve 205 mV olarak hesaplanmıştır. Pik ayrımları sırası ile

120 ve 110 mV olarak hesaplanmıştır.

Şekil 5.53 Aljinat immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği

a. Aljinat-TiO2 elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Aljinat-TiO2-MBP elektrot, d. Aljinat elektrot, e. Anti-MBP inkübe Aljinat-TiO2-MBP elektrot, f. Aljinat-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Aljinat-MBP elektrot

Şekil 5.54 Aljinat immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı

a. Aljinat-TiO2 elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Aljinat-TiO2-MBP elektrot, d. Aljinat elektrot, e. Anti-MBP inkübe Aljinat-TiO2-MBP elektrot, f. Aljinat-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Aljinat-MBP elektrot

113

Çıplak elektrodun aljinat ve kitosan filmler ile modifiye edilmesi sonucu CV’lerde

anodik bölgeye kaymanın gerçekleştirği görülmektedir. Bu sonuç, elektrotların

başarıyla modifiye edildiğinin bir başka göstergesidir. İmpedanstaki direnç değerlerinin

jelatininkine oranla fazla olması da bu sonucu desteklemektedir.

Formal potansiyeller Anti-MBP inkübe Aljinat-MBP ve Aljinat-TiO2-MBP elektrotlar

için sırasıyla 165 ve 207 mV olarak hesaplanmıştır. Pik ayrımları sırası ile 170 ve 165

mV olarak hesaplanmıştır.

Şekil 5.55 Jelatin/Aljinat immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği

a. Çıplak elektrot, b. Jelatin/Aljinat modifiye elektrot, c. Jelatin/Aljinat-MBP elektrot, d. Anti-MBP inkübe Jelatin/Aljinat-MBP elektrot, e. Jelatin/Aljinat-TiO2 elektrot, f. Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP elektrot

114

Şekil 5.56 Jelatin/Aljinat immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı

a. Çıplak elektrot, b. Çıplak elektrot, c. Aljinat-TiO2-MBP elektrot, d. Aljinat elektrot, e. Anti-MBP inkübe Aljinat-TiO2-MBP elektrot, f. Aljinat-MBP elektrot, g. Anti-MBP inkübe Aljinat-MBP elektrot

Formal potansiyeller Anti-MBP inkübe Jelatin/Aljinat-MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-

MBP elektrotlar için sırasıyla 201 ve 195 mV olarak hesaplanmıştır. Pik ayrımları sırası

ile 100 ve 110 mV olarak hesaplanmıştır.

İmmünosensörlerde, immünoreaksiyonların doğası gereği kinetik bir reaksiyon değil

bağlanma olayı meydana gelmektedir. Bu nedenle immünosensörlerde bir ürün ya da

analit difüzyonu değil, elektron difüzyonu gerçekleşmektedir. Bu nedenle

immünosensörlerin Nyqusit grafiğinde difüzyonu gösteren doğrusal kısım

görülmemekte, sadece yarım daire grafiği oluşmakadır. Bu eğriye uygun devre modeli

ise çözelti direnci (Rs), çift tabaka kapasitansı (Cdl) ve yük transfer direncinden

meydana gelen, Warburg impedansını içermeyen Randles devresidir.

Şekil 5.57 Geliştirilen immünosensörlere ait Randles devresi

115

5.7 Kalibrasyon Grafikleri

Tasarlanan immünosensörlere Anti-MBP konsantrasyonları uygulanarak lineer aralık ve

tayin limiti belirlenmiş, kalibrasyon grafiği çizilmiştir. Antijen ya da antikorların, diğer

bazı antijen veya antikorları bağlama özellikleri olduğu için hIgG kullanılarak non-

spesifik bağlanmalar denetlenmiş ve kalibrasyon grafiğinden çıkarılarak gerçek

kalibrasyon grafikleri elde edilmiştir.

Şekil 5.58’de Jelatin-MBP elektrodunun, uygulanan Anti-MBP ve hIgG miktarlarına

göre impedanstaki değişimini gösterilmiştir. 0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon

aralığında yapılan çalışmada en üst düzey olan 2500 ng.mL-1 konsantrasyonunda Anti-

MBP uygulaması sonucu alınan relatif impedans 2.35 iken aynı konsantrasyonda hIgG

uygulaması sonucu alınan relatif impedans 0.11 olarak ölçülmüştür. Bu sonuç, hIgG’nin

MBP’ye %4.68 oranında, yani oldukça düşük bir yüzde ile bağlandığını ve non-spesifik

bağlanmaların immünosensör performansını pek etkilemediğini göstermektedir.

Şekil 5.58 Jelatin-MBP immünosensörüne 0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması

116

Şekil 5.59 Jelatin-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.60 Jelatin-MBP immünosensörünün düşük (0.975-62.5 ng.mL-1)

konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.59 ve 5.60’da Jelatin-MBP immünosensörünün sırası ile yüksek (125-2500

ng.mL-1) ve düşük (0.975-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralıklarında kalibrasyon

grafikleri gösterilmiştir. Jelatin-MBP immünosensörünün cevabı Anti-MBP

konsantrasyonu ile orantılı olup 0.975-62.5 ng.mL-1 konsantrasyon aralığı için

117

determinasyon katsayısı R2= 0.9907; 125-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığı için ise

R2= 0.9733 olarak elde edilmiştir. Yüksek konsantrasyon uygulamalarında doğrusallığın

azalmasının, fazla Anti-MBP ilavesi ile elektrodun doygunluğa ulaşmasından

kaynaklandığı düşünülmektedir. Bu immünosensör için tayin limiti 0.975 ng.mL-1’dir.

Şekil 5.61’de Jelatin-TiO2-MBP elektrodunun, uygulanan Anti-MBP ve hIgG

miktarlarına göre impedanstaki yanıtları değerlendirilmiştir. 0.4875-2500 ng.mL-1

konsantrasyon aralığında yapılan çalışmada en üst düzey olan 2500 ng.mL-1

konsantrasyonunda Anti-MBP uygulaması sonucu alınan sinyal 2.40 iken aynı

konsantrasyonda hIgG uygulaması sonucu alınan sinyal 0.12’dir. hIGg, MBP’ye %5

oranında bağlanmıştır. Jelatin-TiO2-MBP elektroda bağlanan hIgG, Jelatin-MBP

elektroda bağlanan miktardan az da olsa fazladır. Bu durum, nanopartiküllerin yüzey

alanını ve immobizasyon verimini arttırıcı etkisinden kaynaklanmaktadır.

Şekil 5.61 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörüne 0.4875-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması

Şekil 5.62 ve 5.63’te Jelatin-TiO2-MBP elektrodunun kalibrasyon grafikleri

gösterilmiştir. Jelatin-MBP elektroda göre daha geniş olan konsantrasyon aralığında

Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün cevabı Anti-MBP konsantrasyonu ile orantılı

118

olup 0.4875-62.5 ng.mL-1 konsantrasyon aralığı için determinasyon katsayısı R2=

0.9887, 125-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığı için ise R2= 0.9769 olarak elde

edilmiştir. Tayin limiti 0.4875’tir. Sisteme nanopartikül ilave edilmesi, elektron transfer

hızını arttırmış ve direnci düşürmüştür. İmpedans grafiğinde yük transfer direnci

düştüğü için daha düşük konsantrasyonda tayin yapılabilmiştir. Buna karşın, önceki

bölümlerde bahsedildiği gibi TiO2 ilavesi, film kararlılığını azalttığından doğrusallık

Jelatin-MBP elektrodunkine göre daha azdır.

Şekil 5.62 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.63 Jelatin-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (0.4875-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

119

Şekil 5.64’te Kitosan-MBP elektrodunun, uygulanan Anti-MBP ve hIgG miktarlarına

göre impedans değişimleri gösterilmiştir. 0.4875-2500 ng.mL-1 konsantrasyon

aralığında yapılan çalışmada hIGg, MBP’ye %7.4 oranında bağlanmıştır. Non-spesifik

bağlanmalar değerlendirilerek düzeltilmiş kalibrasyon grafikleri şekil 5.65 ve 66’da

gösterilmiştir. İmmünosensörün düşük konsantrasyon aralığındaki (0.4875-62.5 ng.mL-

1) determinasyon katsayısı R2=0.9926 ve yüksek konsantrasyon aralığındaki (125-2500

ng.mL-1) determinasyon katsayısı R2=0.9800’tir.

