Analise Quantitativa Cromatografia Gasosa
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7/31/2019 Analise Quantitativa Cromatografia Gasosa
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ANLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA
Antnio Luiz Pires Valente (in memoriam),Fabio Augusto e Cssio Ricardo Fares RiedoUniversidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica, CP 6154,13084-862 Campinas, So Paulo - Brasil
RESUMO
Este um texto de apoio ao aplicativo multimdia Anlise Quantitativa por Cromatografia (disponvel emAplicativos e Programas). A sua finalidade a de oferecer ao leitor material similar, na forma impressa, ao domultimdia. Este texto mais detalhado do que o apresentado no aplicativo, mas tem um nmero muito menorde figuras. tambm uma forma complementar para a apresentao das informaes e interpretaes, podendo
servir tanto como material de apoio como resumo do material original.
Palavras-chave: Cromatografia, Curva Analtica, Tratamento de Dados, Teste de Huber
Introduo
A anlise quantitativa em cromatografia baseada em
estabelecer o valor da rea da banda cromatogrfica. Na
cromatografia em coluna, isto , gasosa (CG) e em cromatografia
lquida (comumente de alta eficincia, CLAE) a banda registrada
como um pico (Figura 1) que, idealmente deve ter formatogaussiano.
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8
O parmetroquantitativofundamental emcromatografia a rea da bandacromatrogrfica.
Figura 1. Esquema de um cromatgrafo gasoso e de um cromatogramaobtido por cromatografia gasosa.
1
mailto:[email protected]:[email protected] -
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Em cromatografia gasosa de alta resoluo, onde so
usadas colunas capilares, no incomum que os picos tenham perfil
gaussiano, como demonstrado no detalhe da Figura 2, que o pico
destacado em azul da Figura 1.
0
50
100
150
3,9 3,95 4
Na prtica dacromatografia soobservados picos
gaussianos.
Figura 2. Detalhe do pico destacado em azul na Figura 1, mostrandoque ele tende ao perfil gaussiano.
Similarmente ao que ocorre na cromatografia em coluna, asmanchas observadas em cromatografia em camada delgada (CCD)
tambm tendem distribuio gaussiana. Isto mostrado na Figura
3, em que as quantidades de analito numa mancha foram obtidas
para seces verticais:
0
500
1000
1500
2000
1 4 710
13
16
19
22
As bandascromatogrficastendem ao perfil
gaussiano.
Figura 3. Distribuio das quantidades (figura inferior) de analito numamancha (figura superior) de CCD.
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Portanto, nos casos mostrados nas figuras anteriores, nas
correspondentes bandas cromatogrficas as quantidades dos
analitos tendem ao perfil gaussiano, isto , aumentam das bordas
para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro
para a outra borda.
Quando a banda cromatogrfica registrada na forma de
pico, a sua rea pode ser calculada, como mostrado abaixo, como a
rea do tringulo issceles que engloba o pico cromatogrfico
(Figura 4).
Wb
h
Clculo da rea de umpico cromatogrfico
por triangulao:
A = h Wb
Figura 4.A = hWb. Clculo da rea de um pico cromatogrficopor triangulao.
Na cromatografia em camada delgada a rea da mancha
estabelecida pordensitometria, cujo princpio est representado na
Figura 5.
A densitometriafaz a contagem do
nmero de pontos deuma imagem.
Figura 5. O princpio da densitometria: o nmero de pontos que define amancha (como vista por um densitmetro ou computador) proporcional rea da mancha.
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O procedimento e princpio de obter reas em CCD a partir
de imagens digitalizadas e arquivadas em computador est
representado na Figura 6: as placas no caso com manchas visveis
de corantes so digitalizadas e com o arquivo gerado realiza-se a
contagem dos pontos (pixeis o termo usado na rea de
computao) que compem cada mancha. A contagem pode ser
feita manualmente com muita pacincia ou por meio de um
programa que conte os pixeis. O nmero de pontos proporcional
rea da correspondente mancha e, conseqentemente, proporcional
quantidade de analito nela existente. Esta metodologia representa
o princpio de estabelecimento de reas cromatogrficas.
