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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE LA CEPA NATIVA DE Fusarium oxysporum SOBRE EL β-D-GLUCOPIRANOSIL-
ESTER DEL ÁCIDO (-)16-(β-GLUCOPIRANOSILOXIL)-17-HIDROXI-KAURAN 19-OICO E IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS
SECUNDARIOS.
ANA MERCEDES MEDINA BUELVAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA CON ÉNFASIS EN INDUSTRIAL
BOGOTÁ.D.C, NOVIEMBRE 16 2001
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE LA CEPA
NATIVA DE Fusarium oxysporum SOBRE EL β-D-GLUCOPIRANOSIL-ESTER DEL ÁCIDO (-)16-(β-GLUCOPIRANOSILOXIL)-17-HIDROXI-
KAURAN 19-OICO E IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS.
ANA MERCEDES MEDINA BUELVAS
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de
magíster en microbiología.
Director RUBÉN DARÍO TORRENEGRA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA CON ÉNFASIS EN INDUSTRIAL BOGOTA.D.C, NOVIEMBRE 16
2001
NOTA DE ACEPTACIÓN
Dra. MARY SANTELLA
Dr. JORGE ROBLES
Dr. OMAR FUENTES
NOTA DE ADVERTENCIA Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y las conclusiones
anotadas son responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la
universidad.
Artículo 23 de la resolución número 13 de julio de 1964.
EL AUTOR.
Has de permanecer vigilante, para que
tus éxitos profesionales, no te hagan olvidar, cual es el verdadero fin de tu
Trabajo ¡la gloria de Dios! J. E. B
AGRADECIMIENTOS
Les agradézco de todo corazón:
Al doctor Rubén D. Torrenegra.
A Martha. M. Gonzáles, Paola Daza, Ana Oliveros, Adriana Chitiva, Samira Rueda, Constanza Cabrera, Nelly Diaz.
A los profesores Martha Ramirez, Marcela Franco, Martín Bayona, Álvaro
Granados.
Que con su apoyo me hicieron sentir que no importa comenzar el camino
con las mínimas condiciones, si encontramos personas que ante las
dificultades expresan su fraternidad.
A mis padres y a la Santísima Virgen que con su amor me apoyan en todo momento y Dora Yamile (Q.E.P.D) por animarme a seguir mis sueños.
CONTENIDO
Pág INTRODUCCIÓN 1 2. MARCO REFERENCIAL 2
2.1 BIOTRANSFORMACIÓN 2
2.1.1 Tipos de biotransformación 2
2.1.2 Tipos de reacciones 3
2.1.3 Transformaciones con esporas 3
2.2 TERPENOS 4
2.2.1 Kaurenoides 4
2.3 BIOTRANSFORMACIONES DE DITERPENOS KAURENOIDES 4
2.4 BIOTRANSFORMACIÓN POR Fusarium 7
2.5 Fusarium 10
2.6 Fusarium oxysporum 10
2.7 Importancia biotecnológica del género Fusarium 11
3. MÉTODOS 19
3.1 Activación de cepas fúngicas conservadas en suelo 19
3.2 Esporulación 19
3.3 Cultivos monospóricos 19
3.4 Recolección y preservación de conidios 20
3.5 Recuento de conidios 20
3.6 Determinación de posibles cepas transformadoras 21
3.7 Extracción de productos biotransformados y metabolitos
secundarios 21
3.8 Purificación e identificación de sustancias 21
3.9 Actividad antimicrobiana 22
3.9.1 Actividad antibacteriana 22
3.9.2 Actividad antifúngica 22
4. EXPERIMENTACIÓN 23
4.1 Activación de cepas 23
4.2 Obtención de conidios 25
4.3 Selección de la posible cepa transformadora 25
4.4 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa
de Fusarium oxysporum F-14 26
4.5 Aislamiento y purificación de productos 27
4.6 Identificación del metabolito mayoritario secundario 28
4.7 Rendimiento 28
4.8 Actividad antibacteriana de la sustancia F1 29
4.8.1 Prueba de sensibilidad por difusión en pozos 29
4.8.2 Concentración mínima inhibitoria 29
4.8.3 Concentración mínima bactericida 31
4.8.4 Prueba de sensibilidad por difusión con discos 31
4.8.5 Método de siembra en estrías 31
4.9 Actividad antifúngica 33
5. RESULTADOS 34
5.1 Activación de cepas 34
5.2 Selección de la cepa transformadora 34
5.3 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa
de Fusarium oxysporum por CCD.
5.4 Aislamiento y purificación de productos 35
5.5 Identificación del metabolito secundario mayoritario 35
5.6 Rendimiento 38
5.7 Actividad antibacteriana del cloranfenicol 42
5.8 Actividad antifúngica del cloranfenicol 47
6. DISCUSIÓN 51
6.1 Selección de la cepa 51
6.2 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa
de Fusarium oxysporum F-14 51
6.3 Identificación del metabolito secundario mayoritario 52
6.4 Actividad antimicrobiana del cloranfenicol 53
6.4.1 Actividad antibacteriana 53
6.4.2 Actividad antifúngica 54
6.5 Rendimiento del cloranfenicol 54
7. CONCLUSIONES 56
8. RECOMENDACIONES 57
BIBLIOGRAFÍA 58
ANEXOS
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Actividad biológica de los kauranos 5
Tabla 2. Biotransformaciones xenobióticas 8 Tabla 3. Biotransformaciones biosintéticas 9 Tabla 4. Metabolitos secundarios producidos por Fusarium 16 Tabla 5. Bacterias evaluadas por el método siembra en estrías 32 Tabla 6. Asignación por analogía del espectro infrarrojo del cloranfenicol 39 Tabla 7. Datos del espectro de RMN+H del cloranfenicol 40 Tabla 8. Datos del espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol 41 Tabla 9. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con pozos 43 Tabla 10. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus 44
Tabla 11. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a
Escherichia coli 45 Tabla 12. Prueba de sensibilidad por difusión con discos del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus 46 Tabla 13. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frenta a bacterias Gram positivas por el método de siembra en estrías 48 Tabla 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram negativas por el método de siembra en estrías 49
Tabla 15. Actividad antifúngica
LISTA DE FIGURA Pág
Figura 1. β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-) 16-
(β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-kaurano-19-oico 6
Figura 2. Características macroscópicas y microscópicas de
Fusarium oxysporum F-14 12
Figura 3. Relación metabolismo secundario-nutrición y crecimiento 14
Figura 4. Diagrama de flujo 24
Figura 5. Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa
nativa de Fusarium oxysporum por CCD 36
Figura 6. Estructura del cloranfenicol 37
Figura 7. Espectro infrarrojo del cloranfenicol 39
Figura 8. Espectro de RMN+H del cloranfenicol 40
Figura 9. Espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol 41
Figura 10. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con pozos
del cloranfenicol 43
Figura 11. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a
Staphylococcus aureus 44
Figura 12. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a
Escherichia coli 45
Figura 13. Prueba de sensibilidad por difusión con discos del
cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus 46
Figura 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias
Gram positivas por el método de siembra en estrías 48
Figura 15. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias
Gram negativas por el método de siembra en estrías 49
RESUMEN
El presente trabajo evaluó la capacidad transformadora de la cepa nativa de
Fusarium oxysporum sobre el β-D- glucopiranosil-ester del ácido (-) 16- (β-
glucopiranosiloxil)- 17-hidroxi-kaurano-19-oico en el medio de transformación
para diterpenos; la evaluación de la posible transformación se evaluó por
cromatografía en capa delgada, en sílica gel 60G y en fase reversa (RP18),
donde no se observó transformación del sustrato. Paralelamente se aisló,
purificó e identificó el metabolito secundario mayoritario, producido por
Fusarium oxysporum (F-14), durante el proceso de biotransformación, el
cual se denominó sustancia F1 y corresponde por sus propiedades físicas y
datos espectroscópicos a cloranfenicol y tiene una fórmula molecular de
C11H12Cl2N2O.
Durante el ensayo de biotransformación se obtuvo un exceso de 21.3mg de
cloranfenicol, en el medio de transformación para diterpenos.
Posteriormente se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica del
cloranfenicol (sustancia F1), presentando éste una concentración mínima
inhibitoria (CMI) para Staphylococcus aureus de 25μg/mL y para
Escherichia coli de 37μg/mL.
El cloranfenicol hasta 400μg no presentó actividad antifúngica frente a los
dermatofitos Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.
INTRODUCCIÓN
El β-D-glucopiranosil-ester-del ácido (-) 16 (β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-
kaurano-19-oico, es un diterpeno glicosilado, aislado de hojas y flores de
Ageratina vacciniaefolia por el grupo de investigación en fitoquímica, de la
Universidad Javeriana (GIFUJ), fundado hace 25 años, el cual ha venido
estudiando plantas de la familia Asteracea y se ha encontrado que
diterpenos tipo kauranos son los compuestos mayoritarios.