Şekil 5.64 Kitosan-MBP immünosensörüne 0.4875-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP b. hIgG uygulaması

120

Şekil 5.65 Kitosan-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.66 Kitosan-MBP immünosensörünün düşük (0.4875-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

121

Şekil 5.67 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörüne 0.1213-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP b. hIgG uygulaması

Şekil 5.67’de Kitosan-TiO2-MBP elektrodunun non-spesifik davranışı incelenmiştir.

0.1213-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında yapılan çalışmada hIGg, MBP’ye %9.2

oranında bağlanmıştır. Non-spesifik bağlanmalar değerlendirilerek düzeltilmiş

kalibrasyon grafikleri ise şekil 5.68 ve 69’da gösterilmiştir. İmmünosensörün düşük

konsantrasyon aralığındaki (0.1213-62.5 ng.mL-1) determinasyon katsayısı R2=0.9899

ve yüksek konsantrasyon aralığındaki (125-2500 ng.mL-1) determinasyon katsayısı

R2=0.9810’dur. Tayin limiti 0.1213 ng.mL-1’dir. Kitosan taşıyıcı sistemi kullanılarak

yapılan çalışmalarda diğer çalışmalara göre daha düşük düzeylerde tayin limitlerine

ulaşılmıştır. Bu durumun, farklı fonksiyonel gruplar bulunduran kitosana yapılan

immobilizasyon işlermlerinin diğerlerine oranla daha etkin olmasından kaynaklandığı

düşünülmektedir.

122

Şekil 5.68 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.69 Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (0.1213-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.70’de Aljinat-MBP elektrodunun non-spesifik bağlanmaları incelenmiştir. 1.95-

2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında yapılan çalışmada hIGg, MBP’ye %6.36

oranında bağlanmıştır. Non-spesifik bağlanmalar değerlendirilerek elde edilen

düzeltilmiş kalibrasyon grafikleri şekil 5.71 ve 72’de gösterilmiştir. İmmünosensörün

düşük konsantrasyon aralığındaki (1.95-125 ng.mL-1) determinasyon katsayısı

123

R2=0.9947 ve yüksek konsantrasyon aralığındaki (250-2500 ng.mL-1) determinasyon

katsayısı R2=0.9833’dur. Tayin limiti 1.95 ng.mL-1’dir.

Şekil 5.70 Aljinat-MBP immünosensörüne 1.95-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması

Şekil 5.71 Aljinat-MBP immünosensörünün yüksek (250-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

124

Şekil 5.72 Aljinat-MBP immünosensörünün düşük (1.95-125 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.73 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörüne 0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP b. hIgG uygulaması

Şekil 5.73’te Aljinat-TiO2-MBP elektrodunun non-spesifik bağlanmaları incelenmiştir.

0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında yapılan çalışmada hIGg, MBP’ye %4.87

oranında bağlanmıştır. Non-spesifik bağlanmalar değerlendirilerek elde edilen

düzeltilmiş kalibrasyon grafikleri şekil 5.74 ve 75’te gösterilmiştir. İmmünosensörün

125

düşük konsantrasyon aralığındaki (0.975-125 ng.mL-1) determinasyon katsayısı

R2=0.9908 ve yüksek konsantrasyon aralığındaki (250-2500 ng.mL-1) determinasyon

katsayısı R2=0.9878’dir. Tayin limiti 0.975 ng.mL-1’dir.

Şekil 5.74 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (250-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.75 Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (0.975-125 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

126

Şekil 5.76’da Jelatin/Aljinat-MBP elektrodunun non-spesifik bağlanmaları

incelenmiştir. 3.9-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında yapılan çalışmada hIGg,

MBP’ye %12 oranında bağlanmıştır. Non-spesifik bağlanmalar değerlendirilerek elde

edilen düzeltilmiş kalibrasyon grafikleri şekil 5.77 ve 5.78’de gösterilmiştir.

İmmünosensörün düşük konsantrasyon aralığındaki (3.5-62.5 ng.mL-1) determinasyon

katsayısı R2=0.9955 ve yüksek konsantrasyon aralığındaki (125-2500 ng.mL-1)

determinasyon katsayısı R2=0.9780’dir. Tayin limiti 3.90 ng.mL-1’dir.

Şekil 5.76 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörüne 3.9-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. hIgG uygulaması

Şekil 5.77 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün düşük (3.9-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

127

Şekil 5.78 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Şekil 5.79’da Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP elektrodunun non-spesifik bağlanmaları

incelenmiştir. 1.95-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında yapılan çalışmada hIGg,

MBP’ye %12,2 oranında bağlanmıştır. Non-spesifik bağlanmalar değerlendirilerek elde

edilen düzeltilmiş kalibrasyon grafikleri şekil 5.80 ve 5.81’de gösterilmiştir.

İmmünosensörün düşük konsantrasyon aralığındaki (1.95-62.5 ng.mL-1) determinasyon

katsayısı R2=0.9675 ve yüksek konsantrasyon aralığındaki (125-2500 ng.mL-1)

determinasyon katsayısı R2=0.9606’dır. Tayin limiti 1.95 ng.mL-1’dir.

128

Şekil 5.79 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörüne 1.95-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP b. hIgG uygulaması

Şekil 5.80 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün düşük (1.95-62.5 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

129

Şekil 5.81 Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensörünün yüksek (125-2500 ng.mL-1) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği

Geliştirilen immünosensörlerin yanıt süresi, Anti-MBP inkübe elektrotların frekans

değerlerinin MBP immobilize edilmiş elektrotların maksimum kapasitansındaki frekans

değerine gelme süresi baz alınarak hesaplanmış ve Çizelge 5.1’de gösterilmiştir.

130

Çizelge 5.1 Geliştirilen immünosensörlerin çalışma koşulları ve performansları(1)

Jelatin-MBP Kitosan-MBP Aljinat-MBP Jelatin/Aljinat-MBP

Polimer, % 8 1 0,2 4 (J/A oranı 2:1) Çapraz Bağlayıcı, mol.L-1

0.003 0.004 0.0035 (NHS/EDC)

0.004

MBP, µg.mL-1 20 100 40 40 İnkübasyon süresi, dk

60 60 60 60

Tekrar üretilebilirlik, standar sapma %

3.96 5.24 2.95 3.79

Kullanım süresi (gün) ve kullanım süresi sonu aktivitesi %

14, 76.6 14, 75 14, 77.8 14, 69.2

Film kalınlığı, µm

180 156 170 276

Formal potansiyel, mV

205 200 165 201

Pik ayrımı, mV

150 120 170 100

Devre modeli Randles Randles Randles Randles Doğrusal aralık, ng.mL-1

0.975-2500 0.4875-2500 1.95-2500 3.90-2500

Tayin limiti, ng.mL-1

0.975 0.4875 1.95 3.90

Determinasyon katsayısı, R2

0.9907/0.9733 0.9926/0.9800 0.9947/0.9833 0.9955/0.9790

Kalibrasyon grafiği denklemi [y=relatif impedans (ohm), x=Anti-MBP (ng.mL-

1)]

y=0.01x+0.13 (düşük kons.)

y= 0.0004x+1.15

(yüksek kons.)


y= 0.0007x+0.69 (yüksek kons.)

y=0.0058x+0.15 (düşük kons.)



y=0.00016x+0.55

Tayin süresi, s 58 83 104 92

131

Çizelge 5.2 Geliştirilen immünosensörlerin çalışma koşulları ve performansları(2)

Jelatin-TiO2-MBP

Kitosan-TiO2-MBP

Aljina-TiO2-MBP

Jelatin/Aljina-TiO2-MBP

TiO2, g 0.0004 0.00005 0.00004 0.0004 MBP, µg.mL-1 20 40 40 40 İnkübasyon süresi, dk

30 30 30 30

Tekrar üretilebilirlik, standar sapma %

8.72 7.26 5.86 4.12

Kullanım süresi (gün) ve kullanım süresi sonu aktivitesi %

10, 74.5 10, 75.6 10, 75.5 10, 68.9

Formal potansiyel, mV

212 205 207 195

Pik ayrımı, mV

105 110 165 110

Devre modeli Randles Randles Randles Randles Doğrusal aralık, ng.mL-1

0.4875-2500 0.1213-2500 0.975-2500 1.95-2500

Tayin limiti, ng.mL-1

0.4875 0.1213 0.975 1.95

Determinasyon katsayısı, R2

0.9887/0.9769 0.9899/0.9810 0.9908/0.9878 0.9675/0.9606

Kalibrasyon grafiği denklemi [y=relatif impedans (ohm), x=Anti-MBP (ng.mL-

1)]

y=0.012x+0.148 (düşük kons.)

y=0.0004x+1.13 (yüksek kons.)

y=0.0035x+0.183 (düşük kons.)





y= 0.0002x+0.57

(yüksek kons.)

