ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO 1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de...

ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO

• 1) Mutantes ¿por qué son útiles?• 2) Genes de efecto cigótico y materno• 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis

• a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila• b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón• c) Peculiaridades de Arabidopsis• d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de

modificadores• 4) Series alélicas, su importancia y obtención• 5) Estudio de los genes encontrados

• a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas• b) Cómo obtener mosaicos• c) Cómo marcar los sectores mutantes• d) Modificaciones del sistema de mosaicos• e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

COMPLEJIDAD DEL DESARROLLO

¿Cómo se sabe que los productos de estos genes intervienen?¿Cómo se sabe qué genes están en la misma ruta?¿Cómo se sabe el orden deactuación de los que están en la misma ruta?

EL VALOR DE LOS MUTANTES

wt Mutante

El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura

A B DCFenotiponormal

A B DC* Fenotipoanormal

Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica …

El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lohacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura

El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde actúan los genesy el orden en que intervienen en un proceso

EL VALOR DE LOS MUTANTESLa combinación de mutantes en un mismo individuo da pistas sobre

cómo interaccionan los productos de los genes afectados

Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b):

-1) Muestra tanto el fenotipo A como el B

Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes de Mendel)

-2) Fenotipo wt, o casi wt

Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes.

-3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B)

Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro.Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …)

-4) Muestra el fenotipo A o el B

Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro.Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.

LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO

Luz azul

FOTOTROPISMO

Fitocromo A (phyA) influye en el proceso¿phyA actúa preferentemente en el núcleo o en el citoplasma?

CITOPLASMA NÚCLEO

phyAFHL

FHY1phyA

Sin phyA está afectado el fototropismoSin phyA en el núcleo apenas lo está

CONCLUSIÓN:phyA actúa principalmente

en el citoplasma

PERO …

Luz azul

LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO

CITOPLASMA NÚCLEO

phyAphyAFHL

FHY1

phyA-NLSphyA-NLS

En plantas SIN phyA endógeno:todo el phyA está en el núcleo

phyA actuaría sin importar si está en el núcleo,

Ahora notamos que phyA sí hace algo importanteen el núcleo para el fototropismo: MÁS LENTO en fhy1fhl

WT

phyA-NLS-GFP

fhy1fhl

phyAfhy1fhl

phyA

Fenotipado más fino:seguir la velocidad del proceso

o en el citoplasma

ESQUEMA DE UNA FLOR TÍPICA

• Hay mutantes en los que está alterado el patrón floral, NO la morfología de sus partes.• En esos mutantes no hay cualquier tipo de alteración. Ver qué tipos se dan y cuáles no permite comprender cómo tiene lugar el proceso.

LA IMPORTANCIA DE LOS MUTANTES

Mutante “A”

Estructura floral: carpelos, estambres, estambres, carpelos

Mutante “B”

Estructura floral: sépalos, sépalos, carpelos, carpelos

Mutante “C”

pétalos envez de

estambres

Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor

Mutante “C”

Una nuevaflor en vezde carpelos

Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor

B

A C C A

B

carp

elo

pét

alo

pét

alo

esta

mb

re

esta

mb

re

sép

alo

sép

alo

1 12 23 34


• 1) Mutantes ¿por qué son útiles?

• 2) Genes de efecto cigótico y materno• 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis




GENES DE EFECTO MATERNO

(+/-)

(+/-)

(+/-)

(-/-) Fenotipo normal

Fenotipo anormal

Fenotipo determinado porel genotipo de la madre,NO por el del individuo

¿CUÁNTO DE LA MADRE?El caso de Bicoid

Todo el producto del gen necesario para el desarrollo viene de la madre:EFECTO MATERNO CLÁSICO

♂♀

+/- +/-

x

-/-Vive

♂♀

-/- +/-

x

-/-Mueren

+/-

♂♀

+/- -/-

x

-/-Viven

+/-

¿DÓNDE EN LA MADRE?