Los hongos son capaces de transformar una variedad de compuestos
orgánicos como terpenos tipo kaurenoides, muchos de éstos con baja
actividad biológica, tales como antimicrobiana, antiparasitaria, citotóxica,
anti-HIV, anti-inflamatoria, hipotensiva; para lograr una mayor actividad del
compuesto, en algunos casos solo es posible por procesos de
biotransformación microbiana, dicho proceso se ha venido estudiando por el
grupo de investigación en biotransformación de la Universidad Javeriana
(GIBUJ), hace tres años.
Los procesos de biotransformación se prefieren a los químicos por su alta
especificidad, las condiciones de reacción son leves y por los beneficios
ecológicos.
Hongos filamentosos como Gibberella fujikuroi, Fusarium, Aspergillus y
Mucor han sido reportados como transformadores de diferentes diterpenos;
el género Fusarium tiene una amplia importancia biotecnológica en la
producción de metabolitos secundarios con propiedades antibacterianas,
antifúngicas, antivirales, antiparasitarias y anti-inflamatorias.
En los últimos años la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas a
partir de fuentes naturales ha aumentado por la gran biodiversidad que
ofrecen, además debido al desarrollo de patógenos resistentes; por tal motivo
el grupo de biotransformación ha ampliado sus objetivos hacia la
búsqueda de estas sustancias durante los ensayos de biotransformación.
1
2. MARCO REFERENCIAL 2.1 BIOTRANSFORMACIÓN La Biotransformación es el proceso por el cual microorganismos, células
vegetales o células de mamíferos mediante sus sistemas enzimáticos son
hábiles de transformar una variedad de componentes orgánicos tales como:
hidrocarburos, terpenos, esteroides, alcaloides, antibióticos y aminoácidos
para su utilización terapeútica e industrial (Vezina, 1991; Turner, 1994).
Se prefieren biotransformaciones con microorganismos por su rápido
crecimiento y metabolismo; además poseen una variedad de enzimas con
facilidad de adaptación a ambientes artificiales económicos (Vezina, 1991).
Las ventajas de las biotransformaciones frente a procesos químicos, radica
en su especificidad por el sustrato, regioespecificidad, estereoespecificidad,
condiciones de reacciones leves, beneficios ecológicos (disminución de la
contaminación ambiental), economización de energía; es importante la
biotransformación si reemplaza varias etapas químicas. (Anke, 1997; Vezina,
1991).
Los sistemas para las biotransformaciones pueden utilizar: células completas
o enzimas purificadas; en el sistema de enzimas purificadas el control y
monitoreo es màs fácil aunque con células completas es más económico y
se cuenta con la presencia de cofactores (Davies, 1992).
2.1.1 Tipos de biotransformación
Las biotransformaciones son de dos tipos, xenobióticas y biosintéticas, en
las xenobióticas el sustrato es completamente ajeno al microorganismo,
estas transformaciones utilizan sistemas enzimáticos de baja especificidad
por el sustrato pero con una definida regio especificidad e implican uno o
2
dos pasos enzimáticos; en las biotransformaciones biosintéticas el sustrato
es semejante a un intermediario biosintético y la transformación permite
flexibilidad de la vía biosintética existente, además implica una serie de
pasos que hacen que la eficiencia sea menor que la xenobiótica ( Hanson,
1992).
2.1.2 Tipos de reacciones
• Oxidaciones: hidroxilación de posiciones saturadas, hidroxilaciones
de arenos, epoxidación, degradación parcial oxidativa, oxidación
de alcoholes y cetonas.
• Reducciones: Reducción de monocetonas, aldehídos, ácidos
carboxílicos, hidrogenación de dobles enlaces.
• Reacciones hidrolíticas: hidrólisis de ésteres de enlaces C-N,
adición de agua a enlaces C=C, hidrólisis de epóxidos, hidrólisis de
glucósidos.
• 4. Condensación y adiciones: formación de enlaces èsteres y
amidas. (Anke, 1997).
2.1.3 Transformaciones con esporas Las esporas pueden almacenarse o transportarse como catalizador
bioquìmico estable; dan conversiones altas y reproducibles del sustrato y
cantidades mínimas de productos no deseables.
Es el proceso de elección cuando el sustrato es caro y no existen equipos
para fermentación a gran escala, las esporas pueden ser inmovilizadas para
procesos de biotransformación. (Vezina, 1991).
3
2.2 TERPENOS Los terpenos son hidrocarburos, alcoholes, éteres, aldehídos y cetonas,
típicos constituyentes de los aceites esenciales de las plantas, pero también
se encuentran en especies de animales donde desempeñan un papel
fisiológico importante( vitamina A, hormona juvenil de los insectos).
Estructuralmente están constituidos por unidades de isopreno y se clasifican
según las unidades de isopreno que se unen (Gros, 1985).
Los terpenos pueden sintetizarse a través de dos vías: Vía del mevalonato y
la vía del no mevalonato (Dewick, 1999).
2.2.1 Kaurenoides Son una clase de diterpenos que contienen un esqueleto tetracíclico rígido.
La mayoría de kauranos encontrados en la naturaleza provienen de
reacciones de oxidación y/o epoxidación e hidrólisis.
Su importancia radica en que dan origen a las giberelinas, hormonas de
crecimiento en plantas (Dewick, 1999) y en su actividad biológica (tabla 1).
El β-D –glucopiranosil-ester del ácido (-) 16 (β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-
kauran-19-oico es un diterpeno glicosilado, aislado de las hojas y flores de
Ageratina vacciiniaefolia por el grupo de Fitoquímica de la Universidad
Javeriana, (Pescador, 1996), con fórmula molecular de C32H52O14, cuya
estructura se presenta en la figura 1.
2.3 BIOTRANSFORMACIONES DE DITERPENOS KAURENOIDES. Las transformaciones que con mayor frecuencia se presentan son
hidroxilaciones.
4
Tabla 1. Actividad biológica de kauranos (Ghisalberti, 1997).
ACTIVIDAD
KAURANO
ESPECIFICIDAD
Reguladora en el crecimiento de plantas
Ácido grandiflorénico
Estimula la formación de α
amilasa de cebada
Antimicrobiana
Ácido grandiflorénico
Inhibidor del crecimiento B. subtilis, S. aureus, E. coli
Antiparasitaria
Ácido-19-kaurenoico
T. cruzi, B. gabata
Anti-inflamatorio
Ácido-19-kaurenoico
Inhibición de malondialdehído
Anti-HIV
Ácido kauren-13-hidroxi-19-
oico
Replicación en células
linfocíticas H9
Hipotensiva
Ácido kauren-13-hidroxi-19-
oico
Renal
Citotóxico
Ácido kaurenoico
Leucemia linfocítica murina
Insecticida
Ácido kaurenoico
H. eletellum, H. Zea
T. canadiensis
5
o
o
C o
1
2
3
12
6 15
14
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
O
OHOH
OHOH
17
Figura 1. β-D-GLUCOPIRANOSIL-ESTER DEL ÁCIDO (-) 16- (β-GLUCOPIRANOSILOXIL)-17 – HIDROXI-KAURANO- 19-OICO
(Torrenegra, 1999).
6
7
Las biotransformaciones xenobióticas son llevadas a cabo principalmente
por C. decora, R.nigricans, A. niger y A. Ochraceus ( tabla 2).
Las biotransformaciones biosintéticas son llevadas a cabo principalmente
por Gibberella fujikuroi, hongo que de forma normal y por una variedad
de vías divergentes terpénicas, produce giberelinas, ent-kauranos y
lactonas kaurenolidas ( tabla 3).
Otros ejemplos de biotransformaciones.
Por Rhizopus: Metil ent-15-oxokaur-16-en-19-oato (Boaventura, 1995); àcido
ent- kaur-16-en-19-oico (Silva,1999); Ent-kaur-16-eno (García, 1990).
Por Gibberella fujikuroi: Ent-kaur-6,16-dieno (Fraga, 1983); Ent-16β,17-
epoxikaurano (Fraga, 1994); 14β,19-dihidroxi-ent-kaur-15-eno (Fraga, 1993);
Ent-15β,16β-epoxi-kaurano ( Fraga,1993); 18-hidroxy-9-epi-ent-pimara-7,15-
dieno (Fraga, 2000).
Por Mucor :Metil-ent-15-oxokaur-16-en-19-oato (Boaventura,1995).
2.4 BIOTRANSFORMACIÓN POR Fusarium.
• Fusarium moniliforme: 2-benzoxazolina y metoxi-benzoxalinona
(Yue,1998).
• Fusarium oxysporum: Hidroxilación del ácido dehidroabiético (Tapia,
1997).
• Fusarium solani y caucasium: Deshidrogenación C1(introduciendo
un doble enlace) pero degradan extensamente la cadena lateral
cuando existe. No requiere oxígeno. (Vezina, 1991).
