BMC Genomics. 2011; 12: 580.

. Publicado en Internet el 25 de noviembre 2011 doi:  10.1186/1471-2164-12-580

PMCID: PMC3293833

Análisis de los sitios de metilación CpG y CGI entre los genomas de ADN del virus del papiloma humanosSilvia C Galván , 1 Martha Martínez-Salazar , 1 Víctor Galván M , 2 Rocío Méndez , 3 Gibran T-Díaz Contreras , 4 Moisés Alvarado-Hermida , 4 Rogelio Alcántara-Silva , 4 y Alejandro García-Carrancá1, 3

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Abstracto

Fondo

El genoma del virus del papiloma humano (VPH) se divide en secuencias de codificación tempranos y tardíos, incluyendo 8 marcos de lectura abiertos (ORF) y una región reguladora (LCR). La expresión del gen viral puede ser regulada a través de los mecanismos epigenéticos, incluyendo la metilación de citosina en los dinucleótidos CpG. Hemos analizado la distribución de los sitios CpG y las islas CpG / grupos (CGI) entre los 92 genomas de VPH diferentes agrupadas en función de su tropismo preferencial: cutánea o mucosa. Se calculó la proporción de sitios CpG (PCS) para cada ORF y se calcularon los valores CpG esperados para cada tipo viral.

Resultados

CpGs están insuficientemente representadas en los genomas virales. Se encontró una correlación positiva entre los valores observados y esperados CpG, con alto riesgo, los virus de la mucosa (HR) que muestran el más mínimo O / E ratios. Los rangos de los PCS fueron similares para la mayoría de las regiones genómicas excepto E4 , donde la mayoría de CpG se encuentran dentro de islas / grupos. Al menos un CGI pertenece a cada E2/E4 región. Se encontraron correlaciones positivas entre PCS para cada ORF viral en comparación con los otros, a excepción de la LCR contra cuatro ORFs y E6contra otros tres ORFs. La distribución de las islas CpG / grupos entre los grupos de VPH es tipo HR-HPV heterogéneos y mucosas presentan tanto el número más bajo y más corto en comparación con el

tamaño de la isla bajo riesgo cutánea y mucosa (LR) VPH (todos ellos muy diferentes).

Conclusiones

Hay una diferencia entre subrepresentación CpG viral y celular. Existen correlaciones significativas entre el PCS completa del genoma y la falta de correlaciones entre varios pares de región genómica, especialmente aquellos que involucran LCR y E6 . L2 y L1ORF comportamiento es opuesta a la de los oncogenes E6 y E7 . El primer par posee relativamente bajo número de sitios CpG agrupados en CGI mientras que los oncogenes poseen un número relativamente alto de sitios CpG no asociados a CGI. En todos los virus del papiloma humano, E2/E4 es la única región con al menos un CGI y muestra un contenido más alto de sitios CpG en cada tipo de HPV con un identificado E4 . Los HR-HPV mucosas muestran ya sea el tamaño más corto CGI, seguido por la mucosa LR-HPV y por último por el subgrupo viral cutánea, y una tendencia a la CGI número más bajo, seguido por el subgrupo viral cutánea y, por último, por la mucosa LR-HPV .

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Fondo

Virus del papiloma humano (VPH) constituyen un grupo de más de 100 tipos diferentes. VPH infectan epitelios estratificados, tanto la mucosa y cutánea y se asocian con trastornos proliferativos benignos y malignos. Tipos virales que infectan preferentemente epitelios mucosos se agrupan ya sea en un grupo de bajo riesgo (LR-HPV) no asociados con el cáncer, o en un grupo de alto riesgo (VPH-AR), cuyos miembros se encuentran en casi todos los casos de cáncer cervical [ 1 ]. VPH son virus no envueltos icosaédrica en forma de no-líticas,, con una circular, genoma de ADN de doble hebra de aproximadamente 8,0 kb que se divide funcionalmente en dos regiones codificantes (denotado E para principios o L para la tarde) y una región reguladora o LCR. El E región incluye seis principales marcos de lectura abierta (ORF) que codifican proteínas funcionales (E1, E2 y E4) y oncoproteínas (E5, E6 y E7), y la Lregión codifica las dos proteínas de la cápside, L1 y L2. E4 se expresa en ambas etapas tempranas y tardías del ciclo de vida viral [ 2 ].

La expresión de genes de VPH está regulada principalmente a nivel transcripcional y post-transcripcional y varios estudios han sugerido que la

metilación del ADN viral puede estar asociada con la expresión génica viral y la progresión del cáncer [ 3 - 6 ].

La mayor parte del trabajo en la metilación del VPH se ha llevado a cabo en los dos tipos virales principales implicados en el cáncer cervical (tipos 16 y 18). En ambos genomas hay un aumento progresivo en la metilación de portadores asintomáticos, a través de lesiones benignas y enfermedades pre-malignas, a tumores de cáncer. Sin embargo, existe una gran heterogeneidad de la metilación de CpG en genomas virales derivados de muestras clínicas [ 4 - 7 ], y la función exacta de la metilación del ADN viral sigue siendo poco clara.