El producto del gen necesario para el desarrollo viene de las gónadas maternas

♂♀ -/-

Mosaico

+/- +/+

x

+/-

Muere

♂♀

-/-Mosaico

+/- +/+

x

+/-

Viven

¿CUÁNTO DE LA MADRE?El caso de Engrailed (letal en homocigosis)

♂♀ -/-

Mosaico

+/- +/-

x

-/-

Muere

Sólo importa el genotipo del cigoto: EFECTO CIGÓTICO CLÁSICO

♀ ♂

+/- +/-

x

-/-

Muere

+/-

Mismosdefectos

♂♀ -/-

Mosaico

+/- +/-

x

+/-

Vive

¿CUÁNTO DE LA MADRE?Extra sex combs (esc)

-/-

♂♀

+/- +/-

x

NO TODO el producto del gen necesariopara el desarrollo viene de la madre

♀

-/-

♂

-/-

T2 y T3 como T1

+/-Vive

♀-/-

♂+/-

-/-Muere

♀-/-

♂+/-

Se necesita un aporte materno¿pero produce algo el embrión?

Diferente por lo que haproducido el embrión


• 1) Mutantes ¿por qué son útiles?• 2) Genes de efecto cigótico y materno

• 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis




DISEÑO GENERAL

x , , …

, ,

Mutagénesis y obtención de mutantes INDIVIDUALES

x ,, …Amplificación por separado de cada mutante individual

Típicamente no pueden distinguirse los distintos individuos

¿Fenotipo de interés de los mutantes en homocigosis?Mantener la mutación desde los heterocigotos, ¿cómo distinguirlos?

, , En especies AUTOFECUNDABLES se obtienen los homocigotossin necesidad de amplificación previa de cada mutante individual

Cruces entre hermanos de cada familia

3a) EL “SCREENING” DE HEIDELBERG (DROSOPHILA)

DROSOPHILA COMO SISTEMA

• Ventajas generales:– Fácil y barato de mantener– Tiempo de generación corto (10 dias)– Produce mucha progenie

DROSOPHILA COMO SISTEMA

• Ventajas genéticas: – Sin recombinación meiótica en machos– Sólo cuatro cromosomas– Cromosomas politénicos visibles al óptico– Muchos caracteres externos variables

(ojos, nervios en las alas, quetas…)– Un gran repertorio de técnicas y trucos– Genoma completamente secuenciado

EL SCREENING DE HEIDELBERG

• Primer intento de hacer una búsqueda global de mutantes del desarrollo.

• ¿No sería inmanejable el número de genes que intervienen en el proceso?

• ¿Servirían de algo esos mutantes, serían informativos?


• Cosas importantes a tener en cuenta:– ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener

todo.– Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar– Planificar un esquema de cruzamientos para obtener

individuos con las mutaciones y poder conservarlas.– Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés.

• Se buscaron genes cigóticos que mataran al embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.

CICLO VITAL DE DROSOPHILA


• Cosas importantes a tener en cuenta:– ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener

todo.– Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar– Planificar un esquema de cruzamientos para obtener

individuos con las mutaciones y poder conservarlas.– Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés.

• Se buscaron genes cigóticos que mataran al embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.

• Esas mutaciones deberían causar alteraciones morfológicas visibles en la cutícula

LA CUTÍCULA EMBRIONARIA

¿Cómo hacer mutagénesis?

Se hace mutagénesis de un buen número de machos de modo que un ciertoporcentaje de sus espermatozoides tengan mutaciones


x

Todos los descendientes son heterozigotos. Por lo general, cada uno para una mutación distinta.

Los machos mutagenizados se cruzan “en masa” con hembras normales

F1


La autofecundación “en masa” de la F1 NO generará casi nunca homozigotos para cada mutación sino dobles mutantes en heterozigosis

porque típicamente de cada mutación sólo hay 1 individuo en la F1

Para los mutantes recesivos es preciso obtener individuos homozigotos.Pero, ¿cómo conseguirlos?

x

1/4


x

1/2 1/2

Cruzando POR SEPARADO cada macho F1 con hembras wt se obtiene encada cruce (botella) 1/2 de heterozigotos para cada mutación.

F2

Hemos conseguido amplificar cada mutación: ya hay varios individuoscon la MISMA mutación que luego podrán cruzarse entre ellos

(No haría falta si fueran hermafroditas capaces de autofecundarse)


Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellasaparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga

x1/2 1/2

1/4 de los cruces

Todos wt


x1/2 1/2

1/2 de los cruces


1/2 1/2


x1/2 1/2

1/4 de los cruces


1/2 1/41/4

Fenotipo visible


x1/2 1/2

6/16 9/161/16

Entre los hermanos de los mutantes habrá portadores de la mutación, pero también muchos wt

Resumen de los resultados de la autofecundación en botellas donde había un mutante


x

x1/2

6/161/16

El experimento se simplificaría si hubiera algún modo de eliminarautomáticamente los individuos “a” y “b”

1/2

a

9/16

b

F1

F2

F3


xD

r

r

r

r

D

r

r

D

Una posibilidad es usar letales recesivos (r) y letales dominantes inducibles (D)

F1

F2


D

r

xr

Pero si hay recombinación en la hembra el sistema puede destruirse

r… …

Dr

Meiosis


• Los recombinantes que se producen entre cromosomas que difieren en una inversión dan descendientes inviables. En Drosophila hay sistemas de cromosomas con inversiones, CROMOSOMAS BALANCEADORES, que pueden emplearse para evitar este problema.

