Análise Citogenética Comparativa entre Glossophaga ... · 2.3 Citogenética de Chiroptera . 24 ....
Transcript of Análise Citogenética Comparativa entre Glossophaga ... · 2.3 Citogenética de Chiroptera . 24 ....
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
Análise Citogenética Comparativa entre
Glossophaga soricina, Platyrrhinus lineatus e
Sturnira lilium (Phyllostomidae, Chiroptera).
Merilane da Silva Calixto
Recife, PE Fevereiro, 2008
Merilane da Silva Calixto
Análise Citogenética Comparativa entre
Glossophaga soricina, Platyrrhinus lineatus e
Sturnira lilium (Phyllostomidae, Chiroptera).
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco,
como parte dos requisitos necessários para
a obtenção do grau de Mestre em Genética.
Orientadora: Prof. Dra. Maria José de Souza Lopes, Depto. de Genética, Centro
de Ciências Biológicas, UFPE.
Co-Orientadora: Prof. Dra. Neide Santos,
Depto. de Genética, Centro de Ciências
Biológicas, UFPE.
Recife, PE Fevereiro, 2008
ii
Calixto, Merilane da Silva Análise citogénetica comparativa entre Glossophaga soricina, Platyrrhinus
lineatus e Sturnira lilium (Phyllostomidae, Chiroptera). / Merilane da Silva Calixto. – Recife: A Autora, 2008. 101 fls. .: il. Dissertação (Mestrado em Genética) – UFPE. CCB 1. Genetica 2. Chiroptera 3. Morcegos I.Título 599.4 CDU (2ª. Ed.) UFPE 599.4 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 – 39
iii
Aos meus pais, às minhas
irmãs e a Wellington com
muito amor dedico.
iv
v
“As coisas são semelhantes: isto faz a
Ciência possível;as coisas são diferentes:
isto faz a Ciência necessária.”
(Levins e Levontin, 1985).
AGRADECIMENTOS
Em primeiríssimo lugar a Deus, que me deu toda força necessária para eu
concretizar mais esse objetivo, mostrando mais uma vez pra mim que quando se
quer tudo é possível, basta acreditar e fazer por onde.
Em especial à minha mãe Marinalva, por todo amor, carinho, suporte,
incentivo, apoio e confiança depositada em mim durante mais essa etapa da
minha vida, que foram essenciais para eu persistir quando as coisas tornavam-se
difíceis.
Ao meu pai Everaldo e às minhas queridas irmãs Meriene e Merilene,
pelo amor, carinho, compreensão, ajuda, força, incentivo e por sempre
acreditarem em mim.
Ao meu noivo Wellington pelo carinho, amizade, cumplicidade,
disponibilidade, paciência, compreensão pelas minhas ausências e estresses, por
ter me apoiado em todos os momentos em que precisei, principalmente pelo amor
e incentivo constante e por me fazer sentir capaz de realizar meus sonhos
sempre.
À minha orientadora Profª Maria José, pela dedicação, disponibilidade,
ensinamentos, orientação e confiança durante o desenvolvimento deste trabalho.
À minha co-orientadora Profª Neide Santos, pelo carinho, amizade,
solidariedade, estímulo, confiança, ajuda e principalmente por ter me iniciado na
citogenética na graduação, contribuindo na minha formação profissional.
A todos os amigos da minha turma de Mestrado pela excelente
convivência durante o cumprimento dos créditos.
Aos professores da Pós-graduação em genética por todos os
ensinamentos que contribuíram para minha formação profissional.
A todos do Laboratório de Genética e Citogenética Animal: Adriana, Angélica, Bárbara, Carolina, Cibele, Cybelle, Danielle, Diogo, Evillis, Graciela, Guilherme, Helen, Iane, Ituza, Jefferson, Jéssica, João Henrique, Luzia, Marcela, Myrella, Nara, Pollyanna, Sárah, Sérgio, Thatiana, Tyago e Vilma. À Carol, Cibele, Esteban, Jefferson, Luzia, Thaís e Tyago pela excelente
convivência e ajuda nas coletas.
vi
Á minha grande amiga Marcela Pinto pela amizade, carinho,
solidariedade, companheirismo, força, paciência, estímulo e ajuda em todos os
momentos que precisei nessa etapa da minha vida.
Ao meu amigo Jefferson Geovane por toda ajuda, paciência, apoio,
estímulo, carinho e amizade durante o último ano do Curso.
À minha grande amiga Jéssica Miranda pela amizade, força, paciência,
apoio, incentivo e maravilhosa convivência tanto no laboratório como nos
momentos de lazer neste último ano do curso.
Aos Drs. Alfredo Ricardo Langguth Bonino e Katharine Raquel Pereira dos Santos da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pela identificação
taxonômica das espécies utilizadas nesse trabalho.
À Cirlene Maria da Silva e à Francisca Tavares Lira pelo suporte técnico,
excelente amizade e convivência durante a execução do projeto.
Ao Prof. Dr. Marcelo Guerra por ter disponibilizado o sistema de captura
de imagens do Laboratório de Citogenética Vegetal e a Diogo Cabral de Mello pela ajuda com a captura das imagens de fluorescência do trabalho.
À minha prima-amiga Vanessa Calixto e à minha amiga Márcia Tatyana,
pela amizade, apoio, por ter acreditado em mim e me incentivado dando forças
nos momentos difíceis que passei nesse período.
Aos meus amigos: Fábio, Fernando, Juliano, Lidiane, Paulo, Rose, Ricardo, Sandro, Sheyla e Silvana pela maravilhosa convivência nos meus
poucos momentos de lazer nestes dois anos.
Aos meus eternos amigos de faculdade Adriana Megume, Eliane Coimbra, Helena Rocha, Marina de Freitas, Patrícia Santos e Pedro Paulo que sempre me apoiaram e me incentivaram mesmo com a distância entre nós.
Aos meus grandes e eternos amigos conquistados na época de colégio:
Adrienne Carla, Apolônio Neto, Cláudia Fernanda, Fabíola Gomes, Flaviana Silva, Gustavo Queiroz, Jutaír Fernandes, Milane Karine, Paulo Henrique, Suzani França e Vivian Clécia que mesmo distante me apoiarem e incentivarem
a lutar sempre pelos meus objetivos, me dando força para jamais desistir.
A todos os meus familiares pela ajuda e apoio constantes.
Enfim, agradeço a todos que ajudaram direta ou indiretamente para a conclusão
deste trabalho.
vii
viii
SUMÁRIO Página
Lista de Tabelas 9
Lista de Figuras 10
Lista de Abreviaturas 11
Resumo 12
1. Introdução 13
2. Revisão Bibliográfica 15
2.1. Ordem Chiroptera 15
2.1.1 Aspectos Gerais 15 2.1.2 Distribuição e Classificação 17 2.2 Família Phyllostomidae: Taxonomia e Distribuição 19 2.3 Citogenética de Chiroptera 24 2.3.1 Aspectos Gerais 24
2.3.2 Aspectos Citogenéticos e Evolutivos da Família Phyllostomidae: Ênfase para as subfamílias Glossophaginae e Stenodermatinae
26
2.4 Marcadores Cromossômicos na Análise Citogenética de morcegos 33
2.4.1 Heterocromatina constitutiva (HC) e Fluorocromos base- específicos 40
2.4.2 Regiões organizadoras de nucléolo (RONs) 47
3. Referências Bibliográficas 53
4. Manuscrito de Artigo Científico Heterogeneidade da heterocromatina constitutiva e das seqüências intergênicas associadas às RONs em três espécies de morcegos (Phyllostomidae,Chiroptera).
68
5. Conclusões 90
6. Abstract 92
7. Anexo 93
7.1. Instruções para Autores 94
7.2 Fotos das espécies estudadas 101
LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS
Tabela Página
Revisão Bibliográfica
Tabela 1: Número de gêneros e espécies de Microchiroptera
no Brasil
19
Tabela 2: Classificação das subfamílias, tribos e gêneros de
Phyllostomidae proposta por Baker et al. (2003)
23
Tabela 3: Dados cromossômicos de espécies das subfamílias
Glossophaginae e Stenodermatinae 30
Tabela 4: Síntese de dados citogenéticos em espécies de
Phyllostomidae
36
Manuscrito de artigo científico
Tabela 1: Espécies de morcegos, localidade de coleta, coordenadas
Geográficas e número de indivíduos analisados 73
Tabela 2: Padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva em
alguns representantes da subfamília Stenodermatinae
(Phyllostomidae).
89
Tabela 3: Padrão de qualificação da eucromatina, heterocromatina
e das seqüências intergênicas das RONs com o CMA3 e DAPI em
representantes de Phyllostomidae.
89
9
LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS
Figura Página
Manuscrito Figura 1: Coloração convencional em Platyrrhinus lineatus (a),
Sturnira lilium (b) e Glossophaga soricina (c). No inserto
cromossomo X e Y de macho. Barra: 5 μm.
85
Figura 2: Padrão de heterocromatina constitutiva através do
bandeamento C em Platyrrhinus lineatus (a) e Sturnira lilium (b).
Em b notar a coloração diferencial do braço longo do
cromossomo X. Barra: 5 μm.
86
Figura 3: Idiograma mostrando o padrão de heterocromatina e
RONS em Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e
Glossophaga soricina (c). Em b notar a coloração diferencial do
braço longo do cromossomo X.
87
Figura 4: Coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI em
metáfase de Platyrrhinus lineatus (a-c), Sturnira lilium (d-f) e
Glossophaga soricina (g-i). As setas indicam as RONs. Em (e)
destaque para o padrão de CMA3+ do cromossomo X. Em (f)
Cabeças de seta indicam a marcação DAPI + nos pares 5, 6 e 7.
Barra: 5 μm.
88
Anexo Figura 1: Fotos das espécies Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira
lilium (b) e Glossophaga soricina (c). Fonte:
www.flickr.com/photos/morcegao/).
101
10
11
LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS
AgNO3 Nitrato de Prata AT Adenina – Timina CBG Bandeamento C com Giemsa CB-CMA3 Bandeamento C com CMA3 CB-DAPI Bandeamento C com DAPI CMA3 Cromomicina A3 DA Distamicina A DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol DNA
Desoxiribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico
DNAr DNA ribosomal
FISH Fluorescent in Situ Hybridization Hibridização in Situ Fluorescente
GC Guanina – Citosina GTG Bandeamento G com Giemsa HC Heterocromatina Constitutiva NF Número Fundamental RNAr RNA ribosomal RON Região Organizadora de Nucléolo ITS Espaçadores transcritos internos ETS Espaçadores transcritos externos
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Resumo Cromossomos mitóticos de Glossophaga soricina (2n=32,XY; NF=60),
Platyrrhinus lineatus e Sturnira lilium (2n=30,XY; NF=56) foram analisados
através da coloração convencional, bandeamento C, impregnação com nitrato de
prata (AgNO3) e fluorocromos base-específicos. Dados da análise convencional
obtidos para as três espécies estão de acordo com aqueles descritos na
literatura, exceto pela morfologia do cromossomo Y de P. lineatus, indicando
variação cromossômica geográfica para a espécie. Os blocos de HC na região
distal do braço curto dos pares 5, 6, 7 e cromossomo X, observados pelo
bandeamento C, em P. lineatus e S. lilium, além da coloração diferencial do
braço longo do cromossomo X de Sturnira lilium correspondem a um padrão
compartilhado por alguns representantes de Stenodermatinae. A fraca marcação
CMA3+
nas regiões heterocromáticas pericentroméricas e distais de alguns
cromossomos indica uma predominante associação de heterocromatina com
seqüências ricas em pares de bases GC. Contudo, os padrões diferenciais obtidos
com o emprego de fluorocromos base-específicos confirmaram a
heterogeneidade da HC quanto à sua composição (rica em AT e/ou GC) e
comprovaram características diferenciais das seqüências intergênicas
associadas às RONs (CMA3 positiva, negativa ou sem especificidade) em
representantes de Phyllostomidae.
Palavras-chave: Phyllostomidae, bandeamento C, AgNO3, CMA3, DAPI
12
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
1. Introdução
Os morcegos constituem uma das mais extraordinárias ordens de
mamíferos por possuírem a capacidade de vôo verdadeiro e uma avançada
ecolocalização, que lhes permite ocupar abrigos menos expostos à predação e à
competição, bem como explorar uma ampla variedade de nichos ecológicos,
aproveitando de forma mais eficiente os recursos naturais. Estes organismos
apresentam ampla distribuição geográfica, com uma ampla variedade de hábitos
alimentares, constituindo um grupo bem sucedido, com uma grande diversidade
de espécies (Airas, 2003; Baker et al., 2003; Jones, 2005).
Do ponto de vista citogenético, os representantes da família
Phyllostomidae são os mais estudados dentro da ordem Chiroptera. Desde seu
surgimento, no início da década de 70, as técnicas de bandeamento têm sido
amplamente utilizadas no estudo cromossômico de morcegos, particularmente o
bandeamento G que permite a identificação precisa de cromossomos e de seus
eventuais rearranjos, o bandeamento C (CBG) e a marcação com nitrato de
prata (AgNO3) que marcam regiões de heterocromatina constitutiva (HC) e
regiões organizadoras de nucléolos (RONs), respectivamente (Baker e Bickham,
1980; Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990).
Dados da literatura mostram que espécies estreitamente relacionadas
freqüentemente apresentam padrões de bandas G bastante conservados.
Contudo, certa diferenciação ocorre quanto aos padrões de bandeamento C e
RONs. Estes marcadores cromossômicos, aliados aos estudos taxonômicos têm
permitido um melhor entendimento sobre os mecanismos evolutivos
responsáveis pelas divergências encontradas nos diferentes grupos da ordem
13
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
(Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a, b;
Rodrigues et al., 2000; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001; 2002; Leite-Silva
et al., 2003).
Análise citogenética molecular utilizando fluorocromos base-específicos
como o DAPI e o CMA3 específicos para AT e GC, respectivamente, têm
permitido a caracterização de diferentes classes de HC (rica em pares de bases
AT e/ou GC, ou sem especificidade), da eucromatina (bandas G e R) e das
seqüências intergênicas associadas às RONs dentro ou entre cariótipos distintos
em diferentes espécies de mamíferos. O uso desses fluorocromos tem fornecido
informações úteis para o estudo da evolução cromossômica desses organismos.
Contudo, em morcegos apenas alguns representantes das famílias
Vespertilionidae, Phyllostomidae e Molossidae foram estudados com esse
enfoque (Bickham, 1987; Ruedas et al., 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Santos
et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003).
Neste estudo, foi realizada uma análise comparativa através de
marcadores citogenéticos diferenciais (bandeamento C e marcação com AgNO3)
e moleculares (tríplice coloração CMA3/DA/DAPI) nas espécies Glossophaga
soricina, Platyrrhinus lineatus e Sturnira lilium (Phyllostomidae). O padrão e a
heterogeneidade da HC foram analisados através da técnica de bandeamento C
e do uso de fluorocromos base-específicos (CMA3 e DAPI). A caracterização das
RONs e a variabilidade da composição de pares de bases das seqüências
intergênicas associadas a essas regiões foram estudadas pela marcação com
nitrato de prata e pelos fluorocromos CMA3 e DAPI. No conjunto, esses dados
citogenéticos fornecem subsídios para um melhor entendimento sobre a
evolução cromossômica na família Phyllostomidae.
14
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
2. Revisão Bibliográfica 2.1 Ordem Chiroptera 2.1.1 Aspectos Gerais
A ordem Chiroptera compreende um grupo de mamíferos voadores, geralmente
coloniais, que apresenta uma grande diversidade de formas decorrentes de várias
adaptações morfológicas e fisiológicas. Possui a maior variedade de hábitos
alimentares dentre os mamíferos, incluindo adaptações para serem insetívoros,
frugívoros, nectarívoros, piscívoros e hematófagos. O hábito alimentar frugívoro é o
mais comum (freqüente entre os Phyllostomidae), seguido do insetívoro (encontrado
em Molossidae e Vespertilionidae) (Airas, 2003; Baker et al., 2003; Bonato et al.,
2004; Reis et al., 2007).
Como o nome da ordem sugere (Cheir, mão; Peteron, asa), os morcegos
modificaram seus membros anteriores pelo alongamento dos ossos da mão e dedos
para sustentar e controlar movimentos de uma “membrana alar” (patágio), que se
estende entre os seus dedos, juntando-se lateral e posteriormente à parte mais baixa
da perna, seguindo até a região entre os membros posteriores (Jones, 2002). A
diferenciação gradual dos braços somada ao desenvolvimento do patágio conferiu
aos morcegos a capacidade do vôo verdadeiro, tornando-os os únicos mamíferos
com essa característica (Morton, 1989; Wilson e Reeder, 1993).
Os morcegos constituem uma das mais extraordinárias ordens de mamíferos,
não apenas por serem os únicos mamíferos que voam, mas também por possuírem
uma avançada ecolocalização. A maioria das espécies possui adaptações para
executar esse fenômeno também conhecido como biosonar, que é um processo ativo
15
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
usado por espécies que necessitam perceber o ambiente onde a visão é ineficaz
(Jones, 2005).
A ecolocalização envolve emissão de sinais de alta freqüência e captação do
eco gerado por eles em diferentes obstáculos, fazendo com que o animal determine a
sua distância e extensão pela medida do tempo entre a produção e o retorno do som.
Dessa maneira, os morcegos são capazes de ocupar abrigos menos expostos à
predação e à competição, obter estabilidade microclimática, bem como de explorar de
modo mais eficiente os recursos oferecidos pelo meio, devido à diversificação dos
seus hábitos alimentares. De fato, a ecolocalização, juntamente com a capacidade de
vôo dos morcegos, é amplamente responsável pelo sucesso global desses animais,
pela sua riqueza de espécies e habilidade de explorar diversos nichos ecológicos em
complexa relação de interdependência com o meio (Fenton, 1992; Pough et al., 1999;
Jones, 2005; Jones e Teeling, 2006).
Pela sua abundância, diversidade e complexidade biológica, os morcegos são
importantes na regulação dos ecossistemas tropicais, atuando como dispersores de
sementes de diversas espécies vegetais, polinizadores de numerosas espécies de
plantas e reguladores de populações de insetos noturnos, à medida que partilham os
recursos, especialmente os alimentares. Dessa maneira, os morcegos desempenham
um papel muito importante na manutenção dos complexos ecossistemas tropicais
sendo, por vezes, diretamente benéficos ao homem (Nowak, 1991; Marinho-Filho e
Sazima, 1998; Jones et al., 2002; Teeling et al., 2005).
Em contrapartida, esses animais podem ser reservatórios naturais de agentes
infecciosos como o protozoário Trypanossoma cruzi, o fungo Toxoplasmose gondii e
o vírus da raiva. O alto conteúdo orgânico dos solos enriquecidos com os
excrementos dos morcegos favorece a proliferação de fungos patogênicos, como o
16
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Histoplasma capsulatum, causador da histoplasmose (Constantine, 1970). Além
disso, o guano dos morcegos acumulados nos telhados de residências foi identificado
como potencial alergênico, indutor de asma e rinite em humanos (El-Ansary et al.,
1987).
Chiroptera constitui a segunda maior ordem dentre os mamíferos, com
aproximadamente 1120 espécies, sendo o segundo maior grupo em diversidade,
perdendo apenas para a ordem Rodentia. Representam aproximadamente um terço
dos mamíferos da fauna do Brasil com 167 espécies e constituem 22% das espécies
de mamíferos do mundo (Taddei, 1996; Marinho-Filho e Sazima, 1998; Simmons,
2005; Wilson e Reeder, 2005; Reis et al., 2007).
As características biológicas especiais desses animais, bem como sua alta
diversidade, juntamente com seu papel na economia, ecologia e saúde pública
tornam esse grupo um interessante objeto de estudos. Diversos trabalhos com
diferentes enfoques, tais como fisiologia, taxonomia, biologia, sistemática e
citogenética vêm sendo realizados com o intuito de contribuir para o melhor
conhecimento desses mamíferos (Taddei, 1988; Emmons e Feer, 1990; Souza e
Araújo, 1990; Santos et al., 2002; Passos et al., 2003).
2.1.2 Distribuição e Classificação
Apesar de apresentarem distribuição mundial, incluindo grandes altitudes e ilhas
remotas, como a Nova Zelândia, a maioria dos morcegos ocorre nos trópicos,
existindo poucas espécies em latitudes maiores que 50 graus. A maior diversidade de
espécies está concentrada na região Neotropical, da qual se destaca a região
amazônica que possui a fauna de morcegos mais rica do mundo (Findley, 1993;
17
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Altringham, 1996; Jones, 2002). Infelizmente estes “hotspots” de diversidade
freqüentemente coincidem com regiões de grande pressão e influência humana.
Dessa maneira, mais da metade das espécies de morcegos encontra-se em listas de
conservação, extintas ou em perigo de extinção (Jones, 2002).