Además, sobre la base de estudios de virus de Epstein-Barr se ha propuesto que la metilación del genoma viral puede permitir que una proporción de las células infectadas para sobrevivir citotóxico de células T de vigilancia inmune [ 8 , 9 ], y los estudios de adenovirus en los genes virales finales sugieren que son más sensible a la metilación de los primeros [ 10 ]. En el caso de HPV L2 y L1 genes, que se han propuesto para ser reconocidos preferentemente por la maquinaria de metilación celular [ 11 , 12 ].

La metilación es la modificación covalente sólo conocida de ADN en eucariotas y juega un importante papel regulador en los vertebrados por silenciar genes específicos durante el desarrollo y la diferenciación celular. Metilación de citosina se produce en la posición 5 'del anillo de pirimidina, principalmente dentro de un contexto CpG (m5CpG), a pesar de metilación de citosinas en diferentes contextos se ha descrito recientemente [ 13 , 14 ] y 5-hidroximetilcitosina (HMC 5), una novela DNA modificación se informó [ 15 ].

Por lo general, la presencia de m5CpG en el ADN genómico está asociado con condensación de la cromatina y la inactivación de la expresión génica. Sin embargo, no está claro si el papel evolutivo primario de metilación del ADN es el silenciamiento transcripcional o un sistema de defensa del huésped frente a elementos de secuencia parasitarias endógenos o exógenos [ 16 ].

En los genomas de eucariotas superiores, dinucleótidos CpG están generalmente insuficientemente representadas, de un tercio a un 5% de su frecuencia esperada [ 17 -20 ]. El mecanismo propuesto para explicar esta falta de representación, reconoció por primera vez en los sistemas procariotas [ 21 ], es que los sitios CpG son mutagénicos, debido a la

conversión de frecuencia de methylcytosines a timinas través desaminación [ 22 ].

Similar a sus anfitriones, dinucleótidos CpG están insuficientemente representadas en la mayoría de los virus de ADN pequeños, aunque en menor medida [ 23 ]. Se ha propuesto que las frecuencias CpG bajos pueden permitir que los virus o bien para evitar la metilación por metiltransferasas de acogida y por lo tanto maximizar su eficacia de la transcripción, o podría ser un medio para reducir las respuestas inmunitarias mediadas por CpG [ 24 ].

La opinión general es que los sitios CpG en los vertebrados, agrupadas en racimos o islas (CGI), son en su mayoría no metilados en las regiones promotoras de los genes transcripcionalmente activos, y metilados en las regiones promotoras de los genes transcripcionalmente inactivos. En contraste, la metilación de los genes del cuerpo parece ser conservadas evolutivamente y juega un papel importante en el tejido-o regulación de células específicas de promotor alternativo. Además, las células tumorales por lo general muestran hipometilación de la mayoría de la metilación del genoma y de CGI en las regiones promotoras de genes supresores de tumores [ 14 , 25].

Según Gardiner-Garden y Frommer [ 26 ] un CGI se define como un fragmento de ADN de al menos 200 pb que contiene al menos 50% de CpG, con una relación observada / esperada CpG (O / E) de 0,60 o superior y al menos una brecha de 100 pb entre diferentes CGIs. Esta definición, a pesar de su popularidad, ha suscitado muchas críticas y diversas propuestas diferentes se han postulado [ 27 - 31 ]. Han et al., [ 32 ] recientemente comparó tres algoritmos computacionales para la identificación de islas CpG y, sobre la base de la función de genes de vertebrados y de otros factores genómicos, el rendimiento criterios Takai y Jones era el mejor. El análisis de 132 CGI a través de todo el cromosoma humano 21 permitió a los investigadores identificar varios atributos asociados con cualquiera de metilación-resistencia o sensibilidad de metilación-CGI [ 33 ].

La mayoría de las propuestas para la identificación y los criterios para analizar predisposición metilación en las islas CpG CGI no se puede aplicar directamente a los genomas debido a su pequeño tamaño de VPH. Además, la falta de múltiples regiones promotoras y los pocos datos disponibles acerca de metilación de diferentes tipos virales hacen difícil este escenario.

Debido a que en nuestra opinión, la comprensión de la metilación del ADN puede beneficiarse de nuestro conocimiento de la distribución de CpG lo largo de diferentes genomas virales, se han analizado las proporciones genómicas y regionales de sitios CpG (PCS) y su disposición en CGI, en la mayoría de los tipos de virus del papiloma humano secuenciado hasta la fecha. Hasta donde sabemos, no ha habido un análisis exhaustivo de CGIs en los genomas de virus. Proponemos hipótesis acerca de sus roles funcionales, teniendo en cuenta tanto los VPH como un solo grupo o en subgrupos en función de su tropismo preferencial (cutánea y mucosa) y su riesgo asociado para inducir el cáncer (mucosa de bajo y de alto riesgo).

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Resultados

Sitios CpG están infrarrepresentados entre los genomas de HPV, aunque en menor medida que en sus anfitriones

Después de identificar todos los sitios CpG entre los 92 disponibles las secuencias de ADN del VPH, se calculó el valor de CpG esperado para cada genoma viral. El número esperado de sitios CpG se calculó como el número de 'C está multiplicado por el número de' G en el genoma viral, dividido por el tamaño del genoma.