8
Tabla 2. Biotransformaciones xenobióticas (Hanson, 1992)
SUSTRATO
HONGO
REACCIÓN
POSICIÓN
PRODUCTO
Ent-17-norkauran-16-ona
C. decora
R. nigricans
A. niger
A. ochraceus
Hidroxilación
Hidroxilación
Hidroxilación
1α, 6β 1α, 7β
3α
1α, 3α 3α, 7α 3α, 7β
3α
Ent-1α,6β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona Ent-1α,7β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona
Ent-3α-hidroxi-17-norkauran-16-ona
Ent-1α,3α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona Ent-3α,7α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona Ent-3α,7β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona
Ent-3α-hidroxi-17-nokauran-16-ona
17-norkauran-16-ona
R. nigricans
A. niger A. Ochraceus
C. decora
Hidroxilación
Hidroxilación
Hidroxilación
3β
3β,7β
3β.7α
3β,9α
3β
7α 7β
3β-hidroxi-17-norkauran-16-ona
3β,7β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona
3β,7α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona
3β,9α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona
3β-hidroxi-17-norkauran-16-ona
ent-7α,17-dihidroxi-17-norkauran-16-ona ent-7β,17-dihidroxi-17-norkauran-16-ona
Tabla 3. Biotransformaciones biosintéticas de diterpenos kaurenoides
(Hanson, 1992).
SUSTRATO PRODUCTO
Ent-3-hidroxi-16-en-19-lil-succinato Ent-3,7β-dihidroxikaur-16-en-19-il-succinato
Ent-3,7β,6β-trihidroxikaur-16-en-19-il-succinato
Ent-kaur-2,16,dien-19-ol
2,3-dehidro-giberelina A12 2,3-dehidro-giberelina A9
Ácido-ent-3α-hidroxikaur-16-en-19-oico
GA1, GA3, GA
Ent-3β,18-dihidroxikaur-16-eno
Ent-3β,7α,18-trihidroxikaur-16-eno
Ent-7α-hidroxi-16-eno
Ácido giberélico GA4, GA7
Ent-kaur-6,16-dieno
7-hidroxikaurenólido
Ent-18-hidroxikaur-6-16-dieno
7,18-dihidroxikaurenólido
Epicandiol
Ent-7α,18,19-trihidroxikaurenólido
Ent-12β-hidroxikaur-16-eno
12α-hidroxi-GA21 12α-hidroxi-GA25 12α-hidroxi-GA13
Ent-15β,18-dihidroxikaur-16-eno
Ent-11α,15β,18,dihidroxikaur-16-eno
Ent-15β,19-dihidroxikaur-16-eno
Ent-11α,15β,19-trihidroxikaur-16-eno Ent-7β,11α,15β,19-tetrahidroxikaur-16-eno
Ent-kaur.6,16-dieno
7-hidroxikaurenólido
18-hidroxikaur-6,16-dieno
7,18-dihidroxikaurenólido
14β,19-dihidroxi-ent-kaur-15-eno
Ácido-ent-7α,14α-dihidroxikaur-15-en-19-oico Ácido-ent-6α,7α,14α-trihidroxikaur-15-en-19-
oico Ácido-ent-15β,16β-epoxi-6α,7α,14α-
trihidroxikauran-19-oico
14β-acetoxi-15α,16α-epoxi-GA15
Ent-7α,15β-dihidroxikaur-16-eno
Ent-7α,11,15β-trihidroxikaur-16-eno
33
2.5 Fusarium. Reino: Fungi
División: Eumycota
Subdivisión: Deuteromycotina
Subclase: Hyphomycetidae
Clase: Deuteromycetes
Orden: Moniliales
Familia: Tuberculariacea
Género: Fusarium
Género descrito por Link en 1809; Presenta macro y microconidias; las
clamidosporas terminales o intercalares pueden estar o no presentes.
Se encuentran distribuidos en sustratos orgánicos; en suelo tanto en
regiones desérticas como en regiones polares. Fusarium es uno de los
géneros más heterogéneos y taxonómicamente de los más difíciles de
clasificar por métodos tradicionales, debido a la carencia de estabilidad
morfológica del grupo (Andrade, 1993); la morfología de la espora es la
principal característica de identificación(Booth, 1971).
2.6 Fusarium oxysporum
• Generalidades. Hace parte del grupo elegans (Booth, 1971); macroscópicamente presenta
un micelio aéreo esparcido, abundante, flocoso, con tinte púrpura a violeta;
diámetro 4.5-6.5cm al cuarto día a 25°C.
Microscópicamente presenta macro y micro conidias, las macroconidias son
fusiformes, moderadamente curvas, puntiagudas en los extremos, presenta
de 3-5 septos; las microconidias son abundantes, nacen de las fiálides cortas
que se ramifican a conidióforos, nunca forman cadenas, no tienen septos,
son elipsoidales a cilíndricas; Presenta clamidospora terminales o
intercalares.
34
Se encuentran distribuidos en suelo con pH neutro, a 30cm de profundidad,
en algunas ocasiones se presentan en suelos ligeramente ácidos(Traute,
1980). Los ensayos de patogenicidad han sido hasta ahora el único criterio
para diferenciar las poblaciones de Fusarium oxysporum, sin embargo
estos resultados pueden estar influenciados por factores ambientales,
método de experimentación y naturaleza del inóculo (Andrade, 1993), la
patogenicidad tiende a perderse después de repeticiones transferidas sobre
medios de agar (Traute, 1980).
• Condiciones de cultivo. Temperatura: óptima: 25-30°C. Máxima: 37°C Mínima: 5°C.
pH óptimo: 7.7 Rango: 2.2-9.0
Esporulación óptima: 20-25°C.
Fuentes de carbono: ácido succínico, ácido láctico, glicerol, manitol,
celobiosa, almidón, maltosa, sacarosa, lactosa, xilosa. Mejor fuente glucosa y
galactosa ya que incrementan la respiración y el crecimiento. (Trauter, 1980).
Fusarium oxysporum F-14 : Cepa nativa utilizada para el ensayo de
biotransformaciòn , macroscópicamente presenta un micelio aéreo esparcido,
abundante, flocoso, con tinte pùrpura a violeta; microscópicamente presenta
macroconidias fusiformes y microconidias elipsoidales, ( figura 2); fue aislada
de hojas y flores de Espeletia killipi (Pineda, 2000) e identificada por
Claves taxonómicas (Rueda, 2001).
2.7 Importancia biotecnológica del género Fusarium
Fusarium oxysporum: utilizado para la erradicación de cultivos de
Erythroxylum coca (Hebbar, 1997).
Celulolítico, puede fermentar directamente la paja a etanol, siempre que la
paja esté particulada (Wainwright, 1992).
Fusarium solani: transformador de esteroides en la posición 1-2
deshidrogenación (Wainwright, 1992).
35
Micelio aéreo, esparcido, abundante, flocoso, con tinte púrpura a violeta
Macroconidias fusiformes y microconidias elipsoidales
Figura 2. Características macro y microscópicas de Fusarium oxysporum
F-14
36
Fusarium oxysporum: Gibberella fujikuroi: degradación de cianuro por la
cianuro hidrolasa (Wainwright, 1992).
Fusarium flocciferum: degradación del fenol.
Fusarium sp: productor de metabolitos secundarios, los cuales son
compuestos que aunque no hacen parte de la composición celular del
microorganismo son generados bajo condiciones de estrés, en el umbral de
la fase estacionaria o cerca de ella; muchos de estos compuestos son
volátiles, coloreados con propiedades antagonistas, medicinales o tóxicas
(Franco, 1999) y se caracterizan por:
Cada metabolito secundario se forma únicamente a partir de
relativamente pocos microorganismos.
No son indispensables para el crecimiento y reproducción.
Son dependientes de las condiciones de crecimiento, en particular de la
composición del medio.
Suelen producir un grupo de sustancias estrechamente relacionadas.
Se puede obtener una sobreproducción notable, mientras que los
primarios no se sobreproducen.
Los enzimas que intervienen en la producción se regulan por separado
del metabolismo primario.
El producto puede no derivarse del sustrato de crecimiento primario, sino
de un producto que a su vez se formó a partir del sustrato del
metabolismo primario. ( Brock, 1991).
Se encuentran relacionados con la nutrición y el crecimiento (figura 3);
distinguiéndose las siguientes fases:
- Tropofase: período de crecimiento exponencial.
- Idiofase: limitación del crecimiento y producción de metabolitos
secundarios.
- Fase de balance: utilización de nutrientes, crecimiento exponencial, los
metabolitos secundarios son raramente producidos.
37
1 2 3
4 5
1. Fase de balance. Peso seco 2. Fase de almacenamiento. Nitrógeno 3. Fase de mantenimiento. Producto 4. Tropofase. Células 5. Idiofase. Glucosa
Figura 3. Relación metabolismo secundario-nutrición y crecimiento (Garraway, 1984).
38
- Fase de almacenamiento: deplección de nutrientes, el crecimiento
disminuye, la división celular cesa, pero el peso seco se incrementa por
la acumulación de productos de almacenamiento como lípidos y
polisacáridos, comienza la síntesis de metabolitos secundarios.