1074 pontos
664 pontos
641 pontos
554 pontos
O nmero de pontosque compem umamancha escaneada
proporcional sua rea.
Escanear.
Figura 6. Princpio do estabelecimento de rea de uma mancha deCCD por meio de escaneamento da placa cromatogrfica.
Apesar do mtodo de determinar reas ser diferente para
CG e CLAE, o princpio o mesmo do usado em CCD.
O uso das reas cromatogrficas a curva analtica
medindo-se as reas cromatogrficas que se estabelecem
as quantidades de analitos em amostras analisadas e a melhor
forma de realizar quantificaes a baseada numa Curva Analtica1.
A Curva Analtica (Figura 7) a relao entre sinais no caso as
reas e quantidades do analito a ser quantificado.
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1 Curva Analtica o nome sugerido pela IUPAC para substituir o termo Curva de Calibrao.
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rea
Toda anliseefetivamente
quantitativa exige ouso da curva analtica.
Quantidade
A = a + b Q
Figura 7. Esboo de uma Curva Analtica linear (representada pelaequao de uma reta).
Obtendo uma Curva Analtica
O primeiro passo para obter a curva analtica preparar um
conjunto de solues com um padro do analito que se deseja
quantificar em amostras. Portanto, necessrio conhecer a
identidade do analito e dispor dele na forma de padro (puro ou, se
isso no for possvel, com pureza exatamente conhecida e
determinada independentemente).
Cinco a seis solues costumam ser suficientes para este
trabalho. Estas solues so aplicadas lado a lado na placa
cromatogrfica e realizada a corrida cromatogrfica. Como no
incomum que numa anlise tenha-se que quantificar vrios analitos,
as solues podem conter todos eles, do que resultar uma
cromatoplaca como a mostrada nas Figuras 5 e 6. Ento as reas
das manchas so obtidas (Figura 6) e tabeladas, como mostrado na
Tabela 1.
Tabela 1. Concentraespreparadas e reas obtidas para
as correspondentes manchascromatogrficas o analito o
corante Vermelho 40 (V40).
C (g/L) rea
2,8 1175,7 1358,4 162
11,2 19414,1 207
Dispondo de dados como o da Tabela 1 aplica-se a eles uma
Regresso Linear para obter a equao da curva analtica, isto , a
relao funcional entre Sinais e Quantidades. Para o caso dos dados
da Tabela 1, a equao de reta que relaciona as reas com as
concentraes do V402 :
5
2 O V40 um corante artificial usado em alimentos.
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A = 91,7 + 8,5 C (Equao 1)
Note-se que a curva analtica definida como a relao
entre sinais e quantidades; no entanto, na Equao 1 as
quantidades so representadas pelas concentraes das solues.
Isto implica que os volumes de amostra aplicados na placa
cromatogrfica foram iguais, pois, C = Q / V (C= concentrao; Q =
quantidade; V =volume).
Usando a curva analtica
Dispondo da equao da curva analtica pode-se calcular as
quantidades do analito em amostras. As amostras so aplicadas em
outra placa (mesmo volume usado das solues-padro), a corrida
realizada sob as mesmas condies usadas para o conjunto de
padres e as reas do analito nas amostras so determinadas.Suponhamos que para uma amostra esta rea foi estabelecida como
de 184 pixeis. Este valor substituido na equao (1) da curva
analtica e obtm-se a quantidade do analito na amostra (no caso a
sua concentrao):
184 = 91,7 + 8,5 C;
C = (184 91,7) / 8,5;
C = 10,9 g L-1 Numa curva analticainterpolam-se
resultados.
As extrapolaes norefletem resultadosefetivamentequantitativos.
0
50
100
150
200250
0,0 5,0 10,0 15,0
A = 91,7 + 8,5 C
Concentrao (g/L)
rea
14,12,8
Figura 8. Grfico da curva analtica obtida para os dados da Tabela 1.
