ANÁLISIS ENZIMÁTICO

usando MicroCal Origin y Excel

ARREGLO DE DATOS

Vaciar los datos crudos del experimento a una hoja de cálculo.

Convertir las unidades de los datos (ejem. de absorbancia a concentración).

Categorizar los datos y acomodarlos.

EJEMPLO

Concentración de producto a lo largo del tiempo (t) dependiendo de las distintas concentraciones iniciales (a0)

t a0=1 a0=2 a0=5 a0=10 a0=201 0.095 0.180 0.370 0.560 0.7602 0.185 0.340 0.710 1.080 1.5003 0.260 0.490 1.010 1.570 2.2004 0.330 0.620 1.290 2.040 2.8805 0.395 0.740 1.560 2.470 3.5006 0.450 0.850 1.800 2.870 4.1207 0.505 0.950 2.020 3.230 4.6608 0.555 1.040 2.220 3.590 5.2409 0.595 1.120 2.400 3.920 5.740

10 0.630 1.200 2.580 4.220 6.240

OBTENCIÓN DE LAS V0

Gráficamente: Trazar las gráficas para cada valor de a0 y posteriormente trazar una tangente cuando t -> 0 y obtener su pendiente.

(La gráfica y la línea de tendencia fueron trazadas usando Origin)

0 2 4 6 8 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Y =0.0095+0.09195 X-0.00299 X2Pro

duct

o (m

M)

Tiempo (s)

a0=1 Polynomial Fit of Data1_B

OBTENCIÓN DE LAS V0

Analíticamente: En Origin, aplicar a la gráfica, la función “Calculus – Differentiate”. Copiar para cada a0 el primer dato de cada columna marcada como B’(Y)

(La gráfica y la línea de tendencia fueron trazadas usando Origin)

0 2 4 6 8 100.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Y A

xis

Titl

e

X Axis Title

C' D' E' F' B'1

¿QUÉ HACER CON LAS V0?

Reordenar los datos en una nueva tabla ya sea en Excel u Origin y hacer las transformaciones pertinentes, según el método para análisis enzimático requerido.

Directo Henri-M-M L-B Hanes E-HS0 V0 log S V0 1/S 1/V S S/V V/a0 V0

1 0.09 0 0.09 1 11.11 1 11.11 0.09 0.092 0.16 0.301 0.16 0.5 6.25 2 12.5 0.08 0.165 0.34 0.699 0.34 0.2 2.941 5 14.71 0.068 0.34

10 0.52 1 0.52 0.1 1.923 10 19.23 0.052 0.5220 0.74 1.301 0.74 0.05 1.351 20 27.03 0.037 0.74

MÉTODO DE HENRI-MICHAELIS-MENTEN

Graficar directamente V0 vs. a0. Los valores de Km y Vmax se obtienen

por inspección de la gráfica. Difícil estimar los valores reales.

Henri-MM

y = 0.2175Ln(x) + 0.0393

R2 = 0.9691

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

S

LINEWEAVER-BURKE

Se obtienen los dobles recíprocos (1/V0 y 1/a0)

Los puntos obtenidos son ajustados a una recta en la que la pendiente es Km/Vmax, y(0)= 1/Vmax; x cuando y=0 es –1/Km.

No recomendable, pues la magnitud de los errores aumenta proporcionalmente con 1/a0

Análisis de Lineweaver-Burke

1/V = 10.293*(KM/V) + 0.9071R2 = 0.9992

-5

-3

-1

1

3

5

7

9

11

13

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

1/S

1/V 1/V

Lineal (1/V)

GRÁFICA DE HANES

Se obtiene al graficar a0/v0 contra a0. La pendiente es: 1/Vmax. La ordenada al origen es: Km/Vmax. La intercección en x es: -Km. La magnitud de los errores es más o

menos constante, lo cual la hace preferible.

Gráfica de Hanes

(S/V) = 0.828*(1/V) + 10.622R2 = 0.9982

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25

S

S/V

S/V

Hanes

LA GRÁFICA DE EADIE-HOFSTEE

Se grafican V0 contra V0/a0. La pendiente es: -Km La ordenada al origen es Vmax. Los errores en el cálculo de V0 provocan

desviaciones en ambos ejes.

Gráfica de Eadie-Hofstee

V = -12.45*(v/S) + 1.1843R2 = 0.9928v=V-Km(V/S)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1V/S

V0

V0

Ajuste EH

VÍNCULOS PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNAS.

http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ http://www.expasy.org/cgi-bin/nicezyme.pl?

1.14.18.1