Os representantes da ordem Chiroptera estão agrupados em 202 gêneros, 18
famílias e duas subordens: Megachiroptera (megabats= Old World fruit bats) e
Microchiroptera (microbats= echolocating bats). Os morcegos da subordem
Megachiroptera, conhecidos popularmente como raposas-voadoras devido à
similaridade de suas faces com a das raposas, não ocorrem no Brasil, estando
representados por 185 espécies em uma única família, a Pteropodidae, com
ocorrência limitada ao velho mundo, na região tropical da África, Índia, sudeste da
Ásia e Austrália. Devido ao tamanho desses morcegos, a orientação desses animais,
com poucas exceções, é baseada na visão, memória e olfato (Taddei, 1996; Jones,
2002; Peracchi et al., 2006; Reis et al., 2007).
A subordem Microchiroptera está representada por 930 espécies reunidas em
17 famílias, cuja distribuição é mundial, exceto nas regiões polares e algumas ilhas
distantes das áreas de continente. Os morcegos desse grupo, ao contrário dos
Megachiroptera, possuem a habilidade de usar a ecolocalização para orientação e
procura de alimento (Findley, 1993; Jones, 2002; Simmons, 2005; Peracchi et al.,
2006; Reis et al., 2007).
Das 17 famílias de Microchiroptera, nove ocorrem nas Américas, estando todas
representadas no Brasil: Emballonuridae, Furipteridae, Molossidae, Mormoopidae,
Natalidae, Noctilionidae, Phyllostomidae, Thyropteridae, e Vespertilionidae. No Brasil,
são conhecidos 64 gêneros e 167 espécies de Microchiroptera (Tabela 1) (Peracchi
et al., 2006; Reis et al., 2007). Esses morcegos habitam todo o território nacional,
18
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
ocorrendo na Amazônia, no Cerrado, Mata Atlântica, Pantanal, no árido nordeste e
em áreas urbanas (Reis et al., 2007).
Tabela 1: Número de gêneros e espécies de Microchiroptera no Brasil
Famílias Nº de gêneros Nº de espécies
Emballonuridae 7 15
Furipteridae 1 1
Molossidae 7 26
Mormoopidae 1 4
Natalidae 1 1
Noctilionidae 1 2 Phyllostomidae 40 90
Thyropteridae 1 4
Vespertilionidae 5 24
Referência: Peracchi et al., 2006; Reis et al., 2007.
2.2 Família Phyllostomidae: Taxonomia e Distribuição
Os representantes da família Phyllostomidae, também conhecidos como “leaf-
nosed bats”, são caracterizados pela presença de um apêndice nasal bem
desenvolvido, em forma de folha triangular (folha nasal), exceto nas espécies
hematófagas (Desmodontinae), onde a folha nasal é reduzida (Findley, 1993; Nowak,
1994; Medellín et al., 1997). Phyllostomidae constitui uma família taxonomicamente
diversa, apresentando o maior número de gêneros e espécies entre os Chiroptera
Neotropicais. Inclui 56 gêneros e cerca de 140 espécies, das quais aproximadamente
120 espécies foram descritas no Brasil (Baker et al., 2003; Peracchi et al., 2006; Reis
et al., 2007).
19
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
De acordo com a nova classificação proposta por Baker et al. (2003), esta família
possui os 56 gêneros agrupados em 11 subfamílias: Carollinae, Desmodontinae,
Glossophaginae, Glyphonycterinae, Lonchophyllinae, Lonchorhininae, Macrotinae,
Micronycterinae, Phyllostominae, Rhinophyllinae e Stenodermatinae (Tabela 2).
Embora Phyllostomidae seja a terceira maior família dentre os Chiroptera, seus
representantes exibem mais variações morfológicas do que qualquer outro grupo de
mamíferos, possuindo adaptações a uma grande variedade de nichos ecológicos
(Baker et al., 2003). Por conta dessa considerável heterogeneidade, há uma
discordância no que diz respeito às suas relações sistemáticas e evolutivas (Baker et
al., 2000; Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Pieczarka et al., 2005).
Os filostomídeos caracterizam-se por possuir hábito alimentar bem variável,
incluindo insetos, frutos, pólen, néctar, folhas, artrópodes, pequenos vertebrados e
sangue de vertebrados endotérmicos (aves e mamíferos). Espécies dessa família
utilizam como abrigo cavernas, fendas, rochas, minas, túneis, folhagens, ocos de
árvores e edificações (Câmara, 1991; Jones, 2002).
A subfamília Glossophaginae é representada por morcegos que se alimentam
de néctar, pólen e às vezes de partes florais. Esses animais possuem pequeno porte,
sendo adaptados ao seu tipo de alimentação, apresentando um focinho alongado e
uma língua longa e extensível, com numerosas papilas filiformes na extremidade
distal. Possuem vôo muito manobrável, sendo capazes de pairar próximos à flor para
retirada do néctar (Taddei, 1983). Esta subfamília é constituída por 13 gêneros
(Tabela 2) e 33 espécies, distribuídas nas Américas Central e do Sul, indo desde o
Sul do México ao Sul do Brasil, e representa a segunda maior subfamília dentro de
Phyllostomidae. No Brasil está representada por 8 gêneros e 14 espécies (Reis et al.,
2007). O gênero Glossophaga está representado por cinco espécies (G.
20
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
commissarisi, G. leachi, G. longirostris, G. morenoi e G. soricina). Dentre essas
apenas três ocorrem no Brasil (G. commissarisi, G. longirostri e G. soricina). A
espécie G. soricina tem como localidade-tipo o Suriname e está distribuída por toa
região neotropical, ocorrendo desde o México até as Guianas, sudeste do Brasil e
norte da Argentina (Simmons, 2005).
Glossophaginae apresenta uma classificação sistemática bastante discutível,
considerando que dados morfológicos, citogenéticos e imunológicos têm indicado
uma possível origem polifilética para o grupo (Nowak, 1994; Hoffmann e Baker, 2001;
Baker et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). Entretanto, alguns autores têm fornecido
informações compatíveis com a hipótese de que Glossophaginae seja de origem
monofilética, baseando-se em dados imonológicos e eletroforéticos (Haiduk e Baker,
1982; Gimenez et al., 1996).
Alguns pesquisadores aceitam a hipótese monofilética para a família
Phyllostomidae. Esta monofilia tem sido apoiada por dados morfológicos (Hood e
Smith, 1982; Wetterer et al., 2000) e bioquímicos (Honeycutt et al., 1980; Arnold et
al., 1983). Além disso, a filogenia de espécies de Phyllostomidae tem sido
amplamente discutida com base nas análises de homeologia baseadas nos padrões
de bandeamento cromossômico (Baker e Bickham, 1980; Varella-Garcia et al., 1989;
Souza e Araújo, 1990; Baker, 2003; Ribeiro et al., 2003).
Stenodermatinae representa a maior subfamília em Phyllostomidae,
abrangendo 20 gêneros (Tabela 2) e aproximadamente 67 espécies. Seus
representantes apresentam dieta basicamente frugívora, podendo ser
complementada por néctar de flores em períodos de seca onde as frutas são
escassas. Por esta razão, são considerados como um dos mais importantes
dispersores de sementes, essenciais para a regeneração de florestas e colonização
21
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
de plantas em novas áreas (Emmons e Feer, 1990; Altringham, 1996; Baker et al.,
2003; Reis et al., 2007).
Os morcegos da subfamília Stenodermatinae têm sua distribuição na América
Central e do Sul e têm sido considerados muito importantes para a biodiversidade
(Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker, et al., 2003). O gênero Sturnira
compreende 15 espécies (Simmons, 2005; Sánchez-Hernadez et al., 2005), onde
apenas quatro espécies são representadas no Brasil (S. bidens, Sturnira lilium, S.
magna e S. tildae) (Reis et al., 2007). S. lilium ocorre nas pequenas Antilhas e do
México até a região nordeste da Argentina, Uruguai e Paraguai (Simmons, 2005). No
Brasil distribui-se em todo o território (Eisenberg e Redford, 1999). O gênero
Platyrrhinus está constituído por 14 espécies (Velazco, 2005), das quais apenas cinco
espécies ocorrem em território brasileiro (P.brachycephalus, P. helleri, P. infuscus, P.
lineatus e P. recifinus) (Reis et al., 2007). P. lineatus é uma espécie endêmica à
América do Sul e ampla distribuição no continente, com registros para Colômbia,
Peru, Equador, Guiana Francesa, Suriname, Bolívia, Brasil, Uruguai, Argentina e
Paraguai. Brasil (Simmons, 2005). No Brasil, ocorre em todos os biomas, sendo rara
apenas na Amazônia. Nos outros biomas é a espécie mais comumente registrada em
levantamentos faunísticos (Reis et al., 2007).
22
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Tabela 2. Classificação das Subfamílias, tribos e gêneros de Phyllostomidae proposta por Baker et al. (2003)
Família Phyllostomidae
Macrotinae Lonchophyllinae Macrotus Lionycteris Micronycterinae Lonchophylla Micronycteris Platalina Lampronycteris Carolliinae Desmodontinae Carollia Diphyllini Glyphonycterinae Diphylla Glyphonycteris Desmodontini Trinycteris Desmodus Rhinophyllinae Diaemus Rhinophylla Lonchorhininae Stenodermatinae Lonchorhina Sturnirini Phyllostominae Sturnira Macrophyllini Stenodermatini Macrophyllum Vampyressina Trachops Chiroderma Phyllostomini Vampyriscus Lophostoma Uroderma Tonatia Vampyressa Mimon Mesophylla Phylloderma Vampyrodes Phyllostomus Platyrrhinus Vampyrini Mesostenodermatini Chrotopterus Enchisthenina Vampyrum Enchisthenes Glossophaginae Ectophyllina Glossophagini Ectophylla Monophyllus Artibeina Glossophaga Artibeus Leptonycteris Dermanura Brachyphyllini Stenodermatina Brachyphylla Ariteus Phyllonycterini Ardops Erophylla Stenoderma Phyllonycteris Centurio Choeronycterini Pygoderma Anourina Sphaeronycteris Anoura Ametrida Choeronycterina Phyllops Hylonycteris Choeroniscus Choeronycteris Musonycteris Lichonycteris Scleronycteris
23
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
2.3 Citogenética de Chiroptera 2.3.1 Aspectos Gerais
Embora os caracteres morfológicos tenham sido amplamente utilizados em
estudos genéticos, sistemáticos e evolutivos, a análise cariotípica surgiu como uma
complementação destes estudos, após o aperfeiçoamento das técnicas de
preparação e coloração citológicas. Técnicas adequadas de tais preparações ainda
não haviam sido descritas para mamíferos até 1956, quando Ford e Hamerton
descreveram uma técnica a partir da utilização de células de medula óssea com o
emprego de uma solução salina hipotônica que permitia o aumento do volume celular
e um melhor espalhamento cromossômico.
Estudos citogenéticos iniciais em Chiroptera baseavam-se exclusivamente na
análise convencional, permitindo a determinação dos números diplóides, número de
braços autossômicos (número fundamental=NF), morfologia cromossômica e sistema
de determinação sexual em várias espécies (Baker, 1967; Baker e Patton, 1967; Hsu
et al., 1968; Yonenaga et al., 1969). Esse tipo de análise foi possível graças à técnica
de preparação citológica descrita para mamíferos por Ford e Hamerton (1956).
Os primeiros estudos abordando a citogenética evolutiva de morcegos foram
realizados na década de 1960. Baker (1967) analisou 27 espécies representantes de
seis subfamílias e 18 gêneros da família Phyllostomidae e estabeleceu uma relação
filogenética baseada nas variações cariotípicas das espécies. Nesta mesma época,
Baker e Patton (1967) descreveram os cariótipos de 32 espécies, representantes de
nove gêneros de Vespertilionidae, e discutiram as vantagens do uso do cariótipo
como bom indicador filogenético.
24
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Hsu et al. (1968) analisando 26 espécies de morcegos da família
Phyllostomidae, descreveram o sistema sexual múltiplo em seis espécies
pertencentes aos gêneros Artibeus, Carollia e Choeroniscus, e discutiram uma
possível origem para este sistema de determinação sexual em morcegos. No final
dos anos 60, Yonenaga et al. (1969) realizaram os primeiros estudos com morcegos
filostomídeos brasileiros, descrevendo o cariótipo de seis espécies.
Nesse mesmo período, vários trabalhos haviam sido publicados descrevendo o
cariótipo de diversas espécies americanas, européias e brasileiras de diferentes
famílias de morcegos e até o início de 1970, tinham sido publicados trabalhos
contendo observações feitas em relação ao mecanismo de determinação sexual,
devido à ocorrência de translocações entre o cromossomo X e autossomos em
algumas espécies de morcegos como as do gênero Artibeus (Beçak et al., 1968,
1969) e Carollia (Patton e Gardner, 1971).
No início da década de 1970, um estudo muito importante baseado na análise
citogenética convencional foi realizado em um grande número de espécies
representantes das famílias Desmodontinae, Emballonuridae, Molossidae, Natalidae,
Phyllostomidae e Vespertilionidae. Neste estudo, Baker (1970) observou uma elevada
variação cariotípica dentro da ordem, com ampla variação no número diplóide, indo
de 2n=16 (Tonatia bidens) a 2n=62 (Rhinolophus cornulus). Casos de variação
cromossômica em morcegos também foram identificados em outros trabalhos (Baker
e Lopez 1970; Baker e Hsu, 1970). Dessa forma, estes estudos iniciais contribuíram
consideravelmente para um primeiro entendimento da evolução cariotípica da ordem.
25
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
2.3.2 Aspectos Citogenéticos e Evolutivos da Família Phyllostomidae: Ênfase para as Subfamílias Glossophaginae e Stenodermatinae
Estudos realizados na família Phyllostomidae demonstraram uma variabilidade
nos números diplóides (2n), que vão desde 2n=14 em Vampyressa melissa
(Stenodermatinae) até 2n=46 em Macrotus waterhousii (Macrotinae), bem como do
número de braços autossômicos (número fundamental = NF) variando de 20 (Tonatia
bidens) a 68 (Micronycteris megalotis), onde os números mais freqüentes são
2n=30/32 e NF=56/60 (Baker, 1970).
A evolução cromossômica desta família sempre foi um assunto muito discutido.
Baseado nas altas freqüências de cariótipos com 2n=30-32 e NF=56-60 entre as
diferentes espécies de Phyllostomidae, Baker (1973) sugeriu que este poderia ser o
cariótipo primitivo e os demais derivados. Entretanto, posteriormente Patton e Baker
(1978) propuseram que o cariótipo ancestral para a família seria 2n=46 e NF=60,
similar ao observado em M. waterhousii. Portanto, foi proposto que a evolução
cariotípica entre os filostomídeos pode ter levado a uma redução dos números
diplóides através de eventos de fusão cêntrica. Por outro lado, com base em análise
cladística realizada nesta e em famílias relacionadas (Noctilionidae, Mormoopidae e
Vespertilionidae) através dos bandeamentos C e G, Baker e Bickham (1980)
sugeriram que 2n=42/NF=60 seria a condição primitiva para a família Phyllostomidae.
Análises citogenéticas realizadas por Baker e Bickham (1980) em várias
espécies de morcegos, indicaram que a evolução cariotípica de algumas famílias da
ordem Chiroptera (Phyllostomidae, Mormopidae, Mystacinidae e Vespertionidae) não
ocorreu de maneira uniforme. As alterações cromossômicas apresentaram diferenças
tanto na extensão como na velocidade dos eventos evolutivos. Dessa maneira, os
26
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
morcegos foram classificados em grupos que apresentaram mudanças rápidas e
consideráveis (megaevolução cariotípica), e em grupos que apresentaram uma lenta
taxa de evolução cromossômica (conservacionismo cromossômico). Espécies
estreitamente relacionadas exibiram extensos rearranjos cromossômicos, de forma
que as homeologias não puderam ser determinadas pelo bandeamento G. De acordo
com Varella-Garcia et al. (1989) esta não-uniformidade na evolução cromossômica é
uma característica não apenas de algumas famílias, mas de toda a ordem Chiroptera.
As translocações são fenômenos comuns na evolução cromossômica dos mamíferos,
particularmente as Robertsonianas, que levam à formação de cromossomos meta-
submetacêntricos ou subtelocêntricos a partir da fusão cêntrica de dois elementos
acrocêntricos. A atuação desse tipo de translocação pode ser observada em toda a
ordem Chiroptera, particularmente na família Phyllostomidae, que é intensamente
estudada sob o enfoque citogenético. Quando a fusão ocorre entre dois autossomos
o número diplóide é reduzido e o NF permanece o mesmo. Por outro lado, quando
ocorre entre um autossomo e cromossomos sexuais há redução tanto do número
diplóide quanto do número fundamental. Se o evento envolver apenas o X, ocorre
uma mudança no número diplóide da fêmea em relação ao macho, embora o NF
permaneça o mesmo nos dois sexos (Hsu et al., 1968).
Representantes da subfamília Glossophaginae apresentam números diplóides
que vão de 2n=16 em Choeronicteris mexicana a 2n=36 em Lonchophylla thomasi e
número fundamental variando de NF=24 (Hylonycteris underwoodi) a NF=60
(Glossophaga longirostris), sendo 2n=30/32 e NF=56/60 os cariótipos mais
freqüentes (Tabela 3) (Hsu et al., 1968; Baker, 1979; Baker e Bickham, 1980; Varella-
Garcia et al., 1989; Ribeiro et al., 2003).
27
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Com base em dados cromossômicos, dois grupos distintos foram reconhecidos
para Glossophaginae, um grupo conservado que inclui Glossophaga, bem como um
altamente derivado incluindo Anoura. No cariótipo de Glossophaga soricina é possível
reconhecer todos os braços cromossômicos do cariótipo de Macrotus waterhousii
(primitivo), embora alguns desses braços tenham sido encontrados reorganizados em
um único cromossomo (Baker e Bass, 1979). Por outro lado, o cariótipo de Anoura
caudifer, com exceção dos maiores autossomos, sofreu extensos rearranjos
cromossômicos, não sendo possível determinar a presença de homeologias através
do bandeamento G entre seu cariótipo e o de Glossophaga e/ou Macrotus (Varella-
Garcia-et al., 1989).
Casos de variação cariotípica foram encontrados em representantes da
subfamília Glossophaginae. Baker (1967) e Hsu et al. (1968) numa análise
citogenética em Choeroniscus godmani descreveram o cariótipo 2n=19 em todos os
exemplares analisados. Entretanto, posteriormente, Patton e Gardner (1971) ao
analisarem uma fêmea de C. godmani da Costa Rica, observaram número diplóide
2n=20, mostrando a presença de variação intraespecífica.
Os representantes de Stenodermatinae abrangem diferentes números diplóides
de 2n=14 (Vampyressa melissa) a 2n=44 (Uroderma bilobatum) e número
fundamental variando de NF=20 (V. pusilla) a NF=62 (U. magnirostrum) (Tabela 3).
Embora essa subfamília tenha sido caracterizada por uma extensa conservação
cariotípica como é o caso de espécies dos gêneros Artibeus, Sturnira e Platyrrhinus,
cujos cariótipos são altamente conservados, também são encontrados grupos que
englobam espécies portadoras de inúmeros rearranjos cromossômicos, como as dos
gêneros Uroderma e Vampyressa, que apresentam ampla variabilidade inter e
28
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
intraespecífica (Tabela 3) (Baker e Lopez, 1970; Baker, 1973; Baker et al., 1973;
Gardner, 1977; Baker, 1979; Varella-Garcia et al., 1989; Silva et al., 2005).
O sistema simples de determinação cromossômica do sexo do tipo XX;XY é o
mais comum em mamíferos, sendo também o mais freqüente em morcegos.
Entretanto, a família Phyllostomidae apresenta adicionalmente dois mecanismos
distintos de determinação do sexo, o sistema múltiplo XX;XY1Y2 e o sistema Neo-XY
(considerado como derivado do sistema múltiplo), ambos originados a partir de
eventos de translocação entre autossomos e cromossomos sexuais (X e Y) (Baker,
1979; Tucker, 1986; Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e
Souza, 1998b).
O sistema múltiplo tem sido descrito nas subfamílias Carollinae, Glossophaginae
e Stenodermatinae, com esta última apresentando o maior número de espécies com
esse sistema sexual. Por outro lado, o sistema Neo-XY tem sido descrito apenas na
subfamília Stenodermatinae, particularmente nos gêneros Sturnira, Platyrrhinus,
Chiroderma, Uroderma, Vampyressa e em algumas espécies de Artibeus.
Particularmente, amostras de A. cinereus provenientes dos Estados de Pernambuco
e do Pará mostraram sistema sexual Neo-XY diferente de exemplares coletados em
Trinidad, cujo sistema sexual foi XX;XY1Y2 (Baker, 1979; Tucker, 1986; Varella-Garcia
et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998b).
