Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah menganalisis adanya

ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret kedalam sample yang kemudian di ukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer. Reagen biret sendiri terdiri dari Kalium

hidroksida (KOH) , Tembaga (II) sulfat (CuSO4), Kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6).

Hal pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan sampel atau dalam hal ini adalah

tahu, tahu yang digunakan adalah tahu putih yang memiliki tekstur lembut. Tahu tersebut

ditimbang sebanyak 0,4059 gram kemudian dihancurkan dalam mortar sehingga berbentuk bubur

berwarna putih, tahu yang sudah menjadi bubur dilarutkan dengan menggunakan aquades

kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 25 ml dan ditambahkan kembali dengan aquadest

sampai tanda batas. Tahu yang sudah dilarutkan kemudian disaring dengan menggunakan kertas

saring sehingga menghasilkan filtrat berupa larutan tak berwarna dan residu berupa bubur putih.

Filtrat yang dihasilkan inilah yang nantinya akan digunakan untuk menentukan kadar protein.

Larutan standart yang digunakan adalah larutan protein yang divariasikan yaitu 1mg/mL,

2mg/mL, 3mg/mL, 4mg/mL, 5mg/mL. Variasi larutan standart dibuat dengan mengencerkan

larutan protein 10mg/mL, pengenceran yang dilakukan yaitu dengan pengenceran bertingkat.

Untuk membuat larutan protein 5 mg/mL, pertama-tama mengambil larutan standart protein 10

mg/mL sebanyak 5 mL, kemudian diencerkan dengan labu ukur 10 mL sampai tanda batas.

Untuk membuat larutan standart 4 mg/mL yang dilakukan adalah mengambil larutan standart 5

mg/mL sebanyak 8 mL kemudian mengencerkannya pada labu ukur 10 mL sampai tanda batas.

Langkah selanjutnya untuk membuat larutan standart protein 3mg/mL adalah mengambil 7,5 mL

larutan standart protein 4 mg/mL kemudian mengencerkannya pada labu ukur 10 mL sampai

tanda batas. Larutan standart protein 2 mg/mL dibuat dengan mengencerkan larutan standart

protein 3mg/mL sebanyak 6,6 mL ke dalam labu ukur 10 mL. Sedangkan untuk membuat larutan

standart protein 1mg/mL yaitu dengan mengambil lareutan standart protein 2mg/mL sebanyak 5

mL kemudian diencerkan ke dalam labu ukur 10 mL sampai tanda batas.

Larutan standart protein yang dihasilkan adalah tidak berwarna dan ada sedikit busa pada

bagian atas permukaan larutan standart, hal ini menandakan bahwa larutan standart yang dibuat

benar-benar mengandung protein. Setelah dibuat larutan standart protein dengan variasi 1mg/mL,

2mg/mL, 3mg/mL, 4mg/mL, dan 5mg/mL, kemudian ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret

yang berupa larutan berwarna biru pada masing-masing tabung reaksi yang telah berisi larutan

standart protein yang bervariasi sehingga dihasilkan :

1. larutan standart 5 mg/mL : larutan berwarna ungu (++++)

2. larutan standart 4 mg/mL : larutan berwarna ungu (+++)

3. larutan standart 3 mg/mL : larutan berwarna ungu (++)

4. larutan standart 2 mg/mL : larutan berwarna ungu (+)

5. larutan standart 1 mg/mL : larutan berwarna ungu

Berikut ini merupakan reaksi biuret dengan protein, terbentuk kompleks Cu2+ dengan gugus CO

dan gugus NH2 dari rantai peptida dalam suasanabasa. Reaksi yang dihasilkan adalah sebagai

berikut :

Kelima larutan standart ini kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC dan dalam waktu 10

menit, setelah diinkubasi tidak ada perubahan warna dari larutan standart. Fungsi dilakukannya

inkubasi pada suhu 37ºC dan dalam waktu 10 menit adalah untuk mempercepat reaksi reagen

biuret dengan larutan standart protein sehingga pembentukan warna dari reaksi biuret secara

optimal terjadi. Setelah menjalani proses inkubasi maka selanjutnya adalah menguji absorbansi

dari larutan standart tersebut dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS dan panjang

gelombang 520 nm. Panjang gelombang ini yang digunakan karena warna ungu yang teramati

terletak pada panjang gelombang 520 nm. Dari hasil pengujian maka absorbansi yang didapatkan

adalah :