Nesta Figura 8 esto destacados os valores inferior (2,8 g L-1)
e superior (14,1 g L-1) das concentraes usadas para obter a curva
analtica. O valor acima calculado C = 10,9 g L-1 intermedirio entre
estes extremos. Portanto, ele foi interpolado usando-se a Equao
1. Como somente se conhece o comportamento da curva entre
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aqueles extremos, somente interpolaes so vlidas para fins
efetivamente quantitativos. Extrapolaes no so aceitveis. Isto
uma regra geral em Qumica Analtica.
A confiabilidade dos dados (e da Curva Analtica)
A curva analtica obtida com dados experimentais, que
sempre esto sujeitos a erros e desvios. Por isto, os dados
costumam oscilar e pode ser difcil ou impossvel obter uma equao
que os represente com confiabilidade. Um dos motivos a inevitvel
flutuao dos volumes aplicados na placa cromatogrfica. Um
recurso para contornar esta dificuldade alm do cuidado com
operaes experimentais tecnicamente corretas trabalhar com
dados em replicatas.Tabela 2. reas medidas em
triplicatas para as cincoconcentraes.
Em CCD isto corresponde a, por exemplo, preparar trsplacas cromatogrficas e aplicar em cada uma delas as solues de
concentraes variadas dos padres. A Tabela 2 mostra que, em
cada placa aplicam-se amostras com cinco concentraes: 0,3; 0,6;
0,9; 1,2 e 1,5 g L-1. Assim, por concentrao, dispe-se de triplicata
das reas cromatogrficas.
comum que aps obter as triplicatas calculem-se as
mdias das reas correspondentes a cada concentrao, para se
aplicar a regresso linear sobre estas mdias e concentraes. Sem
um critrio adequado isto pode levar a erros.Tomemos como exemplo a menor concentrao e suas
reas 462, 416 e 462, cuja mdia igual a 447. No entanto, uma
simples inspeo visual da Tabela 2, torna evidente que a rea 416
no deve ser usada no clculo da mdia; desprezando este valor
obtem-se uma mdia mais representativa, que igual a 462. O valor
416 claramente oriundo de algum erro, possivelmente devido ao
volume aplicado de amostra e, se usado no clculo, descaracteriza o
significado da mdia. Diz-se que ele um valoranmalo, o qual,
conseqentemente, no deve ser considerado. Ocorre que naTabela 2 existem outros anmalos, e como um conjunto de 15
dados fica difcil identificar todos eles por inspees visuais como a
acima referida. No entanto existe um conjunto de critrios bastante
seguro para identificar e desprezar anmalos, que baseado na
Curva de Linearidade.
22312305207923101,5
18391827184818431,2
14171340152513860,9
9269249249290,6
4474624164620,3
Mdirea3rea2reaC(g/L)
placa 3placa 2
so cinco reas por placa
placa 1
A representatividadede mdias sempredeve ser verificada.
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A Curva de Linearidade
A Curva de Linearidade origina-se de um princpio bastante
simples: admite-se que os dados ajustam-se a uma equao de reta
do tipo
y = a + b x (Equao 2),
a qual tem um coeficiente angular, b, constante. Experimentalmente
o que isto significa? Significa que idealmente os quocientes entre as
reas medidas e correspondentes concentraes seriam constantes,
como mostrado na Figura 9 (A / Q).
Com a curva delinearidade pode-se
identificar dadosanmalos.
QnQ2Q1 Q
A/Q
Q2Q1 Q
A
Figura 9. A Curva de Linearidade ( direita): razes A/Q (correspondentes)vs Q resultaria (idealmente) numa reta paralela com o eixo X.
Portanto, usando os dados da Tabela 3 calculam-se os valores A/C,
que so plotados em relao s correspondentes concentraes.
Disto resulta o grfico da Figura 10.
1,2(A/C) 1
0,9
Tabela 3. Valores deconcentrao e quocientes derea or Concentra o A/C .