Cuando se comparó la CpG observado vs los valores esperados para cada tipo viral, una diferencia significativa fue evidente (un lado p = 0, prueba de Chi cuadrado).Además, se encontró una correlación positiva (dos caras p = 4.30E-37, rho Spearman rango de correlación; Figura Figura 1)1 ) que indica una proporción similar de CpGs disminución independientemente del tipo viral. Como se preveía, los sitios CpG están infrarrepresentados en los genomas virales, aunque en menor medida que en su genoma huésped humano [ 17 , 20 ]. La diferencia media entre medio es 50,5% (que van desde 32,5% a 58,1%).

Figura 1Relación entre los valores observados y esperados CpG de los genomas de VPH .

Curiosamente, la mayoría de HR-HPV infecta muestran ratios de epitelios mucosos CpG O / E por debajo de la O / E ratio media (0.50), sólo cinco tipos de VPH-AR (18, 26, 45, 39 y 68) muestra diferencias ligeramente por encima de la media relación (de ficheros adicionales 1 , Tabla S1). De hecho, el HR-HPV tienen la media más baja (0,47) CpG O / E ratio que significa que este subgrupo viral muestra una representación insuficiente profundo CpG. CpG O / E ratios de medios de LR y los tipos cutáneos de HPV son 0,49 y 0,51, respectivamente.

En la figura Figura 1,1 , podemos observar los valores de CpG como una función de los valores esperados para todos los genomas secuenciados 92 del VPH. La relación calculada O / E de cada nucleótido individual entre los diferentes genomas virales indica que C (0,8) y G (0,9), mientras que están subrepresentadas A (1,2) y T (1,1) están sobre-representados dentro de los genomas de VPH.

HPV E4 es la región con la mayor proporción de CpGs

Se calculó cada PCS como el número de sitios CpG dividido por el número total de nucleótidos en la secuencia considerada. Luego trazamos PCS para cada región viral en orden ascendente (Figura (Figura 2)2 ) independientemente del tipo viral. Esto significa que cada valor del eje x puede representar más de un tipo viral.

La figura 2Distribución de los tipos de VPH en función de los valores del PCS regionales . Cada conjunto de datos se representa gráficamente de acuerdo con el orden de cada uno particulares PCS regionales, desde el más bajo al máximo. PCS es el número de sitios CpG dividido por el número total de nucleótidos en ...

De la figura Figura 22 (de ficheros adicionales 2 , Tabla S2, donde se enumeran todos los genomas virales analizados), está claro que el E4 ORF posee el más alto valor de PCS regional (61 de los 68 tipos de VPH que esta región ha sido identificada, véase la sección Métodos para tipos de VPH que carecen de ORFs reportados), y que el E2región (donde E4 es co-situado) no muestra PCS valores similares (media E2 PCS sin los tipos de VPH que carecen de E4 fue 0.028). En tres de los 68 tipos

virales, E7exhibe los más altos valores de PCS, mientras que la región LCR muestra los valores más altos de PCS en cuatro de cada 68 tipos.

PCS promedio de la región (y el rango) para ORFs individuales y la LCR son los siguientes: E6 , 0,024 (,002-,045); E7 , 0,030 (0,010-0,054); E1 , 0,018 (0,009 a 0,035); E2 , 0.029 (0.014 a 0,050); E4 , 0,051 (0,025-0,088); L2 , 0,023 (0,011-0,043); L1 , 0,018 (0,009 a 0,036), y LCR, 0,027 (0,009 a 0,054).

Cuando los VPH se agrupan en función de su tropismo preferencial, los E4 ORF PCS promedios son los más altos en comparación con cualquier otra región. De hecho, E4ORF PCS promedios están bastante cerca, independientemente del tipo, porque cutánea, 0.054 y mucosa, 0.049, similar a cuando los VPH mucosos se agruparon en función del riesgo: riesgo bajo, 0.050 y de alto riesgo, 0.048. Además, E4 promedio de los valores de PCS son alrededor de dos veces los más altos PCS promedio de cualquier otra región en cada grupo viral / subgrupo (datos no mostrados).

Curiosamente, relaciones de O / E para A (1,16) y G (0,96) nucleótidos individuales en la E4 ORF, siga la misma tendencia encontrada en todo el genoma viral, sin embargo, T (0.68) parece poco representados y C (1,20) sobrerrepresentados, en comparación a los valores de todo el genoma. Cuando Arco-pecado transforman relaciones de O / E de los nucleótidos individuales en E4 se compararon y en todo el genoma, se encontró que los dos conjuntos de datos son significativamente diferentes (p = 4.94E-14; prueba de la t), a pesar de que son significativamente correlación (p = 006; Pearson de correlación producto-momento). PCS se Arc-pecado transformados con el fin de utilizar correctamente los procedimientos estadísticos, como se mencionó en la sección Métodos.

Distribuciones del tipo de VPH en función de la proporción regional de los sitios CpG son diferentes

Tipos de VPH fueron ordenados en función del PCS regionales transformadas Arc-sin (AsPCS) y se compararon entre sí utilizando un coeficiente de correlación lineal de Pearson y de dos caras pruebas t. Los resultados se muestran en la Tabla Tabla 1,1 , donde se puede observar que 36 de los 45 son correlaciones significativas. Esto significa que cualquier tipo viral mantiene estrechamente su posición relativa en función de cada par correlacionada significativa de PCS regionales. Hay una falta de correlación entre PCS LCR y los de los E1, E4, L2 y L1 regiones, así como el promedio de los ORFs; entre E6 PCS y los de los E7, E2 y E4 regiones, y entre E7 y PCS que a partir de la L2región.