A hipótese de que o sistema sexual XY1Y2, observado em representantes da
família Phyllostomidae, surgiu por translocação simples de um autossomo
acrocêntrico para o cromossomo X foi proposta por Hsu et al. (1968). Tucker (1986)
propôs que a origem do sistema múltiplo, bem como do tipo Neo-XY, nesta família, foi
decorrente da fixação evolutiva de translocações ancestrais entre autossomos e
cromossomos sexuais. No sistema múltiplo, o cromossomo Y original passou a ser
29
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
denominado de Y1 e o autossomo homólogo, cujo par foi translocado para o X, foi
chamado de Y2. Por outro lado, após a formação da condição XY1Y2, uma
translocação subseqüente do Y2 para o Y1 deu origem ao sistema Neo-XY (Tucker,
1986; Tucker e Bickham, 1986).
Tabela 3- Dados cromossômicos de espécies das subfamílias Glossophaginae
e Stenodermatinae
Subfamília Glossophaginae
Espécies 2n NF X Y Y2 Referências
Anoura caudifer 30 56 SM A 2,9,17,25,18
A. cultrata 30 54 SM A 17
A. geoffroyi 30 56 SM A 1,4,9,25
Choeroniscus minor 22 36 SM - 27,28
C. intermedius 20 36 SM A 2,19,25
C. mexicana 24-26 - SM - 1,2,4
C.godmani 19/20 32/36 SM ST/A A 1,4,13,17
Brachyphylla cavernarum 32 60 SM A 26
B. nana 32 60 SM A 26
Erophylla cezekorni 32 60 SM A 26
Glossophaga
alticola 32 60 M A
1
G. commissarisi 32 60 M A 1,4
G. longirostris 32 60 M A 17
G. soricina 32 60 M/SM A 1,4,19
Hylonycteris underwoodi 16 24 - - 2
Leptonycteris sanborni 32 60 M A 1,4
L. nivalis 32 60 - - 2
Lichonycteris obscura 24/28 44/50 SM A 17
Monophyllus pletodon 32 60 SM A 17
M. redmani 32 60 SM A 10
Phyllonycteris aphylla 32 60 SM A 25
P. obtusa 32 60 SM A 25
30
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Stenodermatinae Espécies 2n NF X Y Y2 Referências
Ametrida centurio 30-31 - ST SM
M/ST 19
Ardops nichollsi 30-31 56 SM ST A 22
Ariteus flavenscens 30-31 56 ST ST A 22
Artibeus aztecus 30-31 56 ST A A 2
A. cinereus 30-31/30 56 ST SM/M M/- 19
A. concolor 30/31 56 ST SM/A M/A 26
A. obscurus 30-31 56 ST A A 31
A. fimbriatus 30-31 56 - - - 29
A. glaucus 30-31 56 ST A A 24
A. hirsutus 30-31 56 ST ST A 17
A. inopinatus 30-31 56 ST ST A 17
A. jamaicensis 30-31/30 56 ST A/- A 1,4,8,9
A. lituratus 30-31 56 SM/ST A/ST A/SM 1,4,5,6,8,9
A. phaeotis 30 56 ST SM 1,4
A. planirostris 30-31 56 ST A A 24
A. toltecus 30-31 56 ST A A 1,4
A. watsoni 30 56 ST SM 17
Centurio senex 28 52 ST SM 1,4,9
Chiroderma salvini 26 48 ST/SM SM 17
C. improvisum 26 48 ST ST 23
C. trinitatum 26 48 ST SM/ST 9,23,24
C. villosum 26 48 ST/SM SM 4,9,18,24
Ectophylla alba 30 56 SM A 17,21
Enchisthenes hartii 30/30-31 56 ST SM -/A 1,4,9
Mesophylla macconnelli 21/21-22 20 A 1,9,12
Phyllops haitiensis 30-31/30 56 ST ST A/- 21,22
Platyrrhinus lineatus 30 56 ST - 26
P. dorsalis 30 56 ST SM 2
P. helleri 30 56 ST SM 1,4,9
P. infuscus 30 56 ST A 24
P. brachycephalus 30 56 ST SM 2
P. nigellus 30 56 ST A 24
P. recifinus 30 56 ST -
P. vittatus 30 56 ST A 2
Pgloderma bilobatum 30-31
56
M
SM
SM
2
31
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Espécies 2n NF X Y Y2 Referências
Sphaeonycteris toxophyllum
28 52 ST SM
17
Stenoderma rufum
30-31
56
ST
A
A
14
Sturnira bidens 30 56 ST A 7
S. erythromos 30 56 ST A 7
S. lilium 30 56 ST SM 1,4,8,9
S. ludovici 30 56 ST SM/A 1,4,8
S. magna 30 56 ST A 24
S. mordax 30 56 - - 17
S. nana 30 56 ST A 24
S. thomasi 30 56 - - 17
S. tildae 30 - ST SM 9
Uroderma bilobatum 38 a 44 44/50 ST/SM SM/M 1,4,9,10,12,15,34
U. magnirostrum 35/36 60-62 SM/SM SM/M 10,12,29
Vampyressa melissa 14 24 ST - 24
V. nymphaea 26 48 ST SM/A 2,17,24
V. pusilla 18/23/22-23/23-24 20/22 ST/A SM/ST 2,17,24
V. bidens 26 48 - - 26
V. brocki 24 44 ST - 26
Vampyrodes caracciolli 30 46 ST SM 2,9
M= Metacêntrico; SM= Submetacêntrico; ST= Subtelocêntrico; A= Acrocêntrico
- = dado não disponível ou não descrito na literatura
Referências: (1) Baker, 1967; (2) Yonenaga, 1968; (3) Baker, 1970; (4) Hsu et al., 1968; (5) Yonenaga et al., 1969; (6)
Beçak et al., 1969; (7) Gardner e O’Neill, 1969; (8) Kibliski, 1969; (9) Baker e Hsu, 1970; (10) Baker e Lopez, 1970; (11)
Baker e Bleier, 1971; (12) Hsu e Berniscke, 1971; (13) Patton e Gardner, 1971; (14) Genoways e Baker, 1972; (15)
Baker e McDaniel, 1972; (16) Hsu e Bernischke, 1973; (17) Baker, 1973; (18) Pathak e Stock, 1974; (19) Stock, 1975;
(20) Hsu et al., 1975; (21) Greenbaum et al., 1975; (22) Nagorsen e Peterson, 1975; (23) Baker e Genoways, 1976; (24)
Gardner, 1977; (25) Baker 1979; (26) Varella-Garcia et al., 1989; (27) Ribeiro et al., 2003; (28) Neves et al., 2001; (29)
Baker et al., 2003; (30) Silva et al., 2005; (31) Lemos-Pinto, 2007;
32
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
2.4 Marcadores Cromossômicos na Análise Citogenética de Morcegos
Com o desenvolvimento de técnicas de bandeamento cromossômico no início da
década de 70, em especial os bandeamentos Q, G e R, os estudos citogenéticos
foram aperfeiçoados e dessa forma, além de determinarem a morfologia
cromossômica e os números diplóide e fundamental, permitiram identificar cada par
de homólogos, demonstrar homeologias de cromossomos inteiros ou de segmentos
cromossômicos entre diferentes espécies, bem como identificar rearranjos
cromossômicos ocorridos ao longo do processo evolutivo (Sumner, 1990).
Dentre as técnicas atualmente empregadas na análise citogenética de
morcegos, pode-se destacar técnicas básicas como o bandeamento G (Seabright,
1971), que promove a diferenciação longitudinal dos cromossomos, permitindo
identificar cada cromossomo e seus eventuais rearranjos, a técnica de bandeamento
C (Sumner, 1972) que permite definir o padrão de localização da heterocromatina
constitutiva (HC), e a marcação com nitrato de prata (Howell e Black, 1980) que
marca as regiões organizadoras de nucléolos (RONs), indicando a localização
cromossômica dos genes para o RNAr transcricionalmente ativados na intérfase
anterior.
Com o avanço da citogenética, a partir do final dos anos 80, os estudos
citogenéticos em Chiroptera foram ainda mais aperfeiçoados. Análise citogenética
molecular utilizando fluorocromos base-específicos na caracterização da composição
da HC bem como das regiões espaçadoras associadas às RONs têm fornecido
informações úteis para o estudo da evolução cromossômica (Santos e Souza,
1998a,b; Santos et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003).
33
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
A partir do desenvolvimento de novos enfoques citogenéticos utilizando-se
sondas específicas para localização de seqüências cromossômicas através da
hibridização in situ fluorescente (FISH) o estudo citogenético molecular vem
sendo amplamente realizado em diversos grupos de organismos. Em morcegos,
o emprego de sondas de DNA ribossomal e/ou telomérico vem sendo realizado
em algumas espécies. A FISH com sondas de DNAr foi realizada em 15
espécies da família Phyllostomidae (Baker et al., 1992; Santos et al., 2001, 2002)
e três de Molossidae (Leite-Silva et al., 2003), auxiliando no estudo da
variabilidade das RONs em diferentes organismos, uma vez que esta técnica
localiza sítios de DNAr independente de sua atividade (Baker et al., 1992;
Pendás et al., 1993).
Por outro lado, FISH com sondas de DNA telomérico tem sido usada em
várias espécies de morcegos, particularmente nas famílias Phyllostomidae
(Meyne et al., 1990, 2002; Faria e Morielle-Versute, 2002; Volleth et al., 2002;
Ribeiro et al., 2003), Molossidae (Meyne et al., 1990; Finato et al., 2000) e
Vespertilionidae (Ono e Yosida, 1997; Ao et al., 2006).
A análise da citogenética molecular comparativa através da pintura
cromossômica (ZOO-FISH), muitas vezes é complementar ao bandeamento
cromossômico, mostrando-se mais confiável no estudo de espécies relacionadas
que se diferenciaram por diferentes rearranjos cromossômicos. É uma acurada
ferramenta para a determinação de homeologias entre diferentes espécies, e tem
ajudado na compreensão da evolução cariotípica em mamíferos (Scherthan et
al., 1994; Yang et al., 1995; Volleth et al., 1999; Pieczarka et al., 2005; Faria e
Morielle-Versute, 2006).
34
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
A utilização da ZOO-FISH, tem revelado muitos rearranjos cromossômicos
que levaram à organização no genoma de diferentes espécies de mamíferos e
outros vertebrados. Entretanto, em Chiroptera, dados obtidos pela utilização desta
técnica ainda são raros. Apenas algumas espécies pertencentes a cinco famílias
de Microchiroptera (Mollossidae, Phyllostomidae, Vespertilionidae, Hipposideridae
e Rhinolophidae) e a única família de Megachiroptera (Pteropodidae) foram
estudadas pela pintura cromossômica comparativa (Volleth et al., 1999, 2002;
Pieczarka et al., 2005; Ao et al., 2006; Faria e Morielle-Versute, 2006).
Tais marcadores cromossômicos têm sido amplamente utilizados em
representantes da Ordem Chiroptera em todo o mundo, particularmente em
Phyllostomidae que é bastante representada (Tabela 4). Esses marcadores
aliados aos estudos taxonômicos e filogenéticos têm auxiliado no melhor
entendimento dos mecanismos evolutivos responsáveis pelas divergências
encontradas nos diferentes grupos da ordem Chiroptera (Varella-Garcia et al.,
1989; Souza e Araújo, 1990; Rodrigues et al., 2000; Neves et al., 2001; Pieczarka
et al., 2005; Reis et al., 2007).
A elucidação de aspectos relacionados à filogenia de diferentes grupos tornou-
se possível pelo avanço e melhoramento de vários marcadores citogenéticos, uma
vez que estes permitem identificar rearranjos cromossômicos ocorridos. Dessa
forma, o uso de variadas técnicas citogenéticas bem como a determinação das
diferenças citotaxonômicas existentes entre espécies relacionadas tem sido muito
importante na análise cromossômica evolutiva de diferentes grupos de vertebrados,
particularmente morcegos (Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990;
Santos e Souza, 1998a,b; Rodrigues et al., 2000; Neves et al., 2001; Santos et al.,
2001, 2002; Leite-Silva et al., 2003, Pieczarka et al., 2005).
35
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Tabela 4 – Síntese de dados citogenéticos em espécies de Phyllostomidae
Espécies estudadas
2N
NF
Estudos
Referências
Subfamília Macrotinae
Macrotus californicus 40 60 GTG, CBG. 13 M. waterhousii
46 60 Conv., GTG,
CBG. 2,13,50
Subfamília Micronycterinae
Micronycteris brachiots 32 60 GTG, CBG. 13,15,50 M.daviesi 28 52 Conv. 15,50 M.hirsuta 28/30 32 Conv., CBG. 9,10,12,14,48
M.megalotis 40/42 68/70 Conv., GTG, CBG, RON e Fluorocromo
12,25,36,49
M.minuta 28 52 Conv., GTG, CBG 9, 12, 14,25,36
M.nicefori 28 52 Conv., GTG, CBG.
2,13,15,50
M.schmidtorum 38 66 Conv. 15,50 M.sylvestris
22 40 Conv. 15,50
Subfamília Desmodontinae
Desmodus rotundus 28 52 Conv., GTG, CBG, RON e Fluorocromos
12,19, 31,43,52
Diaemus youngii 32 60 Conv., GTG, CBG, e RON.
12,16,20,31
Diphylla ecaudata 32 60 Conv., GTG, CBG, RON e Fluorocromos
12,22,43
Subfamília Lonchorhininae
Lonchorhina aurita
32 60 Conv. 3,9,12,14
Subfamília Phyllostominae
Chrotopterus auritus
28 52 Conv., GTG, CBG e RON.
15,25,32,50,51
Macrophyllum macrophyllum 32 56 Conv. 15,50 Mimon bennettii 30 56 Conv. e GTG. 14,15,50 M.crenulatum
32 60 Conv., GTG e
CBG. 3,7,12,22,25,36
M.koepckeae 32 60 Conv. 15 Phylloderma stenops 32 58 Conv., RON e
FISH 3,9,12,14,25,44
Phyllostomus discolor 32 60 Conv.,GTG, CBG,
RON e FISH 2,3,12,29,33, 40,42,44,52
P.elongatus 32 58 Conv., GTG,
CBG, RON e FISH
13,15,46
P.hastatus 32 58 Conv., GTG, CBG, RON e
FISH
3,18,29,31,36,37, 40,44,52
36
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Espécies estudadas 2N NF Estudos Referências
P.latifolius 32 58 Conv. 15,25 Tonatia bidens 16 20 Conv., GTG,
CBG, RON e FISH
2,13,15,44,50
T. brasiliense 30 56 Conv. e GTG. 15,50 T. carrikeri 26 46 Conv. 15,50 T. minuta 30 56 Conv., GTG e
CBG. 2,13,15
T. schulzi 28 36 Conv., GTG e CBG.
15,50
T. silvícola 34 60 Conv. 15,50 T. saurophyla 16 20 Conv., C, G e
RON 2,3,12,23,25,36,49
T. venezuelae 30 56 Conv. 15 Trachops cirrhosus 30 56 Conv, RON e
FISH 9,12,25,44
Vampyrum spectrum 30 56 Conv. 3,9,12,15,50 Subfamília Glossophaginae
Anoura caudifer 30 54/ 56 Conv, GTG, CBG e RON.
9,12,24,44,50
A. cultrata 30 54 Conv. 15,50 A. geoffroyi 30 56 Conv. e GTG 3,15,24,50
Brachyphylla cavernarum 32 60 Conv. 50 B. nana 32 60 GTG e CBG. 13,50
Choeroniscus godmani 19/20 32/36 Conv. 2,15,50 C. intermedius 20 36 Conv, GTG, CBG
e RON. 13,15,50
C. minor 20 36 GTG, CBG e RON.
38,39
Chrotopterus auritus 20 36 G, C e RON 25 Choeronycteris mexicana 16 24/26 Conv. e GTG. 2,5,
Erophylla bombifrons 32 60 Conv. 4 E. cezekorni 32 60 GTG e CBG. 15,54
Glossophaga alticola 32 60 Conv. 2 G. commissarisi 32 60 Conv. 2,50
G.leachii - - Conv. 50 G. longirostris 32 60 Conv. 13,17,50
G. soricina 32
60 Conv., GTG, CBG, RON e
FISH
14,18,24,31,38, 39,44,50
Hylonycteris underwoodi - - GTG. 50 Leptonycteris nivalis - - Conv. 50
L. sanborni 32 60 Conv. e GTG. 2,50 Lampronycteris brachyotis 32 60 G, C e RON 36,49
Lichonycteris obscura 24 44 Conv. 12,15,50 Monophyllus harrisoni - - GTG. 50
M. plethodon - - Conv. 50 M. redmani 32 60 Conv., GTG e
CBG. 4,13,50
Phyllonycteris aphylla 32 60 GTG e CBG. 13,50 P. poeyi
- - Conv. 50
Subfamília Lonchophyllinae Lionycteris spurrelli 28 50/52 Conv., GTG, CBG
e RON. 12,15,24,25,38,39,
50 Lonchophylla robusta 28 50 Conv. 15,50
37
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Espécies estudadas 2N NF Estudos Referências
L. thomasi 30/32/36 34/38/40/48
Conv., GTG, CBG e RON.
9,12,15,22,24,25, 38,39,50
Subfamília Carolliinae
Carollia benkeithi 22 38 C, G e RON 27,28,35,46,48 C. brevicauda 20/21 36 Conv., GTG e
CBG. 15,35,37,48,50
C. castanea 22 38 Conv., GTG, CBG e RON.
15,50
C. perspicillata 20/21 36 Conv., GTG, CBG, RON,
Fluorocromo e FISH
2,3, 5,12,13,15,17,18, 28,29,31,34,35,41,
48,51,52 C. subrufa 20/21 36 Conv. 2,50
Subfamília Glyphonycterine
G. sylvestris - - - - G. daviese - - - -
Subfamília Rhinophyllinae
Rhinophylla fischerae 34 56 Conv. 5,12,15,50 R. pumilio
26/34/36 48/56/
62/64 Conv. C, G e RON 5,12,13,14,15,25,
27,34,50,51 Subfamília Stenodermatinae
Ametrida centurio 30/31 56 Conv. 2,12,15,50 Artibeus aztecus - - Conv. 50
A. cinereus 30 56 Conv., GTG, CBG, RON e
FISH
2,12,13,15,42,44, 47,48,50,51
A. concolor 31 56 Conv. 14,15,50 A. fimbriatus 30/31 56 Conv. GTG, CBG,
RON e FISH 44
A. fuliginosus - - Conv. 15,50 A. hartii - - GTG e CBG. 50
A. hirsutus - - Conv. 50 A. inopinatus - - Conv. e CBG. 50
A. jamaicensis 30/31 56 Conv, GTG, CBG, RON e FISH
2,3,4,12,13,15, 29,42,44,49,50,51
A. lituratus 30/31 56 Conv., GTG, CBG, Ag-RON,
FISH
2,4,15,31, 42,44,47,49,
50,51,52 A. obscurus 30/31 56 Conv., CBG,
RON e Fluorocromos.
30
A. Phaeotis
30 56 Conv., GTG e CBG.
13,15,50
A. planisrostris 30/31 56/57/58/59
Conv., GTG, CBG, RON e
FISH
15,17,18,22,31,47,50,51
A. toltecus 30/31 56 Conv. 2,50 A. turpis 30/31 56 Conv. 2
A. watsoni 30 56 Conv., GTG e CBG.
13,50
Centurio senex
28 52 Conv., GTG e CBG.
1,2,3,13,15,50
38
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Espécies estudadas 2N NF Estudos Referências
Chiroderma doriae 26 48 Conv., GTG, CBG e RON.
31,50,51,52
C. trinitatum 26 48 RON 2,3,11,15,49,50 C. villosum 26 48 Conv. C, G e RON 1,2,3,13,15,26,31,
49,50,51 C. improvisum - - Conv. 50
C. solvini 26 48 Conv. 15,50 Ectophylla alba - - Conv. 50
Enchisthenes hartii 30/31 56 Conv, GTG e CBG.