(A/C))) 3(A /C) 2C (g/L)
1537
1522
1489
1540
1386
1540
1694
1540
1540
1536
1540
1549
13861540 1540
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
1386 1537
1520
1530
1540
1550
0,0 1,0 2,0
A/C
Concentrao
Figura 10. Curva de linearidade para os dados da Tabela 3. Os valores deA/C superiores a 1546 e inferiores a 1534 indicados com camposombreado na Tabela 3 foram rejeitados.
Nas consideraes da Tabela 3 e da Figura 10 no
indicamos porque os pontos superiores a 1546 e inferiores a 1534
foram rejeitados. Isto pormenorizado a seguir.
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A rejeio sistemtica de anmalos
Para rejeitar anmalos com base na curva de linearidade,
usando o procedimento chamado Teste de Huber, necessrio: (1)
estabelecer um valor central (linha preta na Figura 10) e, acima e
abaixo dela, intervalos de confiana (linhas vermelhas) que definem
quais os dados aceitveis isto , os que pertencem ao intervalo de
confiana. necessrio um critrio para estabelecer o valor central
de forma que ele no dependa dos dados anmalos. Isto feito
obtendo-se a mediana dos dados.
Para estabelecer o valor central a mediana (md) prefervel
mdia, porque o valor da mediana no afetado pelos anmalos.
Para obter a md ordenam-se os dados (rea/concentrao) e, no
presente exemplo, como so 15 dados, a md o oitavo deles, isto
1540. Portanto, o valor central deste conjunto de A/C md = 1540,como realado na Tabela 4. O prximo passo estabelecer os
intervalos de confiana. Antes, porm, uma observao: a mdia
deste conjunto 1525 (marcado em vermelho na Tabela 4), um valor
bastante menor do que o da md, e claramente inadequado para
representar o conjunto.
Tabela 4. Valores ordenados emquocientes de rea por
Concentrao (A/C).
1525
Estabelecendo os intervalos de confiana
O primeiro passo calcular as diferenas absolutas entre
cada valor de A/C e a md. Por exemplo, para o primeiro valor deA/C:
| A/C1 md| = |1522 1540| = 18 (Equao 3).
O intervalo deconfiana
representa a faixade variao que
voc deve esperarpara o seu
experimento.
A seguir obtido o chamado desvio absoluto da mediana (mad) dos
quinze valores |A/Ci md| e o intervalo de confiana (IC) calculado
como:
IC = k mad (Equao 4)
onde k um fator que pode variar de 2 a 8. Para os dados em
considerao mad = 3,1; usando-se k = 2 os valores do intervalo
superior e do inferior, que so os limites para desprezar resultados
anmalos, so obtidos por:
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ICs,i = md k mad = 1540 2 3,1 (Equao 5)
Tabela 5. Reproduo da Tabela 3indicando os dados rejeitados.ou seja,
1537138615401,5
1522154015361,2
1489169415400,9
1540154015490,6
1540138615400,3(A/C)2(A/C)1 (A/C)3
C (g/L)IC s = 1546; IC i = 1534;
de forma que os dados rejeitados so destacados pelos sombreados
mostrados na Tabela 5.
Naturalmente esta definio de intervalos de confiana - e do
critrio para rejeies de anmalos - deve ser comentada. Em
primeiro lugar, o critrio parece ser excessivamente subjetivo pois,
afinal, quem decide o valor de k e, portanto, da rigidez com que os
dados so desprezados o analista. Mas, de fato, com bom senso o
critrio deixa de ser absolutamente subjetivo. Este bom senso
implica, entre outras coisas, em adicionar mais um parmetro naavaliao do resultado final (que a equao da curva analtica).
Este outro parmetro chama-se resduo, rs.
Observe que, noteste de Huber,o estabelecimento
do valor docoeficiente k no
totalmentearbitrrio.
Quais so os dados rejeitados?
Antes de discutir os resduos necessrio estabelecer quais
os dados a serem rejeitados. Na Tabela 4 esto os dados A/C
rejeitados, mas no com estes que se constri a curva analtica.
No entanto, aos valores indicados na Tabela 5 correspondem a
reas que esto na Tabela 2, que so, respectivamente,(considerando colunas-linhas): 416, 929, 1525, 2079, 1340 e 1827.
