Analyse d'extraits complexes de plantes par TLC et HPLC ...
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Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311
Analyse d'extraits complexes de plantes par TLC et HPLC comment détecter les différentes
familles de molécules naturelles
Emilie Destandau
ICOA, UMR 7311, Université d’Orléans
3éme Journée Thématique du CCOA
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311
Métabolisme primaireIndispensable à la survie de la plante
Métabolisme végétal
Molécules majoritaires
Source d’énergieConstitutifs des parois cellulairesNécessaires à la croissance de la plante
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
Sucres
Saccharose
Valine
Triglycérides
Acides Gras
Acides Aminés
2
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Métabolisme Secondaire ou SpécialiséNe participe pas directement au développement
de la plante
Métabolisme végétal
Molécules minoritaires
Molécules de défense face à un stress
d’attraction pour la pollinisation
Terpènes (odeur)
Polyphenols (couleur)
Alcaloides (goût)
a-pinene
piperine
cyanidine
3
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Asiaticosidea-amyrin
b-carotène
Limonène
Caféine
Capsaïcine
Catéchine
Gallotannin
Anthraquinones
Acide gallique
Rutine
Chlorophylle
Métabolisme végétal Des centaines de molecules !
Propriétés physicochimiquesPolarité
SolubilitéVolatilité
Propriétés optiques
Concentrations
glucose
Cafestol
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De la plante aux moléculesExtraction
5
Sélection des molécules
Technique d’extraction
MacérationExtraction assistée par micro-ondesExtraction assistée par ultra sonExtraction par fluide supecritiqueDistillation ….
Solvant d’extraction
EauEthanolAcétate d’EthylHeptane …..
Guide le choix de la méthode d’analyse et des modes de détection
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La chromatographie sur Couche Mince Méthode générique permettant d’analyser tout type de molecule sans traitement d’échantillon
Séparation des composés
Détection des composés
Dépôt de l’échantillon
Spots Bands
Verticale Horizontal IsocratiqueGradient
Visible-UVRévélationScanner
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Multi-détection pour s’assurer de voir tous les composés plaque de silice F254s : indicateur fluorescent
UV 254 nm
UV 366 nm
visible
Absorption des
composés dans
l’UV
Fluorescence des
composés excités à
366 nm
Détection directe
Absorption des
composés dans le
visible
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Dispositif d’immersion automatique
Procédures de dérivation spécifiques ou génériques en fonction des analytes recherchés
Derivatizer
Appareillages de dérivation
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Ninhydrine pour la dérivation des acides aminés et peptides
O
O
OH
OH
H
R
NH2
COOH
OH
N
O O
O
+
lmax=570 nm
e=20000
Détection indirecte
l = 570 nm
Révélation ninhydrine
Acides Aminés
Révélation naphtol + H2SO4
Sucres
Plaque Si60 Eluant ACN/H2OE. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
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Kaem-rut
Que-glc
ac. gal
eCat-gal
bois de taille
jeunes pousses
boutons précoces
boutons avant éclosion
fleurs
Neu (diphenylboric acid 2 amino ethyl ester) puis PEG (polyethylene glycol)
Polyphenols
fleurs
Couleur de fluorescence depend de la structure de la molécule
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ac. galeCat-
gal
O-GlcQue-glc
O-Rut
Kaem-rut
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composés lipidiques non polaires
Beta sitosterol
alpha tocophérol
acide linoléique
tripalmitinesqualène
stigmasterol
bth bté Bae1 Bae2 Fl1 Fl2 Feu1 Feu2 fruits
366 nm primuline
Visible liberman
α hédérine
stigmastérol
acide
linoléiquefarnésol
eugénol
lupéol
bt jp bp bae fl
stigmastérol
Acide linoléique
tocopherol
Vanilline sulfurique
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N+
O-
O
N+
O-
O
N+
O-
O
N N
N+
O-
O
N+
O-
O
N+
O-
O
NH NAH+ + A.
Détection d’activitéActivité antioxydante : DPPH radical stable
violet jaune
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lampe à halogène ou à tungstènepour le visible (400 à 800 nm) lampe à deutérium pour le domaine UV (200 à 400 nm).