1,2,13,15,49
Mesophylla macconnelli 21/22 20 Conv. 2,3,10,12,15,25,50 Phyllops halltensis 30 56 GTG e CBG. 13
Platyrrhinus brachycephalus 30 56 Conv. e G 10,15,49,50 P. dorsalis 30 56 Conv. 15,50 P. helleri 30 56 Conv., G e RON 1,2,15,25,26,49,50
P. infuscus 30 56 Conv. 15,22,50 P. lineatus 30 56 Conv., GTG,
CBG, RON e FISH
17,18,31,52,47, 50,51
P. vittatus 30 56 Conv, GTG e CBG.
13,15,50
Pygoderma bilabiatum 30/31 56 Conv. 15,33,50 Sphaeronycteris toxophyllum 28 52 Conv. 9,12,15,50
Stenoderma rufun 30/31 56 Conv. 50 Sturnira bidens 30 56 Conv. 15,21,50 S. erythromos 30 56 Conv., GTG e
CBG. 13,15,50
S. lilium 30 56 Conv., GTG, CBG, Ag-RON e
FISH
2,13, 15,18,26,29,31,44,
47,49,50,51 S. ludovici 30 56 Conv. 2,15,50 S. magna 30 56 Conv. 15,22,49,50 S. mordax - - Conv. 50 S. tildae 30 56 Conv. e G 3,15,49,50 S. nana 30 56 Conv. 15,50
S. thomasi - - Conv. 50 Uroderma bilobatum 38/39/42/
43/44/49 44/45/48/50
Conv.,C, G, e RON
1,2,3,4,6,8,13, 15,25,27,45,49,50
U. magnirostrum 35/36
62 Conv., GTG, CBG e RON.
4,12,15,27,45,50
Vampyressa bidens 26 48 Conv. 15,22,25,50 V. brocki 26 44 Conv. 10,12,15,22,25,50
V. melissa 14 24 Conv. 15,50 V. nymphae
26 48 Conv., GTG e
CBG. 13,15,50
V. pusilla 18/22/23/24
20/22 Conv., G e RON 9,10,12,13,15, 22,49,50
Referencias: (1) Baker, 1967; (2) Baker, 1970; (3) Baker e Hsu, 1970; (4) Baker e Lopez, 1970; (5) Baker e Bleier, 1971; (6) Baker et al., 1972a; (7) Baker et al., 1972b; (8) Baker e Mc Daniel, 1972; (9) Baker, 1973; (10) Baker et al., 1973; (11) Baker e Genoways,1976; (12) Baker, 1979; (13) Baker e Bickham, 1980; (14) Baker et al., 1981; (15) Baker et al., 1982; (16) Cadena e Baker, 1976; (17) Faria et al, 2000; (18) Faria e Morielle-Versute, 2006; (19) Finato et al., 2000; (20) Forman et al, 1968; (21) Gardner e O’Neil, 1969; (22) Gardner, 1977; (23) Genoways e Willians, 1980; (24) Haiduck e Baker, 1982; (25) Honeycutt et al., 1980; (26) Hsu et al, 1968; (27) Hsu e Berniscke, 1973; (28) Hsu et al., 1975; (29) Kiblisky, 1969; (30) Lemos-Pinto (2007); (31) Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; (32) Morielle-Versutte et al., 1992; (33) Myers, 1981; (34) Noronha et al., 2004; (35) Patton e Gardner, 1971; (36) Patton e Baker, 1978; (37) Pieczarka et al., 2005; (38) Ribeiro et al, 2000; (39) Ribeiro et al., 2003; (40) Rodrigues et al., 2000; (41) Santos e Souza, 1998a; (42) Santos e Souza, 1998b; (43) Santos et al., 2001; (44) Santos et al., 2002; (45) Silva et al., 2005; (46) Solari e Baker, 2006; (47) Souza e Araújo, 1990; (48) Stock, 1975; (49) Tucker e Bickham, 1986; (50) Varella-Garcia e Taddei, 1989; (51) Varella-Garcia et al., 1989; (52) Yonenaga et al, 1969.
39
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
2.4.1 Heterocromatina Constitutiva (HC) e Fluorocromos base específicos
Nas células eucarióticas o DNA genômico está associado com proteínas
histônicas e não-histônicas para formar a cromatina. A cromatina desses organismos
está organizada em duas classes distintas denominadas eucromatina e
heterocromatina (Sumner, 2003). A primeira representa regiões cromossômicas que
sofrem alterações estruturais (condensação e descondensação) durante o ciclo
celular, enquanto que a heterocromatina é representada pelas regiões que
permanecem condensadas durante todo o ciclo celular (Sumner, 1990; Wallrath,
1998).
O termo heterocromatina foi criado por Emil Heitz (1928) para indicar a parte da
cromatina que é mais compactada, baseando-se na compactação diferencial na
intérfase. As regiões cromossômicas que contêm uma alta densidade de elementos
de DNA repetitivo como os sítios de seqüências satélites e elementos de
transposição são os principais constituintes da heterocromatina (Wallrath, 1998;
Grewal e Jia, 2007).
Existem dois tipos principais de heterocromatina: a constitutiva (HC) e a
facultativa (HF). A riqueza de DNA satélite determina o estado permanente ou
reversível da heterocromatina, assim como a presença de polimorfismos e as
propriedades de coloração. A HC é estável e conserva as propriedades
heterocromáticas durante todos os estágios do ciclo celular e em todos os tecidos
(Wallrath, 1998; Grewal e Jia, 2007). Por ser altamente polimórfica, a HC pode ter
seu tamanho e localização afetada, embora aparentemente não haja nenhum efeito
fenotípico. Por outro lado, a HF é reversível e pode mudar do estado de
heterocromatina para eucromatina, dependendo do tipo de célula e do estágio de
40
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
desenvolvimento em que esta se encontra, estando freqüentemente associada a
cromossomos sexuais e diferenciação sexual. O DNA da HC é altamente metilado,
com as metilações ocorrendo exclusivamente nas citosinas, enquanto que o DNA da
HF sofre apenas uma discreta metilação (Mattei e Luciani, 2003).
A heterocromatina difere da eucromatina pela composição de pares de bases
de seu DNA, pela presença de grande parte do DNA satélite, que consiste em um
grande número de pequenas seqüências repetidas em tandem, e por apresentar
replicação tardia em relação à eucromatina, exibindo baixa ou nenhuma atividade
transcricional. O bloqueio da transcrição está associado ao estado altamente
condensado deste tipo de cromatina (Mattei e Luciani, 2003; Sumner, 2003).
Existe uma correlação entre DNA satélite e regiões heterocromáticas, embora
nem toda heterocromatina seja composta por DNA altamente repetitivo. A maior parte
dos segmentos de heterocromatina nos cromossomos de eucariotas contém elevadas
concentrações de DNA repetitivo, que podem variar no comprimento da repetição e
na composição de bases, podendo ser ricos em GC ou AT (Sumner, 1990).
O bandeamento C com Giemsa é um dos procedimentos mais utilizados para
evidenciar a HC em diferentes fases mitóticas e meióticas e núcleos interfásicos de
diferentes grupos de eucariotas. Nesta técnica, o pré-tratamento modifica a estrutura
cromossômica pela extração preferencial de proteínas e DNA eucromático,
fornecendo um padrão característico de bandas. Esta preferência pela extração das
regiões eucromáticas deve estar associada à presença das proteínas não-histônicas
na estrutura e formação da HC, formando um complexo que dificulta a retirada de
DNA heterocromático. Embora o bandeamento C seja eficiente para detectar regiões
de HC, esta técnica nem sempre revela todos os tipos de HC, além de poder
41
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
evidenciar uma HC fraca ou parcialmente corada. Isto pode estar mais relacionado às
características peculiares da cromatina do que à ausência de HC (Sumner, 2003).
A HC tem localização preferencial em determinadas regiões cromossômicas,
particularmente nas centroméricas ou proximais. A heterocromatina forma blocos de
tamanho variáveis, sendo estes específicos para cada grupo de organismos. Além
disso, têm sido descritos blocos de HC distais e, com menor freqüência, em regiões
intersticiais de determinados cromossomos de algumas espécies (Sumner, 2003).
Os morcegos caracterizam-se por ter HC localizada preferencialmente na região
pericentromérica de todos os cromossomos. Contudo, têm sido descrita ocorrência
adicional desse marcador em regiões teloméricas e intersticiais de poucos
cromossomos em algumas espécies (Varella-Garcia et al., 1989; Varella-Garcia e
Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990).
Dentre as espécies de morcegos que apresentam um padrão de distribuição
de HC restrito às regiões pericentroméricas, destacam-se representantes das
famílias: Phyllostomidae - Phyllostomus hastatus, P. discolor, P. elongatus (Varella-
Garcia et al., 1989; Santos e Souza, 1998b; Rodrigues et al., 2000), Chrotopterus
auritus (Morielle-Versute et al., 1992), Anoura caudifer, Chiroderma villosum, C.
doriae (Varella-Garcia et al., 1989), Lonchorhina aurita e Trachops cirrhosus (Barros,
2006); Molossidae - Molossus molossus e M. ater (Leite-Silva et al., 2003) e
Vespertilionidae - Pipistrellus pipistrellus, P. kuhlii, P. nathusii, Glischropus tylopus e
Lasiurus borealis (Volleth et al., 2001).
A presença de HC nas regiões distais e/ou intersticiais tem sido descrita em
algumas espécies como: Carollia perspicillata, Choeroniscus minor, Glossophaga
soricina, Artibeus lituratus, A. planirostris, A. jamaicensis, A. cinereus, Diaemus
youngi, Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata, Anoura caudifer, Uroderma
42
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
magnirostrum, U. bilobatum, Sturnira lillium e Platyrrhinus lineatus (Baker et al., 1982;
Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Volleth
et al., 1999; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001; Silva et al., 2005). De acordo
com Van Den Bussche et al., (1995) as diferenças na quantidade e localização dos
blocos heterocromáticos desempenham um importante papel de variação
cromossômica na ordem.
A análise de HC tem contribuído na diferenciação de espécies que são
morfologicamente semelhantes, como é o caso de Artibeus obscurus, A. lituratus e A.
jamaicensis que apresentaram HC nas regiões pericentroméricas de todos os
cromossomos, na região distal (braço curto) dos subtelocêntricos 5, 6, 7, 9 e no
cromossomo X. Adicionalmente, em A. jamaicensis foi observada HC intersticial nos
braços longos dos pares 1, 2, 3, e distal nos braços curtos do par 13. Nas três
espécies analisadas foi observada uma coloração diferencial da cromatina do
cromossomo X, quando comparada com a do restante do complemento cariotípico.
Os acrocêntricos Y1 e Y2 mostraram-se quase inteiramente heterocromáticos,
principalmente o Y original do complemento (Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza
1998b).
Neves et al. (2001), analisando o cariótipo de Choeroniscus minor
(Glossophaginae), verificaram a presença de heteromorfismo em relação à HC: um
dos homólogos do par 1 tem dois blocos de HC separados por um pequeno
segmento eucromático. Também foi observada a presença de um segmento adicional
no braço curto do par 2, enquanto o par 3 apresentou um pequeno bloco extra na
região pericentromérica do braço longo em um dos homólogos, enquanto o outro
homólogo tem HC localizada na região proximal do braço longo. Considerando esse
padrão, os autores sugeriram a ocorrência de inversões paracêntricas.
43
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
O padrão de distribuição de HC em duas espécies do gênero Uroderma
(Stenodermatinae) foi analisado por Silva et al. (2005). Uroderma magnirostrum
(2n=36, NF=62) mostrou blocos de HC nas regiões pericentroméricas de todos os
autossomos e adicionalmente, blocos distais nos braços curtos de todos os
cromossomos submetacêntricos. Nesta espécie, foi detectado heteromorfismo para
HC no par 5 (bloco intersticial no braço curto) e no par 6 (bloco proximal no braço
longo). No cromossomo X foram observados blocos de HC centromérico e terminal
no braço curto. O Y submetacêntrico apresentou HC no braço longo. O bandeamento
C em U. bilobatum (2n=42, NF=50) revelou padrão diferencial quando comparado
com U. magnirostrum. Este padrão corresponde à HC em regiões pericentroméricas
de todos os autossomos e na posição distal dos braços curtos dos pares 1 e 2
submetacêntricos. O cromossomo X mostrou blocos centromérico e terminal de HC e
o Y apresentou um bloco no braço longo.
Em alguns representantes da ordem Chiroptera com sistema sexual simples, em
geral, o cromossomo Y apresenta-se quase totalmente heterocromático. Do mesmo
modo, aqueles que têm sistema sexual múltiplo exibem o Y1 (Y original)
heterocromático, diferindo apenas pela presença de blocos característicos do Y2
(homólogo livre do autossomo translocado ao Xp). Por outro lado, as espécies que
apresentam sistema sexual composto do tipo neo-XY, destacam-se pela presença
simultânea de dois padrões distintos de HC nos braços curto e longo do Y. Na
subfamília Stenodermatinae, várias espécies apresentam blocos pericentroméricos
de HC no cromossomo X, adicionalmente o braço longo deste cromossomo mostra
um padrão diferencial de sua cromatina (Souza e Araújo, 1990; Morielle-Versute et
al., 1992; Santos e Souza, 1998 a,b; Rodrigues et al., 2000; Santos et al., 2001).
44
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Uma variedade de fluorocromos tem sido utilizada para produzir padrões de
diferenciação cromossômica em animais e plantas. Esses fluorocromos podem ser
agrupados de acordo com sua afinidade pelos pares de bases AT ou GC do DNA. No
primeiro grupo estão incluídos os que são específicos para os pares de bases AT e
no segundo aqueles que têm afinidade pelos pares de bases GC (Schweizer, 1976).
Em alguns casos, esses corantes são associados a outros marcadores que podem ou
não ser fluorescentes (contracorantes) para obtenção de resultados diferenciados
(Sumner, 1990; Verma e Babu, 1995).
O uso de fluorocromos base-específicos como uma forma alternativa no estudo
da HC tem sido importante para determinar sua qualificação e heterogeneidade. O
DAPI e o CMA3 têm sido utilizados na caracterização das regiões heterocromáticas
ricas em AT ou GC, que foram aparentemente homogêneas no bandeamento C. O
uso desses corantes pode ou não estar associado a um pré-tratamento. Quando não
há tratamento prévio, os fluorocromos podem revelar padrões de bandas G e R
(Schmid, 1980; Schweizer, 1980; Sola et al., 1992; Bella e Gonsálvez, 1994). Por
outro lado, a associação dos fluorocromos ao pré-tratamento para o bandeamento C
(CB-CMA3/CB-DAPI) tem revelado diferentes tipos de HC (Bella e Gonsálvez, 1994;
Dio Meo et al., 1998; Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001; Swarça et al.,
2003; Barros, 2006).
O emprego de fluorocromos na análise comparativa de cromossomos tem sido
realizado e tem revelado diferenças de composição na cromatina e na HC de
diferentes organismos. Em peixes, a combinação do CMA3 ou DAPI com o
bandeamento C tem mostrado blocos fluorescentes adicionais aos observados com
CMA3 e DAPI sem tratamento prévio, sugerindo uma modificação na estrutura da
cromatina pelo pré-tratamento, que pode aumentar a instabilidade do CMA3 e DAPI
45
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
(Artoni et al., 1999; Swarça et al., 2003; Kavalco et al., 2004). Em algumas espécies
de anfíbios, os blocos fluorescentes correspondentes àqueles vistos pelo
bandeamento C tem apresentado diferentes respostas aos fluorocromos, indicando
uma variedade na composição da HC de um mesmo cromossomo (Herrero et al.,
1993; Schimid et al., 2002).
Em morcegos, ainda há poucos trabalhos usando fluorocromos base-
específicos. Apenas três espécies da família Molossidae (Molossus ater, M. molossus
e Mollosops planirostris), sete de Phyllostomidae (Carollia perspicillata, Phyllostomus
discolor, Artibeus liturartus, A. jamaicensis, A. cinereus, Desmodus rotundus e
Dyphylla ecaudata) e três de Vespertilionidae (Lasiurus intermedius, Scotophilus
dignii e S. viridis) foram estudadas com esse enfoque, permitindo uma melhor
qualificação da eucromatina e da HC (Ruedas et al., 1990; Santos e Souza, 1998a,b;
Santos et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003).
Na família Phyllostomidae, em geral, a tríplice coloração CMA3/DA/DAPI tem
realçado os padrões de bandas R (ricas em GC) com CMA3, revelando uma coloração
uniforme ao longo dos cromossomos ou um fraco padrão de bandas G (ricas em AT)
com o DAPI (Ruedas et al., 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001;
Barros, 2006). Por outro lado, em A. lituratus, A. jamaicensis, A. cinereus, P. discolor,
D. rotundus e D. ecaudata, esse tipo de coloração revelou padrões de bandas R
(positivas para o CMA3) em todas as espécies. O DAPI mostrou uma coloração
uniforme, contudo, em P. discolor foi possível detectar pequenos blocos DAPI-
positivos nas regiões pericentroméricas de alguns cromossomos. No cariótipo de C.
perspicillata a tríplice coloração CMA3/DA/DAPI mostrou blocos CMA3-positivos
restritos às regiões pericentroméricas e blocos DAPI-positivos na região intersticial e
distal de alguns cromossomos (Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001).
46
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Santos et al. (1998b) analisaram comparativamente a composição da HC em
relação aos pares de bases GC e/ou AT em três espécies do gênero Artibeus e em
Phyllostomus discolor. Lâminas pré-tratadas para o bandeamento C com Giemsa
(CBG) e coradas com o DAPI (CB-DAPI) das três espécies do gênero Artibeus
mostraram um padrão de HC similar ao obtido pelo bandeamento C. A coloração
diferencial, detectada pelas duas técnicas, no braço longo do cromossomo X das três
espécies, sugerem a ocorrência de uma cromatina dispersa com diferentes
propriedades estruturais da cromatina pericentromérica e telomérica do genoma. Por
outro lado, a coloração CB-CMA3 de duas espécies analisadas evidenciou blocos
CMA3-positivos na região telomérica do braço curto de alguns autossomos e no braço
longo do Y1. Além disso, essa coloração mostrou apenas um padrão de bandas R em
P. discolor. Essa resposta diferencial aos fluorocromos base-específicos mostra uma
variabilidade na composição da cromatina em representantes de Phyllostomidae
(Santos et al., 1998a,b; Santos et al., 2001).
2.4.2 Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs)
O nucléolo é um compartimento subnuclear de células eucarióticas no qual
ocorre síntese de RNA ribossomal (RNAr) e biogênese dos ribossomos (Busch e
Smertana, 1970). No nucléolo estão localizados os genes que são transcritos a RNAr.
Durante a divisão celular ocorre o rompimento do nucléolo, que é uma das
características mais marcantes do ciclo celular. Contudo, os sítios cromossômicos
onde se situam os genes para transcrição de DNAr geralmente permanecem visíveis
como uma constrição. A síntese de RNAr é completamente inibida até o final da
divisão celular, onde ocorre o reaparecimento do nucléolo seguido da retomada da
47
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
síntese. Nenhum outro tipo de gene ativo, exceto os de RNAr, foi descrito fazendo
parte do nucléolo (Hernadez-Verdun et al., 2002; Sumner, 2003; Raska et al., 2004).
As células somáticas de eucariotas superiores contêm de dez a mil genes
ribossomais. Esses genes encontram-se repetidos em tandem, podendo formar
grupos em apenas um ou mais cromossomos, existindo em dois tipos distintos de
cromatina: aquela que permite a transcrição (eucromatina) e a que é
transcripcionalmente inativa (heterocromatina). Os mecanismos que estabelecem e
mantêm o estado ativo ou inativo dos loci de DNAr ainda são pouco entendidos
(Santoro et al., 2002; Raska et al., 2004).
Os sítios cromossômicos onde se situam os genes para transcrição do DNAr são
denominados regiões organizadoras de nucléolos (RONs). O RNAr é sintetizado e
processado em pré-ribossomos existentes no nucléolo, e em seguida torna-se parte
de ribossomos maduros localizados no citoplasma. Em eucariotas superiores, as
seqüências de RNAr encontram-se organizadas em duas classes de genes. Na
primeira, estão os principais genes de RNAr (18S, 5.8S e 28S), que consistem de
várias cópias de um segmento de aproximadamente 40kb que se encontram em
sítios específicos nos cromossomos, denominados RONs. A segunda classe
compreende os genes de RNA 5S que ocorrem, em geral, em apenas um par
cromossômico podendo apresentar vários locus (Sumner, 1990). Cada unidade de
repetição das múltiplas cópias que compõem os genes de RNAr, contém uma
seqüência de transcrição envolvida por seqüências espaçadoras não transcritas,
denominadas espaços intergênicos (Raska et al., 2004).
As RONs são importantes marcadores para o estudo da evolução
cromossômica. O método citogenético mais utilizado na detecção da posição dessas
regiões ativas em cromossomos utiliza o nitrato de prata (AgNO3), que tem uma alta
48
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
afinidade pelas proteínas nucleolares. Contudo, esta técnica evidencia apenas as
RONs que se encontram transcripcionalmente ativas na intérfase anterior, visto que a
técnica tem como princípio a reação do AgNO3 com as proteínas ácidas
(ribonucleoproteínas) remanescentes da organização nucleolar que se encontram
associadas ao DNAr. Dessa forma, o uso da coloração com AgNO3 tem tido uma
maior importância para o estudo da expressão dos genes ribossomais do que para
sua localização (Sumner, 2003).
RONs de vários grupos de vertebrados também têm sido analisadas através de
fluorocromos GC-específicos (CMA3 e MM) e/ou pela hibridização in situ fluorescente
(FISH) através do uso de sonda de DNA ribossomal, particularmente em mamíferos
(Stitou et al., 2000; Svartman e Vianna-Morgante, 2003), anfíbios (Schmid et al.,
1995; Lourenço et al., 2000) e peixes (Tigano et al., 2004; Gromicho et al., 2005). A
FISH para genes ribossomais tem permitido uma maior compreensão quanto à
variabilidade de genes de DNAr, podendo ser usada na localização destas
seqüências independente de estarem ou não ativas no genoma, visto que a
marcação por esta técnica independe da presença do produto de transcrição (Porter,
1994).