Portanto, estas so as reas a serem rejeitadas.
O uso dos resduos
Aps eliminar os dados anmalos supe-se que os
remanescentes representem adequadamente a relao existente
entre rea e Concentrao com reas e concentraes que se
constri a curva analtica. Portanto, a regresso linear aplicada s
reas no rejeitadas da Tabela 5, obtendo-se a seguinte equao
para apossvelcurva analtica:
Os resduosrepresentam o
grau de confiabilidadede interpolao dedados com a sua
curva analtica.
A = 2,10 + 1537,7 C; r = 1,000 (Equao 6)
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Nesta equao (6) pode-se substituir os valores das
concentraes (0,3 g L-1 a 1,5 g L-1) para obter valores interpolados
de reas (Aint). Ento so calculadas as diferenas relativas (%)
entre estes Aint e as mdias das correspondentes reas
experimentais (exp
). Por exemplo, para a concentrao de 0,3 g L-1
a exp = 462 e a Aint = 463, de forma que:
rs = 100 (Aint - exp)/100 = + 0,3% (Equao 7).
Os valores rs (calculados para todas as concentraes) so
os resduos, isto , as medidas de quanto as reas interpoladas se
afastam das experimentais. Para o exemplo considerado os resduos
esto relacionados na Tabela 6.
Tabela 6. Valores de reasinterpoladas e resduos.
0,02308,6
- 0,11847,3
0,01386,0
- 0,1924,7
+ 0,3463,4
rs ( %)A int
Agora dispe-se de mais informaes para decidir se aescolha de k = 2 foi adequada para o critrio de rejeio.
Os resduos mostrados na Tabela 6 sugerem que o erro
mximo a ser cometido em interpolaes com a equao obtida para
a curva analtica estariam em torno de 0,3 %. Para cromatografia em
camada delgada pode-se considerar este como um resultado muito
bom. Por outro lado, considerando os sinais dos resduos existe
suficiente compensao entre resduos positivos e negativos.
Ademais, o coeficiente de correlao obtido r = 1,000 indicativo de
tima preciso da curva obtida. Portanto, pelo conjunto deargumentos acima pode-se concluir que a seleo de k = 2 foi um
critrio adequado para a rejeio de resultados. O contrrio ocorreria
se, por exemplo, dos 15 dados fossem rejeitados 7 ou 8; neste caso
seria necessrio repetir o procedimento com k = 3 e reanalisar os
resultados. Outra possibilidade seria dos resduos serem
excessivamente elevados e apresentarem uma distribuio
claramente no-aleatria entre valores positivos e negativos (caso
onde o modelo linear de calibrao no aplicvel). Estes casos
poderiam sugerir erros experimentais e, inevitavelmente, a repetiode todo o procedimento cromatogrfico.
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Um resumo do procedimento
Dispondo das reas cromatogrficas o que se faz (as
etapas de 1 a 6 constituem o chamado Teste de Huber, baseado em
medianas para rejeio de anmalos):
1. Dividir as reas pelas correspondentes concentraes, para
plotar um esboo de curva de linearidade: A/C vs C.
2. Calcular a md das razes A/C.
3. Calcular as diferenas absolutas entre as A/C e md.
4. Obter a mediana mad dessas diferenas absolutas.
5. Calcular os IC = k mad e estabelecer os limites superior e
inferior ICS,I = md k md.
6. Rejeitar as A/C de valor acima ou abaixo dos ICS,I e,
conseqentemente, as correspondentes reas.
7. Aplicar a regresso linear s mdias das reas no rejeitadas e
concentraes para obter uma equao para a curva analtica.
8. Substituir os valores das concentraes nesta equao para
obter reas interpoladas e calcular os resduos.
Uma generalizao da curva de linearidade e um critrio maisgenrico para a aplicao do teste de Huber
As discusses anteriores foram baseadas no fato de que se
a curva analtica obedece a uma equao do primeiro grau,
A = a + b C ou, como mostrado na equao 2, y = a + b x, ela
tem um coeficiente angular, ou a sua primeira derivada, constante.