• El “screening” se hace por separado para cada cromosoma

El “screening” de Heidelberg

xD

rBw

w

EMS

wr

B

w

D

Se mutagenizan con EMS varios miles de machos que después secruzan con hembras vírgenes “en masa”

F1

El “screening” de Heidelbergw

rB

w

D

D

rB

x

wr

B

w

D

rB

rB

D

rB

D

D

29º 4 dias18º o 25º

F2

El “screening” de Heidelbergw

rB

wr

Bx

w

w

1/4

wr

B

1/2

rB

rB

1/4Mueren como larvas

CRITERIOS DE SELECCIÓN:-1)no hay moscas de ojos blancos;-2)de 1/4 de los huevos no salen larvas; -3)observación embriones

F3

RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2

• 1500 machos mutagenizados se cruzaron con unas 2500 hembras vírgenes

xD

rBw

w

EMS


• 1500 machos mutagenizados se cruzaron con unas 2500 hembras vírgenes

• 10.000 cruces individuales de F1, 5764 dieron suficiente descendencia

wr

B

w

D

D

rB

x


• 4217 de las F2 no dieron descendientes de ojos blancos (73% → 1.3 mut/crom) Poisson, no media

• 2843 daban 25% huevos de los que no salían larvas

w

w

1/4

wr

B

1/2

rB

rB

1/4Mueren como larvas


• Examen a la lupa de los embriones de las 2843 líneas

• 1620 líneas son letales embrionarios auténticos

• 321 muestran defectos claros cutícula

• Análisis de complementación: 61 genes, 48 con más de 1 alelo, 13 con 1 alelo

ASPECTO DE ALGUNOS MUTANTES

MUCHOS MUTANTES CON PROBLEMAS EN LOS SEGMENTOS

LOS MUTANTES SUGIEREN APARICIÓN PROGRESIVA DE PATRONES

Zonas a lo largo del eje A/P

14 parasegmentos

Borde anterior y posterior decada parasegmento

Identidad de cada región

SATURACIÓN DEL “SCREENING”¿Qué fracción de los genes que se podría encontrar con este protocolo de trabajo se ha encontrado realmente?

¿Merece la pena seguir buscando con este protocolo?

El caso del cromosoma2 de Drosophila:

Criterio 1: seguir la marcha del proceso

Cada vez se encuentranmenos GENES nuevos

Constantemente aparecenmutantes, pero …

SATURACIÓN DEL “SCREENING”

Criterio 2: número de alelos por gen. Cuantos más haya, más cerca de la saturación.


Aproximadamente4,55 alelos/locus

(hay mejores aproximaciones)

¿Podemos predecir cuántos genes quedan por encontrar?

Asunción clásica: la distribución de frecuencias de alelos sigue una PoissonLa fracción de genes sin mutar (0 alelos) será: P(0)= e-m

Caso del cromosoma 2: m=4,55, P(0)= 0,01. El 1% del total de genes que se podrían encontrar no se ha mutado aún, quedarían menos de 1 (0,6)

SATURACIÓN DEL “SCREENING”Problema: muchas veces la distribución no parece una Poisson.Previsible si no todos los genes tienen la misma probabilidad de recuperarse como mutantes.

Posteriormente se han encontrado 8 genes más en este cromosoma con el tipo de problema buscado en el “screening” original. Esos 8 loci representan el 11,6% del total de 69 loci, P(0)=0,116, mucho más que lo previsible según Poisson (P(0)=0,01)


0

2

4

6

8

10

12

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18Número de alelos

Nú

me

ro d

e l

oc

iObservados

Poisson

Poisson param = 4,55 alelos/locus

Fuerte exceso de loci con una

mutación

SATURACIÓN DEL “SCREENING”

El caso del cromosoma 2 de Drosophila:

Criterio 3: análisis de deleciones. ¿Las hay que causen un fenotipo de interés pero en las que no mapee uno de los loci identificados?