A coloração com AgNO3 em associação com fluorocromos CMA3 e DAPI tem
sido utilizada para qualificar as regiões intergênicas associadas às RONs quanto a
sua composição de pares de bases CG e AT, uma vez que os genes que codificam os
RNAr 18S, 5.8S e 28S estão separados por espaçadores transcritos internos (ITS) e
externos (IGS ou ETS). Os ITSs são geralmente compostos de seqüências repetitivas
ricas em pares de bases GC, o que justifica a detecção das regiões organizadoras de
nucléolos através do emprego de fluorocromos GC-específicos (Torres et al., 1990;
King, 1991).
49
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Em representantes da família Phyllostomidae, a coloração seqüencial
AgNO3/CMA3/DAPI tem evidenciado uma composição diferencial nessas regiões. Nas
espécies Artibeus lituratus, A. jamaicensis, Desmodus rotundus e Diphylla ecaudata
essas regiões mostram-se positivas para o CMA3 e neutras para o DAPI, enquanto
que Carollia perspicillata e Phyllostomus discolor mostraram que essas regiões são
CMA3 neutras e DAPI negativas (Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001).
Em Phyllostomidae, ocorre uma grande incidência de espécies com RONs em
apenas um par autossômico indicando que esse padrão pode ser considerado como
uma condição ancestral para a família. Entretanto, a presença de RONs múltiplas tem
sido descrita no gênero Choeroniscus (Baker et al., 1992; Neves et al., 2001) e na
espécie Lonchophylla thomasi (Ribeiro et al., 2003), pertencentes à subfamília
Glossophaginae, bem como em espécies pertencentes à subfamília
Stenodermatinae, como é o caso do gênero Uroderma (Silva et al., 2005),
Chiroderma doriae (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988) e do gênero Artibeus
(Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Souza e Araújo, 1990), que tem como
característica mais freqüente a presença de RONs em três pares autossômicos,
provavelmente originada por fragmentação e amplificação de seqüências de DNAr
(Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988).
As RONs podem estar localizadas nas regiões distais ou intersticias dos
cromossomos, estando geralmente em suas constrições secundárias. Este padrão de
RONs localizadas nas contrições secundárias é comum no cariótipo de vertebrados e
foi descrito como sendo uma condição ancestral para o grupo (Hsu et al., 1975). Em
morcegos, essa relação entre RONs e constrições secundárias têm sido observada
em algumas espécies (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Santos e Souza,
1998ª; Santos et al., 2002).
50
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Em Phyllostomidae, é comum a presença de variabilidade no número de RONs
ativas por células em espécies portadoras de RONs múltiplas, nas quais geralmente
as freqüências de marcações por metáfases diferem de forma significativa entre
indivíduos e espécies. Contudo, pouca variabilidade tem sido observada em espécies
que possuem apenas um par de RONs por célula. Essas diferenças relacionadas ao
número e localização das RONs indicam que essas regiões estão freqüentemente
envolvidas em rearranjos cromossômicos, desta forma esses marcadores podem ser
utilizados como ferramenta para avaliação de relações filogenéticas quando estão
envolvidos em algum rearranjo cromossômico (Souza e Araújo, 1990; Santos et al.,
2002).
Em geral, o número e a localização das RONs são característicos de
espécies e populações, embora variações interindividuais dessas regiões tenham
sido observadas em vários organismos, particularmente morcegos. Em
Phyllostomidae, também ocorre variação intraespecífica na atividade dessas regiões,
sugerindo que esses marcadores cariotípicos podem ser úteis na compreensão dos
mecanismos de evolução cromossômica na família. Além disso, a análise de várias
espécies através da técnica Ag-RON tem permitido concluir que esses organismos
apresentam uma grande variabilidade de número de RONs. Em Chiroptera, Myotis
myotis (Vespertilionidae) exibe o maior número de RONs, estando estas localizadas
em 14 pares de autossomos (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Souza e
Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998b; Santos et al., 2002).
Comparando-se o número de cromossomos com RONs marcadas e o número
de nucléolos por núcleo marcado por célula, verifica-se a freqüente ocorrência de
associação de RONs ativas na formação de um único nucléolo, fenômeno
denominado fusão nucleolar. Dessa forma, os cromossomos que se encontram
51
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
envolvidos na organização dos nucléolos durante a intérfase podem permanecer
associados na metáfase, servindo como evidência da associação nucleolar
(Anastossova-Kristeva, 1977).
Embora a presença de RONs em cromossomos sexuais seja considerada
incomum, estudos mostram a presença dessas estruturas em cromossomos sexuais
de alguns mamíferos, em especial em duas espécies de morcegos da subfamília
Carollinae: Carollia perspicillata (cromossomo X) e C. castanea (cromossomos X e
Y), que apresentaram RONs unicamente nesses cromossomos (Hsu et al., 1975;
Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Santos e Souza, 1998a).
Santos et al., (2002) analisando treze espécies de filostomídeos pertencentes
aos gêneros Artibeus, Glossophaga, Phyllostomus, Phylloderma, Platyrrhinus,
Tonatia e Trachops, descreveram a localização das RONs utilizando a marcação com
AgNO3 para detectar os sítios que se encontravam ativos, e usaram a FISH com
sonda de DNAr 18S para confirmar a localização dos sítios de genes de RNAr. Nove
das 13 espécies analisadas apresentaram apenas um par cromossômico com RON
ativa, enquanto A. cinereus, A. jamaicensis, A. fimbriatus e A. lituratus apresentaram
múltiplas RONs ativas, variando de dois a três pares. A FISH confirmou o número e a
posição das RONs em todas as espécies, com exceção de A. cinereus, que
apresentou sinais de hibridização em um par cromossômico a mais, indicando a
ocorrência de RONs silenciosas.
52
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
3. Referências Bibliográficas
Airas M (2003) Echolocation in bats. in Proceedings of Spatial sound perception
and reproduction. The postgrad seminar course of HUT Acoustics
Laboratory.
Altringham JD (1996) Bats, Biology and Behaviour. Oxford: Oxford University
Press. 255p.
Anastossova-Kristeva M (1977) The nucleolar cycle in man. J. Cell Sci. 25, 103–
110.
Ao L, GU X, Feng, Q, Wang, J, O’Brien PCM, Fu B, Mao X, Su W, Wang Y,
Volleth M, Yang F and Nie W (2006) Karyotype relationships of six bat
species (Chiroptera, Vespertilionidae) from China revelead by chromosome
painting and banding comparison. Cytog. Gen. Res. 115:145-153.
Arnold ML, Baker RJ and Honeycutt RL. (1983) Genic differentiation and
phyllogenetic relationships within two New World bat genera. Bioch. Syst.
Ecol. 11: 295-303.
Artoni RF, Molina WF, Bertollo LAC and Galleti Jr PM (1999) Heterochromatin
analysis in the fish species Liposarcus anisiti (Siluriformes) and Leporinus
elongates (Characiformes). Gen. Mol. Biol. 22:39-44.
Baker, RJ (1967) Karyotypes of bats of the family Phyllostomidae and their
taxonomic implications. Sout. Nat. 12 (4):407-428.
Baker, RJ and Patton, JL (1967) Karyotypes and karyotypic variation of North
American vespertilionid bats. J. Mammal. 48: 270-286.
Baker RJ (1970) Karyotypic trends in Bats. In: Wimsatt, W.A. (Ed). Biology of
Bats. Academic Press, NY. (1): 65-96.
Baker RJ and Hsu TC (1970) Further studies on the sex-chromosome system of
the American leaf-nosed bats (Chiroptera, Phyllostomidae). Cytogenetics,
9:131-138.
Baker RJ and Lopez G (1970) Chromosomal variation in bats of the genus
Uroderma (Phyllostomidae). J. Mammal. 51(4):786-789.
Baker RJ and Bleier WJ (1971) Karyotypes of bats of the subfamily Carollinae
(Mammali, Phyllostomatidae) and their evolutionary implications.
Experientia, 27:220.
53
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Baker RJ and McDaniel VR (1972) A new subspecies of Uroderma bilobatum
(Chiroptera: Phyllostomatidae) from Middle America. Occ. Pap Mus. Tex
Tech Univ. 7:1-4.
Baker RJ, Atchley WR and McDaniel CR (1972a) Karyology and morphometrics
of Peter’s tent-making bat, Uroderma bilobatum Peters (Chiroptera,
Phyllostomatidae). Syst. Zool., 21:414-429.
Baker RJ, Gardner AL and Patton JL (1972b) Chromosomal polymorphism in the
phyllostomatid bat, Mimon crenulatum (Geoffroy). Experientia, 28, 969p.
Baker RJ, Genoways HH, Bleier WJ and Warner JW (1973) Cytotypes and
morphometrics of two phyllostomatid bats, Mycronycteris hirsute and
Vampyressa pusilla. Occ. Pap. Mus. Tex. Tech Univ. 17:1-10.
Baker RJ (1973) Comparative cytogenetics of the New World leaf-nosed bats
(Phyllostomatidae). Period. Biol. (75):37-45.
Baker RJ and Genoways HH (1976) The Phyllostomatidae bat, Vampyressa
brocki in Colombia. Bull. South California Acd. Sci, 71:54.
Baker RJ (1979) Karyology. In: Baker RJ, Jones JK and Carter DC (eds.) Biology
of the bats of the New World family Phyllostomatidae. Part III. Special
Publications, Mus.Tex.Tech. Univ., pp. 107-155.
Baker RJ and Bass (1979) Evolutionary relationship of the Brachyphyllinae to the
Glossophaginae genera. Glossophaga and Monophyllus. J. Mammal.,
60(2):364-372.
Baker RJ and Bickham JW (1980) Karyotypic evolution in bats: evidence of
extensive and conservative chromosomal evolution in closely related taxa.
Syst. Zool. 29:239-253.
Baker RJ, Hood C and Honeycutt RL (1981) Phylogenetic relationships and
classification of the higher categories of the New World bat family
Phyllostomidae. Syst. Zool., 38(3):228-238.
Baker RJ, Haiduk MW, Robbins LW, Cadena A and Koop BF (1982)
Chromosomal studies of south American bats and their systematic
implications. In Mares MA e Genoways HH. Mammalian Biology in South
America. Special publications series – Pymat. Lab.Ecol., 303-327.
54
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Baker RJ, Maltbie M, Owen JG, Hamilton MJ and Bradley RD (1992) Reduced
number of ribosomal sites in bats: evidenced for mechanism to contain
genome size. J Mammal 73(4):847-858.
Baker RJ, Porter CA, Patton JC and Van Den Bussche RA (2000) Systematics of
bats of the family Phyllostomidae based on RAG2 DNA sequences. Occ.
Pap., Mus.Tex. Tech. Univ., 202: 1-16.
Baker RJ, Hoofer, SR Porter, CA and Van Den Bussche, RA (2003)
Diversification among new world leaf-nosed bats: An evolutionary
hipothesis and classification inferred from digenomic congruence of DNA
sequence. Occ. Pap. Mus. Tex. Tech. Univ., v. 230, p. 1-32.
Barros HMDR (2006) Análise Cariotípica nos Morcegos Lonchorhina aurita e
Trachops cirrhosus (Phyllostomidae) Usando Técnicas Citogenéticas
Diferenciais e Moleculares. Dissertação de Mestrado, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco.
Beçak ML, Batistic, RF Vizotto, LD and Beçak, W (1968) Mecanismo de
determinação do sexo XY1Y2 em Artibeus litturatus litturatus (Chiroptera –
Phyllostomatidae). Ci. E Cult. 20:173.
Beçak ML Batistic RF, Vizotto LD and Beçak W (1969) Sex determinating
mechanism XYY in Artibeus lituratus lituratus (Chiroptera,
Phyllostomatidae). Experientia 25:81-83.
Bella JL and Gosálves J (1994) Banding human chromosomes using combined C
banding-fluorochrome sataing technique. Biotech. Histochem. 69:243-248.
Bickham JW (1987) Chromosomal variation among seven species of lasiurine
bats (Chiroptera: Vespertilionidae). J. Mammal. 68:837-842.
Bonato V, Facure KG and Uieda, W (2004) Food habitats of bats of subfamily
Vampyrinae in Brazil. J. Mammal, 85:708-713.
Busch H and Smertana K (1970) The Nucleolus. Academic Press, New York.
Cadena A and Baker RJ (1976) Cariótipos de los murciélagos vampiros
(Chiroptera: Desmodinae). Caldais, 15(54):159-163.
Camara IG (1991) Mata Atlântica-Atlantic Rainforest. Index Ltda. Fundação
S.O.S Mata Atlântica, Fundação Banco do Brasil: 133-134. Chrom. Res.
5:203-205.
55
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Constantine DG (1970) Bats in relation to the health, welfare and economy of
man. In: WIMSAT, W. A., Biology of bats. New York Academic Press,
2:319-449.
Dio Meo GP, Perucatti A, Ferrara L, Palazzo M, Matassino D and Iannuzzi L
(1998) Constitutive heterochromatin distribuition in pig (Sus scrofa)
chromosomes. Carylogia 51:65-72.
Eisenberg JF (1989) Mammals of the Neotropics. University of Chicago Press,
Illinois.
Eisenberg JF and Redford KH (1999) Mammals of the Neotropics. The Central
Neotropics: Ecuador, Peru, Bolivia, Brazil. University of Chicago Press, Vol.
3, 609p.
El-Ansary EH, Gordon DJ, Tee RD and Taylor AJN (1987) Respiratory allergy to
inhaled bat guano. Lancet, 8527:316-318.
Emmons LH and Feer F (1990) Neotropical rainforest mammals: a field guide.
Chicago, Press, 2nd ed., p. 44-94.
Faria KC, Evangelista LP and Morielle-Versute E (2000) Identificação dos sítios
de RNA telomérico nas espécies Carollia perspcillata, Artibeus planirostris e
Platyrrhinus lineatus (Phyllostomidae: Chiroptera). Gen. Mol. Biol
(Suplement), p28.
Faria KC and Morielle-Versute E (2002) In situ hybridization of bat chromosomes
with human (TTAGGG)n probe, after previous digestion with Alu I. Gen.
Mol. Biol. 25(4):365-371.
Faria KC and Morielle-Versute E (2006) Genetic relationships between Brazilian
species of Molossidae and Phyllostomidae (Chiroptera, Mammalia).
Genetica 126:215–225.
Fenton MB (1992) Bats. New York: Facts On File, Inc. p.207.
Finato AO, Varella-Garcia M, Tajara EH, Taddei VA and Morielle-Versute E
(2000) Intrachromosomal distribution of telomeric repeats in Eumops
glaucinus and Eumops perotis (Molossidae, Chiroptera). Chrom. Res.
8:563-569.
Findley, JS (1993) Bats: A community Perspective. Cambridge University Press.
Cambridge, p. 167.
56
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Ford, CE and Hamerton, JL (1956) A colchicine hypotonic citrate squash
sequence for mammalian chromosomes. Stain. Tech. 31: 247-251.
Forman GL, Baker RJ and Gerber J (1968) Comments on the systematic status
of vampire bats (Family Desmodontidae). Syst. Zool., 17:417-425.
Gardner AL and O’Neill PO (1969) The taxonomic status of Sturnira budens
(Chiroptera: Phyllostomidae) with notes on in karyotypes and life history.
Occ. Pap. Mus. Tech. Univ., 38:1-8.
Gardner AL (1977) Chromosomal variation in Vampyressa and review of
chromosomal evolution in the Phyllostomidae (Chiroptera). Syst. Zool.,
26:300-318.
Genoways HH and Baker RJ (1972) Stenoderma rufum. Mammaliam species,
18:1-4.
Genoways HH and Williams Sl (1980) Results of the Alcoa Foundation –
Suriname Expeditions. I. A new species of the genus Tonatia (Mammalia:
Phyllostomidae). Anna, Carne, Mus,, 49:203-211.
Gimenez E, Ferrarezzi H and Taddei VA (1996) Lingual morphology and cladistic
analisys of the New World néctar-feeding bats (Chiroptera: Phyllostomidae).
J. Comp. Biol.,1:41-64.
Greenbaum JF, Baker RJ and Wilon DE (1975) Evolutionary implications of the
karyotypes of the stenodermatinae genera Ardops, ariteus, Phyllops and
Ectophylla. Byll. South. California Acad. Sci., 74:156-159.
Grewal SI and Jia S (2007) Heterochromatin revisited. Genetics 8:35-46.
Gromicho M, Ozouf-Costaz C and Collares-Pereira MJ (2005) Lack of
correspondence between CMA3, Ag-positive signals and 28S rDNA loci
in two Iberian minnows (Teleostei, Cyprinidae) evidenced by sequential
banding. Cytog. Gen. Res., 109:507-511.
Haiduk MW and Baker RJ (1982) Cladistical silver-staining of G-banding
chromosomes of nectar seeding bats (Glossophaginae: Phyllostomidae).
Syst. Zool. 31:252-265.
Heitz E (1928) Das Heterochromatin der Moose. J.B. Wist. Botan 69: 762-818.
Hernadez-Verdun D, Roussel P and Gebrane-Youmes I (2002) Emerging
concepts of nucleolar assembly. J. Cell. Sci., 115:2265-2270.
57
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Herrero P, De La Torre J, López-Fernández C, Gosálvez J and Sumner AT
(1993) Heterochromatin heterogeneity in Triturus mamoratus (Uroderma,
Salamandridae) demonstrated with specific DNA-binding fluorochromes and
in situ restriction endonuclease/nick translation. Caryologia 46:343-353.
Honeycutt RL, Baker RJ and Genoways HH (1980) Results of Alcoa Foundation-
Suriname Expeditions III. Chromosomal dada for bats (Mammalia:
Chiroptera) from Suriname. Ann. Carn. Mus., 49:237-250.
Hood CS and Smith JD (1982) Cladistical analysis of female reproductive
histomorphology in phyllostomatoid bats. Syst. Zool., 31:241-251.
Hooffmann FG and Baker, RJ (2001) Systematics of bats of the gnus
Glossophaga (Chiroptera: Phyllostomidae) and phylogeography in G.
soricina based on the cytochrome-b gene. J. mammal 82(4):1092-1101.
Howell WM and Black DA (1980) Controlled silver-staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia
36:1014-1015.
Hsu, T, Baker, RJ and Utakoji, T (1968) The multiple sex chromosome system of
American leaf-nosed bats (Chiroptera, Phyllostomatidae). Cytogenetics 7:
27-38.
Hsu TC and Berniscke K (1971) An Atlas of mammalian chromosomes. Volume
5, New York: Springer- Verlag.
Hsu TC and Berniscke K (1973) An Atlas of mammalian chromosomes. Volume
7, New York: Springer- Verlag.
Hsu T, Spirito SE and Pardue ML (1975) Distribuition of 18+ 28S ribosomal
genes in mammalian genomas. Chromosoma. 53:25-36.
Jones KE (2002) Chiroptera. Encyclopedia of Life Sciences. Macmillan
Publishers Ltd,pp.1-5.
Jones KE, Purvis A, MacLarnon A, Bininda-Emonds ORP and Simmons NB
(2002) A phylogenetic supertree of the bats (Mammalia: Chiroptera). Biol.
Review 77:223-259.
Jones, G (2005) Echolocation. Current Biology, 15(13):484-488.
Jones G and Teeling EC (2006) The evolution of echolocation in bats. Trend. Ecol.
Evolut.., 24(3):149-156.
58
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Kavalco KF, Pazza R, Bertollo LAC and Moreira-Filho O (2004) Heterochromatin
characterization of four fish species of the family Loricariidae (Siluriformes).
Hereditas 141:237-242.
Kibliski P (1969) Chromosome patterns of 7 species of leaf-nosed bats of
Venezuela (Chiroptera-Phyllostomidae). Experientia, 25:1203.
King M (1991) The evolution of the heterochromatin in the amphibian genome. In:
D.M. Green and S.K. Amph. Cytog. Evol. 359-391.
Leite-Silva C, Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y and Souza MJ
(2003) Karyotypic characterization of the bat species Molossus ater, M.
molossus and Molossops planirostris (Chiroptera, Molossidae) using FISH
and banding techniques. Hereditas 138:94-100.
Lemos-Pinto, MMP (2007) Utilização de marcadores citogenéticos na análise
comparativa dos grandes Artibeus (Phyllostomidae, Chiroptera), avaliando
estruturas conservadas e sítios espécie-específicos. Dissertação de
Mestrado, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco.
Lourenço LB, Garcia PCA and Recco-pimentel SM (2000) Cytogenetics of two
species of Paratelmatobius (Anura: Leptodactylidae), with phylogenetic
comments. Hereditas 133:201-209.
Marinho-Filho J and Sazima I (1998) Brazilian bats and conservation biology: a
fist survey. In: KUNZ, T H.; RACEY, P. A. Bat biology and conservation.