Tabla 1valores de p para las correlaciones entre los valores * AsPCS regionales

La distribución de las islas CpG / grupos entre los VPH es heterogénea

Ubicación CGI se resume en la tabla Tabla22 (y se describe en el archivo adicional 3 , Tabla S3). Hay en promedio 3 CGI por VPH genoma (que van desde 1 a 8) y el tamaño medio de la isla es 394 pb, que van desde 203 hasta 1379 pb. Veinte dos tipos de HPV tienen un solo CGI con un tamaño medio de 447 pb (que van desde 210 hasta 835); 25 tipos poseen dos CGIs con un tamaño promedio de 360 pb (que van desde 215 hasta 562); 15 tipos poseen tres CGIs con un tamaño medio de 303 pb (que van desde 234 hasta 426); 10 posee cuatro tipos CGI, tamaño medio de 365 pb (que van desde 241 hasta 510); 6 tipos poseen cinco CGI, tamaño medio de 481 pb (que van desde 265 hasta 724) ; 6 tipos poseen seis CGI, tamaño medio de 477 pb (que van desde 391 hasta 575); 7 tipos poseen siete CGI, tamaño medio de 381 pb (que van desde 344 hasta 424), y un solo tipo (VPH 57) posee ocho CGI con un tamaño medio de 505 pb (que van desde 209 hasta 1.159). Ninguno de los virus carecen de CGI, y en todos los casos al menos un CGI pertenece a la E2/E4 región.

Tabla 2Proporción de islas CpG por VPH para cada grupo viral

HPV E2/E4 es la región con el mayor número de CGIs

Se encontró que la región viral con el mayor número de CGI (CGIN) es E2/E4 ; cada tipo viral que posee al menos un CGI en esta región. Es importante dejar claro que en el caso de E4 , como en cualquier otra región, sólo hemos tenido en cuenta los tipos de VPH que este ORF se ha

identificado. Otras regiones que contienen más comúnmente CGI incluyen los E1, E7 y L2 ORF que tienen CGI en al menos la mitad de los tipos de VPH; la L1 regiones ORF y LCR con una CGI en 25 a 50% de los tipos virales, y, finalmente, la región donde menos de 25% de los tipos virales poseen una CGI es E6 .

En la mayoría de los tipos, no hay una correspondencia exacta entre toda CGIN genoma y CGIN regionales porque cuando una isla / cluster se distribuye en más de una región viral, se toma en cuenta en cada región comprendida, incluso si sólo hay una CGI en todo el genoma. Esto se aplica particularmente a los E2 y E4 regiones debido a que el E4 ORF se encuentra dentro de la E2 ORF, aunque en un marco de lectura diferente (véase la Tabla Tabla22 ).

Los tipos de VPH de alto riesgo presentan islas CpG / grupos menos y más cortos

Cuando agrupados por tropismo, y el promedio de CGI tamaños rangos son los siguientes: los tipos de VPH cutáneos promedio de 446 pb (203 a 1211 pb); todos los tipos de VPH de la mucosa, 345 pb (205 a 1379 pb); mucosas tipos LR-HPV, 363 pb (205-1379 pb) y la mucosa tipos de VPH-AR, 275 pb (210-410 pb). En particular, cuando se compararon las frecuencias CGI por tamaño, se encontraron diferencias significativas entre los HPV cutáneos y mucosos (p <0,0005), así como entre la mucosa LR y HR-HPV (p <0,0001, prueba de Chi cuadrado). Además, ambos tipos virales cutáneas y mucosas comparten un promedio de 3,0 CGIs por genoma viral (que van desde 1 a 8), y entre los tipos de mucosas, LR-HPV muestran un promedio de 3,93 CGIs por genoma viral en contraste con HR-HPV que muestran sólo 1,60 CGIs.Al comparar las frecuencias por número de CGI, también encontramos diferencias significativas entre los HPV cutáneos y mucosos (p <0,005), así como entre la mucosa LR y HR-HPV (p <0,001, test de Chi cuadrado).

Treinta de 45 cutánea y 32 de los 47 tipos de mucosas poseen 3 o menos CGIs, y 15 de los 45 cutánea y 15 de los 47 tipos de mucosas poseen más de 3 CGIs. En el grupo de la mucosa, 14 de los 29 LR y los 18 HR-HPV poseen 3 o menos CGIs, y 15 de los 29 LR-HPV posee más de 3 CGIs (archivo adicional 3 , Tabla S3).

Aunque CGI parecen regionalmente distribuidos de manera similar entre los tipos cutáneas y mucosas (a excepción de E6, L1 y LCR), hay una diferencia notable entre la proporción de CGI entre tanto HR-y de la mucosa LR-tipos (véase la tabla Tabla2),2 ), especialmente para regiones E6 (0,07 y 0,32, respectivamente), E1 (0,33 y 1,14,

respectivamente), L2 (0,13 y 1,00, respectivamente), L1 (0,0 y 0,55, respectivamente), y LCR (0,0 y 0,46, respectivamente ). De hecho, entre la mucosa tipos de VPH-AR, sólo HPV 33 contiene un CGI en el E6 región, sólo el VPH 45 contiene un par de CGIs en la L2 región, y ninguno de los HR-HPV mucosas contienen CGIs ya sea en la L1 o LCR regiones.