Tayin süresi, s 46 65 79 71

5.8 BOS ve Serum Çalışmaları

Tasarlanan immünosensörlerin kliniğe uyarlanabilmesi amacıyla gerçek biyolojik

örnekler kullanılarak çalışmalar yapılmıştır. Yapılan çalışmalarda benzer sonuçlar

alındığından bu tez çalışması kapsamında üretilen immünosensörlerden en düşük tayin

132

sınırına sahip olan Kitosan-TiO2-MBP elektrodu kullanılarak yapılan çalışmanın

sonuçları verilmiştir.

BOS ve serumdaki Anti-MBP miktarlarının bulunması amacıyla yapay BOS ve yapay

serum ile kalibrasyon grafikleri çizilmiş ve kalibrasyon denklemleri yapay BOS için

doğrusal denklemler RI=0.0037[Anti-MBP]+0.179 (düşük konsantrasyon),

RI=0.00044[Anti-MBP]+0.606 (yüksek konsantrasyon); yapay serum için ise

RI=0.0036[Anti-MBP]+0.184 (düşük konsantrasyon), RI=0.00081[Anti-MBP]+0.558

olarak bulunmuştur (Şekil 5.82-5.85). Kitosan-TiO2-MBP immünosensörlerine 10’ar µL

BOS ve serum damlatılarak alınan impedimetrik sinyaller ile kalibrasyon

denklemlerinden Anti-MBP miktarları hesaplanmıştır. Yapılan BOS denemesi

sonucunda 0.205’lik bir relatif impedans sinyali elde edilmiş ve bu değer kalibrasyon

grafiğinde yerine konularak 6,28 ng.mL-1 Anti-MBP değeri bulunmuştur. Yapay BOS

ile elde edilen kalibrasyon grafiğinden ise Anti-MBP değeri 6,99 ng.mL-1 olarak

hesaplanmıştır. Bu değerlerin oldukça yakın olduğu görülmektedir. Benzer şekilde

serum denemesi sonucu 0.215’lik bir relatif impedans sinyali elde edilmiş ve bu değer

kalibrasyon grafiğinde yerine konularak 9,14 ng.mL-1 Anti-MBP değeri bulunmuştur.

Yapay serum kalibrasyon denkleminden ise serumdaki Anti-MBP miktarı 8,61 ng.mL-1

olarak hesaplanmıştır.

133

Şekil 5.82 Düşük konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün

kalibrasyon grafiği, (b) Yapay BOS ile elde edilen kalibrasyon grafiği

Şekil 5.83 Düşük konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği, (b) yapay serum ile elde edilen kalibrasyon grafiği

134

Şekil 5.84 Yüksek konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği, (b) Yapay BOS ile elde edilen kalibrasyon grafiği

Şekil 5.85 Yüksek konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği, (b) Yapay serum ile elde edilen kalibrasyon grafiği

135

6. TARTIŞMA ve SONUÇ

Bu çalışmada, MS hastalığına yol açan oto-antikorlardan biri olan Anti-MBP tayini için

spesifik, duyarlı, hızlı ve kolay sonuç verecek MBP immünosensörünün geliştirilmesi

hedeflenmiştir. Bu amaçla, MBP immobilizasyonu için jelatin, kitosan, aljinat; bu

polimerlerin kombinasyonları ve TiO2 nanopartikülleri ile karışımları kullanılmıştır.

Jelatin/Kitosan ve Aljinat/Kitosan sistemlerinden istenilen verim alınamadığı için

çalışmaya jelatin, kitosani aljinat ve Jelatin/Aljinat sistemleri ile devam edilmiştir.

MBP’nin taşıyıcılara immobilizasyonu amacıyla çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit ve

NHS/EDC kullanılmıştır.

Tez çalışmasında ilk olarak hazırlanan Polimer, Polimer-MBP, Polimer-TiO2 ve

Polimer-TiO2-MBP filmlerinin SEM görüntüleri alınmış ve morfolojik değerlendirme

yapılmıştır. İmmünosensörlerden maksimum performans alabilmek amacıyla taşıyıcı

miktarları, nanopartikül miktarları, çapraz bağlayıcı ve MBP konsantrasyonları ve

inkübasyon süreleri optimize edilmiştir. Ayrıca QCM kullanılarak film kalınlıkları

hesaplanmıştır. Daha sonra EIS ve CV sonuçları değerlendirilerek immünosensörlerin

elektrokimyası incelenmiştir. Optimize immünosensörlere non-spesifik bağlanmalar

hIgG kullanılarak denetlenmiş ve kalibrasyon grafikleri elde edilmiştir. Son olarak ise

immünosensörlerin klinik uygulamaları amacıyla MS’li hastalardan alınan BOS ve

serum ile çalışmalar yapılmış ve sonuçlar değerlendirilmiştir.

Değişik polimer miktarları kullanılarak hazırlanan immünosensörlerin impedimetrik

cevapları değerlendirilerek en uygun taşıyıcı oranları araştırılmıştır. Jelatin için % 4-14,

kitosan için % 0.5-2.75, aljinat için % 0.2-1.3 ve Jelatin/Aljinat için 0.5-10 (oran)

aralıklarında polimerler kullanılarak hazırlanan immünosensörler ile yapılan

optimizasyon çalışması sonucunda sırası ile % 8, % 1, % 0.2 ve 2 oranları en uygun

taşıyıcı miktarları olarak tespit edilmiştir. Yüksek polimer oranları, bağlanan MBP

miktarının artmasına, dolayısıyla immünosensör sinyalinin artmasına olanak

sağlamıştır. Artan polimer miktarı ise taşıyıcı gözeneklerinin küçülmesine neden olmuş

ve substrat ve ürün giriş-çıkışlarını kısıtladığından sinyalde düşüş gözlenmiştir (Sungur

136

vd. 2004, Emregül 2005). Yapılan literatür taramasında kitosanın genellikle % 0.5-% 1

oranlarında (Yu vd. 2004, Luo vd. 2005); aljinatın ise % 2 oranında (Gonchar vd. 1998,

Gorenek vd. 2004) kullanılarak yapılan çalışmalara rastlanmıştır. Literatürde

Jelatin/Aljinat polimer karışımı ile geliştirilen bir immünosensöre rastlanmamıştır.

Polimer-TiO2 sistemlerinde TiO2 optimizasyonu amacıyla jelatin için 0.0001-0.0008 g,

kitosan için 0.00003-0.00007 g, aljinat için 0.00002-0.0001 g ve Jelatin/Aljinat için

0.0002-0.0006 g TiO2 kullanılarak immünosensörler hazırlanmış ve optimum değerler

sırası ile 0.0004 g, 0.00005 g, 0.00004 g ve 0.0004 g olarak bulunmuştur. Jelatin,

kitosan, aljinat ve Jelatin/Aljinat polimerlerinin hepsinde çok düşük nanopartikül

miktarları yüzey alanını gerektiği kadar arttıramazken çok fazla nanopartikül miktarları

ise polimer yüzeyini tamamen kaplayarak direnci arttırmakta ve elektron transferini

inhibe etmektedir.