Crom. 2

Deleciones(cubren 30% del cromosoma)

Deleciones dandofenotipos cuticulares

En todas mapea alguno de los loci identificados(compatible con saturación)

Loci de mutantespreviamente identificados

3b) PROBLEMAS EN OTROS ORGANISMOS: PEZ CEBRA Y

RATÓN

EL PEZ CEBRA COMO SISTEMA MODELO DE VERTEBRADOS

• Pequeño tamaño (3-4 cm)

• Tiempo de generación corto (3-4 meses)

• Alta fecundidad (100-200 huevos/hembra)

• Fácil de mutagenizar

• Embrión transparente y de desarrollo externo

• Se puede fecundar “in vitro”. Esperma congelable

“SCREENINGS” EN EL PEZ CEBRA

1/4 de los cruzamientos entre losF2 darán individuos homozigotospara m: con fenotipo visible

Varias peceras, cada unacon cruces entre parejas

de hermanos F2

Amplificación de cada mutanteen una familia F2

“SCREENINGS” DEL PEZ CEBRA

“SCREENING” DE TÜBINGEN

• 49 MACHOS MUTAGENIZADOS• 3075 FAMILIAS F2 INICIADAS• 2746 FAMILIAS F2 ANALIZADAS

– (14.357 cruces para dar F3)

• 4624 MUTANTES OBTENIDOS• 1163 MUTANTES CONFIRMADOS• 372 GENES IDENTIFICADOS

– 150 GENES CON MÁS DE 1 ALELO

– 222 GENES CON 1 ALELO

– Nº alelos/gen: de 1 a 34. Nº medio: 2.4

Development 123:1-36 (1996)

“SCREENING” DE BOSTON

• 266 MACHOS MUTAGENIZADOS• 2799 FAMILIAS F2 INICIADAS• 1808 FAMILIAS F2 ANALIZADAS

– (más de 30.000 cruces para dar F3)

• 2383 MUTANTES OBTENIDOS• 695 MUTANTES CONFIRMADOS• 220 GENES IDENTIFICADOS

– 56 GENES CON MÁS DE 1 ALELO

– 164 GENES CON 1 ALELO

– Nº alelos/gen: de 1 a 11. Nº medio: 1.5

Development 123:37-46 (1996)

“SCREENING” DE HAPLOIDES

-2)Los embriones haploides tienenalgunos problemas de desarrollo

Problemas:-1)Los embriones haploidesacaban muriendo

Ventaja:Enseguida se detectan mutaciones interesantes

MÉTODOS ALTERNATIVOS

“Screeining” de haploides ya visto

Presión poco despuésde la fertilización:

NO se completa la meiosis II y embriones diploides

Problema: no son completamente homocigotos

Choque térmico tras fertilización: NO se completa 1ª mitosis tras

meiosis y embriones diploides y completamente homocigotos

Problema: pobre viabilidad (10-20%)

EL RATÓN COMO MODELO• Es un mamífero (cercano al hombre)• Genoma secuenciado• Transformable y sistemas “knock out” • Corto tiempo de generación (2 meses)

• Desarrollo embrionario intrauterino• Requerimientos de espacio en jaulas

• Pocos programas de mutagénesis a gran escala: unos 300 mutantes dominantes (visibles en G1) desde más de 40.000 ratones, pocos de desarrollo

DISEÑO DE UN CROMOSOMA BALANCEADOR EN RATÓN

Sin Wnt3 el ratón muere

Ag da color amarillento al pelo

Puro y Neo dan resistenciaa antibióticos

Se obtiene un gen Hprt funcional,Hprt permite crecer en medio HAT

ca. 1/3 del cromosoma con la inversión

UN BALANCEADOR PARA EL CROMOSOMA 11

Color amarillento de partes delcuerpo de los ratones portadores

de la inversión

ESQUEMA DEL “SCREENING”

Ratones macho

Marcador dominanteREX: pelo rizado Mutación

Camadas de más de 24 ratones sin animales negros indican un mutante recesivo letal

3c) PECULIARIDADES DE ARABIDOPSIS

MUTAGÉNESIS EN ARABIDOPSISMeristemo apical del embrión

Nº células del meristemo que contribuirán a las semillas de la planta = 2 en ArabidopsisSector

m/+

Sector+/+

Como cada individuo se autofecunda no hace falta una generación previade amplificación del número de individuos m/+

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