Curiosamente, cuando se centra sólo en regiones en las que se identificaron las islas (con exclusión de cualquier región sin CGI; ver la Tabla S3), la región que posee el número más alto CGI es L1 (promedio 1,71 CGI sobre 21 tipos de VPH), seguido de L2(promedio 1,58 CGI en 36 tipos de VPH), E1 (promedio 1,26 CGIs en 61 tipos de VPH) y LCR (promedio 1,20 CGIs en 25 tipos de VPH). Los oncogenes E6 y E7 , así comoE2 y E4 ORF cuota 1 CGI los días 17, 45, 92 y 68 tipos de VPH, respectivamente.

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Discusión

Para nuestro conocimiento, este es el primer análisis sistemático de CGI, así como de la distribución del sitio CpG realizado en 92 tipos de VPH. Este análisis proporciona la estructura principal que subyace al fenómeno metilación, orientar la identificación de regiones genómicas interesantes para futuros estudios experimentales epigenéticos.

Como era de esperar [ 23 ], encontramos diferencias significativas entre los valores observados y esperados CpG entre todos los genomas secuenciados VPH. Sin embargo, contrariamente a la escasa representación notable de sitios CpG entre genomas eucariotas donde representan sólo un tercio a un 5% de los valores esperados; genomas virales tienen una escasa representación de sólo alrededor del 50% de los valores esperados CpG. De acuerdo con la hipótesis de co-evolución, sería de esperar que los genomas humanos y VPH exhiben valores de infrarrepresentación de CpG similares. Las grandes diferencias encontradas podrían estar relacionados con otros fenómenos relevantes, tales como el uso del codón específico de la especie y la composición genómica de base. De hecho, una relación entre el uso de codones y la composición base con C + contenido de G en los VPH se encontró anteriormente [ 34 ,35 ].

En este contexto, parece necesario mencionar que los VPH son pequeños genomas de ADN virales de tamaño que no evolucionan rápidamente, a

diferencia de otros virus.Se ha calculado que se necesitan alrededor de 200.000 años en 17 pb, hasta el cambio de estos genomas [ 36 ].

En un contexto biológico, una correlación significativa entre los valores observados y esperados CpG podría reflejar constricciones funcionales globales comunes compartidos por la mayoría de los tipos de VPH. Al mismo tiempo, la falta AsPCS inter-regional de correlaciones punto a divergencias funcionales constricción locales, en particular en los E6 regiones y LCR (Tabla (Tabla 2).2 ). Sin embargo, más estudios de los diferentes tipos de VPH son necesarios para confirmarlo.

Curiosamente, L2 y L1 ORF muestran un comportamiento CpG paralelo. Ambos poseen relativamente bajos PCS dispuestas principalmente en CGI. La L2 región es el sexto lugar en el valor promedio de PCS y el cuarto lugar en número isla, y L1 es el octavo lugar en el valor promedio de PCS y el sexto lugar en número isla. Se sabe que en las lesiones de cuello uterino de bajo grado asociadas al VPH 16, el genoma viral es episomal, hipometilado, y las L1 y L2 ORF se expresa con el fin de generar las cápsides virales. Por el contrario, la mayoría de las lesiones cervicales de alto grado muestran DNA viral integrado, hypermethylated y las L1 y L2 ORF no se expresan. En los vertebrados, la metilación en los genes del cuerpo juega un papel importante en el tejido o la regulación de células promotor específico de alternativa, de tal manera que CGI huérfanos se utilizan para la identificación alternativa promotor [ 37 ]. A pesar de que esta es una idea arriesgada, es tentador especular que los ORFs que codifican la cápside viral se comportan de manera similar y que cuando la célula hypermethylates ellos, es posible que la L1/L2 región desempeña un papel como un promotor alternativo para los genes virales y, cuando integrado, para algunos genes celulares.

Además, los oncogenes virales también muestran un comportamiento CpG paralelo, pero de una manera opuesta como los genes que codifican la cápside. Ambos de ellos poseen relativamente altas PCS valores asociados a unos pocos CGI. E7 ocupa el segundo lugar de acuerdo con los valores promedio de PCS regionales y el quinto lugar de acuerdo con el número media de la isla, mientras que el E6 región ocupa el quinto lugar de acuerdo con PCS regionales y la octava colocar de acuerdo con el número promedio de isla. Esto significa que los sitios CpG están ampliamente distribuidos y sugieren ambas regiones podrían ser sensibles a la metilación, especialmente cuando los virus del papiloma humano integran en el genoma de la célula.