MBP’nin taşıyıcı sistemlere immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak 0.001-0.005

mol.L-1 konsantrasyon aralığında glutaraldehit (jelatin, kitosan ve Jelatin/Aljinat için) ve

0.0035-0.04 mol.L-1 konsatrasyon aralığında NHS/EDC (aljinat için) kullanılarak

immobilizasyonlar gerçekleştirilmiş ve en uygun çapraz bağlayıcı konsantrasyonları

jelatin için 0.003 mol.L-1, kitosan için 0.004 mol.L-1, aljinat için 0.0035 mol.L-1 ve

Jelatin/Aljinat için 0.004 mol.L-1 olarak tespit edilmiştir. Glutaraldehit

konsantrasyonlarındaki artış ile MBP’nin taşıyıcıya bağlanması artmıştır. Yüksek

glutaraldehit konsantrasyonu, MBP inaktivasyonuna, elektron aktarımının azalmasına

ve buna bağlı olarak da duyarlılıkta düşüşe neden olmuştur (Sungur vd. 2004, Emregül

2005).

Bir MS biyobelirteci olan ve bu çalışmada tanıyıcı biyomolekül olarak kullanılan

MBP’nin optimizasyonu amacıyla 2-1000 µg.mL-1 konsantrasyon aralıklarında MBP

kullanılarak farklı elektrotlar hazırlanmış ve optimum MBP konsantrasyonları Jelatin-

MBP elektrot için 20 µg.mL-1, Jelatin-TiO2-MBP elektrot için 20 µg.mL-1, Kitosan-

MBP elektrot için 100 µg.mL-1, Kitosan-TiO2-MBP elektrot için 40 µg.mL-1, Aljinat-

137

MBP elektrot için 40 µg.mL-1, Aljinat-TiO2-MBP elektrot için 40 µg.mL-1,

Jelatin/Aljinat-MBP için 40 µg.mL-1 ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP için 40 µg.mL-1

olarak bulunmuştur. Artan MBP yüklemesi taşıyıcı gözeneklerinde aşırı doygunlaşmaya

neden olduğundan elektron difüzyonunu engellemekte ve elektron transfer hızını

azaltarak sinyali düşürmektedir.

MBP’ye Anti-MBP’nin en iyi şekilde bağlanmasını sağlamak amacıyla Anti-MBP

inkübasyon süreleri optimize edilmiş ve nanopartiküllü elektrotlar için 30’ar dakika,

nanopartikülsüz elektrotlar için ise 60’ar dakika bulunmuştur. Bu sonucun, yüzey alanı

daha fazla olan ve dolayısıyladaha etkin immobilizasyonların gerçekleştiği Polimer-

TiO2 taşıyıcı sistemlerine Anti-MBP’nin daha etkin bağlanmasından kaynaklandığı

düşünülmektedir. Literatürde bu sürelerden daha kısa (Kong vd. 2011, Chen vd. 2010,

Chen vd. 2006) inkübasyon sürelerinin yanı sıra yaklaşık aynı (Darain vd. 2003,

Ordonez ve Fabregas 2007, Li vd. 2008) inkübasyon sürelerine sahip immünosensör

çalışmaları da bulunmaktadır.

Geliştirilen immünosensörlerin pratik uygulanmasında önem arzeden yüksek yüzde ile

tekrar üretilebilirlik amacıyla her bir elektrottan 20’şer adet hazırlanmış ve verdikleri

impedimetrik yanıtların yakınlığı araştırılmıştır. Sonuçlar incelendiğinde nanopartikül

ilaveli immünosensörlerin daha yüksek standart sapma gösterdikleri görülmüştür. Bu

durumun, nanopartiküllerin farklı elektrot yüzeylerinde aynı homojenizasyon ile

dağılmadığından ileri geldiği düşünülmekedir. Ayrıca en kararlı elektrotların aljinat

elektrotlar olduğu da % 2.95’lik standart sapmadan anlaşılabilmektedir. Düzgün film

yapısının açık bir şekilde görülebildiği SEM mikrografları da bu sonucu

desteklemektedir.

Geliştirilen immünosensörlerin raf ömürlerinin araştırılması amacıyla yapılan çalışmada

Jelatin-MBP immünosensörünin 14 günlük kullanım süresi sonunda aktivitesini % 76.6

oranında koruduğu görülmüştür. Bu değer Kitosan-MBP immünosensör için % 75.0,

Aljinat-MBP immünosensör için, % 77.8 ve Jelatin/Aljinat immünosensör için

%69.2’dir. En kararlı film yapılarının Aljinat immünosensörlerinde meydana geldiği bu

138

sonuçlardan da anlaşılmaktadır. TiO2 ilaveli immünosensörlerde ise 10 günlük kullanım

süresi sonunda korunan aktivite Jelatin-TiO2-MBP için % 74.5, Kitosan-TiO2-MBP

için % 75.6, Aljinat-TiO2-MBP için % 75.5 ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP için ise

%68.9’dur. Deneylerler gerçekleştirilirken de TiO2 ilaveli elektrotlardan filmlerin

belirli bir süre sonunda kalktığı görülmüştür. Bu durumun, düz polimer film yapılarının

nanopartikül ilavesi sonucunda bozulmasından ve mekanik dayanımın azalmasından

kaynaklandığı düşünülmektedir. Literatürde kullanım ömrü sonunda daha düşük (Li vd.

2011, Zhang vd. 2008) ve daha yüksek (Ordonez ve Fabregas 2007, Kong vd. 2011)

aktivitelere sahip immünosensör çalışmaları bulunmaktadır.

Geliştirilen immünosensörlerin CV voltamogramları kullanılarak formal potansiyelleri

ve pik ayrımları hesaplanmış, immünosensörlerin tersinirliği araştırılmıştır. Formal

potansiyeller Jelatin-MBP, Jelatin-TiO2-MBP immünosensörler için sırası ile 205 mV,

212 mV; Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2-MBP için 200 mV, 205 mV; Aljinat-MBP,

Aljinat-TiO2-MBP için 165 mV ve 207 mV, Jelatin/Aljinat-MBP ve Jelatin/Aljinat-

TiO2-MBP için 201 mV ve 195 mV bulunmuştur. Pik ayrımları ise Jelatin-MBP,

Jelatin-TiO2-MBP için 150 mV, 105 mV; Kitosan-MBP, Kitosan-TiO2-MBP için 120

mV, 110 mV; Aljinat-MBP, Aljinat-TiO2-MBP için 170 mV, 165 mV; Jelatin/Aljinat-

MBP ve Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP için 100 mV ve 110 mV olarak hesaplanmıştır. Bu

sonuçlar yorumlandığında, tüm immünosensörlerin tersinmezliğe yakın olduğu fakat

nanopartiküllü immünosensörlerin genelde daha tersinir oldukları görülmektedir. Ayrıca

Nyquist grafikler incelendiğinde, immünosensörler için en uygun devre modelinin

Randles olduğu da görülmüştür. Çıplak elektrotlar polimer filmler ile modifiye

edildiğinde CV’lerde anodik bölgeye kaymanın gerçekleştiği görülmektedir. Bu sonuç,

impedans spektrumlarının yanında elektrotların başarıyla modifiye edildiğinin bir başka

göstergesidir. İmpedans ve CV grafiklerindeki değişimler literatürdekilerle uyum

içerisindedir (Pei vd. 2001, Tang vd. 2007, Zhang vd. 2008, Li vd. 2008, Wu vd. 2009,

Kong vd. 2011).

Geliştirilen immünosensörlere çeşitli konsantrasyon aralıklarında Anti-MBP’ler

uygulanarak kalibrasyon grafikleri çizilmiştir. Non-spesifik bağlanmaların

denetlenmeleri amacıyla Anti-MBP konsantrasyonları kadar hIgG elektrotlara inkübe

139

edilmiş ve elde edilen sinyallerin kalibrasyon grafiklerinden çıkarılmasıyla gerçek

kalibrasyon grafikleri elde edilmiştir. Jelatin-MBP immünosensöre 0.975-2500 ng.mL-1

konsantrasyon aralığında Anti-MBP uygulanmış ve düşük konsantrasyon aralığı için

(0.975-62.5 ng.mL-1) 0.9907, yüksek konsantrasyon aralığı için ise 0.9733’lük

determinasyon katsayısı elde edilmiştir. Tayin limiti 0.975 ng.mL-1’dir. Jelatin-TiO2-

MBP immünosensör ise 0.4875-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında doğrusallık

göstermiş ve determinasyon katsayıları 0.9887 ve 0.9769 olarak bulunmuştur. Tayin

limiti 0.4875 ng.mL-1’dir. Sonuçlar incelendiğinde nanopartiküllü immünosensörlerin

doğrusallığının daha düşük olduğu görülmektedir. Bu durumun, daha önce de değinilen,

nanopartiküllerin film kararlılıklarını bozmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.