I. Absorbans

i

II. Konsentrasi

0,043 1

0,093 2

0,141 3

0,181 4

0,215 5

Sehingga didapatkan kurva standar :

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06-0.005

0.045

0.095

0.145

0.195

0.245

f(x) = 4.32 x + 0.00499999999999998R² = 0.993780352730681

konsentrasi

konsentrasiLinear (konsentrasi)

Konsentrasi

Absorbansi

Persamaan yang didapat dari kurva yang dibuat adalah y = 4,32x + 0,005 dan R2 =

0,9938, persamaan ini akan digunakan untuk menghitung konsentrasi dari larutan sampel yang

diuji sesuai dengan Hukum Lambert-Beer. Pada kurva di atas membentuk suatu garis lurus yang

linear, hal ini dikarenakan larutan protein yang digunakan merupakan larutan encer dengan

konsentrasi yang kecil. Penyimpangan Hukum Beer akan berlaku jika larutan protein yang

digunakan mempunyai konsentrasi yang besar.

Langkah percobaan selanjutnya yang dilakukan adalah penetapan absorbansi larutan

blanko dan larutan sampel. Untuk larutan blanko 1 ml aqudest dimasukkan dalam tabung reaksi

setelah itu ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret dan untuk larutan sampel 1 ml larutan sampel

tahu dimasukkan dalam tabung reaksi setelah itu ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret.

Sehingga dihasilkan perubahan warna sebagai berikut :

- Larutan blanko : larutan berwarna biru

- Larutan sampel 1 : larutan berwarna biru

- Larutan sampel 2 : larutan berwarna biru

- Larutan sampel 3 : larutan berwarna biru

Larutan sampel dan blanko ini kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC dan dalam

waktu 10 menit, setelah diinkubasi tidak ada perubahan warna dari larutan standart.

Fungsi dilakukannya inkubasi pada suhu 37ºC dan dalam waktu 10 menit adalah untuk

mempercepat reaksi reagen biuret dengan larutan blanko dan sampel sehingga

pembentukan warna dari reaksi biuret secara optimal terjadi. Setelah menjalani proses

inkubasi maka selanjutnya adalah menguji absorbansi dari larutan standart tersebut

dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS dan panjang gelombang 520 nm.

Panjang gelombang ini yang digunakan karena warna ungu yang teramati terletak pada

panjang gelombang 520 nm. Dari hasil pengujian maka absorbansi yang didapatkan

adalah :

Sampel Konsentrasi Absorbansi

1 0,001 0,006

2 0,001 0,005

3 0,002 0,009

Dengan menerapkan rumus dari Hukum Lambert-Beer, kadar protein dalam larutan

sampel dapat diketahui dengan memasukkan nilai absorbansi yang didapat pada persamaan

yang diperoleh dari kurva standart : y = 4,32 x + 0,005. Untuk menghitung konsentrasi

protein dalam larutan sampel maka data absorbansi yang diperoleh dari sampel 1, 2 dan 3

dimasukkan ke persamaan garis sesuai dengan hukum Lambert-Beer kemudian dibuat rata-

rata hasil perhitungan didapatkan hasil sebagai berikut :

- Sampel 1 Tahu

y = 4,32x + 0,005

0,006 = 4,32x + 0,005

x = 0,00023

- Sampel 2 Tahu

y = 4,32x + 0,005

0,005 = 4,32x + 0,005

x = 0

- Sampel 3 Tahu

y = 4,32x + 0,005

0,009 = 4,32x + 0,005

x = 0,00092

maka kadar protein dalam sampel tahu dapat diketahui dengan cara :

0,00038 mg /mL40,59 mg /mL

x 100% = 0,00094 %