El E4 ORF parece ser un caso especial debido a sus múltiples funciones durante el ciclo viral. Está implicado en diversas funciones celulares y virales, especialmente en la disminución de la integridad de queratinocitos [ 38 ], [detención del ciclo celular en G239 ], la replicación del ADN del VPH [ 40 ] y la expresión de las proteínas tardías [ 41], posiblemente a través de varios productos de la proteólisis proteína E4 [ 42 ]. De hecho, la E4 ORF se expresa en todo el ciclo viral [ 2 ]. Sus funciones y la expresión continua podrían depósito municipal restricciones funcionales duros a mutaciones de secuencia, así como la necesidad de un mecanismo implicado en evitar la metilación.El mantenimiento de los sitios CpG en CGI podría ser una especie de compromiso para satisfacer las restricciones del código de secuencia con la expresión necesaria de la proteína E4.

Además de la falta de representación de los sitios CpG en el genoma del VPH, las proporciones de un solo nucleótido apuntan a T y A mayores frecuencias a costa de G y C frecuencias, lo que refuerza la hipótesis de la mutación T → C como resultado de la desaminación CpG.

Sin embargo, el E4 región no comparte el mismo comportamiento.Sorprendentemente, incluso cuando A y G proporciones son similares a los de todo el genoma, frecuencias C parecen ser aumentado a expensas de Ts. Este hecho, sumado a la gran cantidad de sitios CpG, en su mayoría organizados en CGIs, lleva a la pregunta de si existe algún mecanismo para evitar la C → T mutaciones, como resultado de la desaminación, que afecta el VPH y en especial la viral E4 región. De hecho, existen enzimas de reparación que eliminan bases desaminados, en concreto, timina ADN glicosilasa (TDG) y metil-CpG dominio de la proteína de unión 4 (MBD4), que son capaces de eliminar uracilo o timina de G · U y G · T miss- parejas en el seguimiento de las enzimas de reparación por escisión de base restaurar un G · C par [ 43 , 44 ].

Cuando agrupados por tropismo, el grupo de VPH cutánea, muestra el mayor tamaño medio de CGI (446 pb), seguido por el grupo LR-HPV con un tamaño medio de CGI intermedia (363 pb) y el grupo HR-HPV muestra el tamaño promedio más pequeño CGI (272 pb). Además, a pesar de que Cgin de ambos tipos de HPV cutáneas y mucosas comparten valores similares (3 CGIs, promedio), parece que hay una tendencia hacia Cgin más pequeño en comparación con el HR-LR-VPH (1,6 y 3,93, respectivamente). Estos datos plantean preguntas sobre el posible papel de los CGIs en la interacción entre el virus y las células. Al mismo tiempo, esto sugiere una posible susceptibilidad diferencial a la metilación en función de cualquiera de VPH tropismo o riesgo asociado. Sin embargo, los únicos estudios

experimentales sobre methylomes se han llevado a cabo en los tipos de VPH 16 y 18, donde se observaron cambios de metilación y alta heterogeneidad a lo largo de las fases de la infección viral [ 3 - 8 ]. En resumen, las diferencias entre los grupos podrían estar relacionados con diferentes estrategias epigenéticos infecciones virales.

Por último, debe ser interesante examinar virus determinados genes en el genoma humano y ver cuáles son sus características y CGI CpG son. Esperamos que nuestro análisis de la distribución de CpG y CGI entre los genomas de VPH puede proporcionar elementos para aproximaciones experimentales racionales relacionadas con los procesos biológicos y evolutivos de estos virus y sus anfitriones.

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Conclusiones

En primer lugar, queremos señalar que este trabajo se basa únicamente en el análisis de secuencia característica, por lo que los resultados presentados aquí pueden necesitar corroboración experimental. En este estudio, hemos encontrado que hay dos diferencias importantes y las correlaciones entre los valores observados y esperados CpG entre todos los genomas secuenciados de VPH, y que los genomas virales tienen una escasa representación de sólo alrededor del 50% en comparación con los genomas eucariotas en representación insuficiente es de 30 a 5 %.

El análisis de la distribución regional de sitio CpG muestra que las correlaciones entre PCS completos del genoma son significativos, a pesar de que hay una falta de correlación entre varios pares de región genómica, especialmente aquellos que involucran LCR y E6 . Por otra parte, se encontró que L2 y L1 ORFs exhiben un comportamiento opuesto a los oncogenes E6 y E7 ; el primer par que posee un número relativamente bajo de sitios CpG que se asocian a CGI mientras que los oncogenes poseen un número relativamente alto de sitios CpG que no están asociados a CGI. Nos gustaría señalar que E4 es la región que posee el mayor contenido de CpGs en cada tipo de VPH que una E4 se identifica.

A partir del análisis CGI, el E2/E4 es la única región con al menos una CGI en todos los VPH, y la principal diferencia entre esta región y el genoma completo es que en elE4 región de la frecuencia de Cs parece aumentó a expensas de Ts . Los HR-HPV mucosas poseen los tamaños CGI más cortos, seguido por las mucosas LR-HPV y, finalmente, por el subgrupo viral cutánea. Al mismo tiempo, los HR-HPV mucosa muestran una tendencia

hacia números más bajos CGI, seguido por el subgrupo viral cutánea y, finalmente, por la mucosa LR-HPV.

Por último, esperamos que nuestro análisis de la distribución de CpG y CGI entre los genomas de VPH puede proporcionar apoyo a los enfoques experimentales racionales relacionadas con los procesos biológicos y evolutivos de estos virus y sus anfitriones.