Yapılan literatür taramasında jelatin, kitosan ve aljinat kullanılarak geliştirilen sınırlı

sayıda immünosensör çalışması olduğu görülmüştür. Tang vd. (2004) jelatin/nafyon

taşıyıcı sistemi üzerine Hepatit B yüzey antikoru immobilize etmişler ve 4–800 ng.mL-1

tayin aralığında, 1.3 ng.mL-1’e kadar Hepatit B yüzey antijeni tayini yapabilmişlerdir.

Yapılan bir başka çalışmada ise fenolik bileşenlerin tayinine yönelik Jelatin/tirozinas

biyosensörü geliştirilmiş ve 5×10-8-1.4×10−4 mol.L-1 konsantrasyon aralığında katekol,

5×10−8-7.1×10−5 mol.L-1 konsantrasyon aralığında fenol ve 1×10−7-3.6×10−5 mol.L-1 p-

krezol tayini yapılabilmiştir (Li vd. 2005).

Kitosan-MBP immünosensör 0.4875-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında

doğrusallık göstermiş, determinasyon katsayıları 0.9926 ve 0.9800 olarak bulunmuş,

tayin limiti ise 0.4875 ng.mL-1’dir. Kitosan-TiO2-MBP immünosensör 0.1213-2500

ng.mL-1 konsantrasyon aralığında doğrusallık göstermiş, determinasyon katsayıları

0.9899 ve 0.9810 olarak bulunmuş, tayin limiti ise 0.1213 ng.mL-1’dir. Literatürde

kitosan kullanılarak 0.74 ng.mL-1 seviyesinde α-1-fetoprotein (Hua vd. 2004), 10

ng.mL-1 seviyesinde Okratoksin A (Khan ve Dhayal 2009), 0.01 ng.mL−1 seviyesinde

karsinoembriyonik antijen (Huang vd. 2010), 4.86 pg.mL-1 seviyesinde

karsinoembriyonik antijen (Cai vd. 2012), 0.06 pg.mL-1 seviyesinde epididimis spesifik

protein-4 ve 0.94 ng.mL−1 seviyesinde Dang virus zarf proteini (Cavalcanti vd. 2012)

tayinlerinin yapılabildiği immünosensör çalışmaları görülmüştür.

140

Aljinat-MBP immünosensör 1.95-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında doğrusallık

göstermiş, determinasyon katsayıları 0.9947 ve 0.9833 olarak bulunmuş, tayin limiti ise

1.95 ng.mL-1’dir. Aljinat-TiO2-MBP immünosensör 0.975-2500 ng.mL-1 konsantrasyon

aralığında doğrusallık göstermiş, determinasyon katsayıları 0.9908 ve 0.9878 olarak

bulunmuş, tayin limiti ise 0.975 ng.mL-1’dir. Literatürde 3.1x103 cfu.mL-1 seviyesinde

Shigella flexneri (Zhao vd. 2011), 0.23 µg.mL-1 seviyesinde süperoksit radikali (Wang

vd. 2012) ve 16.41x10-6 mg.mL-1 seviyesinde H2O2 tayini yapabilen aljinat bazlı

biyosensör çalışmaları vardır.

Jelatin/Aljinat-MBP immünosensör 3.90-2500 ng.mL-1 konsantrasyon aralığında

doğrusallık göstermiş, determinasyon katsayıları 0.9955 ve 0.9790 olarak bulunmuş,

tayin limiti ise 3.90 ng.mL-1’dir. Jelatin/Aljinat-TiO2-MBP immünosensör 1.95-2500

ng.mL-1 konsantrasyon aralığında doğrusallık göstermiş, determinasyon katsayıları

0.9675 ve 0.9606 olarak bulunmuş, tayin limiti ise 1.95 ng.mL-1’dir.

Tez çalışmasının son aşamasında en düşük tayin limitine sahip Kitosan-TiO2-MBP

immünosensör ile BOS ve serum çalışması yapılmıştır. Bu amaçla yapay BOS ve yapay

serum hazırlanarak kalibrasyon grafikleri çizilmiş ve immünosensörün kalibrasyon

grafikleriyle karşılaştırılmıştır. Yapılan BOS denemesi sonucunda kalibrasyon

denklemleri kullanılarak immünosensörün kalibrasyon grafiğinden 6,28 ng.mL-1, yapay

BOS kalibrasyon grafiğinden 6,99 ng.mL-1 Anti-MBP hesaplanmış ve bu değerlerin

birbirine oldukça yakın olduğu görülmüştür. Benzer şekilde serum denemesi sonucunda

immünosensörün kalibrasyon eşitliğinden 9,14 ng.mL-1, yapay serum kalibrasyon

grafiğinden ise 8,61 ng.mL-1 Anti-MBP hesaplanmıştır.

Sonuçlar toparlandığında her bir immünosensörün bazı avantaj ve dezavantajları olduğu

görülmüştür. Örneğin Jelatin-MBP immünosensöründe 20 µg.mL-1 MBP kullanılması

bu immünosensörü daha ekonomik hale getirirken 100 µg.mL-1 MBP gerektiren

Kitosan-MBP immünosensörü ise daha düşük tayin sahiptir. En kararlı film yapısı ise

aljinat immünosensörlerinde gözlenmiştir. Nanopartikül ilaveli immünosensörlerde ise

diğerlerine oranla daha az MBP kullanılmış, inkübasyon süreleri daha kısa, cevap

141

süreleri daha kısa ve tayin limitleri düşüktür fakat kararsız film yapıları dolayısıyla

immünosensör ömürlerinin kısa olması ise dezavantajlarıdır.

142

KAYNAKLAR

Akter, R., Rahman, M.A. and Rhee, C.K. 2012. Amplified Electrochemical Detection of a Cancer Biomarker by Enhanced Precipitation Using Horseradish Peroxidase Attached on Carbon Nanotubes, Anal Chem., 2012 Jul 13. [Epub ahead of print]

An, Y., Tang, L., Jiang, X., Chen, H., Yang, M., Jin, L., Zhang, S., Wang, C. and

Zhang, W. 2010. A photoelectrochemical immunosensor based on Au-doped TiO2 nanotube arrays for the detection of α-synuclein, Chemistry, Vol.16(48); pp.14439-46.

Andreescu, S. and Sadik, O.A. 2004. Trends and Challenges in Biochemical Sensors for

Clinical and Enviroment Monitoring., Pure Appl. Chem., Vol.76(4); pp. 861-878.

Arroyo, E.J. and Scherer, S.S. 2000. On the molecular architecture of myelinated fibers,

Histochem. Cell Biol., Vol.113; pp.1-18.

Balkenhohl, T. and Lisdat, F. 2007. Screen-printed electrodes as impedimetric immunosensors for the detection of anti-transglutaminase antibodies in human sera, Anal Chim Acta., Vol.597(1); pp. 50-7.

Bard, A.J. and Faulkner, L.R. 1980. Electrochemical Methods, Wiley, New York.

Bard, A.J. and Faulkner, L.R. 2001. Electrochemical methods, 2nd edition, John Wiley

and Sons, Inc., pp. 833, New York. Başoğlu, H. and Çetindamar, D. 2006. Uluslararası Rakabet Stratejileri: Türkiyede

Bitoyeknoloji işbirlikleri, TÜSİAD Rekabet işbirlikleri Dizisi 9, Haziran, Yayın No: TÜSİAD-T/2006/06-421.

Bao, S-J., Li, C-M., Zang, J-F., Cui, X-Q., Qiao, Y. and Guo, J. 2008. Adv. Funct.

Mater., Vol.18; pp. 591–599.

Baumann, N. and Pham-Dinh, D. 2001. Biology of Oligodendrocyte and Myelin in the Mammalian Central Nervous System. Physiol. Rev., Vol.81; pp. 871-927.

Berggren, C. and Johansson, G. 1997. Capacitance measurements of antibody-antigen

interactions in a flow system. Anal Chem. Vol.15;69(18); pp. 3651-7.

Berson, S.A., and Yalow, R.S., 1957. Studies with insulin-binding antibody, Diabetes. Vol. 6(5); pp.402-5.