- Fase de mantenimiento: el peso seco es constante, la producción de
metabolitos secundarios baja, autolisis celular (Garraway, 1984).
Una variedad de metabolitos secundarios son producidos por el género
Fusarium; en la tabla 4 encontramos diversas estructuras de metabolitos
secundarios producidos por diferentes especies.
39
Tabla 4. Metabolitos secundarios producidos por el género Fusarium.
Fusarium METABOLITO ACTIVIDAD REFERENCIA
oxysporum
Reguladores de crecimiento en
plantas
Miersh, 1999.
moniliforme
Mutagénico para
Salmonella
Barrero, 1991
O
(CH2)n
O
OH
Ácido jasmónico
OH
O
(CH2)n
O
Ácido 7-iso-jasmónico
O
OO
OH
OH
HN
9
8
23 6
MeOFusarina-8z
N
H
OH
OH
OO
O10 8 6 4
2
1
24 23 22 CO2Me
Fusarina C
40
HONGO METABOLITO ACTIVIDAD REFERENCIA
Gibberella fujikuroi
Primer triterpeno
precursor de esteroles
Primer triterpeno
tetracíclico precursor de
esteroles
Hormonas de crecimiento en
plantas
Fernández, 2000
Tudzynski, 1999
subglutinans
Tóxico para plantas y linfocitos B
Logrieco, 1996
Escualeno
H
ent-kaurano
AH
C
DB
18 19
H7
15
1617
20
111
2
314
1312
68
Giberellinas
CH2
CH2
C
H
CC
C
HCH
CH3 OH
CH2
CH2
C
CH3CH3
CH2
C
HCH2
CHCH3C
CO CC
OH
CH CH3
CH2
OCOH3
Fusaproliferina
41
Fusarium
METABOLITOS
REFERENCIA
solani
Mendentsev, 1998
bostrycoides
Mendentsev, 1998
martii
Mendentsev, 1998
O
MeOO
O
OH
Me
OH
OH
Fusarubin
Me
MeOO
O
Me
OH
OH
OH
Solaniol
OH
O
O
MeOOH
N
bostrycoidin
MeOOH
OH
O
O
O
CH2OH
Novarubin
42
3. MÉTODOS
3.1 Activación cepas fúngicas conservadas en suelo. Para la activación de cepas conservadas en suelo, se esparcen granos de
suelo sobre cajas de petri con agar selectivo para hongos (Demain, 1986).
3.2 Esporulación. Se pueden utilizar medios sólidos para hongos altamente esporulantes y
medios líquidos para los de baja esporulación.
Medios sólidos: agar papa, sacarosa, cloranfenicol; agar harina de maíz
( Franco, 1999); en tubos de agar inclinado se siembra el microorganismo y
se deja crecer hasta que esporule a 25°C, 10h/luz.
Medios líquidos: caldo papa, glucosa, cloranfenicol, caldo malta; se adicionan
en erlenmeyer guardando una relación mínima 1/5 y se agitan a 250
revoluciones por minuto (rpm) a 25°C, 10h/luz de 5-10 días.
3.3 Cultivos monospóricos.
Esporas obtenidas en tubos con agar inclinado : se adicionan 5mL de tween
80 al 0.5%, a partir de esta suspensión se realiza una dilución 1/500, de
ambas soluciones se toma 0.1ml y se siembra por agotamiento en cajas de
petri con agar papa, sacarosa, cloranfenicol, se incuban a 25°C y se
monitorean cada dos horas hasta lograr observar una espora germinada, se
marca y la porción de medio con la espora se lleva asépticamente a un tubo
con agar inclinado, selectivo para hongos; el cultivo que se desarrolle será un
cultivo monospórico (Silverio, 1983).
43
Esporas obtenidas de caldo: se filtran con gasa para la obtención de
conidios, se les adiciona tween 80 al 0.5% y luego se realiza siembra por
agotamiento en caja de petri con agar APSC, se incuban a 25°C y se
monitorean cada dos horas hasta la germinación de una espora, se marca y
la porción del medio con la espora se lleva a un tubo con agar inclinado.
3.4 Recolección y preservación de conidios.
La solución con esporas se centrifugan a 10.000 rpm durante una hora , el
sobrenadante se descarta y las esporas se recolectan con pipeta pasteur
estéril, en tubos eppendorf con glicerol y se almacena a –5°C, también se
pueden preservar en suelo estéril colocando 1ml de suspensión de conidios
por 5g de suelo (Demain, 1986).
3.5 Recuento de conidios.
Se realizan diluciones por duplicado 10-1, 10-2, 10-3 de la suspensión de
esporas con tween 80 al 0.5% y se realiza el conteo en cámara de Newbauer
(Bauer, 1986)
células contadas Área contada x profundidad de la cámara x dilución del recuento
0.1 mm: profundidad de la cámara. Área contada : # de cuadrantes contados / # de cuadrantes totales.
44
3.6 Determinación de posibles cepas transformadoras.
Se buscan microorganismos transfomadores al azar ( Vezina, 1991). Se
toman varios hongos de géneros y especies diferentes, se cultivan en las
mismas condiciones, adicionándole igual cantidad de sustrato ( Tapia, 1997;
Demythenaere, 2001), la relación erlenmeyer / medio de cultivo utilizadas
son:
250/50 (Fraga, 2000) ; 500/100 (Silva, 1999); 250/100 (Boaventura, 1995)
y la selección de la cepa se puede realizar por:
• Cromatografía en capa delgada(CCD), por comparación de controles
(Tapia, 1997).
• Cromatografía de alta resolución en fase líquida (HPLC) (Yue, 1998).
3.7 Extracción de productos biotransformados y metabolito secundario
mayoritario. Se realiza tanto del caldo como del micelio; cultivos menores de 200mL con
embudo de separación y los de volúmenes mayores en sistema continuo
líquido-liíquido, las sustancia del micelio seco se extraen por maceración con
solventes (Silva, 1999; Fraga, 2000).
3.8 Purificación e identificación de sustancias. La purificación de las sustancias se pueden realizar por:
• Columna Sílica gel (Boaventura, 1995) (Hanson, 1994).
• Cromatografía preparativa en capa delgada en sílica gel (Hirabayashi,
1996).
45
La identificación se realiza por Resonancia magnética nuclear de
hidrógeno(RMN1H) y de carbono (RMN13C); espectrometría de rayos
infrarrojos (IR).
3.9 Actividad antimicrobiana. 3.9.1 Actividad antibacteriana.
• Prueba de sensibilidad por macrodilución y microdilución en caldo
(Koneman, 1999).
• Prueba de sensibilidad por macrodilución en agar (Koneman, 1999).
• Prueba de difusión en agar en disco (Sánchez, 1986; García, 1997).
• Método de siembra por estría (Brock, 1991).
3.9.2 Actividad antifúngica.
• Prueba de sensibilidad por macrodilución en agar, (Koneman, 1999).
46
4. EXPERIMENTACIÓN
El desarrollo de la investigación fue realizado en varias etapas; se inició con
la activación de diferentes cepas fúngicas, pertenecientes al grupo de
investigación en biotransformación de la universidad Javeriana, las cuales
fueron aisladas de plantas de Espeletia killipi cuatr y barclayana cuatr;
posteriormente se realizaron ensayos preliminares con diferentes especies
para evaluarlas como posibles transformadoras del β-D- glucopiranosil-ester
del ácido (-) 17-(β-glucopiranosiloxil)-16-ol kauran 19 oico, sustrato
suministrado por el GIFUJ, escogiendose la cepa de Fusarium oxysporum
(F-14) para los ensayos de biotransformación, por literatura; paralelamente
se identificó el metabolito mayoritario producido por este hongo, empleando
espectroscopía de rayos infrarrojos, RMN13C y RMN1H, al cual se le
determinó su actividad antibacteriana y antifúngica. Todo el procedimiento
se presenta como diagrama de flujo en la figura 4.
4.1 Activación de las cepas.
Se activaron las cepas de Fusarium: EK-14, EK-8.1, F-14; Aspergillus:
19-4, 407; Penicillium: 404, 405; Curvularia: 9-bonito; Mucor: 321, 509;
géneros reportados en literatura como transformadores de diterpenos, las
cuales se encontraban conservadas en suelo, para lo cual se esparcieron
granos de suelo sobre cajas de petri con agar papa, sacarosa y
cloranfenicol(APSC) (Booth, 1971); posterior a su crecimiento se realizaron
subcultivos en tubos con APSC y se dejaron crecer hasta que esporularon,
las cepas que no esporularon se pasaron a un erlenmeyer de 125ml con
10mL de caldo papa, glucosa y cloranfenicol(CPGC) (anexo B), se agitaron a
250 rpm en shaker; bajo 10 h/luz a 25°C; una vez esporuladas las cepas se
realizaron diluciones 10-1, 10-2, 10-3 en tween 80 al 0.5% y de éstas diluciones se realizaron cultivos monospóricos (Wiley, 1981), seguidamente
47
Figura 4. Diagrama de flujo de la metodología utilizada
Activación de las cepas Esporulación Cultivos monospóricos
Recolección masiva de conidios
Tubo Caldo
Selección de la cepa Almacenamiento Rto # de conidios -5°C, glicerol
Evaluación de la capacidad Monitoreo del sustrato
biotransformadora de la cepa por CCD
de Fusarium oxysporum F-14
Purificación CCD. Fermentación 1L
con sustrato
Sustrato Metabolito mayoritario
Fermentación 1L
sin sustrato RMN13C
Identificación RMN+H
IR
Actividad antimicrobiana
Antibacteriana Antifúngica
Rendimiento
48
se tomó una espora de cada uno de los microorganismos y se transfirió a un
erlenmeyer de 125mL con 10mL de CPGC, se incubó a 25°C a 10h/luz con
agitación constante de 250rpm.