Analyse quantitative
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Couplage HPTLC-API-MS
Désorption par un solvant adaptéSpot dirigé vers API (ESI, APCI)Ionisation des composésAcquisition du spectre de masse
Spot désorbé
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m/z 449 [M]+ cn-3-gal
m/z 419[M]+ cn-3-ara
m/z 595 [M]+ cn-3-rut
Identification moléculairem/z 287 [A+]
m/z 287 [A+]
m/z 287 [A+]
Food Chemistry 146 (2014) 104–112
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Echantillon
Matrice
Support
+
+
-
-
-
Laser
Désorption Désolvatation
H+
Transfert de proton
plaque aluminium dimension 5*7 cm
Couplage HPTLC-MS type MALDI
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Analyse TLC-MALDI
Dépôts faits en double : Plaque de référence révélation des spotsPlaque Maldi avec dépôt de matrice
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3
5
1
2
4
6
7
89
10
11
12
Quercetin+ Pentose
Kaempferolglucuronide
Kaempferol+ glucoseQuercetin +
pentose
KaempferolGalloide+hexose
Kaempferol+ pentose
593
599
461433
433
447
447
431
417
Kaempferol+ rhamnose
Quercetin+ rhamnose
Kaempferolrutinoside
18 flavonols caractérisés
285
285
285
285
301
301
301
Analyse TLC-MALDI de polyphenols
Phytochemical Analysis. (2018);1–8
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La chromatographie en phase liquide
Chaine HPLC-UHPLC
Détecteur à barrette de diode DAD
Détecteur réfractomètre
Détecteur fluorimétrique
Détecteur électrochimique
Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière DEDL
Détecteur Corona
Détecteur spectrométrie de masse
Tous les composés (universel)Certains composés (spécifique)Sensibilité
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Détecteur UV-vis à barrette de diodes(diode-array detector DAD)
Le chromatogramme 3DDifférents chromatogrammes observés à différentes λ
Spectre complet à chaque tR
Temps d’analyse
λ Heat map
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A = e l C
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Détecteur DAD
l = 280 nm
l = 520 nm
Différentes longueurs d’onde sélectionnées
pour observer les différents composés
Identification des
composés par les
spectres d’absorption
1
3
5
Separation and Purification Technology 100 (2012) 51–58
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Extrait Flos primulae veris
E. de Rijke et al. / J. Chromatogr. A (2006)
RPLC–UV216 nm RPLC–FLU (ex, 330 nm; em, 440 nm)
Détecteur fluorimétrique
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Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311 D. Zielińska et al., Analytica Chimica Acta (2008)
Extrait d’oignon
Détecteur Electrochimique500 mV
950 mV
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Détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL)
Chambre de nébulisation: Séparation des gouttelettes (selon taille)
Tube d’évaporation
Nebuliseur
Sourcelumineuse
Lumière diffusée
Gaz auxilliaire(N2)
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Molécules non volatiles
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-250000
250000
750000
1250000
1750000
2250000
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Time (minutes)
Inte
nsity (
uA
)DEDL
sucr
es
terp
ène
s
-10000
40000
90000
140000
190000
240000
290000
340000
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Time (minutes)
Inte
nsity (
uA
)
UV 280 nm
ph
éno
liqu
es
RPLC- Pursuit varian XR-C18, Phase mobile gradient Eau/MeOH
Molécules non volatiles
Information sur la quantité
Détection basée sur le coefficient
d’extinction molaire A = elC
Complémentarité des détecteurs en HPLC
25
Nécessité d’associer les informations des 2 détecteurs
Industrial Crops and Products 49 (2013) 794– 804 )E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
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Source d’ion