143

Boitieux, J.L., Romette, J.L., Aubry, N. and Thomas, D. A. 1984. Computerised enzyme immunosensor: application for the determination of antigens. Clin Chim Acta., Vol.136(1); pp.19-28.

Bourigua, S., Hnaien, M., Bessueille, F., Lagarde, F., Dzyadevych, S., Maaref, A., Bausells, J., Errachid, A. and Jaffrezic R.N. 2010. Impedimetric immunosensor based on SWCNT-COOH modified gold microelectrodes for label-free detection of deep venous thrombosis biomarker. Biosens Bioelectron. Vol.26(4); pp.1278-82.

Bouvrette, P. and Luong, J.H. 1995. Development of a flow injection analysis (FIA) immunosensor for the detection of Escherichia coli. Int J Food Microbiol. Vol.27(2-3); pp.129-37.

Bright, F.V., Betts, T.A. and Litwiler, K.S. 1990. Regenerable fiber-optic-based immunosensor, Anal Chem., Vol.62(10); pp. 1065-9.

Bhavsara, K. Fairchild, A., Alonasa, E., Bishopa, D.K., La Bellea, J.T., Sweeneyb, J., Alford, T.L. and Joshi, L. 2009. A cytokine immunosensor for Multiple Sclerosis detection based upon label-free electrochemical impedance spectroscopy using electroplated printed circuit board electrodes, Biosensors and Bioelectronics, Vol.25; pp. 506–509.

Byfield, M.P. and Abuknesha, R.A. 1994. Biochemical aspects of biosensors. Biosens.

Bioelectron., Vol.9; pp. 373-399. Cai, Y., Li, H., Li, Y., Zhao, Y., Ma, H., Zhu, B., Xu, C., Wei, Q., Wu, D., and Du,

B. 2012. Electrochemical immunoassay for carcinoembryonic antigen based on signal amplification strategy of nanotubular mesoporous PdCu alloy, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 36; pp. 6–11.

Campanella, L., Attioli, R., Colapicchioni, C. and Tomassetti, M. 1999. New

Amperometric and Potentiometric Immunosensors for Anti-Human Immunoglobulin G Determinations., Sensors and Actuators B, Vol.55; pp. 23-32.

Cavalcanti, I.T., Silva, B.V.M., Peres, N.G., Moura, P., Sotomayor, M.D.P.T., Guedes,

M.I.F. and Dutra, R.F. 2012. A disposable chitosan-modified carbon fiber electrode for dengue virus envelope protein detection, Talanta, Vol. 91; pp. 41– 46

Chen, H., Tang, J., Su, B., Chen, G., Huang, J. and Tang, D. 2010. Nanogold-actuated

biomimetic peroxidase for sensitized electrochemical immunoassay of carcinoembryonic antigen in human serum. Anal Chim Acta., Vol.678(2): pp.169-75.

144

Chen J., Tang, J., Yan, F. and Ju, H. 2006. A gold nanoparticles/sol–gel composite architecture for encapsulation of immunoconjugate for reagentless electrochemical immunoassay, Biomaterials, Vol. 27. pp. 2313–2321.

Chen, W., Lu, Z. and Li, C.M. 2008. Sensitive human interleukin-5 impedimetric sensor based on polypyrrole-pyrrolepropylic acid-gold nanocomposite, Anal Chem., Vol.80(22); pp.8485-92.

Darain, F., Park, S.U. and Shim, Y.B. 2003. Disposable amperometric immunosensor system for rabbit IgG using a conducting polymer modified screen-printed electrode. Biosens Bioelectron., Vol.18(5-6): pp. 773-80.

Deng, T., Wang, H., Li, J-S., Hu, S-Q., Shen, G-L. and Yu, R-Q. 2004. A novel

immunosensor based on self-assambled chitosan/alginate multilayers fort he detection of factor B, Sensors and actuators B, Vol.99; pp. 123-129.

Deng, Z., Rui, Q., Yin, X., Liu, H. and Tian, Y., 2008. Anal. Chem. 80: pp. 5839–5846. Díaz-González, M., González-García, M.B. and Costa-García, 2005. A. Immunosensor

for Mycobacterium tuberculosis on screen-printed carbon electrodes. Biosens Bioelectron., Vol. 20(10); pp.2035-43.

Emregül, E. 2005. Development of a new biosensor for superoxide radicals. Anal.

Bioanal. Chem., Vol.383; pp.947-954. Fisher, A.C. 1996. Electrode Dynamics, Oxford Sci. Publ., Oxford, UK. Fu, Y., Yuan, R., Tang, D., Chai, Y. and Xu, L. 2005. Study of Anti IgG on Au-

Colloidal Modified Gold Electrode Via Potentiometric Immunosensor, Cyclic Voltametry, And Electrochemical Impedanse Techniques., Colloids And Surface B: Biointerface, Vol.40; pp. 61-66.

Gonchar, V.M., Maidan, M.M., Moroz, O.M., Woodward, J.R. and Sibirny, A.A. 1998,

Microbial O2- and H2O2-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 13; pp. 945–952.

Gorenek, G.,Akyilmaz, E. and Dinçkaya, E. 2004. Immobilization of catalase by

entrapping in alginate beads and catalase biosensor preparation for the determination of hydrogen peroxide decomposition; Vol.32(3); pp. 453-61.

Haga, M., Itagaki, H., Sugawara, S. and Okano, T. 1980. Liposome immunosensor for

theophylline, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 95(1); pp.187–192.

Hou, M. Y. 2005. Eleboration Et Caracterisation de Biofilms Pour Micro et Nanobiocapteurs Olfactıfs, cegely.ec lyon.fr/IMG/pdf/These_Yanxia_Hou_

2005.pdf

145

Hua, Y., Feng, Y., Zong, D. and Huangxian, J. 2004. A disposable amperometric immunosensor for a-1-fetoprotein based on enzyme-labeled antibody/chitosan-membrane-modified screen-printed carbon electrode, Analytical Biochemistry, Vol. 331; pp. 98–105.

Idiman, E. 2004. Multipl Skleroz'un İmmunopatogenezi.Turkiye Klinikleri Noroloji

Dergisi, 2; pp. 171-176. Ivnitski, D. and Rishpon, J. 1996. A one-step, separation-free amperometric enzyme

immunosensor. Biosens. Bioelectron., Vol.11(4); pp. 409-417. Jie, G., Huang, H., Sun, X. and Zhu J-J. 2008. Electrochemiluminescence of CdSe

quantum dots for immunosensing of human prealbumin, Biosensors and Bioelectronics, Vol.23; pp. 1896–1899.

Josephs, H.J. 1971. The Heaviside Papers found at Paignton in 1957. Electromagnetic

Theory by Oliver Heaviside, Chelsea Publishing Co, New York Kalab, T. and Skladal, P. 1997. Disposable multichannel immunosensors for 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid using acetylcholinesterase as an enzyme label. Electroanalysis, Vol. 9(4); pp. 293-297.

Khan, R. and Dhayal M. 2009. Chitosan/polyaniline hybrid conducting biopolymer base

impedimetric immunosnesor to detect ochratoxin-A, Biosensors and Bioelectronics, Vol.24; pp. 1700-1705.

Kılıçturgay, K. 2003. İmmünoloji. Yenileştirilmiş 3.Basım, Nobel&Güneş Kitapevi,

pp.71-73. Kitade, T., Kitamura, K. and Konishi, T. 2004. Potentiometric Immunosensors Using

Artificial Antibody Based on Molecularly Imprinted Polymers., Anal. Chem., Vol.76; pp.6802-6807.

Kong, F-Y., Xu, M-T., Xu, J-J., and Chen, H-Y., 2011. A novel lable-free

electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on gold nanoparticles–thionine–reduced graphene oxide nanocomposite film modified glassy carbon electrode, Talanta, Vol. 85; pp.2620– 2625.

Kumar R., Majeti N. V. 2000. A review of chitin and chitosan applications, Reactive &

Functional Polymers,Vol. 46; pp.1-27.

Kurtzke, J.F. 2002. A reassessment of the distribution of multiple sclerosis. Parts I and II. Acta Neurol Scand 1975; 51:110-157.(abstract) Lassmann H, Mechanisms of demyelination and tissue destruction in multiple sclerosis, Clin Neurol Neurosurg, Vol.104; pp.168-71.