Isto tambm aplica-se quando o coeficiente angular, b, diferente de
zero, pois: ento,
C
aAb
= (Equao 8).
A equao 8 permite generalizar o critrio de quais dados
aplicar o teste de Huber. Consideremos um segundo exemplo de
obteno de curva analtica.
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Obtendo a Curva Analtica quando o coeficiente linear muitodiferente de zero
Tabela 7. reas em triplicata obtidaspara as concentraes da coluna 1.Na Tabela 7 est outro conjunto de dados obtidos por
cromatografia em camada delgada. Ao calcular as razes A/C com
estes dados e plota-las na forma de uma curva de linearidadeobtem-se o grfico da Figura 11.
2714244827201,5
2232225822521,2
1737197617960,9
1334133413410,6
8727858720,3
rearea 2rea 1C
0
2000
4000
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Linearidade ?
C
A / C
A curva de linearidadetem um aspecto de
curva de segundo grauquando o coeficiente
linear da curva analtica
muito diferente de zero.
Figura 11. Grfico obtido com os dados de rea e concentrao da Tabela7.
visvel na Figura 11 que inexiste uma curva de
linearidade. Isto ocorre porque a correspondente curva analtica tem
(como se ver a seguir) um coeficiente linear bastante diferente de
zero.
Em outros termos, todas as reas obtidas experimentalmente tm
embutido o valor correspondente ao coeficiente linear. Isto cadarea experimental tem um componente Ai proporcional
correspondente concentrao, mais um valor constante a, de forma
que os quocientes A/C so sucessivamente menores,
n
n
2
ii
1
i
C
aA
C
aA
C
aA
o que faz com que o grfico de A/C vs C tenha o aspecto no linear
e decrescente mostrado na Figura 11.
A generalizao vista na equao 8:
C
aAb ,
auxilia no contorno a esta dificuldade.
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Se as quinze reas Ai, as concentraes Ci e o coeficiente
linear a so substitudos nesta equao obtm-se quinze valores
para o coeficiente lineara.
No entanto, qual o valor de a para tais clculos, j que ele est
embutido nas reas experimentais?
O fato que este valor pode ser estimado aplicando-se uma
regresso linear sobre os dados da Tabela 6. Esta regresso
exploratria resulta na equao:
A = 434,0 + 1493,4 C; r = 0,9981 (Equao 9)
de forma que o provisrio a = 434,0 pode ser substitudo na
Equao 9 para obterem-se valores bi correspondentes s
concentraes Ci.
Tabela 8. Valores do coeficientes
angulares (b) obtidos pelassubstituies de A e C (Tabela 7)
na Equao 9.Quando isto feito obtm-se os valores bi 1-3 listados na
Tabela 8. Os valores bi da Tabela 8 (que idealmente seriam
constantes), so submetidos ao teste de Huber (com k = 2)
resultando na rejeio de bi = 1169, 1713, 1343 e 1447 e
correspondentes valores de reas (785, 1976, 2448 e 1737) na
Tabela 7. Ento, s mdias das reas remanescentes e
correspondentes concentraes aplica-se a regresso linear,
obtendo-se a equao da curva analtica:1520134315241,5
1498152015151,2
1447171315130,9
1500150015120,6
1460116914600,3
bi 3bi 2bi 1C(g/L)
O critrio geral baseado no fato deque uma reta tem
coeficiente angular
constante.
A = 416,5 + 1533,8 C; r = 1,0000 (Equao 10).
Os resduos % calculados a partir desta Equao 9 so
(respectivamente da menor para a maior concentrao): + 0,5; 0,0; -
0,1; - 0,4 e 0,0, indicando que o critrio de aplicar o teste de Huber
aos valores bi (obtidos com a Equao 9 a partir de um valor
estimado de b conforme a Equao 10) adequado para obter uma
curva analtica com coeficiente linear diferente de zero. Este critrio
geral, de forma que tambm se aplica quando este coeficientelinear pode ser considerado como estatisticamente nulo.