4.2 Obtención de conidios.
Una vez esporulados los cultivos monospóricos, los cultivos en medio líquido
se filtraron con gasa para la separación de los conidios, los cultivos en medio
sólido se lavaron con tween 80 al 0.5%, tanto la suspensión obtenida en
medio líquido, como la de medio sólido, se centrifugaron a 10.000 rpm en
centrífuga modelo Clay Adams N.J 07054 durante una hora, el sobrenadante
se descartó y los conidios se recolectaron en un tubo eppendorf, se les
adicionó glicerol y se almacenaron a –5°C (Demain, 1986). El número de
conidios /mL se determinó en cámara de Newbauer (Bauer, 1986).
4.3 Selección de la posible cepa transformadora.
Las siguientes cepas fueron evaluadas: Fusarium: EK-14, EK-8.1, F-14;
Aspergillus: 19-4, 407; Penicillium: 404, 405; en 10mL de medio de
transformación para diterpenos (Hanson, 1992)(anexo A ) con 60 ppm de
Chlorocholine chloride (CCC), inhibidor de la sintetasa ent-kaurano (Hanson,
1992); a las 48 horas se adicionó 3mg del sustrato disuelto en metanol,
paralelamente se escogió la cepa F-14 para los siguientes controles.
Medio de transformación y biomasa(1x107 conidios/mL) (Tapia, 1997).
Medio de transformación y sustrato (3mg) ( Tapia, 1997)
Buffer fosfato 10mM, sustrato (3mg) y biomasa (1x107 conidios/mL) (Pineda,
2000).
Después de haber sido adicionado el sustrato, la fermentación se siguió por
nueve días (Tapia, 1997), tiempo en el cual se midió el pH para verificar la
acidez de los cultivos y seguidamente se filtraron; los micelios obtenidos se
lavaron tres veces, cada lavado se hizo con 5mL de agua destilada, se
49
secaron a 45°C y se maceraron con acetato de etilo (Tapia, 1997), el caldo
se extrajo igualmente con acetato de etilo con embudo de separación, luego
las muestras se secaron con sulfato de sodio (Oliverio, 1996) y se
concentraron en rotavapor BUCHI-RE111.
Para escoger la posible cepa transformadora se realizó cromatografía en
capa delgada, utilizando como fase estacionaria placas de sílica gel 60 G y
como fase móvil diclorometano-metanol 7:3 y se reveló con vainillina.
4.4 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa Fusarium oxysporum.
Se seleccionó la cepa de Fusarium oxysporum para los ensayos de
biotransformación en base a literatura, ya que es hongo estrechamente
relacionado con Gibberella fujikuroi, hongo más reportado como
biotransformador de kauranos (Alam, 1991; Hanson, 1992; Fraga, 2000);
además Fusarium se ha reportado como transformador de glucósidos.
Para la evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa de
Fusarium oxysporum (F-14) se realizó inicialmente un monitoreo del
sustrato por CCD, la fermentación para el seguimiento de posibles
transformaciones del sustrato, se llevó a cabo en un erlenmeyer de 500mL
con 50mL de medio de transformación para diterpenos. Al tercer, cuarto y
quinto día después de haber adicionado 20mg de sustrato, se extrajeron
15mL del cultivo cada uno de los días, se les midió el pH y se filtró, el micelio
se lavó con 15mL de agua destilada y se siguió el mismo procedimiento que
en el ensayo anterior, tanto para el micelio como para el caldo. Se realizó
cromatografía en capa delgada, de los exractos del micelio y del caldo en
placas RP18 utilizando como fase móvil metanol agua 7:3.
Posteriormente se realizó un ensayo para evaluar la capacidad
biotransformadora de la cepa de Fusarium F-14, en un erlenmeyer de
5000mL conteniendo 1000mL de medio de transformación para diterpenos; a
50
las 48 horas de fermentación se adicionaron 160mg del sustrato disueltos en
metanol; al séptimo día después de haber sido adicionado el sustrato se
midió el pH, luego el cultivo se filtró y el micelio se lavó con 50mL de agua
destilada, la extración tanto del micelio como del caldo se hizo con acetato de
etilo, el micelio por maceración y al caldo en sistema continuo líquido-líquido,
las muestras se secaron con sulfato de sodio y se concentraron en rotavapor.
Se corrió cromatografía en placas RP18 utilizando como fase móvil metanol-
agua 7:3 para la separación del sustrato ; y para la separación de metabolitos
secundarios en sílica gel 60G con diclorometano-metanol 9:1 y 7:3
observadas bajo luz ultravioleta (U.V)
4.5 Aislamiento y Purificación de productos.
Los extractos del micelio y del caldo obtenidos de la fermentación en 1L
fueron lavados con éter de petróleo y eluídos por separado en una columna
fase reversa, utilizando como fase móvil metanol-agua 7:3, se unieron las
fracciones donde se encontraba el sustrato y se eluyeron en una columna en
sílica gel con diclorometano, diclorometano-metanol 9:1, 8:2, 7:3;
nuevamente se unieron las fracciones donde se encontraba el sustrato y se
corrió cromatografía en sílica gel 60G con fase móvil diclorometano-metanol
7:3 revelada con vainillina.
Una vez separado el sustrato se unieron las fracciones restantes y se
separaron tres fracciones: diclorometano, cloroformo y acetona, ésta última
se eluyó en una columna sílica gel 60G con diclorometano-metanol 9.5:0.5
para la purificación del metabolito mayoritario, luego se corrió cromatografía
en capa delgada en sílica gel 60G con diclorometano-metanol 9:1,
observados bajo luz U.V, para confirmar la pureza.
posteriormente se realizó una fermentación en un erlenmeyer de 5000mL con
1L de medio de transformación con un inóculo de 1x107conidios/mL de
Fusarium oxysporum F-14, para determinar si el metabolito mayoritario
51
producido por el hongo era inducido o no por el sustrato y para obtener
mayor cantidad del metabolito.
4.6 identificación Se realizó la prueba de solubilidad con los siguientes solventes:
diclorometano, acetato de etilo, metanol, cloroformo y acetona.
Microfusión sódica: se tomaron 5mg de la sustancia F1 con un pedacito
de sodio y se llevó a la fusión sódica para la determinación de nitrógeno
con base a la reacción de ferrocianuro férrico.
Rf: se determinó en placas de sílica gel 60G corridas con diclorometano-
metanol: 9:1.
Punto de fusión : se realizó en un fusiómetro MEL-TEMP, laboratory.
Devices. Mass 02139.
Pruebas
Absorción Ultravioleta : en un spectronic 2000 Bausch&Lomb.
Rotación óptica: en un polarímetro Polartronic E. SCHMID-HAENSCH.
Espectrometría de rayos infrarrojos en un equipo FTIR-8300 SHIMADZU.
Resonancia magnética nuclear de Carbono 13 y de Hidrógeno: en un
espectrómetro de resonancia magnética nuclear Jeol FX 90Q de 90MH.
4.7 Rendimiento de la sustancia F-1
Se determinó:
- La cantidad de sutancia F1 producida en 1L de medio de transformación
producida por un inóculo de 1x107conidios/mL de Fusarium oxysporum.
- Rendimiento en biomasa : Y= biomasa/sustrato x 100 (Scragg, 1997).
- Rendimiento en producto: Y= producto/sustrato x 100 (Scragg, 1997).
- mg de producto / g de peso seco de biomasa (Scragg, 1997).
52
4.8 Actividad antibacteriana de la sustancia F1. 4.8.1 Prueba de sensibilidad por difusión en agar en pozos.
Fueron evaluadas las siguientes bacterias:
Bacillus subtilis: Bacilo Gram positivo, formador de endosporas
Escherichia coli: Cocobacilo Gram negativo.
Staphylococcus aureus: Coco Gram positivo.
Se tomaron placas con agar Mueller Hinton a las cuales se le realizó cuatro
perforaciones a cada una de las cajas, cada perforación con un diámetro de
6mm; seguidamente se sembró el microorganismo masivamente con un
inóculo equivalente al estándar de Mc Farland de 0.5, en fase exponencial;
por otra parte 5mg de la sustancia F-1 fueron disueltos en 2mL de
dimetilsulfóxido(DMSO).
