ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Reacción de la ninhidrina (espectrofotométrica)...
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ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS
Reacción de la ninhidrina (espectrofotométrica)
Reacción con o-ftalaldehído (Fluorimétrica)
Cromatografía deintercambio catiónico
Actualmente: HPLC
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Cromatografía en capa fina (aminoácidos)
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PURIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS
Suspensión deCélulas ó tejidos: Ultrasonidos
Detergente Émbolo rotatorio (potter ó aspas)
Homogenado
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
FRACCIONAMIENTO DEL HOMOGENADO CELULAR
Centrifugación a baja velocidad
Homogenadocelular
PRECIPITADO 1Células enteras,núcleos,citoesqueleto
Velocidad media20000g, 20min1000g, 10 min
Velocidad alta80000g, 1h
Velocidad muy alta150000g, 1h
SOBRENADANTE1
SOBRENADANTE2
SOBRENADANTE3
PRECIPITADO 2mitocondrias,lisosomas,peroxisomas
PRECIPITADO 3Microsomas,otras vesículaspequeñas
PRECIPITADO 4Ribosomas,virusmacromoléculas
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
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CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Centrifugación
Fraccionamiento
Muestra
Gradiente de sacarosa
Componente menos denso
Componente mas denso
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SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Se basa en la diferente:
• Solubilidad
• Tamaño
• Carga eléctrica
• Densidad
• Afinidad por otras moléculas
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SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNALas diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos Muestra
aplicada
El solvente se aplica contínuamente a la boca de la columna
Matrizsólida
Tapón poroso
Tubo deensayo
tiempo
Moléculas fraccionadas eluídas y recogidas
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TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
A) Intercambio iónico:en base a la cargaDepende del pH yde la fuerza iónica
B) Filtración en gel:en base al tamaño
C) de Afinidad:
Flujo de solvente
Partícula cargada positivamente
Molécula cargada negativamente unidaMolécula cargada positivamente libre
Flujo de solvente
Partículas porosas
Molécula pequeña retrasadaMolécula grande no retrasada
Flujo de solvente
Partícula con sustrato unido covalentemente
Molécula de enzima unida
Otras proteínas pasan de largo
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A: CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO(Ej: intercambio catiónico)
Las proteínas se separan según su carga a un pH determinado
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B: CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN O EXCLUSIÓN MOLECULAR
Las proteínas se separan según su tamaño
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C: CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Las proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando. En este ejemplo
el ligando es la glucosa y se separan aquellas proteínas que se unen a ella. Las proteínas de interés
se eluyen añadiendo un exceso de ligando libre.
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ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
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ELECTROFORESIS EN GEL
ELECTROFORESIS EN GEL:Tras aplicar un campo eléctrico las proteínas migran en función del tamaño y de la carga
(solubiliza proteínas)
Electroforesis en SDS-PAGE
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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Ejemplo de análisis de proteínas por SDS-PAGE en cada paso de una purificación. En el último paso hay una única banda, lo que indica que tenemos la proteína de interés completamente purificada
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ISOELECTROENFOQUEEs un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un gradiente de pH. Cada proteína migra hasta su punto isoeléctrico.
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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Ejemplo de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie
Marcador d
e PM
Marcador d
e PM
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GELES BIDIMENSIONALES (2D)Primero isoelectroenfoque y luego SDS-PAGE
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Ejemplo de gel bidimensional
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SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Se basa en la diferente:
• Solubilidad
• Tamaño
• Carga eléctrica
• Densidad (centrifugación)
• Afinidad por otras moléculas
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FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD
(Voet)
(p.e. sulfato de amonio)
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(Voet)