Kramer, E.M., Schardt, A. and Nave, K.A. 2001. Membrane traffic in myelinating

oligodendrocytes, Microsc. Res. Tech., Vol.52; pp. 656-671.

146

Laczka, O., Munoz, F.J.D.C., Xavier, F. 2007. Pathojen Detection: A Perspective of Traditional Methods and Biosensors, Biosensors and Bioelectronics, Vol.22; pp. 1205-1217.

Lamers, K.J.B., Vos, P., Verbeek, M.M., Rosmalen, F., van Geel, W.J.A. and van

Engelen, B.G.M. 2003. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients, Brain Research Bulletin, Vol.61; pp. 261-264.

Li, N., Xue M-H., Yao, H., and Zhu, J-J., 2005. Reagentless biosensor for phenolic

compounds based on tyrosinase entrapped within gelatine film, Anal Bioanal Chem Vol. 383; pp. 1127–1132.

Li, R., Wu, D., Li, H., Xu, C., Wang, H., Zhao, Y., Cai, Y., Wei, Q. and Du, B.

2011. Label-free amperometric immunosensor for the detection of human serum chorionic gonadotropin based on nanoporous gold and graphene, Analytical Biochemistry, Vol.414; pp. 196–201.

Li, Y-W., Xia, K., and Wang, R-Z., 2008. An impedance immunosensor for the

detection of the phytohormone abscisic acid, Anal Bioanal Chem, Vol. 391; pp. 2869–2874.

Liu, K., Zhang, J-J., Wang, C. and Zhu, J-J., 2011. Graphene-assisted dual

amplification strategy for the fabrication of sensitive amperometric immunosensor, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 26 pp. 3627–3632.

Liu, H., Tian, Y. and Xia, P., 2008. Langmuir, 24(12): pp. 6359-6366. Luo, X., Morrin, A., Killard, A.J. and Smyth, M.R. 2006. Electroanalysis, Vol.18(4);

pp. 319 – 326.

Luo, X-L., Xu, J-J., Zhang, Q., Yang, G-J., and Chen, H-Y., 2005. Electrochemically deposited chitosan hydrogel for horseradish peroxidase immobilization through gold nanoparticles self-assembly, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 2; pp.190–196.

Luppa, P. B., Sokoll, L. J. and Chan, D. W. 2001. Immunosensors-Principles and

Applications to Clinical Chemistry, Clinica Chimica Acta, Vol.314; pp.1-26.

Macdonald, J.R. 1987. Impedance Spectroscopy, Wiley, New York. Martin, E.J. 2001. Composite Films for Modifying Evanescent Wave Characteristics in

Long-Period Grating, Master's Thesis, http://scholar.lib.vt.edu/theses/ available/etd-02172001 014116/unrestricted/JEMartinETD.pdf

147

Marty, J-L., Leca, B. and Noguer, T. 1998. Biosensors for the Detection of Pesticides., Analusis Magazine, 26, N°6.

Marx, K.A. 2003. Quartz Crystal Microbalance: A Useful Tool for Studying Thin

Polymer Films and Complex Biomolecular Systems at the Solution-Surface Interface, Biomacromolecules, Vol. 4,(5); pp. 2003.

Messina, G.A., Panini, N.V., Martinez, N.A. and Raba, J. 2008. Microfluidic

immunosensor design for the quantification of interleukin-6 in human serum samples, Anal Biochem., Vol.380(2); pp.262-7.

Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. A., and Israelachvili,

J. 2009. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol(106): pp. 3154–3159.

Mirhabibollahi, B., Brooks, J.L. and Kroll, R.G. 1990. Development and performance of an enzyme-linked amperometric immunosensor for the detection of Staphylococcus aureus in foods, J. Appl. Bacteriol., Vol.68(6); pp.577-85.

Muratsugu, M., Ohta, F., Miya, Y., Hosokawa, T., Kurosawa, S., Kamo, N., Ikeda, H. 1993. Quartz crystal microbalance for the detection of microgram quantities of human serum albumin: relationship between the frequency change and the mass of protein adsorbed, Anal Chem., Vol.65(20); pp.2933-7.

Noseworthy, J.H., Lucchinetti, C., Rodriguez, M. and Weinshenker, B.G. 2003. Multiple sclerosis. N Eng J Med., Vol.343; pp.938-52.

Offenbacber, H., Fazekas, F. and Scbmidt, R. 1993. Assesment of MRl criteria for

diagnosis of MS.Neurology Vol.43; pp. 2625-2631. Ordonez S.S. and Fabregas, E., 2007. New antibodies immobilization system into a

graphite–polysulfone membrane for amperometric immunosensors, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22: pp.965–972.

Parkinson, G. and Pejcic, B. 2005. Using Biosensors Detect Emerging Infectious

Diseases. Nanochemistry Research Institute, Curtin University of Technology Perth, Western Australia, Prepared for the Australian Biosecurity Cooperative Research Centre, Final Report.

Paty, D.W., Oger, J.J. and Kastrukoff, L.F. 1988. MRI in tbe diagnosis of MS:A

prospective study with comparison of clinical evaluation, evoked potentials oligoclonal banding and CT. Neurology, Vol.38; pp.180-5.

Parry, R.P., Love, C. and Robinson, G.A. 1990. Detection of rubella antibody using an optical immunosensor, J. Virol. Methods., Vol.27(1); pp. 39-48.

148

Poser, C.M., Paty, P.W. and Scheinberg, L. 1983. New diagnostic criteria for multiple sclerosis: Guidelines for research protocols. Ann Neurol, Vol.13; pp. 227-31.

Pei, R., Cheng, Z., Wang, E., and Yang, X., 2001. Amplification of antigen–antibody

interactions based on biotin labeled protein–streptavidin network complex using impedance spectroscopy, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 16; pp. 355–361.

Rishpon, J. and Rosen, I. 1989. The development of an immunosensor for the electrochemical determination of the isoenzyme LDH5, Biosensors., Vol.4(2); pp.61-74.

Schumacher, G.A., Beebe, G. and Kubler, R.F. 1965. Problems of experimental trials of therapy in multiple selerosis:Report by the panel on the evaluation of experimental trials of therapy in multiple selerosis. Annals of New York Academy of Science, Vol.122; pp. 522-68.

Seung-Wook, K. 2004. Development of Enzye Immobilization Technique, Laboratuary

of Bioprosecess Engineering, Departmen of Chemical and Biological Engineering, Korea University. cheric.org/ippage/e/ipdata/2004/02/file/ e200402-1001.pdf

Sharma, M.K., Rao, V.K., Agarwal, G.S., Rai, G.P., Gopalan, N., Prakash, S., Sharma,

S.K. and Vijayaraghavan, R. 2008. Highly sensitive amperometric immunosensor for detection of Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 in serum of humans with malaria: comparison with a commercial kit, J. Clin. Microbiol., Vol.46(11); pp.3759-65.

Shi, Y-T., Yuan, R., Chai, Y-Q. and He, X-L. 2007. Development of an amperometric immunosensor based on TiO2 nanoparticles and gold nanoparticles, Electrochimica Acta, Vol.52; pp.3518-3524.

Singh, K., Rahman, M.A., Son, J.I., Kim, K.C. and Shim, Y.B. 2008. An amperometric immunosensor for osteoproteogerin based on gold nanoparticles deposited conducting polymer. Biosens Bioelectron., Vol.23(11); pp.1595-601.

Stefan, R-I., Van Staden, J.F. and Aboul-Enein, H.Y. 2000. Immunosensors In Clinical

Analysis , Fresenius J. Anal Chem., Vol.366; pp.659-668. Sungur, S., Emregül, E., Günendi, G. and Numanoğlu, Y. 2004. J Biomater. Appl.

Vol.18(4); pp.265. Susmel, S., O'Sullivan, C.K. and Guilbault, G.G. 2000. Human cytomegalovirus

detection by a quartz crystal microbalance immunosensor, Enzyme Microb Technol. Vol.127(9); pp.639-645.

149

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y., Dai, J., Zang, X. and Liu, Y. 2004. A novel immunosensor based on immobilization of hepatitis B surface antibody on platinium electrode modified colloidal gold and polyvinyl butyral as matrices via electrochemical impedance spectroscopy, Biolectrochemistry, Vol.65; pp. 15-22.