En el 1er pozo, de cada una de las cajas, se adicionó 62.5μg de la sustancia
F-1, en el 2do pozo 100μg, en el 3er pozo 125μg y en el 4to pozo sólo DMSO.
Cada microorganismo se evaluó por duplicado en agar Mueller Hinton y la
actividad antimicrobiana se determinó por la presencia de halos de inhibición.
4.8.2 Concentración mínima inhibitoria (CMI) Se determinó la CMI de la sustancia F1 frente a Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, por la prueba de sensibilidad en caldo.
A. Preparación del inóculo
Los microorganismos (S. aureus y E. coli) se dejaron toda la noche a 35°C
en agar nutritivo.
- En 2mL de caldo tripticasa de soya, y se inocularon aproximadamente 5
colonias provenientes de la placa de agar y se corrigió la turbidez para
que fuera equivalente al estándar de Mc Farland 1.
- De la suspensión anterior se transfrió 0.1mL a 10mL de caldo tripticasa
de soya y se incubó por seis horas, esto representa el punto medio de la
fase exponencial.
53
- Se estandarizó el inóculo haciéndolo coincidir con el estándar de Mc
Farland 0.5 en 3mL de caldo tripticasa de soya.
- El inóculo estandarizado se diluyó1:10 en caldo tripticasa de soya
(aproximadamente 5x106UFC/mL).
- Se tomaron 5 tubos con 4mL de caldo tripticasa de soya y se evalúo la
sustancia a diferentes concentraciones: 6μg/mL, 12μg/mL, 25μg/mL,
37.5μg/mL, 50μg/mL; a cada tubo se le adicionó 0.1mL del inóculo diluido,
además se incluyeron los siguientes controles:
Control de esterilidad: 4mL de caldo tripticasa de soya.
Control positivo : 4mL de caldo + amoxacilina 3μg/mL
Control negativo: 0.1mL de suspensión bacteriana+4mL de caldo.
Control DMSO: 0.1mL de DMSO + 0.1mL de suspensión bacteriana+4mL de
caldo.
Posteriormente se incubaron los tubos por 20 horas a 37°C.
B. Cuantificación del inóculo.
- A partir de la dilución final del inóculo se les realizó 4 diluciones seriadas
al décimo en caldo tripticasa de soya.
- Se colocó 0.1mL sobre la superficie en una placa con agar Mueller-Hinton
y se distribuyó el inóculo uniformente .
- se incubaron las placas a 35°Cx 24horas, pasado este tiempo se realizó
el conteo de las UFC/mL.
Determinación de la CMI. Después de la incubación de los tubos se determinó la menor concentración
de la sustancia F1, que impide el crecimiento in vitro de las bacterias (CMI)
de forma visual y por determinación en absorbancia a 500nm.
54
4.8.3 Concentración mínima bactericida.
Después de la determinación de la CMI se incubaron los tubos por 4 horas
más y de los tubos aparentemente límpidos se distribuyó 0,1mL de cada tubo
en la superficie de las placas de agar Mueller-Hinton y se incubaron por
24horas a 37°C, terminado este tiempo se contaron las colonias y se
determinó la concentración mínima de la sustancia que mata el 99.9% de
UFC/mL.
La CMI y la CMB se evaluaron por duplicado.
4.8.4 Prueba de sensibilidad por difusión con discos. Se tomaron placas con agar Mueller-Hinton y se sembró masivamente con
un inóculo de Staphylococcus aureus en fase exponencial equivalente al
estándar de Mc Farland de 0.5, posteriormente se colocó sobre la superficie
del medio, discos con una carga de 25μg y 50μg de la sustancia F1,
utilizándose como control, sensidiscos de eritromicina 15μg y vancomicina
30μg; a las 24 horas se determinó el diámetro del halo de inhibición del
crecimiento.
4.8.5 Método de siembra en estrías. La actividad antibacteriana fue ampliada con otras bacterias por el método de
siembra en estrías (Brock, 1991), el cual permite evaluar diferentes bacterias
en una misma caja.
Se tomaron cajas de Mueller-Hinton y se realizaron perforaciones centrales
donde se colocó 200μg de la sustancia F1; se tomaron dos cajas para
evaluar bacterias Gram positivas y dos para Gram negativas, las bacterias
evaluadas se presentan en la tabla 6.
55
Tabla 5. Bacterias evaluadas por el método de siembra en estrías.
Bacterias Gram positivas
ESTRÍA # BACTERIAS 1 Bacillus cereus 2 Bacillus subtilis 3 Streptococcus mutans 4 Staphylococcus epidermidis 5 Streptococcus pyogenes 6 Staphylococcus aureus
Bacterias Gram negativas
ESTRÍA # BACTERIAS 1 Citrobacter freundii 2 Escherichia coli 3 Salmonella tiphy 4 Klebsiella pneumoniae 5 Pseudomonas aeruginosa 6 Proteus sp
56
4.9 Actividad antifúngica.
Se realizó por el método de macrodilución en tubos con agar inclinado
(Rodríguez, 1999); los hongos evaluados fueron los dermatofitos
Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.
Se tomaron tubos de 10x150 y se les adicionó 4mL de agar saboureand sin
solidificar y se agregó a cada tubo cantidades diferentes de la sustancia F1
400μg, 200μg, 100μg, 50μg, se dejó solidificar y se sembró el hongo con un
asa de disección, en el centro del bisel, además se realizó un control positivo
con 50μg de Ketoconazol; un control negativo, un control de esterilidad y un
control con DMSO. La prueba se dejó por 12 días y se evaluó por la
presencia o ausencia de crecimiento comparada con los controles.
57
5. RESULTADOS 5.1 Activación de las cepas. Las cepas de Fusarium, Curvularia y Mucor 321 no esporularon en APSC
por lo que fue necesario pasarlas a CPGC, de estas cepas no se pudieron
recolectar esporas suficientes de la Curvularia ni del Mucor 321 por esto
fueron descartados. Se seleccionarion las siguientes cepas para ser evaluadas: Fusarium: EK-14, EK-8.1, EK-16, F14; Aspergillus: 19-4, 407;
Penicillium: 404, 407, ya que fueron de los géneros reportados, las cepas de las que se pudo recuperar gran cantidad de
conidios.
5.2 Selección de la cepa transformadora. Terminada la fermentación el pH estaba en 2.0 en todos los cultivos.
En las cromatografías realizadas a los extractos del micelio y del caldo, de
cada uno de los cultivos no se pudo observar ninguna mancha similar al
patrón, posiblemente por degradación del sustrato, se procedió a escoger la
cepa de Fusarium oxysporum F-14 para evaluar su capacidad
biotransformadora, porque es un hongo estrechamente relacionado con
Gibberella fujikuroi, hongo más reportado como transformador de kauranos
(Alam, 1991; Hanson, 1992; Fraga, 2000), además Fusarium ha
transformado glucósidos (Yue, 1998).
5.3 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa de Fusarium oxysporum .
En los ensayos del monitoreo del sustrato y fermentación a 1L, para evaluar la capacidad biotransformadora de la cepa de F. oxysporum; el sustrato no presentó cambios en CCD en sílica gel 60G con fase móvil diclorometano-metanol 7:3; y en cromatografía en RP18 con fase móvil metanol-agua 7:3 (figura 5); la cromatografía para metabolitos secundarios reveló una mancha en gran cantidad que se decidió purificar.
58
5.4 Aislamiento y Purificación de productos. Una vez pasado los extractos de la fermentación a 1L por las columnas en RP18 se unieron las fracciones del sustrato y se
realizó cromatografía en placas RP18 corridas con metanol-agua 7:3 y en sílica gel 60G diclorometano-metanol 7:3 y ambas
revelaron el sustrato al mismo nivel del patrón (figura 5), por lo cual la cepa de Fusarium oxysporum no presenta capacidad
biotransformadora en el medio de transformación para diterpenos.
Se purificó el metabolito mayoritario producido por el hongo durante el proceso de biotransformación, con diclorometano-
metanol 9.5:0.5 al que se denominó F1, confirmándose la pureza en cromatografía en sílica gel 60G, utilizando como fase móvil
diclorometano-metanol 9.0:1.0.
5.5 Identificación del metabolito secundario mayoritario producido por Fusarium oxysporum.
La sustancia F1 se identificó como cloranfenicol, según sus propiedades
físicas y datos espectroscópicos y presenta una fórmula molecular de
C11H12Cl2N2O, cuya estructura se presenta en la figura 6.
Cristalización: diclorometano; solubilidad: metanol y acetona.
Punto de fusión : 150°C
Rf: diclorometano-metanol (9.0: 1.0) = 0.5 , en CCD bajo luz U.V de onda
corta.
Microfusión sódica: Se determinó la presencia de nitrógeno .
Rotación óptica: αD25 = 0.0
Absorción ultravioleta: longitud de onda de máxima absorción :273λ .
