LAPORAN PRAKTIKUM ENDOKRINOLOGI DAN REPRODUKSI HEWAN

ACARA V

ANALISA HORMON DENGAN METODE ELISA

OLEH

LALU ACHMAD TAN TILAR WSK.

10/306157/PBI/00959

PROGRAM PASCASARJANA S2

FAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

2011

ACARA V

ANALISA HORMON DENGAN METODE ELISA

1. Tujuan

Mempelajari langkah-langkah penting dalam analisa hormon dengn menggunakan

metode Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

2. Bahan dan Alat

a. Bahan

Antigen yang dimurnikan

Antibodi yang dimurnikan

Larutan standard

Sampel yang ingin dites

Cairan pencuci (buffer)

Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal

Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.

b. Alat

Microtiter

Micropipet

ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif

3. Cara Kerja

Tentukan jumlah microtitter yang akan digunakan kemudian letakkan pada

penahannya.

Masukkan masing-masing 25 L sebagai larutan standar, kontrol dan sampel

Masukkn 200 L enzim conjugate ke dalam setiap sumuran dan diaduk selama

10 detik

Inkubasi selama 60 menit dalam suhu ruangan

Mengeluarkan seluruh isi sumuran dan dicuci 3 kali menggunakan larutan

pencuci sebanyak 400 L setiap sumuran

Menghentakkan sumuran dengan keras di atas kertas penyerap untuk

menghilangkan gumpalan residu

Menambahkan 200 L substrat solution pada setiap sumuran

Inkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan

Menghentikan reaksi enzimatik dengan menuangkan 100 L stop solution

pada setiap sumuran

Membaca penyerapan pada setiap sumuran menggunakan microtitter plate

reader, 10 menit setelah penambahan stop solution.

4. Tinjauan Pustaka

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay)

atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang

umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa

keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan

memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971

oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen

dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai

pelapor (reporter label) (Lequin, 2005).

ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang

menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk

mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti

teknik flurogenic, electrochemiluminescent, dan real-time PCR dibuat untuk

mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan

diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al, 2008).

Teknik ELISA merupakan teknik kuantitatif yang sangat sensitif,

penggunaannya sangay luas, memerlukan peralatan yang sedikit, reagen yang

diperlukan sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat mudah didapat.

Tes ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antigen maupun antibodi

Pemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam tubuh

manusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam pemeriksaan ELISA.

Tes ini dapat dilakukan dengan kit yang sudah jadi atau dapat juga dilakukan

dengan menggunakan antigen yang diracik sendiri (Setiawan, 2007).

5. Hasil Pengamatan

Tabel hasil pembacaan hormon menggunakan ELISA reader (spektrofotometer)

Kadar Testosteron

0 0.2 0.5 1 2 6 16

Absorbansi 0.807 0.665 0.179 0.108 0.024 0.399 0.402

Grafik hasil pembacaan hormon menggunakan ELISA reader (spektrofotometer)

6. Pembahasan

Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa

indonesianya disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim,

merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi

antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam

bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam

suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat

terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan

perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bentuk

lain termasuk menganalisis kadar hormon yang terdapat dalam suatu organisme.

Secara singkat dapat dikatakan bahwa teknologi ELISA yang digunakan

untuk asai hormon dalam cairan tubuh adalah sistem competitive enzyme

immunoassay yang analog dengan teknik RIA. Antigen yang berlabel dan antigen

yang tidak berlabel saling bersaing untuk berikatan dengan tapak pengikatan

antibodi yang terdapat dalam jumlah terbatas. Saturasi antibodi terjadi secara

simultan bila semua reaktan diinkubasikan bersama – sama. Contoh reaksi seperti

ini adalah ELISA untuk mengukur progesteron, estradiol, dan kortisol.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Konsentrasi

Absorbansi

Pengukuran hormon kortisol dalam saliva menggunakan teknik ELISA dapat

mengetahui tingkat stres yang di alami oleh organisme (Haussmann et al., 2007).

Teknik ini tidak membutuhkan peralatan yang banyak.

Hormon – hormon reproduksi seperti estrogen, progesteron, dan testosteron,

merupkan hormon yang tersusun dari steroid. Steroid tidak bersifat imunogenik

secara alami karena senyawa ini mempunyai berat molekul yang rendah sehingga

untuk dapat menghasilkan respons imun steroid harus diikatkan pada senyawa

dengan berat molekul yang lebih tinggi.

Dari hasil pengamatan diketahui bahwa kadar hormon testosteron sangat erat

kaitannya dengan absorbansi yang dihasilkan. Testosteron dengan konsentrasi

yang lebih rendah cenderung memiliki tingkat absorbansi yang lebih tinggi.

Sedangkan kadar hormon yang lebih tinggi (konsentrasi 6 dan 16) memiliki

absorbansi yang relatif stabil. Hasl ini mungkin dipengaruhi oleh banyak faktor

terutama faktor kelemahan dari teknik ELISA yang digunakan. Kelemahan yang

dapat diketahui antara lain:

Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut

dengan enzim.

Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.

Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari

antibodi pada percobaan yang berbeda.

Amplifikasi signal hanya sedikit.

Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum

digunakan untuk uji ELISA direct.

7. Kesimpulan

Dari hasil pengamatan serta pembahasan yang dilakukan dapat diambil beberapa

kesimpulan penting antara lain:

a. Secara singkat dapat dikatakan bahwa teknologi ELISA yang digunakan untuk

asai hormon dalam cairan tubuh adalah sistem competitive enzyme

immunoassay yang analog dengan teknik RIA.

b. Steroid tidak bersifat imunogenik secara alami karena senyawa ini mempunyai

berat molekul yang rendah sehingga untuk dapat menghasilkan respons imun

steroid harus diikatkan pada senyawa dengan berat molekul yang lebih tinggi.

c. Dari hasil pengamatan diketahui bahwa kadar hormon testosteron sangat erat

kaitannya dengan absorbansi yang dihasilkan.

Daftar Pustaka

Haussmann, M. F., C. M. Vleck, and E. S. Farrar. 2007. A laboratory exercise to

illustrate increased salivary cortisol in response to three stressful conditions

using competitive ELISA. Adv. Physiol. Educ. 31: 110–115.

Leng, S. J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel (October 2008).

"Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in

Inflammation and Aging Research". J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8):

879–884. PMC 2562869. PMID 18772478.

Lequin, RM (2005). "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (ELISA)". Clinical Chemistry 51 (12): 2415–2418.

Setiawan, I Made. 2007. Pemeriksaan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

untuk diagnosis Leptospirosis . EBERS PAPYRUS.