Washington, Smithsonian Instituition Press. p-282-294.
Mattei MG and Luciani J (2003) Heterochromatin, from Chromosome to protein.
Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Hematology.
Medilín RA, Arita HT and Sánchez-Hernandez O (1997) Identificacíon de los
murciélagos de México: chaves de campo (publicaciones especiales n.2).
Ciudad Universitaria, México DF: Associación Mexicana de Mastozoologia
AC, 89p.
Meyne J, Bailey SM and Goodwin EH (2002) Strand-specific fluorescence in situ
hybridization: CO-FISH and COD-FISH, FISH technology. In Rautenstrauss
BW e Liehr T, FISH Technology, Springer Laboratory Manual. Springer, pp.
262–271.
59
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Meyne J, Baker RJ, Hobart HH, Hsu TC, Ryder OA, Ward OG, Wiley JE,
Wurster-Hill D, Yates TL and Moyzis RK (1990) Distribution of non-
telomeric sites of the (TTAGGG)n telomeric sequence in vertebrate
chromosomes. Chromosoma 99: 3-10.
Morielle-Versute E, Goloni EM, Varella-Garcia M and Taddei VA (1986) Análise
cariotípica em morcegos hematófagos (Chiroptera, Desmodontinae).
Ciência e Cultura (Suplemento), 38:938.
Morielle-Versute E and Varella-Garcia M (1988) Variability of nucleolus organizer
regions in Phyllostomid bats. Rev. Brasil. Genet. 11(4):853-871.
Morielle-Versute E, Taddei VA and Varella-Garcia M (1992) Chromosome
banding studies of Chrotopterus auritus (Chiroptera: Phyllostomidae). Rev.
Brasil. Genet.15 (3):569-573.
Morton P (1989) Murcielagos Tropicales Americanos. Ed. El Fondo Mundial para
la Naturaleza, E.U.A. World Wildlife Fund, U.S.A. 48p.
Myers P (1981) Observation on Pygoderma bilabiatum (Wagner). Zeitschrift für
Saügetierkunde, 46:146-151.
Nagorsen DW and Peterson RL (1975) Karyotypes of six species of bats
(Chiroptera) from the Dominican Republic. Life Sci. Contrib., Royal Ontario
Mus., 28:1-8.
Neves ACB, Pieczarka JC, Barros RMS, Marques-Aguiar S, Rodrigues LRR and
Nagamachi CY (2001) Cytogenetic studies on Choeroniscus minor
(Chiroptera, Phyllostomidae) from the Amazon region. Cytobios 105:91-98.
Noronha RCR, Nagamachi CY, Pieczarka JC, Marques- Aguiar S, Assis MFL and
Barros RMS (2004) Meiotic analyses of the sex chromosomes in Carollinae-
Phyllostomidae (Chiroptera): NOR separates the XY1Y2 into two
independent parts. Caryologia, 57(1):1-9.
Nowak, RM (1991) Walker’s Mammals of the World. 5th ed. Baltimore. The Johns
Hopkins University Press. v. 1, p. 568.
Nowak, RM (1994) Walker´s Mammals of the World. Baltimore Johns Hopkins
University Press. p. 287.
Ono T and Yoshida MC (1997) Differences in the chromosomal distribution of
60
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Passos FC, Silva WR, Pedro WA e Bonin MR (2003) Frugivoria em morcegos
(Mammalia: Chiroptera) no Parque Estadual Intervales, sudeste do Brasil.
Rev. Bras. Zool. 20(3):511-517.
Pathak S and Stock AD (1974) The X chromosomes of mammals: karyological
homology as revealed by banding technics. Genetica, 78:703-714.
Patton JL and Gardner AL (1971) Parallel evolution of multiple sex-chromosome
systems in the Phyllostomatid bats, Carollia and Choeroniscus. Experientia,
27:05-106.
Patton JC and Baker RJ (1978) Chromosomal homology and evolution of
phyllostomatoid bats. Syst. Zool., 27:449-462.
Pendás AM, Morán P and García-Vázquez E (1993) Multi-chromosomal location
of ribosomal RNA genes and heterochromatin association in brown trout.
Chrom. Res., 1(1):63-67.
Peracchi Al, Lima IP, Reis NR, Nogueira MR e Ortêncio-Filho H (2006) Ordem
Chiroptera. In: Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA e LLima IP. Mamíferos do
Brasil, Londrina, p.153-230.
Pieczarka JC, Nagamachi CY, O’Brien PCM, Yang F, Rens W, Barros RMS,
Noronha RCR, Rissino J, Oliveira EHC and Ferguson-Smith MA (2005)
Reciprocal chromosome painting between two South American bats:
Carollia brevicauda and Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae,
Chiroptera). Chrom. Res.,13:339–347.
Porter CA (1994) Organization and Chromosomal location of repetitive
DNA sequences in three species of squamate reptiles. Chrom. Res.,
2:263-273.
Pough FH, John BH e Mc Farland WN (1999) A vida dos vertebrados, 2ª edição,
p.710-714.
Raska I, Koberna K, Malínský J, Fidlenorová H and Masata M (2004) The
nucleolus and transcription of ribosomal genes. Biology of the Cell.,
96:579-594.
Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA and Lima IP (2007) Morcegos do Brasil, 1ª
edição, p. 253.
Ribeiro NAB, Nagamachi CY, Pieczarka JC, Marques-Aguiar S, Gonçalves
61
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
ACO, Neves ABC and Barros RMS (2000) Evolução cromossômica e
filogenia de quatro espécies de morcegos nectarívoros do novo mundo
(Phyllostomidae-Chiroptera). Genet. Biol. Mol. (Suplemento), p32.
Ribeiro NAB, Nagamachi CY, Pieczarka JC, Rissino, JD, Neves ABC, Gonçalves
ACO, Marques-Aguiar S, Assis MFL and Barros RMS (2003) Cytogenetic
analysis in species of the subfamilie Glossophaginae (Phyllostomidae,
Chiroptera) supports a polyphyletic origin. Caryologia 56 (1):85-96.
Rodrigues LRR, Barros RMS, Assis MFL, Marques-Aguiar SA, Pieczarka JC and
Nagamachi CY (2000) Chromosome comparison between two species of
Phyllostomus (Chiroptera - Phyllostomidae) from Eastern Amazonia, with
some phylogenetic insights. Genet. Mol. Biol. 23(3):595-599.
Ruedas LA, Lee Jr. TE, Bickham W and Schlitter DA (1990) Chromosomes of five
species of vespertilionid bats from Africa. J. Mammal. 71: 94-100.
Sánchez-Hernadez, C, Romero-Almaraz, ML and Schnell, GD (2005) New
species of Sturnira (Chiroptera: Phyllostomidae) from northen South
America. J. Mammalogy, 86:866-872.
Santoro R, Li I and Grummt I (2002) The nucleolar remodeling complex NoRC
mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene
transcription. Nat. Genet. 32:393-396.
Santos N and Souza MJ (1998a) Characterization of the constitutive
heterochromatin of Carollia perspicillata (Phyllostomidae, Chiroptera) using
the base-specific fluorochromes, CMA3 (GC) and DAPI (AT). Caryologia
51:51-60.
Santos N and Souza MJ (1998b) Use of fluorochromes chromomycin A3 and
DAPI to study constitutive heterochromatin and NORs in four species of
bats (Phyllostomidae). Caryologia 51:265-278.
Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y and Souza MJ (2001) Comparative
karyology of brazilian vampire bats Desmodus rotundus and Diphylla
ecaudata (Phyllostomidae, Chiroptera): banding patterns, base-specific
fluorochromes and FISH of ribossomal genes. Hereditas 134: 189-194.
Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y and Souza MJ (2002) Localization
of rRNA genes in Phyllostomidae bats reveals silent NORs in Artibeus
cinereus. Hereditas, 136:137-143.
62
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Scherthan H, Cremer T, Arnason U, Weier HU, Lima-de-Faria A and
Frönicke L (1994) Comparative chromosome painting discloses
homologous segments in distanly related mammals. Nat. Genet., 6:342-
Schmid M (1980) Chromosome evolution in Anphibian. IV. Differentiation of G- C
and A-T rich chromosome regions in Anura. Chromosoma 77:83-103.
Schmid M, Feichtinger W, Weimer R, Mais C, Bolaños F and Léon P (1995)
Chromosome banding in Amphibia. XXI. Inversion polymorphism and
multiple mucleolus organizer regions in Agalychnis callidtyas (Anura,
Hylidae). Cytog. Cell. Gen., 69:18-26.
Schmid M, Haaf T, Steinlein C, Nanda I and Mahony M (2002) Chromosome
banding in Anphibia. Cytog. Gen. Res., 97:239-253.
Schweizer D (1976) Reverse flourescent chromosome banding with chromomycin
and DAPI. Chromosoma 58:307-324.
Schweizer D (1980) Simultaneos fluorescent staining of R bands and specific
heterochromatic regions (DA-DAPI bands) in human chromosomomes.
Cytog. Cell. Gen., 27:190-193.
Seabright M (1971) A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet
2: 971-972.
Silva AM, Marques-Aguiar SA, Barros RMS, Nagamachi CY and Pieczarka JC
(2005) Comparative cytogenetic analysis in the species Uroderma
magnirostrum and U. bilobatum (cytotype 2n=42) (Phyllostomidae,
Stenodermatinae) in the Brazilian Amazon. Gen. Mol. Biol., 28 (2): 248-253.
Simmons NB (2005) Mammal species of the world: A Taxonomic and geographic
reference. Baltimore, The Johns Hopkins University Press, 3ªed, v1, 312-
529.
Sola L, Iaselli V, Rossi AR, Rash EM and Monaco PJ (1992) Cytogenetics
of bisexual/unisexual species of Poecilia. II. Analysis of
heterochromatin and nucleolar organizer regions in Poecilia mexicana by
C-banding and DAPI, quinacrina, chromomycin A3 and silver staining.
Cytog. Cell. Gen., 60:229-235.
Solari S and Baker RJ (2006) Mitochondrial DNA sequence, karyotypic, and
morphologiacal variation in the Carollia castanea species complex
63
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
(Chiroptera: Phyllostomidae) with description of a new species. Occ. Pap.
Mus. Tex. Tech. Uni., 254:1-16.
Souza MJ and Araújo MCP (1990) Conservative pattern of the G-bands and
diversity of C-banding patterns and NORs in Stenodermatinae (Chiroptera-
Phyllostomatidae). Rev. Bras. Gen., 13:255-268.
Stitou S, Díaz de la Guardiã R, Jiménez R e Burgos M (2000) Inactive ribosomal
cistrons are spread throughout the B chromosomes of Rattus rattus
(Rodentia, Muridae). Implications for their origin and evolution. Chrom.
Res., 8:305-311.
Stock AD (1975) Chromosome banding pattern homology and its phylogenetic
implications in the bat genera Carollia and Choeroniscus. Cytog. Cell .
Gent., 14:34-41.
Sumner AT (1972) A sample technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Expl. Cell Res. 75:304-306.
Sumner AT (1990) Chromosome banding. 1st ed. Unwin Hyman Ltd. London,
UK, 434 p.
Sumner AT (2003) Chromosomes: organization and function. Blackwell
Publishing. North Berwick, UK.
Svartman M e Vianna-Morgante AM (2003) Conservation of chromosomal
location of nucleolus organizer in American marsupials (Didelphidae).
Genetica 118:11-16.
Swarça AC, Fenocchio AS, Cestari MM and Dias AL (2003) Analysis of
heterochromatin by combination of C-banding and CMA3 and DAPI staining
in two fish species (Pimelodidae, Siluriformes). Genetica 119:87-92.
Taddei,VA (1983) Morcegos. Algumas considerações sistemáticas e biológicas.
Bol. Tec. CATI 172, Campinas-SP, 25p.
Taddei, VA (1988) Morcegos: Aspectos ecológicos, econômicos e médico-
sanitários, com ênfase para o estado de São Paulo. Zôo Intertropica, São
José do Rio Preto, n. 12, p. 1-37.
Taddei VA (1996) Sistemática de quirópteros. Boletim do Instituto Pasteur, 1(2):
3-15.
64
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Teeling EC, Springer MS, Madsen O, Bates P, O’Brien SJ and Murphy WJ (2005)
A molecular phylogeny for bats illuminates biogeography and the fossil
record. Science 307:580-584.
telomeric (TTAGGG)n sequences in two species of the vespertilionid bats.
Tigano C, Rocco L, Ferrito V, Costagliola D, Pappalardo AM and Stingo V (2004)
Chromosomal mapping and molecular characterization of ribosomal RNA
genes in Lebias fascista (Teleostei, Cyprinodontidae). Genetica 121:95-
100.
Torres RA, Ganal M and Hemleben V (1990) GC balance in the internal
transcibed spacer ITS1 and ITS2 of nuclear ribossomal RNA genes. J. Mol.
Evol. 30: 170-181.
Tucker PK (1986) Sex chromosome-autosome translocations in the leaf-nosed
bats family Phyllostomidae. I. Mitotic analyses of the subfamilies
Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytogenet. Cell Genet. 43:19-27.
Tucker PK and Bickham JW (1986) Sex chromosome-autosome translocations in
the leaf-nosed bats family Phyllostomidae. II. Meiotic analyses of the
subfamilies Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytog. Cell. Gen., 43:28-
37.
Van Den Bussche RA, Longmire JL and Baker RJ (1995) How bats achieve a
small C-value: frequency of repetitive DNA in Macrotus. Mammal. Genome
6:521–525.
Varella-Garcia M e Taddei VA (1989) Citogenética de Quirópteros: Métodos e
Aplicações. Rev. Bras. Zool. 6:297-323.
Varella-Garcia M, Morielle-Versute, E and Taddei VA (1989) A survey of
cytogenetic data on brazilian bats. Rev. Bras. Gen., 12(4):761-793.
Velazco PM (2005) Filogenia de murciélagos del género Platyrrhinus Saussure,
1980 (Chiroptera: Phyllostomidae) con la descripción de cuatro nuevas
especies. Fieldiana, Zoology (New Series), 105:1-53.
Verma RS and Babu A (1995) human chromosome: Principles and techniques.
Mcgrew-Hill.
Volleth M, Klett C, Kollak A, Dixkens C, Winter Y, Just W, Vogel W and
Hameister H (1999) ZOO-FISH analysis in a species of the order
Chiroptera: Glossophaga soricina (Phyllostomidae). Chrom. Res., 7:57-64.
65
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Volleth M, Bronner G, Göpfert MC, Heller KG, von Helversen O and Yong HS
(2001) Karyotype comparison and phylogenetic relationships of Pipistrellus-
like bats (Vespertilionidae; Chiroptera; Mammalia). Chrom. Res. 9: 25-46.
Volleth M, Heller KG, Pferffer RA and Hameister H (2002). A comparative ZOO-
FISH analysis in bats elucidates the phylogenetic relationships between
Megachiroptera and five microchiropteran families. Chrom. Res.,10:477-
497.
Wallrath LL (1998) Unfolding the mysteries of heterochromatin. Curr. Opini. Gen.
Devel., 8 147-153.
Wetterer, AL, Rockman MV e Simoons NB (2000) Phylogeny of phyllostomid bats
(Mammalia: Chiroptera): data from diverse morphological systems, sex
chromosomes, and restriction sites. Bull. Amer. Mus. Nat. Hist., 248: 1-200.
Wilson DE and Reeder DM (1993) Mammal species of the world: a taxonomic
and geographic reference. 2nd ed. Smithsonian Institution
Press,Washington, D.C.
Wilson DE and Reeder DM (2005) Mammal species of the World: a taxonomic
and geographic reference. 3 ed.,v.1 Balimore: jonhs Hopkins University
Press, 2181p.
Yang F, Carter NP, Shi L and Ferguson-Smith MA (1995) A comparative study of
karyotypes of muntijacs by chromosome painting. Chromosoma 103:642-
652.
Yonenaga Y (1968) Estudos cromossômicas em espécies de Chiroptera. Ciência
e Cultura, 20:172p.
Yonenaga Y, Frota-Pessoa O and Lewis KR (1969) Karyotypes of seven species
of Brazilian bats. Caryologia, 22:63-78.
66
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
4. Manuscrito de Artigo Científico
Heterogeneidade da heterocromatina constitutiva e das
seqüências intergênicas associadas às RONs em três espécies
de morcegos (Phyllostomidae, Chiroptera).
Manuscrito a ser encaminhado à revista
Micron: The International Research
and Review Journal for Microscopy
ISSN: 0968-4328
67
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Heterogeneidade da heterocromatina constitutiva e das seqüências intergênicas
associadas às RONs em três espécies de morcegos (Phyllostomidae, Chiroptera).
.
Calixto, M.S., Santos, N. & Souza. M.J.
Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas/CCB, Universidade
Federal de Pernambuco/UFPE, Av. Professor Moraes Rego, Nº 1235, CEP
50670-901, Recife, Pernambuco, Brasil; (Fone: +55-81-21268520, e-mail:
*Autor para correspondência: Departamento de Genética, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Av. Prof. Moraes do
Rego Nº 1235, Cidade Universitária, CEP: 50732 -970, Recife, Pernambuco,
Brasil. Fone: +55 81 21268520; e-mail: [email protected]
68
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Resumo
Cromossomos mitóticos de Glossophaga soricina (2n=32,XY;NF=60),
Platyrrhinus lineatus e Sturnira lilium (2n=30,XY; NF=56) foram analisados
através da coloração convencional, bandeamento C, marcação com nitrato de
prata (AgNO3) e fluorocromos base-específicos. Dados da análise convencional
obtidos para as três espécies estão de acordo com aqueles descritos na
literatura, exceto pela morfologia do cromossomo Y de P. lineatus, indicando
variação cromossômica geográfica para a espécie. Os blocos de HC na região
distal do braço curto dos pares 5, 6, 7 e cromossomo X, observados pelo
bandeamento C, em P. lineatus e S. lilium, além da coloração diferencial
observada na cromatina presente no braço longo do X de Sturnira lilium
correspondem a um padrão compartilhado por alguns representantes de
Stenodermatinae. As respostas diferenciais obtidas com os fluorocromos base-
específicos CMA3 e DAPI confirmaram a heterogeneidade da HC e das
seqüências intergênicas associadas às RONs quanto à sua composição de
pares de bases. Contudo, a fraca marcação CMA3+
nas regiões heterocromáticas
pericentroméricas e distais de alguns cromossomos indica uma predominante
associação de heterocromatina com seqüências ricas em pares de bases GC.
Esses resultados sugerem a necessidade de uma ampliação no número de
espécies estudadas com esse enfoque, visando um melhor entendimento da
expansão diferencial das seqüências repetitivas (ricas em AT ou GC) dentro da
família Phyllostomidae.
Palavras-chave: Phyllostomidae, bandeamento C, AgNO3, CMA3, DAPI
69
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Introdução
Sturnira lilium e Platyrrhinus lineatus pertencem à subfamília
Stenodermatinae considerada detentora da maior biodiversidade de gêneros e
espécies, quando comparada com as demais subfamílias da ordem Chiroptera
(Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker et al., 2003). Stenodermatinae é
a maior subfamília de Phyllostomidae, estando representada por 17 gêneros e 67
espécies (Reis et al., 2007) com distribuição na América Central e do Sul, indo
do centro do México ao Sul do Uruguai (Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002;
Baker, et al., 2003). Seus representantes são importantes dispersores de
sementes, sendo essenciais para a regeneração de florestas e colonização de
novas áreas de plantas (Alttringham, 1996).
Glossophaginae compreende a segunda maior subfamília dos
filostomídeos, estando representada por 13 gêneros e 33 espécies, distribuídas
nas Américas Central e do Sul, indo desde o Sul do México ao Sul do Brasil.
(Ribeiro et al., 2003). Esta subfamília apresenta uma classificação sistemática
bastante discutível, considerando que dados morfológicos, imunológicos e
citogenéticos têm indicado uma possível origem polifilética para o grupo (Baker
et al., 2003; Ribeiro et al., 2003).
Em morcegos, os dados cariotípicos revelados pelos bandeamentos G
bem como pela marcação com nitrato de prata têm indicado uma evolução
cromossômica conservativa (Baker e Bickham, 1980; Souza e Araújo, 1990;
Neves et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). Entretanto,
desde que o bandeamento C foi descrito por Sumner (1972) como um método
eficiente para identificação cromossômica da heterocromatina constitutiva (HC),
70
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
seu emprego na análise da HC em Phyllostomidae tem revelado variabilidade
quanto à localização deste marcador entre as espécies, ainda que a localização
preferencial da HC seja nas regiões pericentroméricas dos cromossomos
(Santos e Souza, 1998a,b; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001).