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y., Zhang L., Zhong, X., Dia, J. and Liu, Y. 2004b. Novel Potentiometry Immunoassay with Amplified Sensitivity for Diphtheria Antigen Based on Nafion, Colloidal Ag And Polyvinyl Butyral as Matrixes., J. Biochem. Biophys. Methods, Vol.61; pp.299-311.

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y., Zhong, X., Liu, Y. and Dia, J. 2004c. Novel

Potentiometric Immunosensors for the Detection of Diphtheria Antigen Based on Colloidal Gold and Polyvinyl Butyral as Matrixes., Biochemical Engineering Journal, Vol.22; pp. 43-49.

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y., Fu, Y., Dai, J., Liu, Y. and Zhong, X. 2005a. New

Amperometric and Potentiometric Immunosensors Based on Gold Nanoparticles/Tris (2,2'-bipyridyl)cobalt (III) Multilayer Films for Hepatitis B Surface Antigen Determination., Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21; pp. 539-548.

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y., Zhang L., Dia, J., Liu, Y. and Zhong, X. 2005b.

Potentiometric Immunosensors Based on Immobilization of Hepatitis B Surface Antibody on Platinum Electrode Modified Silver Colloids and Polyvinyl Butyral As Matrixes, Electroanalysis.

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y., Zhang L., Zhong, X., Liu, Y. and Dia, J. 2005c.

Preparation and Application on Kind of Immobilization Methods of Anti- Diphtheria for Potentiometric Immunosensors Modified Colloidal Au and Polyvinyl Butyral as Matrixes., Sensors and Actuators B, Vol.104; pp.199-206.

Tang, D., Yuan, R., Chai, Y. and Fu, Y. 2005d. Study on Electrochemical Behavior of

Diphtheria Immunosensor Based on Silica/Silver/Gold Nanoparticles and Polyvinyl Butyral as Matrixes., Elecrochemistry Communications, Vol.7; pp.177-182.

Tang, H., Chen, J., Nie, L., Kuang, Y., and Yao, S., 2007. A label-free electrochemical

immunoassay for carcinoembryonic antigen (CEA) based on gold nanoparticles (AuNPs) and nonconductive polymer film, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22 pp.1061–1067.

Telefoncu, A. 1999. Enzimoloji, Ege Üniversitesi, İzmir, Bölüm 9, İmmobilize

Enzimler, pp.193-243.

150

Thevenot, D., Toth, K., Durst, R. A. and Wilson, S. 1999. Electrochemical Biosensors: Recommended Definitions and Classification (Technical Report), Pure Appl. Chem., Vol.71 (12); pp. 2333-2348.

Tischeri, W. and Wedekind, F., 1999. Immobilized Enzymes: Methods and

Applications, Topics in Current Chemistry,Vol. 200; pp. 96-123.

Tsekenis, G., Garifallou, G-Z., Davis, F. Millner, P.A., Gibson, T.D. and Higson, S.P.J. 2008. Label-less Immunosensor Assay for Myelin Basic Protein Based upon an ac Impedance Protocol, Anal. Chem., Vol.80; pp. 2058-2062.

Tunalı, G. 2004. Multıpl skleroz’da tanı kriterleri. Turkiye Klinikleri Noroloji Dergisi,

Vol.2; pp.205-209. Turan, A.A., Üstündag, Z., Solak, A.O., Kılıç, E. and Avseven, A. 2008.

Characterization of a 2-Benzo[c]cinnoline Modified Glassy Carbon Electrode by Raman Spectroscopy, Electrochemical Impedance Spectroscopy and Ellipsometry. Electroanalysis, Vol.20; pp. 1665-1670.

Urban, G. 2000. Biosensors Microsystems, Sensors Update, Vol.8(1); pp.189-214. Victor, M., Ropper, H. A. 2001. Adams and Victor’s Principles of Neurology. 7th

Edition, Mc Graw-Hill, New York. 954-979. Vo-Dihn, T. and Cullum B. 2000. Biosensors and Biochips: Advences in Biologial and

Medical Diagnostic, Fresenius J. Anal Chem., Vol.366; pp.540-551. Wang, H-E. 2011. Journal of Power Sources, Vol.196; pp. 6394–6399.

Wang, Y., Chen, T., Mu, Q. 2011. J. Mater. Chem., Vol.21; pp. 6006-6013.

Wang, G.L., Xu, J-J., Chen, H-Y. and Fu, S-Z. 2009. Label-Free photoelectrochemical immunoassay for α−fetoprotein detection based on TiO2/CdS hybrid, Biosensors and Bioelectronics, Vol.25; pp.791-796.

Wang, X., Han, M., Bao, J., Tu, W. and Dai, Z., 2012. A superoxide anion biosensor based on direct electron transfer of superoxide dismutase on sodium alginate sol–gel film and its application to monitoring of living cells, Analytica Chimica Acta, Vol. 717; pp.61– 66.

Wu, C-C., Lin, C-H. and Wang, W.S. 2009. Development of an enroflaxacin

immunosensor based on label-free electrochemical impedance spectroscopy, Talanta, Vol.79; pp. 62-67.

Yang, H., Yuan, R., Chai, Y. and Zhuo, Y. 2011. Electrochemically deposited nanocomposite of chitosan and carbon nanotubes for detection of human chorionic gonadotrophin, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Vol.82; pp. 463-469.

151

Yu, H., Yan, F., Dai, Z., and Ju,H., 2004. A disposable amperometric immunosensor for α-1-fetoprotein based on enzyme-labeled antibody/chitosan-membrane-modified screen-printed carbon electrode, Analytical Biochemistry, Vol. 331; pp.98–105.

Yuan, R, Tang, D, Chai, Y., Zhong, X., Liu, Y. and Dai, J. 2004a. Ultrasensitive

Potentiometric Immunosensor Based on SA and OCA Tecniques for Immobilization of HBsAb with Colloidal Au and Polyvinyl Butyral as Matrixes., Langmuir, Vol.20; pp.7240-7245.

Zhou, L.,Yuan, R. and Chai, Y. 2007. On-Off PVC Membrane Based Potentiometric

Immunosensor for Label-Free Detection of Alpha-Fetoprotein., Electroanalysis, Vol.19; pp. 1131-1138.

Zhao, G., Zhan, X., and Dou, W., A disposable immunosensor for Shigella flexneri

based on multiwalled carbon nanotube/sodium alginate composite electrode, 2011. Analytical Biochemistry 408; pp. 53–58

Zhang, L., Liu, Y., and Chen, T., 2008. A mediatorless and label-free amperometric

immunosensor for detection of h-IgG, International Journal of Biological Macromolecules, Vol. 43; pp.165–169.

152

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Burak DERKUŞ Doğum Yeri : Mersin Doğum Tarihi : 15.07.1987 Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu

Lise : Mersin Gazi Lisesi (2005)

Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü (2010)

Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Müh. (2011)

Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı

(Eylül 2010-Kasım 2012)

Bilimsel Çalışmalar

Yayınlar

Emel Emregul, Ozge Kocabay, Burak Derkus, Tugrul Yumak, Kaan Cebesoy Emregul, Ali Sınag, Kamran Polat, A novel carboxymethylcellulose-gelatin-titanium dioxide–superoxide dismutase biosensor; electrochemical properties of carboxymethy lcellulose-gelatin-titanium dioxide–superoxide dismutase. Bioelectrochemistry, Vol.90; pp. 8-17. Bildiriler

1. Electrochemical properties of carboxymethylcellulose-gelatin-SOD biosensor (10th International Symposium on Pharmaceutical Sciences-Poster Sunumu)

2. The electrochemical properties of carboxymethylcellulose-gelatin-TiO2-SOD biosensor

3. Highly sensitive superoxide radical biosensor based on the effective immobilization of superoxide dismutase in carboxymethylcellulose-gelatin-TiO2

4. A novel impedimetric Protein A-TiO2 immunosensor for the detection of IgG (8th Nanotechnology and Nanoscience Congress; Nanomed 2012-Poster Sunumu)

ANKARA ÜNİVERSİTESİacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25049/burakderkus.pdf · EMREGÜL’e (Ankara...

Documents

Transcript of ANKARA ÜNİVERSİTESİacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25049/burakderkus.pdf · EMREGÜL’e (Ankara...