14
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O uso do mtodo da padronizao interna
Os dois exemplos anteriores de obteno de curva analtica
foram baseados no Mtodo da Padronizao Externa (MPE), isto
, preparam-se vrias solues com concentraes diferentes do
analito e aplica-se na placa volumes iguais destas solues (Figura
12).
C = Q / V , de onde,
Q = V CV tem de ser constante
Figura 12. Representao esquemtica do princpio do Mtodo daPadronizao Externa (MPE).
O Mtodo da Padronizao Externa tem, dentre outras, uma
condio rgida: os volumes aplicados devem ser iguais, o que
dificilmente se consegue na prtica, de forma que as reas
cromatogrficas podem oscilar substancialmente, levando a
resultados como os apresentados na Tabela 9 e Figura 13.
Tabela 9. Conjunto de dados dereas e Concentraes. Os dados
com sombreado foram rejeitadosaps o teste de Huber. A
correspondente curva analtica mostrada na Figura 13.
0
400
800
0 0,5 1 1,5 2
A = 0,22 + 461,1 C ; r = 0,9999
6926246931,5
5485545531,2
3104574160,9
2583792770,6
1351801380,3
A3A2A1C(g/L)
Figura 13. Grfico e equao da curva analtica obtida para os dados daTabela 9.
A curva analtica acima s tem aparncia de boa qualidade,
pois ela foi obtida depois que oito dos quinze dados originais foram
rejeitados pelo teste de Huber. Isto certamente demasiado, pois
foram rejeitadas mais de 50 % da informao. Este problema, que
ocorreu por excessiva flutuao dos volumes de amostra aplicados,
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pode ser contornado com o Mtodo da Padronizao Interna
(MPI).
O mtodo da padronizao interna
O MPI consiste em adicionar s solues usadas para obter
a curva analtica um composto, de forma que sua concentrao seja
a mesma em todas as solues (Figura 14). Este composto
denominado de padro interno (PI).
Figura 14. MPI: cinco solues do analito com concentraes variadas, squais adicionado o PI em concentrao nica.
Depois de preparadas as solues do analito mais o PI elas
so aplicadas na placa, efetua-se a corrida cromatogrfica e medem-
se as reas. As reas do analito (variveis) so divididas pela rea
do PI (que deveria ser constante), obtendo-se as razes de rea, Rz(A). As concentraes do analito so divididas pela concentrao
(valor nico) do PI, obtendo-se as razes de concentrao Rz (C).
Para o exemplo em questo estes dados esto na Tabela 10.
Agora a curva analtica do tipo Rz (A) vs Rz (C),
supostamente uma reta. Portanto, o teste de Huber aplicado sobre
os quocientes Rz (A) / Rz (C) que correspondem inclinao da
curva Rz (A) vs Rz (C). Com isto so rejeitados os dados destacados
em sombreado na Tabela 11.
Aos dados no rejeitados aplica-se a regresso linearobtendo-se a seguinte equao de reta:
1,651,461,6015
1,261,301,3112
0,961,090,979
0,590,860,646
0,320,400,333
Rz(A3)Rz(A2)Rz(A1)Rz (C)
0,1100,0970,10615
0,1050,1090,10912
0,1070,1210,1089
0,0980,1440,1066
0,1070,1330,1103
Rz (A3)/ Rz(C)
Rz (A2)/ Rz(C)
Rz (A1)/ Rz(C)
Rz(C)
Tabela 11. Rz (C) e Rz (A)(triplicata) s quais aplicado o
teste de Huber. Os dadosdestacados foram rejeitados.
Tabela 10. Triplicatas dasRazes de Concentrao
e Razes de rea.
O mtodo dapadronizao
interna atenua osproblemas oriundos
da incerteza dovolume de amostra
aplicado.
C = 0,1
C = 1,2 1,50,90,60,3
Rz (A) = - 0,006 + 0,1083 Rz (C) (Equao 11)
r = 0,9999
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Esta equao permite interpolar razes de reas (a partir
das correspondentes razes de concentrao com os seguintes
resduos: -1,9; +0,6; +0,4; +0,3; -0,4.