Em morcegos, as RONs são importantes marcadores para o estudo da
evolução cromossômica. O método de análise cromossômica mais utilizado na
detecção dos sítios ativos utiliza a marcação com AgNO3 (Morielle-Versute e
Varella-Garcia, 1988; Varella-Garcia e Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990;
Baker et al., 1992; Santos e Souza, 1998a,b). Os genes que codificam os RNAr
18S, 5.8S e 28S estão separados por regiões espaçadoras, geralmente
compostas de seqüências repetitivas ricas em pares de bases GC, que podem
ser detectadas através do emprego de fluorocromos GC-específicos (Torres et
al., 1990; King, 1991). Em representantes da família Phyllostomidae, a
coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI tem evidenciado uma composição
de pares de bases diferencial nessas regiões (Santos e Souza, 1998a,b; Santos
et al., 2001).
O emprego de fluorocromos base-específicos na análise cromossômica
tem revelado padrões diferenciais na cromatina (eucromatina e heterocromatina)
e nas seqüências intergênicas associadas às RONs de diferentes organismos,
particularmente peixes (Kavalco et al., 2004), aves (Mayr et al., 1990), roedores
(Burgos et al., 1990), anfíbios (Schimid et al., 2002) e primatas (Pieczarka et al.,
2000; 2001). Em morcegos, apenas poucas espécies tiveram a heterocramatina
e as seqüências intergênicas presentes nas RONs analisadas com esses
corantes fluorescentes, os quais têm evidenciado uma composição de pares de
71
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
bases diferencial nessas regiões (Bickham, 1987; Ruedas et al. 1990; Santos e
Souza,1998a,b; Santos et al., 2001; Santos et al., 2002; Leite-Silva et al., 2003)
Neste trabalho, os cariótipos de P. lineatus, S. lilium e G. soricina
provenientes da região Nordeste do Brasil, foram analisados pelo bandeamento
C, coloração com AgNO3, CMA3/DA/DAPI e coloração seqüencial
AgNO3/CMA3/DA/DAPI. Os dados obtidos reforçam a heterogeneidade da HC
quanto à sua composição (rica em AT e/ou GC) e ratificam as características
particulares das seqüências intergênicas associadas às RONs (em geral, CMA3
positiva) na família Phyllostomidae. No conjunto, esses resultados fornecem
subsídios para um melhor entendimento sobre a evolução cromossômica desta
família.
Material e Métodos
As análises cromossômicas foram realizadas a partir de preparações
diretas de medula óssea em 18 indivíduos de Platyrrhinus lineatus (3 fêmeas e
15 machos), nove de Sturnira lilium (2 fêmeas e 7 machos) e 13 de Glossophaga
soricina (4 fêmeas e 9 machos). Os exemplares analisados foram capturados em
municípios dos Estados de Pernambuco e Bahia, no Nordeste do Brasil (Tabela
1).
O bandeamento C (CBG) e a marcação com AgNO3 foram realizados de
acordo com Sumner (1972) e Howell e Black (1980), respectivamente, com
pequenas modificações em relação ao tempo de exposição da lâmina em cada
reagente. A tríplice coloração CMA3/DA/DAPI foi realizada de acordo com
Schweizer (1980), com algumas modificações (Santos e Souza, 1998a). Para a
coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI as lâminas foram coradas com
72
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
AgNO3 de acordo com Howell e Black (1980), e depois de fotografadas foram
descoradas segundo Guerra (1991) e coradas com CMA3/DA/DAPI (Schweizer,
1980).
Tabela 1 – Espécies de morcegos, localidades de coleta, coordenadas
geográficas e número de indivíduos analisados.
Espécies Localidades Coordenadas Nº de indivíduos
Platyrrhinus lineatus
Aldeia -PE Andaraí -BA Caruaru -PE Igarassu -PE Ipojuca-PE Recife-PE Rio de Contas -BA Saloá-PE
8º 1’ 18”; 34º 58’ 52” 12º 45’ 26”; 41º 10’ 53” 8º 17’ 0”; 35º 58’ 34” 7º48’45’’S; 34º56’15’’ 8º26’15’’S; 35º03’45’’ 8º 3’ 14”; 34º 52’ 52” 13º 34’ 44”; 41º 48’ 41” 8º 58’ 33”; 36º 41’ 15”
2 3 1 2 2 2 3 3
Sturnira lilium Aldeia-PE Igarassu-PE Ipojuca-PE Saloá-PE
8º 1’ 18”; 34º 58’ 52” 7º48’45’’S; 34º56’15’’ 8º 23’ 56”; 35º 3’ 50” 8º 58’ 33”; 36º 41’ 15”
4 1 2 2
Glossophaga soricina
Aldeia-PE Caruaru-PE Ipojuca-PE Rio de Contas -BA Saloá-PE Saltinho-PE Toritama-PE
8º 1’ 18”; 34º 58’ 52” 8º 17’ 0”; 35º 58’ 34” 8º26’15’’S; 35º03’45’’ 13º 34’ 44”; 41º 48’ 41” 8º 58’ 33”; 36º 41’ 15” 5º 43’ 35”; 35º 6’ 17” 8º 0’ 24”; 36º 3’ 24”
1 1 2 1 3 3 2
73
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Resultados
Coloração convencional
Sturnira lilium e Platyrrhinus lineatus apresentaram número diplóide 2n=30,XY e
número fundamental (NF) igual a 56, com cromossomos meta-submetacêntricos
(1-4, 8,10-14) e subtelocêntricos (5,6,7,9 e X). O cromossomo Y é um pequeno
subtelocêntrico em P. lineatus (Fig. 1a) e metacêntrico em S. lilium (Fig. 1b). O
número diplóide de Glossophaga soricina foi 2n=32,XY e NF=60 com a
morfologia cromossômica constituída por meta-submetacêntricos (1-10, 14 e X),
subtelocêntricos (11-13) e acrocêntricos (15 e Y), sendo o Y um pequeno
acrocêntrico (Fig.1c).
Bandeamento C e marcação com nitrato de prata
O bandeamento C revelou HC pericentromérica em todos os cromossomos das
três espécies (Fig. 2 a-b e 3a-c). Adicionalmente, blocos intersticiais de HC
foram visualizados nos pares 1, 2, 3, 5, 6, 7 e 8 em P. lineatus, na região distal
dos braços curtos dos subtelocêntricos (5, 6, 7, 9 e X) em P. lineatus (Fig. 2a e
3a) e S. lilium (Fig. 2b e 3b) e na região distal do braço longo do Y de G. soricina
(Fig. 3c). Em S. lilium o braço longo do X apresentou uma coloração diferencial
e o cromossomo Y foi quase totalmente marcado (Fig. 2b e 3b) e P. lineatus
apresentou bloco adicional de HC na região distal do braço longo do Y (Fig. 2a e
3b). As Ag-RONs foram localizadas na região distal do braço curto do
cromossomo 7 em P. lineatus (Fig. 4a) e S. lilium (Fig. 4d) e na constrição
secundária do braço longo do par 15 em G. soricina (Fig. 4g).
74
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI)
A tríplice coloração CMA3/DA/DAPI revelou um padrão de bandas R com o
CMA3 em P. lineatus (Fig. 4b), S. lilium (Fig. 4e) e G. soricina (Fig. 4h), além de
uma fraca marcação na região pericentromérica de alguns cromossomos.
Adicionalmente, foi observado um bloco CMA3 positivo na região
pericentromérica do cromossomo X de S. lilium (Fig. 4e). O uso do DAPI revelou
uma coloração uniforme nos cromossomos de P. lineatus (Fig. 4c) e G. soricina
(Fig. 4i), enquanto que em S. lilium (Fig. 4f) exibiu um fraco padrão de bandas G
e uma marcação na região centromérica nos pares 5, 6 e 7. A coloração
seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI evidenciou uma correspondência entre as
regiões CMA3 positivas com os sítios marcados pelo AgNO3 em P. lineatus (Fig.
4a-c), S. lilium (Fig. 4d-f) e G. soricina (Fig. 4g-i). Contudo, em S. lilium o CMA3
apresentou um fraco sinal fluorescente (Fig. 4e). Nas três espécies esses sítios
apresentaram-se DAPI negativos (Fig. 4c,f,i).
Discussão Os dados cariotípicos obtidos, referentes aos números diplóide e
fundamental, morfologia cromossômica e sistema sexual de G. soricina e S.
lilium, estão de acordo com aqueles previamente descritos na literatura (Varella-
Garcia e Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990; Volleth et al., 1999; Santos et al.,
2002). Contudo, em P. lineatus foi observada uma divergência quanto à
morfologia do cromossomo Y em relação à descrita por Tucker (1986) para o
gênero Vampyrops (= Platyrrhinus) que descreveu o mecanismo sexual de
espécies dos gêneros Vampyrops (= Platyrrhinus), Chiroderma, Sturnira,
Uroderma e Vampyressa como do tipo Neo-XY. Este sistema composto teria
75
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
sido derivado de fusão entre os cromossomos Y1 e Y2 (sistema múltiplo)
resultando na formação de um Y metacêntrico. Nos exemplares de P. lineatus
aqui analisados, entretanto, este cromossomo corresponde a um pequeno
subtelocêntrico diferente daquele descrito por Tucker (1986) como metacêntrico
em exemplares coletados na Costa Rica, Peru e Trinidad. A morfologia
subtelocêntrica para o cromossomo Y é uma condição incomum entre os
morcegos filostomídeos, sendo observada em apenas alguns representantes
(Baker e Hsu, 1970; Baker, 1973; Nargosen e Peterson, 1975; Baker e
Genoways, 1976). Dessa forma, nossos resultados indicam uma variação
cromossômica geográfica para P. lineatus.
O padrão pericentromérico de distribuição de HC revelado pelo
bandeamento C nas espécies aqui analisadas coincide com o observado na
maioria dos representantes da família Phyllostomidae (Varella-Garcia et al.,
1989; Souza e Araújo, 1990; Santos et al., 1998a, b; Santos et al., 2001). Além
disso, os blocos adicionais de HC na região telomérica do braço curto dos pares
5, 6, 7 e cromossomo X em P. lineatus e S. lilium correspondem a um padrão
compartilhado por alguns representantes de Stenodermatinae (Tabela 1)
(Varella-Garcia et al. 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998b).
Adicionalmente, a coloração diferencial presente no braço longo do cromossomo
X de S. lilium representa uma característica de alguns representantes de
Stenodermatinae, particularmente do gênero Artibeus (Souza e Araújo, 1990;
Santos e Souza, 1998b; Santos et al., 2001), indicando a ocorrência de uma
cromatina dispersa, com propriedades estruturais diferentes da cromatina da
região pericentromérica e telomérica do genoma dessas espécies.
76
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Embora P. lineatus e S. lilium apresentem semelhanças quanto ao padrão
pericentromérico e distal de HC, diferenças foram observadas em relação à
presença de blocos intersticiais em P. lineatus e a coloração diferencial do braço
longo do cromossomo X de S. lilium (Figura 2a, b e Tabela 2).
A localização das RONs observadas pela marcação com AgNO3 no par 7
em P. lineatus e S. lilium e no par 15 em G. soricina coincide com dados da
literatura (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Souza e Araújo, 1990),
representando uma condição ancestral para a família Phyllostomidae. Em
morcegos, o padrão de RONs ativas tem sido evidenciado pelo AgNO3, devido a
sua afinidade pelos remanescentes nucleolares presentes nesses sítios (Volleth
1987; Morielle-Versute e Varella-Garcia 1988; Souza e Araújo 1990), e também
pelo CMA3, pela associação aos pares de bases GC comumente presentes nas
regiões intergênicas das RONs (Santos e Souza 1998a,b; Santos et al., 2001;
Leite-Silva et al., 2003).
Os fluorocromos base-específicos têm revelado padrões diferenciais tanto
na eucromatina como na heterocromatina de diferentes organismos,
particularmente vertebrados (Pieczarka et al., 2001; Santos et al., 2001; Schmid
et al., 2002; Leite-Silva et al., 2003; Kavalco et al., 2004). Em morcegos, a
tríplice coloração CMA3/DA/DAPI geralmente induz um padrão de bandeamento
da eucromatina e tem revelado uma composição diferencial da hererocromatina
(Tabela 3) (Bickham, 1987; Ruedas et al., 1990; Santos e Souza 1998a, b; Santos
et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003). O padrão de bandas R com o CMA3
observado em G. soricina, P. lineatus e S. lilium, a coloração uniforme dos
cromossomos observada com o DAPI em P. lineatus e G. soricina e o fraco
padrão de bandas G em S. lilium, também tem sido observado em outros
77
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
representantes da família Phyllostomidae (Santos e Souza, 1998a, b; Santos et
al., 2001).
O uso da tríplice coloração CMA3DA/DAPI permitiu identificar a ocorrência
de um grande bloco CMA3 positivo na região pericentromérica do cromossomo X
em S. lilium, indicando uma heterocromatina diferencial, que pode ser
considerada como um marcador cariotípico para essa espécie. Além disso, a
coloração uniforme com o DAPI nos cromossomos de P. lineatus e G. soricina e os
blocos positivos para o DAPI na região centromérica de alguns cromossomos de
S. lilium, também observada em outras espécies (Santos e Souza, 1998a,b;
Santos et al., 2001), confirmam a ampla heterogeneidade na composição da
heterocromatina em Phyllostomidae.
Em Carollia perspicillata, a coloração CMA3/DA/DAPI mostrou tanto bandas
da eucromatina (bandas G e R) como três tipos de heterocromatina constitutiva:
CMA3-positiva, DAPI-positiva e CMA3 e DAPI neutra (Tabela 3). Em Phyllostomus
discolor foram evidenciados blocos DAPI positivos nas regiões pericentroméricas
de alguns cromossomos (Santos e Souza, 1998a,b). Por outro lado, Artibeus
lituratus, A. jamacensis, A. cinereus, Desmodus rotundus e Diphyla ecaudata
(Santos e Souza, 1998b; Santos et al., 2001) não apresentaram nenhuma riqueza
de pares de bases AT e GC através dessa coloração (Tabela 3), indicando que o
uso desses fluorocromos permite uma qualificação da composição da cromatina
no genoma de morcegos.
A correspondência entre as regiões CMA3 positivas com os sítios
marcados pelo nitrato de prata visualizada pela coloração AgNO3/CMA3/DA/DAPI
nas três espécies indica a riqueza de pares de bases GC nesses sítios e também
tem sido encontrada em outras espécies de Phyllostomidae (Tabela 3) (Santos e
78
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Souza 1998b; Santos et al. 2001). Contudo, em S. lilium foi observado um sinal
fluorescente menos intenso desses sítios marcados com o CMA3, sugerindo uma
variabilidade desses sítios em relação à repetição das seqüências de pares de
bases GC quando comparado com P. lineatus e G. soricina. Essa composição
diferencial também foi observada em Carollia perspicillata e Phyllostomus
discolor que apresentaram as seqüências intergênicas associadas às RONs
neutras para o CMA3 e negativa para o DAPI (Tabela 2)(Santos e Souza,
1998a,b). Dessa forma, nossos dados confirmam a existência de uma
variabilidade na composição desses sítios em Phyllostomidae.
A afinidade das seqüências intergênicas associadas às RONs pelos
fluorocromos específicos para GC, também tem sido constatada em outros
organismos, como peixes (Gromicho et al., 2005, Silva et al., 2006), anfíbios
(Lourenço et al., 2000) e mamíferos (Svartmam e Vianna-Morgante, 2003). Tal
comportamento observado nessas regiões em diferentes organismos,
particularmente vertebrados, indica uma maior riqueza de pares de bases GC
nos sítios de DNAr, embora ocorra casos em que esses sítios são ricos em AT
ou sem nenhuma riqueza específica (Amemyia e Gold, 1986; Santos e Souza,
1998b).
As respostas diferenciais aos fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI
obtidas nas espécies analisadas confirmam a heterogeneidade da HC quanto à
sua composição nesses representantes de Phyllostomidae, e comprovam as
características particulares das seqüências intergênicas associadas às RONs
que geralmente apresentam-se CMA3 positiva em filostomídeos podendo ser,
com menor freqüência, negativa ou sem especificidade. Contudo, mais espécies
precisam ser estudadas com esse enfoque, numa tentativa de estabelecimento
79
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
de que tipo de seqüência repetitiva (rica em AT ou GC) apresenta expansão
diferencial nesses organismos.
Agradecimentos
As autoras agradecem aos Drs. Alfredo Ricardo Langguth Bonino e a Katharine
Raquel Pereira dos Santos da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pela
fundamental contribuição na identificação taxonômica das espécies utilizadas
nesse trabalho; à Cirlene Maria da Silva e Francisca Tavares Lira pelo suporte
técnico e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico) pelo apoio financeiro ao projeto.
Referências Bibliográficas
Altringham, J.D., 1996. Bats, Biology and Behaviour.Oxford: Oxford University,
255p
Amemyia, C.T., Gold, J.R., 1986. Chromomycin A3 stains nucleolus organizer
regions of fish chromosomes. Copeia 226--231.
Baker, R.J., 1973. Comparative cytogenetics of the New World leaf-nosed bats
(Phyllostomatidae). Peridicum Biologicum 75, 37--45
Baker, R.J., Genoways, H.H., 1976. The Phyllostomatidae bat, Vampyressa
brocki in Colombia. Bull. South California Acd. Sci 71, 54.
Baker, R.J., Bickham J.W., 1980. Karyotypic evolution in bats: evidence of
extensive and conservative chromosomal evolution in closely related taxa.
Syst Zool 29, 239--253.
Baker, R.J., Maltbie, M., Owen, J.G., Hamilton, M.J., Bradley, R.D., 1992
Reduced number of ribosomal sites in bats: evidenced for mechanism to
contain genome size. J Mammal 73, 847--858.
Baker, R.J., Hoofer, S.R., Porter, C.A., van Den Bussche, R.A., 2003.
Diversification among New World leaf-nosed bats: An evolutionary
hypothesis and classification inferred from digenomic congruence of DNA
sequence. Occ Papers 230, 1--32.
80
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Bickham, J.W., 1987. Chromosomal variation among seven species of lasiurine
bats (Chiroptera: Vespertilionidae). J. Mammal 68, 837--842.
Burgos, M., Olmos, D.M., Jimenez, R., Sanchez, A., Diaz, de La Guardia R.,
1990. Fluorescence banding in four species of Microtidae: na analysis of the
evolutive changes of the constitutive heterochromatin. Genetica 81, 11--16.
Gromicho, M., Ozouf-Costaz, C., Collares-Pereira, M.J., 2005. Lack of
correspondence between CMA3, Ag-positive signals and 28S rDNA loci
in two Iberian minnows (Teleostei, Cyprinidae) evidenced by sequential
banding. Cytog Gen Res 109, 507--511.
Guerra, M.S., 1991. Cis-acting regulation of NOR cistrons in Eleutherine bulbosa
(Iridaceae). Genetica 83, 235--241.
Howell, W.M., Black, D.A., 1980. Controlled silver-staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia,
36, 1014--1015.
Jones, K.E., Purvis, A., MacLarnon, A., Bininda-Emonds., O.R.P., Simmons,
N.B., 2002. A phylogenetic supertree of the bats (Mammalia: Chiroptera).
Biology Rev 77, 223--259.
Kavalco, K.F., Pazza, R., Bertollo, L.A.C., Moreira-Filho, O., 2004.
Heterochromatin characterization of four fish species of the family
Loricariidae (Siluriformes). Hereditas 141, 237--242.
King, M., 1991. The evolution of the heterochromatin in the amphibian genome.
In: D.M. Green and S.K. Amph Cytog Evol 359--391.
Leite-Silva, C., Santos, N., Fagundes, V., Yonenaga-Yassuda, Y., Souza, M.J.,
2003. Karyotypic characterization of the bat species Molossus ater, M.
molossus and Molossops planirostris (Chiroptera, Molossidae) using FISH
and banding techniques. Hereditas 138, 94--100.
Lourenço, L.B., Garcia, P.C.A., Recco-Pimentel, S.M., 2000. Cytogenetics of two
species of Paratelmatobius (Anura: Leptodactylidae), with phylogenetic
comments. Hereditas 133, 201--209.
Mayr, B., Lambrou, M., kalat, M., Schleger, W., Bigelbah, A., 1990.
Characterization of heterochromatin by sequential counterstain enhaced
fluorescence in three domestic birds species: Meleagris gallopavo,
Columbia livia domestica and Anser anser L. J. M Heredity 81(6), 468--475.
81
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Morielle-Versute, E., Varella-Garcia, M., 1988. Variability of nucleolus organizer
regions in phyllostomid bats. Rev Brasil Genet 11 (4), 853--871.
Nagorsen, D.W., Peterson, R.L., 1975. Karyotypes of six species of bats
(Chiroptera) from the Dominican Republic. Life Sci. Contrib., Royal Ontario
Mus. 28, 1--8.
Neves, A.C.B., Pieczarka, J.C., Barros, R.M.S., Marques-Aguiar, S., Rodrigues,
L.R.R., Nagamachi, C.Y., 2001. Cytogenetic studies on Choeroniscus minor
(Chiroptera, Phyllostomidae) from the Amazon region. Cytobios 105, 91--
98.