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Métodos

Nuestro análisis de CpG comprende dos fases: la primera es la comparación de la distribución del sitio CpG entre los tipos de VPH como un solo grupo, y en la segunda fase que identificar posibles similitudes o diferencias en la distribución del sitio CpG asociados a la tropismo preferencial y / o el riesgo de cáncer causado por los subgrupos virales mucosas. La distribución de CpG se refiere a proporciones CpG (PCS) y, o bien tamaños CGI o números.

Fuente de datos

VPH secuencias de ADN se obtuvieron en línea de GenBank (EE.UU. Biblioteca Nacional de Medicina y los Institutos Nacionales de Salud; ver ficheros adicionales 1 , Tabla S1). El criterio principal para la selección del genoma viral fue que cada secuencia de nucleótidos había sido identificado previamente como un tipo de HPV por un estudio taxonómico. Seleccionamos todas las secuencias de VPH incluidos en los esquemas de clasificación de De Villiers et al. [ 45 ], sobre la base de la secuencia de L1, y de Diallo et al. [ 46 ], en base a secuencias del genoma completo.

Secuencia del VPH tipo 16 incluye los cambios propuestos por el Grupo de Biología Teórica y Biofísica en el Laboratorio Nacional de Los Alamos. 92 Todos los genomas de VPH incluidos en el análisis fueron reeditados por lo que todas las secuencias comienzan en el primer nucleótido de la E6 ORF. Las excepciones a esto son los tipos de VPH 71 y 14D, porque ninguno tiene un reporte de E6 ORF. Además, los tipos de VPH 14D y 3 falta informaron E7 ORFs, tipo de VPH 53 carece de un informado E1ORF y 24 tipos virales carecen informado E4 ORF (VPH 1a, 3, 7, 8, 9, 10, 12, 14D, 15, 17, 19, 25, 26, 27, 30, 32, 34, 40, 45, 50, 52, 53, 56 y 71).

Debido a la ausencia de datos puede contribuir a un sesgo en el análisis, se identificaron ORFs putativo para cada tipo de VPH que carecen ORFs

reportados utilizando la herramienta en línea "ORF finder" [ 47 ]. Los principales criterios de selección putativo ORF era el tamaño de las regiones codificantes identificados y la existencia de un solo candidato ORF en cada región considerada. Tomamos en cuenta los fragmentos individuales de 200 pb o más, y luego se calculó el PCS para estos ORFs putativo. Como puede verse en el archivo adicional 4 , Tabla S4, encontramos putativo sola E 1 y E 7 ORFs para tipos de VPH 53 y 3, respectivamente. En el caso de VPH 14D, encontramos sola E 6 y E 7 ORFs, sin embargo, se constató que eran recubrirse con más de 100 pb. Para los tipos de VPH sin reportado E 4 ORF, hemos identificado un único ORF putativo en sólo tres tipos virales de VPH: 25, 26 y 32. Los otros 21 tipos de VPH tenían más de un ORF identificado: se encontraron 11 tipos de VPH con 2, 8 tipos de VPH de 3, 1 tipo de VPH con 4 y 1 tipo de VPH con 5 putativo E4 ORFs.

El PCS para las ORFs putativo no cambiaron notablemente el PCS promedios regionales ni el análisis de los resultados (véase la disposición 5 , cuadro S5).

Por último, con el fin de evitar sesgos en los resultados, se incluyó una secuencia de cada tipo de VPH y evitamos cualquier secuencia de tipo Variant.

Datos de entrada

Los datos de entrada comprendidos todo el genoma, cada ORF y LCR, incluyendo los sitios de inicio y fin, para cada tipo de HPV.

Se analizaron los genomas completos de 92 secuencias virales, así como los dividen en 8 regiones ( E1, E2, E4, E6, E7, L1 , y L2 ORF, y LCR). Debido a la escasa cantidad de datos, no hemos incluido tres ORFs reportados en el análisis: el E8 ORF se ha encontrado solo en 1 de HPV, el E5 ORF está presente sólo en 23 de los 92 tipos de VPH (5, 6 bis, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 51, 58, 59, 67, 68, 69, 70, 74, 82 y 85), y el E5 B ORF se informaron sólo para dos HPV tipos (11 y 31).

Datos de salida

Con el fin de identificar los sitios CpG que utilizamos PISMA, una herramienta computacional que hemos diseñado, que está disponible a petición de SCG y / o RAS.PISMA permite la localización y la identificación de los motivos que varían entre 2 a 10 bases, en un máximo de 10 kb secuencias de ADN. Además, esta herramienta contará el número de motivos en las regiones definidas. Hemos identificado los sitios CpG

individuales por región de todas las secuencias de VPH, y en base a los datos de PISMA, se calcularon los PCS como el número de sitios CpG dividido por el número total de nucleótidos en la secuencia. Identificación de putativo islas CpG / grupos se llevó a cabo utilizando la isla CpG Explorer 2.0, disponible públicamente enhttp://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx [ 28 ]; parámetros utilizados en la isla CpG de identificación fueron los de Gardiner-Jardín y Frommer [ 26 ]: CpG 50% o más, ObsCpG / ExpCpG relación de 0,60 o más alto, al menos 200 pb tamaño y 100 pb brecha. En la figura Figura 33 se muestran los resultados obtenidos para el VPH 16.