Volatilisation et IonisationESI, APCI, APPI…
Collecteur d’ion
Comptage des ions
Acquisition
Echantillon
Analyseur
Séparation des ionsQuad, Trap, Tof…
Méthode de Séparation
Spectre de masse
Couplage LC-MS
m/z
Ab
on
dan
ce r
ela
tive
%
Ion moléculaireIons
fragments
Adduits
Quelle source ? Polarité, taille Quel analyseur ? Précision, résolution, sensibilitéQuel mode d’ionisation ? positif, négatif Quel mode ? full scan, SIM, MS/MS, MRM
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-Q1: 13.856 to 14.047 min from Sample 1 (neg ESI) of Mel Stds 100ppm.wiff (T... Max. 6.9e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z, amu
1.0e6
2.0e6
3.0e6
4.0e6
5.0e6
6.0e6
6.9e6
Inte
ns
ity
, c
ps
609.0
300.5
271.0 645.5
Rutine M = 610 u
ESI-[M-H]-
[M-162-146-H]-
-Q1: 13.916 to 14.108 min from Sample 4 (neg APCI) of Mel Stds 100ppm.wiff (... Max. 4.9e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z, amu
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
3.0e6
3.5e6
4.0e6
4.5e6
4.9e6
Inte
ns
ity
, c
ps
300.5
609.5
271.5
255.0
151.0 243.0 343.0283.5
APCI- [M-H]-[M-162-146-H]-
Fragments de génine RDA
+Q1: 13.916 to 14.108 min from Sample 3 (pos APCI) of Mel Stds 100ppm.wiff (... Max. 6.9e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z, amu
1.0e6
2.0e6
3.0e6
4.0e6
5.0e6
6.0e6
6.9e6
Inte
ns
ity
, c
ps
303.0
611.5465.5
633.5449.0147.5 345.0285.5257.0229.5
APCI+
[M+H]+
[M-162+H]+
[M-146+H]+
[M+N
a] +
[M-162-146+H]+
301 162
146
Analyse LC-MS ESI vs APCI mode + vs -
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
+Q1: 13.856 to 14.047 min from Sample 2 (pos ESI) of Mel Stds 100ppm.wiff (T... Max. 4.4e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650m/z, amu
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
3.0e6
3.5e6
4.0e6
4.4e6
Inte
ns
ity
, c
ps
611.5
303.5
633.5
465.5
630.5449.5301.5 341.5
ESI+[M+H]+
[M+N
a] +
[M-162+H]+
[M-146+H]+
[M-162-146+H]+
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311
Recherche sélective de composés dérivésRecherche de dérivés de quercétine dans un extrait de pommes en ESI-
XIC of -Q1: 301.0 amu from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (Turb... Max. 2.9e6 cps.
10 12 14 16 18 20Time, min
0.0
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
2.9e6
Inte
ns
ity
, c
ps
Que
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
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Recherche sélective de composés dérivésRecherche de dérivés de quercétine dans un extrait de pommes en ESI-
XIC of -Q1: 301.0 amu from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (Turb... Max. 2.9e6 cps.
10 12 14 16 18 20Time, min
0.0
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
2.9e6
Inte
ns
ity
, c
ps
Que
-Q1: 15.469 to 15.651 min from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (T... Max. 5.4e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450m/z, amu
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
3.0e6
3.5e6
4.0e6
4.5e6
5.0e6
5.4e6
Inte
ns
ity
, c
ps
447.5
300.5
433.5271.5255.0
-146 u
Rhamnose
-Q1: 13.856 to 14.078 min from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (T... Max. 4.7e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z, amu
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
3.0e6
3.5e6
4.0e6
4.5e6
Inte
ns
ity
, c
ps
463.5
300.5
609.5
531.5441.5271.0 485.5 577.5395.5255.0
Rut
-146 u -162 u
Rhamnose Glucose
-Q1: 14.390 to 14.562 min from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (T... Max. 2.7e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z, amu
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
2.7e6In
ten
sit
y,
cp
s
433.5
300.5
271.5 501.5
-132 u
Xylose
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
-Q1: 15.227 to 15.409 min from Sample 1 (neg ESI) of Golden 50000ppm.wiff (T... Max. 4.7e6 cps.