Pieczarka, J.C., Nagamachi, R.Y., Pissinatti, A., Barros, R.M., Mattevi, M.S.,
2000. Characterization of constitutive heterochromatin of Callithrix geoffroyi
(Callitrichidae, Primatas) by restriction enzymes and fluorochromes bands.
Cytobios 101 (398), 161--172.
Pieczarka, J.C., Nagamachi, R.Y., Muniz, J.A., Barros, R.M., Mattevi, M.S., 2001.
Restricion enzyme and fluorochrome banding analysis of the constitutive
heterochromatin of Saguinus species (Callitrichidae, Primates). Cytobios,
105 (408), 13--26.
Reis, N.R., Peracchi, A.L., Pedro, W.A., Lima, I.P., 2007. Morcegos do Brasil, 1ª
edição, 253p.
Ribeiro, N.A.B., Nagamachi, C.Y., Pieczarka, J.C., Rissino, J.D., Neves, A.B.C.,
Gonçalves, A.C.O., Marques-Aguiar, S., Assis, M.F.L., Barros, R.M.S.,
2003. Cytogenetic analysis in species of the subfamilie Glossophaginae
(Phyllostomidae, Chiroptera) supports a polyphyletic origin. Caryologia 56
(1), 85--96.
Ruedas, L.A., Lee Jr., T.E., Bickham, W., Schlitter, D.A., 1990. Chromosomes of
five species of vespertilionid bats from Africa. J. Mammal 71, 94--100.
Santos, N., Souza, M.J., 1998a. Characterization of the constitutive
heterochromatin of Carollia perspicillata (Phyllostomidae, Chiroptera) using
the base-specific fluorochromes, CMA3 (GC) and DAPI (AT). Caryologia 51,
51--60.
Santos, N., Souza, M.J., 1998b. Use of fluorochromes chromomycin A3 and DAPI
to study constitutive heterochromatin and NORs in four species of bats
(Phyllostomidae). Caryologia 51, 265--278.
82
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Santos, N., Fagundes, V., Yonenaga-Yassuda, Y., Souza, M.J., 2001.
Comparative karyology of brazilian vampire bats Desmodus rotundus and
Diphylla ecaudata (Phyllostomidae, Chiroptera): banding patterns, base-
specific fluorochromes and FISH of ribossomal genes. Hereditas 134, 189--
194.
Santos, N., Fagundes, V., Yonenaga-Yassuda, Y., Souza, M.J., 2002.
Localization of rRNA genes in Phyllostomidae bats reveals silent NORs in
Artibeus cinereus. Hereditas 136, 137--143.
Schmid, M., Haaf, T., Steinlein, C., Nanda, I., Mahony, M., 2002. Chromosome
banding in Anphibia. Cytog Gen Res 97, 239--253.
Schweizer, D., 1980. Simultaneous fluorescent staining of R bands and specific
heterochromatic regions (DA-DAPI bands) in human chromosomes. Cytog
Cell Genet 27, 190--193.
Silva, A.P.Z., Haddad, C.F.B., Galassi, G.G., Kasahara, S., 2006. Multiple
nucleolus organizer regions Leptodactylus mystacinus (Amphibia, Anura)
and comments on its systematic position in the L. fuscus group based on
cytogenetic and molecular analyses. Genetica 127, 35--44.
Souza, M.J., Araújo, M.C.P., 1990. Conservative pattern of the G-bands and
diversity of C-banding patterns and NORs in Stenodermatinae (Chiroptera-
Phyllostomatidae). Rev Brasil Genet 13, 255--268.
Souza, L., Giuliano-Caetano, L., Dias, A.L., 2004a. Banding chromosome
patterns of two species of Pimelodus (Siluriformes, Pimelodidae) from the
Paraná River Basin of Brazil. Folia Biologica (Kraków) Vol. 52 (3-4), 165--
169.
Souza, L., Swarça, A.C., Dias, A.L., 2004b. Analysis of the nucleolus organizer
regions in 5 species of the genus Pimelodus (Siluriformes, Pimelodidae),
using AgNO3, CMA3 and FISH with the 18S rDNA probe. Caryologia 57 (2),
144--150.
Sumner, A.T., 1972. A sample technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Exp Cell Res 75, 304--306.
Svartmam, M., Viana-Morgante, A.M., 2003. Conservation of chromosome
location of nucleolus organizer in American marsupials (Didelphidae).
Genetica 118, 11--16.
83
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Torres, R.A., Ganal, M., Hemleben, V., 1990. GC balance in the internal
transcibed spacer ITS1 and ITS2 of nuclear ribossomal RNA genes. J Mol
Evol 30, 170--181.
Tucker, P.K., 1986. Sex chromosome-autosome translocations in the leaf-nosed
bats family Phyllostomidae. I. Mitotic analyses of the subfamilies
Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytog Cell Genet 43, 19--27.
Varella-Garcia, M., Taddei, V.A., 1989. Citogenética de Quirópteros: Métodos e
Aplicações. Rev Bras Zool 6, 297--323.
Varella-Garcia, M., Morielle-Versute, E., Taddei, V.A., 1989. A survey of
cytogenetic data on Brazilian bats. Rev Brasil Genet 12, 761--793.
Volleth, M., 1987. Differences in the location of nucleolus organizer regions in
European vespertilionid bats. Cytog Cell Genet 44, 186--197.
Volleth, M., Klett, C., Kollak, A., Dixkens, C., Winter, Y., Just, W., Vogel, W.,
Hameister, H., 1999. ZOO-FISH analysis in a species of the order
Chiroptera: Glossophaga soricina (Phyllostomidae). Chrom Res 7, 57--64.
Wetterer, A.L., Rockman, M.V., Simmons, N.B., 2000. Phyllogeny of phyllostomid
bats (Mammalia: Chiroptera): data from diverse morphological systems, sex
chromosomes and restriction sites. Bull Amer Mus Nat Hist 1, 248.
84
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Figura 1 – Coloração convencional em Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e
Glossophaga soricina (c). No inserto cromossomo X e Y de macho. Barra: 5 μm.
85
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
a
Figura 2 – Padrão de heterocromatina constitutiva através do bandeamento C
em Platyrrhinus lineatus (a) e Sturnira lilium (b). Em b notar a coloração
diferencial do braço longo do cromossomo X. Barra: 5 μm.
86
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Heterocromatina constitutiva Cromatina dispersa RONs
Figura 3 - Idiograma mostrando o padrão de heterocromatina e RONS em
Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e Glossophaga soricina (c). Em b notar
a coloração diferencial do braço longo do cromossomo X.
87
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
88
Figura 4 - Coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI em metáfase de
Platyrrhinus lineatus (a-c), Sturnira lilium (d-f) e Glossophaga soricina (g-i). As
setas indicam as RONs. Em (e) destaque para o padrão de CMA3+ do
cromossomo X. Em (f) Cabeças de seta indicam a marcação DAPI + nos pares 5,
6 e 7. Barra: 5 μm.
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Tabela 2: Padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva em alguns representantes da subfamília Stenodermatinae (Phyllostomidae).
Padrão de bandeamento C Espécies Pericentromérico Distal Intersticial Referências
Platyrrhinus lineatus + 5,6,7, X, Y 1,2,3,5,6,7,8 3 Sturnira lilium + 5,6,7, X - 3 Glossophaga soricina + Y - 3 Artibeus lituratus + 5,6,7 6 1,2 A. fimbriatus + 5,6,7 - 1,2 A. jamaicensis + 5, 6, 7, 9 e
13 1, 2 e 6 1,2
A. obscurus + 5, 6, 7 e 9 1, 2, 5 e 6 1 Referências: (1) Lemos-Pinto (2007); (2) Santos e Souza (1998b); (3) Presente trabalho
Tabela 3: Padrão de qualificação da eucromatina, heterocromatina e das seqüências intergênicas das RONs com o CMA3 e DAPI em representantes de Phyllostomidae.
CMA3 DAPI
Espécies Eucromatina HC Seqüências intergênicas
Referências
Platyrrhinus lineatus R CMA3+ CMA3+/DAPI- 6
Sturnira lilium R e G CMA3+ e DAPI+ CMA3+/DAPI- 6
Glossophaga soricina R CMA3+ CMA3+/DAPI- 6
Artibeus obscurus R CMA3+ CMA3+ 2
A. lituratus R CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 4
A. jamaicensis R CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 4
A. fimbriatus R CMA3+ CMA3+ 2
Desmodus rotundus R e G CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 5
Diphylla ecaudata R e G CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 5
Lonchorhina aurita R CMA3+ CMA3+ 1 Trachops cirrhosus R CMA3+ CMA30 1
Carollia perspicillata R e G CMA3+/DAPI+,
CMA30/DAPI0
CMA30/DAPI- 3
Phyllostomus discolor R CMA3/DAPI+ CMA30/DAPI- 4
R=Banda R; G=Banda G; CMA3 =Banda R; DAPI = Banda G; HC=heterocromatina
constitutiva; + =positiva; - =negativa; 0=neutra
Referências: (1) Barros (2006); (2) Lemos-Pinto (2007); (3) Santos e Souza (1998a);
(4) Santos e Souza (1998b); (5) Santos et al. (2001); (6) Presente trabalho.
89
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
5. Conclusões
1. Os números diplóides (2n=30,XY e 2n=32,XY) e os números fundamentais
(NF=56-60) encontrados nas três espécies são considerados a condição
primitiva para a família Phyllostomidae;
2. A morfologia subtelocêntrica do Y de Platyrrhinus lineatus indica a ocorrência de
uma variação cromossômica geográfica para essa espécie, uma vez que dados
da literatura descrevera um Y metacêntrico;
3. Os blocos adicionais de HC na região distal do braço curto dos pares 5, 6, 7 e
cromossomo X observado em P. lineatus e S. lilium correspondem a um padrão
compartilhado por alguns representantes de Stenodermatinae;
4. A coloração diferencial observada na cromatina presente no braço longo do X de
Sturnira lilium, quando submetida ao bandeamento C, tem sido observada em
alguns representantes da subfamília Stenodermatinae. Além disso, o
comportamento quase totalmente heterocromático do Y dessa espécie é um
padrão freqüente em Phyllostomidae;
5. A ocorrência de um único par de RONs em autossomos observada nas espécies
analisadas é considerada uma condição ancestral para os filostomídeos;
6. Nas três espécies analisadas as regiões heterocromáticas pericentroméricas e as
regiões distais de alguns cromossomos apresentaram uma fraca marcação com o
CMA3, indicando uma predominante associação de heterocromatina com
seqüências ricas em pares de bases GC;
7. As respostas diferenciais obtidas com os fluorocromos base-específicos CMA3 e
DAPI confirmaram a heterogeneidade da HC e das seqüências intergênicas
associadas às RONs quanto à sua composição de pares de bases. Esses
resultados sugerem a necessidade de uma ampliação no número de espécies
estudadas com esse enfoque, visando um melhor entendimento da expansão
90
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
diferencial das seqüências repetitivas (ricas em AT ou GC) dentro da família
Phyllostomidae.
91
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
6. Abstract
Mitotic chromosomes of Glossophaga soricina (2n=32,XY; NF=60), Platyrrhinus
lineatus and Sturnira lilium (2n=30,XY; NF=56) were analyzed through the
conventional staining, C-banding, silver nitrate impregnation (AgNO3) and base-
specific fluorochromes. Data of the conventional analysis obtained from the three
species are in agreement with those described in the literature, except for the
morphology of the Y chromosome of P. lineatus, indicating geographical
chromosomal variation for the species. The blocks of CH in the distal region of
the short arm of 5, 6, 7 and X chromosomes, observed by the C-banding, in P.
lineatus and S. lilium, besides the differential staining in the long arm of the X
chromosome of Sturnira lilium correspond a pattern shared by some
representatives of Stenodermatinae. The weak marking CMA3+ in the
pericentromeric and distal heterochromatic regions of some chromosomes
indicate a predominant association of heterochromatin with GC-rich sequences.
However, the differential patterns obtained with the base-specific fluorochromes
confirmed the heterogeneity of CH to its composition (AT- and/or GC-rich) and
proved differential characteristics of the intergenic sequences associated to NORs
(positive CMA3, negative or without specificity) in representatives of Phyllostomidae.
Key-word: Phyllostomidae, C-banding, AgNO3, CMA3, DAPI
92
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
7. ANEXOS
93
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
7.1 INSTRUÇÕES PARA AUTORES
Revista Micron: The International Research and Review
Journal for Microscopy
ISSN: 0968-4328
94
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Micron: The International Research and Review Journal for Microscopy Submission of Papers
Submission of a paper implies that it has not been published previously, that it is
not under consideration for publication elsewhere, and that if accepted it will not
be published elsewhere in the same form, in English or in any other language,
without the written consent of the publisher.
Authors are encouraged to submit their papers using the online submission tool
at http://ees.elsevier.com/jmic
Alternatively, for hardcopy submissions:
For Physical Science Research papers and communications, three copies of
the entire paper should be sent directly to either of the following:
Professor D.J.H. Cockayne, University of Oxford, Department of Materials, Parks
Road, Oxford OX1 3PH, UK. Tel: 44 (0) 1865 273682; Fax: 44 (0) 1865 273789;
e-mail: [email protected]
Professor R.F. Egerton, Physics Department, University of Alberta, Edmonton,
Canada T6G 2J1. Tel.: 1 780 492 5095; Fax: 1 780 492 0714; e-mail: [email protected] For Physical Science Review papers, three copies of the entire paper should
be submitted to Professor Egerton at the above address.
For Biological Research papers and Short communications, three copies of
the entire paper should be sent directly to:
Dr J.R. Harris, Institute of Zoology, University of Mainz, D-55099 Mainz,
Germany. Tel: 49 6131 392 3158; Fax: 49 6131 392 4652; e-mail: [email protected]
For Biological Review papers, three copies of the entire paper should be
submitted to Dr Harris at the above address.
Manuscript Preparation
General: Manuscripts must be typewritten, double-spaced with wide margins on
one side of white paper. Good quality printouts with a font size of 12 or 10 pt are
required. The corresponding author should be identified (include a Fax number
and E-mail address). Full postal addresses must be given for all co-authors.
95
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
Authors should consult a recent issue of the journal for style if possible. An
electronic copy of the paper should accompany the final version. The Editors
reserve the right to adjust style to certain standards of uniformity. Authors should
retain a copy of their manuscript since we cannot accept responsibility for
damage or loss of papers. Original manuscripts are discarded one month after
publication unless the Publisher is asked to return original material after use.
Abstracts: This must be a concise statement of the purpose of the paper and of
the major results obtained. Abstracts must be self-explanatory and should not
consist of more than 500 words.
Text: Follow this order when typing research manuscripts: Title, Authors,
Affiliations, Abstract, Keywords (about 10), Introduction, ?Materials and Methods,
Discussion, Acknowledgements, Appendix, References, Figure Captions and
then Tables. For short communications sub-headings (introduction, etc.) should
not be used. For reviews, include a contents list, and appropriate sub-headings
(two grades of heading only) after the introduction, i.e
I.?Introduction
A. . . .
B. . . .
II.?. . .
A. . . .
B. . . . etc.
Do not import the Figures or Tables into your text. The Title should be short but
must accurately reflect the content of the paper. The corresponding author should
be identified with an asterisk and footnote. Authors are requested not to use
footnotes in the main body of the paper but to include any scientific matter or
sources of special materials in the text and any which take the form of an
acknowledgement in the appropriate section. All acknowledgements should be
confined in the section set aside at the end of the text for this purpose. Papers
should carry the appropriate sub-headings
Units: Authors are required to use SI units throughout. Please ensure that any
Greek or unusual symbols are clearly identified in the margin.
References: All publications cited in the text should be presented in a list of
references following the text of the manuscript. In the text refer to the author's
96
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
name (without initials) and year of publication (e.g. "Since Peterson (1993) has
shown that . . ." or "This is in the agreement with results obtained later (Kramer,
1994)"). For three or more authors use the first author followed by "et al.", in the
text. The list of references should be arranged alphabetically by authors' names.
The manuscript should be carefully checked to ensure that the spelling of
authors' names and dates are exactly the same in the text as in the reference list.
References should be given in the following form:
Adams, A., Nelson, W.J., Smith, S.J., 1996. Quantitative analysis of cadherin-
catenin-actin reorganization during development of cell-cell adhesion. Journal of
Cell Biology 135, 1899--1911.
Mostov, K.E., Cardone, M.H., 1995. Regulation of protein traffic in polarized
epithelial cells. Bioessays 17 (1), 129--138.
Strunk Jr., W., White E.B., 1979. The Elements of Style, 3rd ed. Macmillan, New
York.
Gurman, A.S., Kniskern, D.P., 1981. Family therapy outcome research: knowns
and unknowns. In: Gurman, A.S., Kniskern, D.P. (Eds.), Hand book of Family
Therapy. Brunner/Maazel, New York, pp. 742--775.
Shida, H., Shida, M., Ohga, R., 1986. A new method for quantitative high
resolving power analysis of immunoelectron microscopy using post-embedding
labeling procedure. In: T. Imura, S. Maruse, T. Suzuki, III (Eds.), Proceedings
XIth International Congress on Electron Microscopy, Kyoto.
Illustrations: For online submissions, electronic graphics are mandatory. Online
instructions can be found at: http://ees.elsevier.com/jmic and artwork instructions
are at: http://www.elsevier.com/locate/authorartwork
If you are not submitting online, all illustrations should be provided in camera-
ready form, suitable for reproduction (which may include reduction) without
retouching. Photographs, charts and diagrams are all to be referred to as
"Figure(s)" and should be numbered consecutively in the order to which they are
referred. They should accompany the manuscript, but should not be included
within the text. All illustrations should be clearly marked on the back with the
figure number and the author's name. All figures are to have a caption. Captions
97
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
should be supplied on a separate sheet.
Line drawings: Good quality printouts on white paper produced in black ink are
required. All lettering, graph lines and points on graphs should be sufficiently
large and bold to permit reproduction when the diagram has been reduced to a
size suitable for inclusion in the journal. Dye-line prints or photocopies are not
suitable for reproduction. Do not use any type of shading on computer-generated
illustrations.
Photographs: Original photographs must be supplied as they are to be
reproduced (e.g. black and white or colour). Authors should indicate clearly their
preferred size for micrographs and diagrams. All sets of photographs should be
fully labelled with Letraset symbols and contain scale bars. Please note that
photocopies of photographs are not acceptable.
Colour: No charges will be made for colour illustrations for those papers in which
colour is essential to convey the full information content of the image. The pages
will be decided at the Editors' discretion.
Tables
Tables should be numbered consecutively and referred to by Arabic numerals.
These should be given a suitable caption and each table typed on a separate
sheet. Footnotes are acceptable to tables and should be typed below the table
and should be referred to by superscript lowercase letters. No vertical rules
should be used. Tables should not duplicate results presented elsewhere in the
manuscript, (e.g. in graphs).
Electronic submission
Authors should submit an electronic copy of their paper with the final version of the manuscript. The electronic copy should match the hardcopy exactly. Always keep a backup copy of the electronic file for reference and
safety.
Proofs
Proofs will be sent to the author (first named author if no corresponding author is
identified of multi-authored papers) and should be returned within 48 hours of
receipt. Corrections should be restricted to typesetting errors; any others may be
charged to the author. Any queries should be answered in full. Please note that
authors are urged to check their proofs carefully before return, since the inclusion
98
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
of late corrections cannot be guaranteed. Proofs are to be returned to the Log-in
Department, Elsevier, Stover Court, Bampfylde Street, Exeter, Devon EX1 2AH,
UK.
Reprints
The corresponding author will be provided with a PDF of the article in its
published form. Authors wishing to order additional paid reprints should indicate
the number of reprints required when returning proofs.
Copyright All authors must sign the "Transfer of Copyright" agreement before the article can
be published. This transfer agreement enables Elsevier to protect the copyrighted
material for the authors, without the author relinquishing his/her proprietary rights.
The copyright transfer covers the exclusive rights to reproduce and distribute the
article, including reprints, photographic reproductions, microfilm or any other
reproductions of a similar nature, and translations. It also includes the right to
adapt the article for use in conjunction with computer systems and programs,
including reproduction or publication in machine-readable form and incorporation
in retrieval systems. Authors are responsible for obtaining from the copyright
holder permission to reproduce any material for which copyright already exists.
Author Enquiries
For queries relating to the technical aspects of manuscript submission (especially
electronic text and graphics), please contact:
Author Support Department
Elsevier
Radarweg 29
1043 NX Amsterdam
The Netherlands
E-mail: [email protected]
Fax: (=31) 20 485 3752
Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially
those relating to proofs, are provided when an article is accepted for publication.
99
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
7.2 FOTOS DAS ESPÉCIES ESTUDADAS
100
Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...
101
a
b
c
a
Figura 1 – Fotos das espécies Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e
Glossophaga soricina (c). Fonte: ). www.flickr.com/photos/morcegao/