MONITOREO DEL SUSTRATO
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Extracto 3er día de fermentación: 1 y
2 Extracto 4to día de fermentación: 3 y 4 Extracto 5to día de fermentación: 5 y 6
Control: medio+sustrato: 7
59
Fermentación 1L Sustrato purificado
C: Extracto del caldo M: Extracto del micelio P: Patrón
P: Patrón S: Sustrato
Figura 5. Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa de
Fusarium oxysporum F-14 por CCD
NO2
C
C
CH2
H OH
H NH C
O
CHCl2
OH
Figura 6. Estructura química del cloranfenicol
60
Espectro infrarrojo: En la figura 7, se observa una señal en la posición 3263
cm-1 que nos indica la presencia de OH; en 3080cm-1 un OH; en 1689 cm-1
un grupo carbonilo; en 1562 cm-1 un éster; en 1521 cm-1 un C-N; en la
posición 1350cm-1 un grupo O-C y en 1064 cm-1 un C-O; la asignación por
analogía la observamos en la tabla 6.
En el espectro de RMN1H, se observan señales en 2.1, multiplete que hace
referencia al solvente; en 3.8 y 5.3 multipletes que representan H unidos a C-
O ó C-N; en 6.4 dobletes que son H muy desplazados a campos bajos; en
7.2 y 8.2 dobletes que representan aromáticos con sustitución para. (figura 8,
tabla 7).
El espectro de RMN13C de la figura 9, presenta señales para 1 grupo CH2 en la posición 62; 7grupos CH en las posiciones 58, 68, 72, 122 126, siendo uno de éstos un C-N y 3 grupos C en las posiciones 140, 149, 162; para un total de 11 átomos de carbono, las asignaciones por analogía se presentan en la tabla 8. 5.6 Rendimiento.
Biomasa: 3.214g/L
Cloranfenicol extraído del micelio y del caldo: 421.3mg, es decir, se presenta
un exceso de 21.3mg.
Extracto total: 862mg
Rendimiento en biomasa= Y = 3214mg/mL 8000mg/mL = 0.40 x 100= 40%
Rendimiento en producto Y= 21.3mg/mL 8000mg/mL= 0.0026x100 = 0.26%. Del cloranfenicol se obtuvo: 0.15 mg de cloranfenicol por g de peso seco.
61
0.0
25.0
50.0
75.0
%T
500.01000.01500.02000.03000.01/cmA.M.
1064.61350.11521.7
1562.2
1689.53263.3
Figura 7. Espectro infrarrojo del cloranfenicol.
Tabla 6. Asignación por analogía del espectro infrarrojo del cloranfenicol
POS(1/cm) Asignación 1064.6 C-O 1350.1 O-C 1521.7 C-N 1562.2 C-O 1689.5 C=O 3080.1 O-H 3263.4 O-H
62
Figura 8. Espectro de RMN+H del cloranfenicol.
Tabla 7. Datos del espectro de RMN+H del cloranfenicol
RMN1H δppm Multiplicidad
3.8 m 5.3 m 6.4 d 7.7 d 8.2 d
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 δ(ppm)
63
Figura 9. Espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol .
Tabla 8. Datos del espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol.
RMN13C δppm C
58 (+) CH 62 (−) CH2
68 (+) CH 72 (+) CH
122 (+) =CH- 126 (+) =CH- 140 (−) =C= 149 (−) =C= 162 (−) -C=0
200 170 150 120 90 70 50 30 10 0
64
5.7 Actividad antibacteriana del cloranfenicol.
• Prueba de sensibilidad por difusión en agar con pozos: En la tabla 9 se
presentan los datos de los halos de inhibición en mm, correspondientes a los
μg de cloranfenicol evaluados, con las siguientes bacterias: Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis y Escherichia coli; de igual forma se presentan en
la figura 10.
• Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida del
cloranfenicol para Staphylococcus aureus.
El inóculo utilizado para la CMI fue de 1.6x106 UFC/mL ( 164
colonias/0.1mLx 3 diluciones seriadas = 164x10x103= 164x104= 1.6x107
UFC/mL).
La CMI del cloranfenicol para Staphylococcus aureus fue de 25μg/mL; los
datos en absorbancia para la determinación de la CMI, se presentan en la
tabla 10, de igual forma en el gráfico 11.
la CMB para Staphylococcus aureus se evaluó en 37μg/mL y en 50μg/mL,
obteniéndose un recuento de UFC: incontables; por lo que se determinó que
a éstas concentraciones el cloranfenicol es bacteriostático.
• Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida del
cloranfenicol para Escherichia coli.
La CMI para E. coli fue de 37μg/mL, los datos en absorbancia se presentan
en la tabla 11, de igual forma en el gráfico 12; la CMB para E. coli se evaluó
en 37μg/mL y en 50μg/mL , obteniéndose un recuento de UFC: incontables;
por lo que se determinó que a éstas concentraciones el cloranfenicol es
bacteriostático.
El inóculo utilizado fue de 3.6x106UFC/mL .
• Prueba de sensibilidad por difusión con discos.
Con el cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus se obtuvo halos de
inhibición de 18mm para 25μg y de 23mm para 50μg respectivamente, estos
datos se observan en la tabla 12 y figura 13
65
Tabla 9. Prueba de sensibilidad por difusión en agar en pozos .
BACTERIAS
Cloranfenicol
Halos en mm Halos en mm DMSO 50μL
62.5 24 S.aureus 100 26 0
125 30 62.5 18
E.coli 100 19 0 125 20 62.5 18
B.subtilis 100 19 0 125 20
62.5 μg 125 μg
DMSO 100 μg DMSO
125 μg 100 μg
62.5 μg
DMSO
62.5 μg 100 μg
125 μg
Stafilococcus aureus Bacillus subtilis
Escherichia coli
Figura 10. Prueba de sensibilidad por difusión en agar en pozos.
66
Tabla 10. concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para Staphylococcus aureus .
Cloranfenicol μg/mL Absorbancia 6 1
12 0.3 25 0.07 37 0.07 50 0.07
control esterilidad 0.06 control positivo 0.07 control negativo 1.08 control DMSO 1.11
CMI: 25μg/mL.
CMI
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,1
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0
Concentración
Abs
orba
ncia
Figura 11. concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para Staphylococcus aureus .
67
Tabla 11. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para E. Coli .
Cloranfenicolμg/mL Absorbancia 6 0.85
12 0.06 25 0.50 37 0.14 50 0.12
Control esterilidad 0.08 Control positivo 0.09 Control negativo 1.15 Control DMSO 1.15
CMI: 37μg/mL.
CMI
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración F1
Abs
orba
ncia
Figura 12. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para E. Coli.
Tabla 12. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus .
68
Cloranfenicol Halos en mm 25μg 18 50μg 24
Eritromicina 15μg ( sensible >18) 29 Vancomicina 30μg (sensible >12) 15
50 μg
V
50 μg 25 μg 25 μg
E
V: Vancomicina E: Eritromicina
Figura 13. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus .
• Actividad antibacteriana por el método de siembra en estrías.
Todas las bacterias Gram positivas evaluadas fueron sensibles a 200μg del
cloranfenicol, los datos se presentan en la tabla 13 y en la figura 14.
69
De las bacterias Gram negativas evaluadas, Pseudomonas aeruginosa fue resistente a 200μg de la sustancia F1, los datos se presentan en la tabla 14 y figura 15. 5.8 Actividad antifúngica. Hasta 400μg/mL del cloranfenicol no ejercen actividad antifúngica frente a los dermatofitos T.
rubrum y T. mentagrophytes. (tabla 15)
Tabla 13. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram positivas por el método de siembra en estrías .
ESTRÍA # BACTERIA mm
1 Bacillus cereus 13 2 Bacillus subtilis 10 3 Streptococcus mutans 14 4 Staphylococcus epidermidis 13 5 Streptococcus pyogenes 20 6 Staphylococcus aureus 13
70
Figura 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias
Gram positivas por el método de siembra en estrías
Tabla 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram negativas por el método de siembra en estrías.
ESTRÍA # BACTERIAS mm
1 Citrobacter freundii 14 2 Escherichia coli 10 3 Salmonella tiphy 14 4 Klebsiella pneumoniae 11 5 Pseudomona aeruginosa 2 6 Proteus sp 10
Figura 15. Figura 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram negativas por el método de siembra en estrías
71
Tabla 15. Actividad antifúngica del cloranfenicol.
cloranfenicol μg Crecimiento T. rubrum/mm
Crecimiento T. mentagrophytes/mm
25 + + 100 + + 150 + + 200 + + 400 + +
Control positivo: ketoconazol
(50μg).
−
−
Control negativo + + Control DMSO + +
Control esterilidad
−
−
72
6. DISCUSIÓN
El β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)16-(β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-
kaurano 19 oico, fue seleccionado para los ensayos de biotransformación,
por las considerable concentraciones producidas por la Ageratina
vacciniaefolia, planta promisoria colombiana.