150 200 250 300 350 400 450m/z, amu
5.0e5
1.0e6
1.5e6
2.0e6
2.5e6
3.0e6
3.5e6
4.0e6
4.5e6
Inte
ns
ity
, c
ps
433.5
300.5
271.5447.5255.0 385.0
-132 u
Xylose
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311 30
RT: 0.00 - 18.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
1007.28
0.53 7.354.53 10.446.91
15.321.73 16.428.16 8.932.13 10.52 14.260.68 4.78 11.894.23 6.163.53 12.59 17.35
10.44
10.32
8.4911.89
4.773.38 6.99 9.497.50 10.845.94 12.070.48
9.54
2.498.87
7.746.46 10.610.52 13.311.22 11.34
7.28
4.53 6.9115.320.49
1.73 16.428.16 8.932.1314.260.68 4.78 9.454.23 6.163.53 10.78 17.3513.3010.98
0.53 7.35
10.52
12.593.23 13.70 14.2212.22 16.395.272.20 10.055.93
NL: 6.51E1
TIC MS MO_190403211207
NL: 3.40E1
TIC F: - c ESI SRM ms2 679.278 [455.150-455.152, 517.207-517.209, 526.985-526.987] MS MO_190403211207
NL: 1.40E1
TIC F: - c ESI SRM ms2 817.443 [611.596-611.598, 637.243-637.245, 655.279-655.281] MS MO_190403211207
NL: 6.51E1
TIC F: - c ESI SRM ms2 969.157 [924.985-924.987, 932.801-932.803, 951.070-951.072] MS MO_190403211207
NL: 4.24E1
TIC F: - c ESI SRM ms2 979.187 [888.989-888.991] MS MO_190403211207
RT: 0.00 - 18.01
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
1009.04
8.439.58
9.998.28 10.384.753.00 5.25 11.767.31 13.610.78 14.18 15.351.28 16.50
9.69
9.04
4.75
5.25 8.497.763.64 5.47 9.97 11.91 13.193.47 14.370.85 16.38
9.04
8.439.58
9.998.28 10.38 11.767.31 13.61 14.18 15.35 16.506.043.990.52 5.36
3.00 3.05
0.78 0.89 4.751.28 3.61 4.86 9.185.58 6.60 17.9014.379.32 11.15 13.38 16.12
0.53
8.592.88 3.78 7.794.851.65
NL: 2.34E5
TIC MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7
NL: 3.01E3
TIC F: - c ESI SRM ms2 679.278 [455.150-455.152, 517.207-517.209, 526.985-526.987] MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7
NL: 2.34E5
TIC F: - c ESI SRM ms2 817.443 [611.596-611.598, 637.243-637.245, 655.279-655.281] MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7
NL: 6.13E2
TIC F: - c ESI SRM ms2 969.157 [924.985-924.987, 932.801-932.803, 951.070-951.072] MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7
NL: 3.13E1
TIC F: - c ESI SRM ms2 979.187 [888.989-888.991] MS Vin-blanc-boise-copeaux-6mgmL_J+7
MRM 679→455
MRM 817→611
MRM 969→924
Recherche sélective de composés dérivés
Analyse quantitative
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
Full scan
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311
Identification des composés UHPLC-HRMS
447.09447
227.03513
255.03027
284.03303
447.09323
0
1000
2000
3000
4000
5000
Intens.
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
200 250 300 350 400 450 m/z
447.09447
227.03513
255.03027
284.03303
447.09323
0
1000
2000
3000
4000
5000
Intens.
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
200 250 300 350 400 450 m/z
C21H19O11
Kaempférol glycoside ?Cohérent avec HPTLC et HPLC
447,09447
1ère analyseLC/MS – full scan
DataAnalysis
Chemspider212 propositions
2ème analyse LC-MS/MS
Ions fragments
-162 (hexose)
Ion précurseur
Proposition d’identification
structurale
31
Maxis Q-Tof
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311
Fleur extrait EtOH/H2OUHPLC-ESI mode négatif
Tanins hydrolysables
Eléments de base
Tanins condensés Flavonoïdes
flavonols
Eléments de base
Identification des composés UHPLC-HRMS
Environ 60 composes phénoliques
• Interprétation des spectres • Comparaison avec des bases de données• Injection de standards
Phytochemistry 99 (2014) 127–134
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311Phytochemical Analysis (2015), (2017)
Time (min)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
6x10
Intens.
0 5 10 15 20 25 30
Fleurs Extrait AcOEtUHPLC-APPI-HRMS mode négatif
Dopant Acétone
triterpènes
acides gras glycolipides
sphingolipides
stérols
chlorophylles triglycérides
Environ 60 composés de familles différentes
polyphenols
33
Identification des composés UHPLC-HRMS
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311 34
Conclusion
triterpène
Anthraquinones
sucre
Flavonol
Acide gras
Gallotannin
Molécules dans tous leurs états
Détection dans tous ses états
Large choix de détecteur
Détecteur courant
Détecteur ‘universel’
Détecteur spécifique
Information sur la structure meme sans MS
Choix de détecteur plus restreint
Détecteurgénérique
Pas d’ Information sur la structure sans MS
E. Destandau 3éme Journée Thématique du CCOA
Institut de Chimie Organique et Analytique – UMR 7311 35
Remerciements
Partenaires INRA, CIRAD
CDHRC, Roseraie
André Eve
Thomas Ludivine Cristina Laetitia, Souhila Thibault, Sandrine, Cyril, Eric, Claire …..
Industriels LVMHAlban MullerRadouxCamag
Vous
E. Destandau SEP 2019