Estes resultados so melhores do que os obtidos sem o
recurso do MPI, isto para os dados de reas e concentraes da
Tabela 6, quando oito de quinze dados foram rejeitados. Resta
Compreender o porque da melhora, o que simples: como o PI est
junto com o analito em todas as solues cromatografadas, a
oscilao de volume de uma aplicao para outra afeta, na mesma
proporo, as reas de ambos. Portanto, quando elas so divididas
o efeito da variao do volume aplicado atenuado.
Finalmente, para quantificar o analito na amostra, adiciona-
se a ela o PI na mesma concentrao usada anteriormente e, com a
razo de reas obtidas para a amostra interpola-se a correspondenterazo de concentraes e calcula-se a concentrao desconhecida
do analito.
Concluses
A anlise quantitativa implica na obteno de uma curva
analtica para o analito a ser quantificado. Dificilmente pode-se usar
outro composto para obter a curva, porque a sensibilidade de
resposta do detector (a inclinao da curva analtica) pode, alis
costuma, ser tpica do composto. Com a equao da curvainterpolam-se valores de quantidade (que pode ser concentrao
quando o volume aplicado constante) do analito em amostras
desconhecidas.
Extrapolaes no so vlidas, porque o comportamento
linear (s avaliamos curvas descritas por equaes do primeiro grau,
que so as mais comuns) s foi estabelecido na faixa estudada.
Para determinar a regio de linearidade usa-se o princpio da curva
de linearidade, apoiado num mtodo de identificao e rejeio de
dados anmalos os que desviam-se da linearidade por razesexperimentais. Caso a curva analtica tenha coeficiente linear igual
ou muito prximo de zero, a rejeio com o teste de Huber pode ser
realizada com sucesso diretamente sobre os quocientes de rea por
Concentrao (A/C - de fato, generalizando, Sinal/Quantidade).
Existindo coeficiente linear diferente de zero mais conveniente
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aplicar o teste sobre valores do coeficiente angular. Para tal
submete-se os pares rea, Concentrao a uma regresso linear
para obter uma equao tentativa, com a qual interpolam-se os
coeficientes angulares a serem inspecionados para rejeio como
este um mtodo geral, o mais conveniente seria tambm
aplic-lo para os casos de coeficiente linear igual ou muito
prximo de zero. A inspeo final da qualidade e confiabilidade da
curva analtica obtida envolve o clculo dos resduos, avaliando-se
seus valores e sinais (pois, por exemplo, excesso de resduos
negativos ou positivos sugere algum erro experimental e,
consequentemente, repetio do experimento); claro que o total de
dados rejeitados tambm um fator importante. Uma faixa de
resduos compatvel com os recursos qumico analticos disponveis
e um coeficiente de correlao prximo da unidade sugerem que oprocedimento para obteno da curva analtica foi adequado.
No processo acima descrito o teste de rejeio de anmalos
fundamental. Propomos o uso do teste de Huber, porque ele
baseado na rejeio em relao a medianas um mtodo robusto,
pois independente dos anmalos. O teste de Huber implica na
definio do valor do fatork pelo analista, o que no deixa de ser
subjetivo. Contudo, a subjetividade baseada em conhecimentos da
metodologia analtica e pode ser avaliada para vrios valores de k,
buscando-se coerncia entre incertezas conseguidas com a curvaanaltica e as esperadas para metodologia analtica. Alm deste
procedimento eliminar uma subjetividade absoluta, ele tem como
grande vantagem a interao do analista com seus dados, o que
certamente aumenta a sua viso da metodologia analtica que tem
em mos. Finalmente, curvas analticas tem de ser obtidas com
muitos dados, o que torna impraticvel rejeies por inspees
visuais, assim como torna muito tedioso aplicar o teste de Huber
com clculos manuais, o que sugere o uso de recursos como uma
planilha eletrnica que, quando adequadamente estruturada,recalcula todos os dados quando se altera o valor de k.
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