6.1 Selección de la cepa.
Aunque se realizó un ensayo preliminar con cepas de los géneros:
Penicillium, Aspergillus y Fusarium, no fue posible realizar la selección
por CCD probablemente por degradación del sustrato.
La selección de la cepa nativa de Fusarium oxysporum para los ensayos de
biotransformación, se basó en los reportes de literatura, ya que es un género
estrechamente relacionado con Gibberella fujikuroi (estado sexual de
Fusarium moniliforme), hongo transformador de una variedad de diterpenos
kaurenoides(Fraga, 2000; Alam, 1991), además Fusarium transforma
kauranos y beyeranos, hidroxilando el C7 y C12β de igual forma que
Gibberella fujikuroi (Oliveira, 1996).
6.2 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa de Fusarium oxysporum por CCD.
Desde los primeros reportes en biotransformación se ha utilizado la CCD
para detectar posibles transformaciones, por comparación de controles
(Anderson, 1975; Ipsen, 1982), en la última década todavía sigue vigente
el método (Tapia, 1997);éste método se escogió para determinar la
posible cepa transformadora por disponibilidad del laboratorio, ya que
73
métodos como HPLC son muy costosos. La posibilidad de que el hongo
genere sustancias con polaridades iguales o similares al sustrato e
interfiera en la interpretación de resultados, es superada con la
fermentación del hongo sin adición de la sustancia a transformar.
Como se pudo observar en el ensayo a los 11 días de fermentación en el
medio de transformación para diterpenos, el sustrato es degradado
completamente, ésto se confirmó con un posterior ensayo en 200mL de
medio con 50mg del sustrato, por lo cual se decidió realizar un monitoreo al
5to, 6to y 7tmo día de fermentación , aquí no se observó cambios del sustrato ni
en la cromatografía en sílica gel 60G , ni en RP18, sin embargo se realizó
una posterior fermentación en 1L de medio donde tampoco se observó
ningún cambio.
El sustrato se decidió purificar ya que en los extractos , se pueden presentar
numerosa sustancia producidas por el hongo que podrían no tener relación
con el diterpeno en cuestión , sin embargo el sustrato purificado tampoco
reflejó cambios; además se utilizaron dos sistemas de cromatografía en sílica
gel 60G y RP18, no ameritando el resultado RMN, por lo cual la cepa nativa
de Fusarium oxysporum no presenta capacidad de transformar el β-D-
glucopiranosil-ester del ácido (-)16-(β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-kauran 19
oico en el medio de transformación para diterpenos.
6.3 Identificación del metabolito secundario mayoritario producido por Fusarium oxysporum.
Durante el proceso de biotransformación se aisló, purificó e identificó, el
metabolito secundario mayoritario producido por la cepa nativa de Fusarium
oxysporum, sustancia denominada F1, que según datos espectrales, se
74
identifica como un metabolito nitrogenado que tiene en su estructura
molecular un anillo aromático con sustitución en para, grupos ésteres y un
grupo alcohol, con una fórmula molecular C11H12Cl2N2O5, la cual
corresponde a cloranfenicol.
para su identificación se tuvo en cuenta los siguientes aspectos:
-Propiedades físicas: Solubilidad, punto de fusión.
-Datos espectroscópicos: RMN1H, RMN13C, IR.
-Actividad antibacteriana: Amplio espectro.
-Actividad antifúngica: No presenta actividad.
Todos éstos datos son iguales a la literatura.
6.4 Actividad antimicrobiana del cloranfenicol. 6.4.1Actividad antibacteriana.
• Prueba de difusión en agar con pozos.
Se realizó esta prueba como ensayo preliminar para determinar si la
sustancia F1 (Cloranfenicol) presentaba actividad antibacteriana, se
evaluaron las siguientes bacterias: E. coli, como representante del grupo de
bacterias Gram negativas ; S. aureus, del grupo Gram positivo; y B. subtilis
representando el grupo de bacterias formadoras de endosporas, las tres
bacterias frente a 62.5, 100 y 125 μg de F1 presentaron halos de inhibición ,
entre 18 y 30 mm; pero el tamaño del halo no es significativo por sí solo ya
que no se conocen las características de difusión de la sustancia (Koneman,
1999), por tal motivo se determinó la CMI y la CMB para S. aureus y E. coli.
• Determinación de La CMI y CMB . (Koneman, 1999).
Para S. aureus la CMI es de 25μg/mL y para E. coli es de 37μg/mL ; E. coli
y S. aureus fueron seleccionados por su importancia clínica; S. aureus es el
agente causal de infecciones de heridas y abscesos, además produce
75
infecciones respiratorias y alimentarias; E. coli se encuentra frecuentemente
comprometida en infecciones urinarias y gastrointestinales. (Broock, 1991).
• Prueba de sensibilidad por difusión con discos (García, 1997).
Para ésta prueba se utilizó Staphylococcus aureus, presentando halos de
inhibición de 18mm para discos con 25μg y 23mm para discos con 50μg de
cloranfenicol La eritromicina y la vancomicina de utilizaron como controles
de la técnica, estos datos son muy similares a los obtenidos con el reportado
en la literatura para Staphylococcus aureus: discos con 30μg de
cloranfenicol, sensible: halos>18mm.
• Método de siembra en estrías.
De 12 bacterias evaluadas sólo Pseudomonas aeruginosa fue resistente a
200μg de cloranfenicol, las bacteria evaluadas se seleccionaron por su
importancia clínica.
S. pyogenes, produce infecciones de garganta y fiebre reumática, K.
pneumoniae, infecciones respiratorias; Proteus sp infecciones urinarias, S.
tiphy infecciones alimentarias y fiebre tifoidea.
6.4.2 Actividad antifúngica: Hasta 400μg de cloranfenicol no ejercen
acitividad frente a los dermatofitos Trichophyton rubrum y Trichopyton
mentagrophytes.
6.5 Rendimiento.
Se obtuvo un exceso de 21.3mg de cloranfenicol en un litro de medio de
transformación para diterpenos con un inóculo de 107 conidios/ mL de
Fusarium oxysporum; dato importante para continuar la investigación, ya
76
que los datos espectroscópicos no reflejan impurezas, además durante el
proceso de purificación se perdió gran cantidad de sustancia mientras se
determinó el sistema de elución adecuado. También supone pérdida la
acción del antibiótico ya debe unirse a la unidad ribosomal 50s.
Se obtuvo un rendimiento en biomasa de 40% y en producto 5.2% estos
datos fueron determinados para tener en cuenta en estudios posteriores,
pues no se dieron las condiciones óptimas para la producción de metabolitos
secundarios, ni se monitorearon parámetros importantes (Curva de
crecimiento).
77
7. CONCLUSIONES • El β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)16-(β-glucopiranosiloxil)-17-
hidroxi-kaurano 19 oico no es transformado por la cepa nativa de Fusarium oxysporum, en el medio de transformación para diterpenos.
• La sustancia F1 aislada del medio de transformación para diterpenos
inoculado con Fusarium oxysporum corresponde a cloranfenicol. • El cloranfenicol presenta una CMI para S. aureus de 25μg/mL. • El cloranfenicol presenta una CMI para E. coli de 37μg/mL. • El cloranfenicol a 200μg no ejerce actividad antibacteriana contra
Pseudomonas aeruginosa. • El cloranfenicol hasta 400μg no tiene actividad antigúngica contra los
dermatofitos T. rubrum y T. mentagrophytes. • Se obtuvo un exceso de 21.3mg de cloranfenicol a partir de 1L de
medio de transformación para diterpenos con un inóculo de 1x107conidios/mL, con un rendimiento en biomasa del 40% y en producto de 0.26% ; obteniéndose 0.15 mg de cloranfenicol/ g de peso seco.
78
8. RECOMENDACIONES • Evaluar la capacidad biotransformadora de otros géneros del hongos
sobre el β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-glucopiranosiloxil)-16-ol-kauran 19 oico.
• Realizar el ensayo de biotransformación en diferentes medios de
cultivo y variando las condiciones de fermentación. • No adicionar sustancias en los procesos de fermentación para la
obtención de metabolitos secundarios a partir de hongos que puedan interferir en la interpretación de resultados
79
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MEDIO DE BIOTRANSFORMACIÓN PARA DITERPENOS (Anexo A)
• Glucosa : 80g/L
• Sulfato de amonio: 7.92g/L
• Fosfato dipotásico: 5g/L
• Sulfato de Mg: 1g/L
• 2mL de elementos trazas :
Sulfato ferroso: 0.1g Sulfato de cobre: 0.015g Sulfato de zinc: 0.016g
Sulfato de manganeso: 0.01g Molibdato de amonio: 0.01g
Co(No3)26H2O: 0.01g
• Cloranfenicol: 400ppm/L
86
MEDIO LÍQUIDO PARA ESPORULACIÓN (Anexo B)
• Papa: 200g/L • Glucosa: 20g/L
• Sulfato de amonio: 1g/L
• Cloranfenicol: 400ppm/L
87