Figura 3Distribución de CpG en el genoma de VPH tipo 16 . A. mapa Viral gen; B. Localización de sitios CpG y C. sola isla CpG identificados.

PCS transformaciones Arc-sen se calcularon con el fin de utilizar correctamente los procedimientos estadísticos paramétricos que no son adecuados para los datos de proporción debido a la naturaleza binomial del proceso biológico (ocurrencia CpG). En resumen, la distribución de proporciones es a menudo sesgada, y la transformación arcoseno a menudo hace que la distribución más normal.

Por último, se calcularon los valores esperados CpG para cada genoma viral con el fin de compararlos con los valores observados CpG.

Análisis de Datos

Las posibles relaciones entre los resultados de los datos se identificaron utilizando rho de Spearman rango de correlación y pruebas de Chi cuadrado, así como Momento de Pearson del producto de correlación y dos caras pruebas t. Los cálculos se realizaron utilizando ad hoc Excel macros y corroboración de los cálculos, el uso de software libre en línea las estadísticas [ 48 , 49 ].

Procedimiento de revisión

Con el fin de comprobar la posibilidad de errores en los cálculos, se revisó todo el procedimiento de selección al azar tres grupos de treinta tipos de VPH cada uno. A un grupo se utiliza para repetir los procedimientos de datos de entrada; un segundo grupo se utilizó para repetir los

procedimientos de datos de salida, y el tercer grupo se utilizó para repetir los cálculos del valor estadísticos y p.

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Lista de las abreviaturas

VPH: virus del papiloma humano; LR-HPV: los tipos de VPH de bajo riesgo; HR-HPV: los tipos de VPH de alto riesgo; ORF: marco de lectura abierto; PCS: proporción de sitios CpG; AsPCS: Arc-sin proporción transformada de sitios CpG; m5CpG : sitio CpG metilado; CGI: isla CpG; Cgin: Número isla CpG; E (número): proteína viral temprana, L (número): proteína viral tardía; E (número): viral temprana ORF, L(número): viral tardía ORF; LCR: región de control de largo; SRPK1: serina-arginina-rica proteína quinasa 1.

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Autores de las contribuciones

SCG inició el estudio, realizado el análisis y la interpretación, y escribió el manuscrito.MMS, VMG y RM obtuvieron los datos y revisó el manuscrito. RAS, GTDC MAH y desarrollaron la herramienta computacional y participó en la obtención de los datos, y AGC siempre ímpetu inicial para llevar a cabo el análisis y participaron en la redacción y revisión del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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Información de los autores

SCG es un investigador asociado y RAS es profesor en la Universidad Nacional Autónoma de México; AGC es un investigador de la Universidad Nacional Autónoma de México y en el Instituto Nacional del Cáncer, VMG es profesor en la Universidad Metropolitana, RM es un investigador asociado en el Instituto Nacional del Cáncer, MMS es becario postdoctoral en el laboratorio de AGC; GTDC y TAC son estudiantes guiados por RAS.

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Material complementarioArchivo adicional 1:

Tabla S1. CpG observado y esperado valores para cada tipo de VPH . La tabla contiene el número de acceso de GenBank, los números

observados y esperados CpG, y la relación O / E CpG, para todos los 92 tipos de VPH incluidos en el análisis.

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Archivo adicional 2:

Tabla S2. Proporción de sitios CpG entre diferentes regiones genómicas . La tabla contiene la proporción de CpG en la E6, E7, E1, E2, E4, L2 y L1 ORF, y la LCR, todo el genoma y todos los ORFs juntos, para cada tipo viral.

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Archivo adicional 3:

Cuadro S3. Islas CpG por región de cada tipo de VPH . La tabla contiene el número de la isla CpG en la E6, E7, E1, E2, E4, L2 y L1 ORF, y la LCR y de genoma completo, el tamaño medio de CGI y el tropismo para cada tipo viral.

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La disposición 4:

Tabla S4. ORFs putativo de los tipos de VPH que carecen de ORFs reportados . La tabla contiene todos los fragmentos posible codificación de 200 pb o más grande para cada tipo de HPV que carece ORFs reportados; los sitios de inicio y fin, y los valores correspondientes PCS.

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Archivo adicional 5:

Tabla S5. P valores de las correlaciones entre AsPCS regionales cuando se incluyen las ORFs putativo . La tabla contiene valores de p para las correlaciones entre los valores AsPCS regionales cuando se incluyen AsPCS de ORFs putativo.

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Agradecimientos

Queremos reconocer el apoyo de PAPIIT-UNAM IN215411-3 (a SCG) y IN226408 (a AGC). Este trabajo se realizó en la Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto de Investigaciones Biomédicas de la

Universidad Nacional Autónoma de México y el Instituto Nacional de Cancerología, SSA, en colaboración con investigadores de la Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional Autónoma de México y del Instituto Nacional de Cancerología , SSA. Agradecemos al Prof. Luis Bojórquez-Castro útil para los debates y asesoramiento estadístico, y la Dra. Elizabeth Langley y QFB Martha D. Sánchez-Barrios para la revisión crítica del manuscrito.También damos las gracias a dos revisores anónimos por excelentes críticas constructivas.

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