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Ana Carolina ZakirDjanira Rodrigues Negrão
João Paulo Apolari
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOCENA – CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA
AGRICULTURA
Ecologia Experimental de Micro-organismosResponsável: Pr0fª Drª Siu Mui Tsai
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Introdução
A estrutura e a atividade das comunidades microbianas do solo
podem ser influenciadas por diversos fatores como:
Composição e características físico-químicas;
Formas de manejo e tipo de cultura empregada;
Condições climáticas, geografia;
Contaminações de natureza diversa: herbicidas, fungicidas,
fertilizantes, metais pesados, poluentes orgânicos, etc;
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Introdução
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Introdução
A microbiota do solo apresenta elevada diversidade genética e
funcional, que pode ser caracterizada com base em estudos que
empregam paralelamente:
Dependentes de cultivo
Independentes de cultivo
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Introdução
Técnicas independentes de cultivo:
T-RFLP;
Construção de biblioteca do gene 16S rRNA;
Clonagem e sequenciamento de genes, como o nifH;
Análise filogenética;
q-PCR.
RT-RFLP.
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Estudo de caso 1Estudo de caso 1
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Objetivos
Análise da biodiversidade microbiana do solo da rizosfera
de cana-de-açúcar com adubação de fertilizante nitrogenado.
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Cana-de-açúcar: RB72454
Tratamentos: com e sem adubação.
Controle: mesmo local, ano anterior com adubação.
Dois diferentes regimes de fertilização:
Sem fertilizante nitrogenado.
120 kg/ha de fertilizante nitrogenado.
O controle utilizado foi uma amostra do solo de rizosfera de cana-
de-açúcar crescida no mesmo local no ano anterior, que também
recebeu adubação nitrogenada.
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O solo aderido às raízes foi coletado por agitação manual em tubos
e imediatamente armazenado a -70 °C para análise.
Um total de 1 g de solo de cada amostra foi utilizado para a
extração de ácido nucleico.
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O kit UltraClean soil DNA isolation
(Mobio Laboratories, inc., USA).
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O gene 16S rRNA foi amplificado por PCR.
Os primers: 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’) e 1492r
(5’GGYTACCTTGTTACGACTT3’) foram usados para amplificar
fragmentos de aproximadamente 1500 pb.
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Amplificação 16S rRNA
Clonagem PCR2.1-TOPO (Invitrogen, USA)
Seleção de 12 clones por placa (96 poços)
Digestão EcoRI
Sequenciamento dos fragmentos
Construção de biblioteca de 16S rRNA e sequenciamento
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Sequências e análise de diversidade
Remoção das sequências de baixa qualidade (Phred base caller)
Taxonomia (Ribossomal
Database Project)
Alinhamento de sequências
(Mothur v.1.9.0)
MEGA-BLAST(Busca de Sequências depositadas no NCBI)
Depósito de Sequência no banco de dados (≥ 50 pb)
(GenBank database)
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RESULTADOSRESULTADOS
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Construção de biblioteca de 16S rRNA e sequenciamento
Foram obtidas um total de 541 sequências com mais de 50 pb390 (72,1 %) dessas sequências tiveram mais de 250 pb
• S0N*= solo de rizosfera de plantas com 12 meses (1 ano antes)
• S13N*= solo de rizosfera de plantas com 13 meses (1 ano depois)
• S13n= solo de rizosfera de plantas com 13 meses (1 ano depois)
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86 % das sequências
poderiam ser atribuídas
em 15 filos.
127 (23,6 %) foram
atribuídas a nível de
gênero com confiança
média de 95,5% nas 3
bibliotecas.
Distribuição taxonômica dos clones das biblioteca de 16S rRNA
vc
vc
vc
vc
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Para investigar a
classificação destes
clones, as sequências
foram recuperadas e
submetidas a uma
pesquisa MEGA-BLAST
na base de dados NCBI.
Identidades elevadas (98 a
100%) com bactérias não
cultivadas e / ou Bacillus
isolados a partir de solo
agrícola contaminado.
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Riqueza de comunidade pelo índice de Chao:
1º - S13N (298), 2º - S0N (220), 3º - S13n (217)
Diversidade das bibliotecas pelo índice de Shannon:
1º - S13N (4,25), 2º - S0N (4,19), 3º - S13n (4,09).
No entanto, as três amostras apresentaram riqueza e diversidade semelhante,
sem diferença significativa no intervalo de confiança de 95%.
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CONCLUSÃOCONCLUSÃO
Esperava-se que nas amostras S0N e S13N que receberam
adubação nitrogenada as populações bacterianas compartilhariam
grupos comuns. O que de fato não aconteceu, sugerindo que a
adubação nitrogenada pode não ser o principal fator que influencia a
biodiversidade do solo.
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CONCLUSÃOCONCLUSÃO
O número de sequências de Verrucomicrobia recuperados à partir
de ambas amostras com fertilizantes foram significativamente
menores em relação às amostras sem fertilizantes (S13n),
sugerindo que este grupo pode ser um indicador de solos ricos em
nitrogênio.
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Estudo de caso 2Estudo de caso 2
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OBJETIVOSOBJETIVOS
Estudar a diversidade e abundância de bactérias
fixadoras de N2, através do gene nifH, em resíduos de
mina de cobre.
Explorar o papel determinante na distribuição das
comunidades diazotróficas na sucessão primária.
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Local dos resíduos de cobre em
Yangshanchong
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Mais importante fonte de cobre na China.
Precipitação anual: 1300 mm.
Temperatura média anual: 16 ºC.
Operações durante 30 anos, abandonada em 1990.
Área aproximada de 20 ha.
Monitoramento da área durante sete anos.
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1. Resíduos sem cobertura.
2. Agregados biológicos de algas.
3. Agregados biológicos de algas e musgo.
4. Agregados biológicos de musgo.
5. Comunidade de plantas vasculares.
6. Sítio de referência – local distante dos resíduos.
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Coleta: 0 – 10 cm, com sonda (3 cm x 20 cm).
Três replicatas (compostas de 5 sondas cada).
Mantidas sob refrigeração.
Homogeneizadas e peneiradas (2 mm).
Para as análises moleculares: - 40ºC.
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pH.
Condutividade elétrica.
NO3- e NO4
-
Carbono orgânico total (TOC-VCPH).
Nitrogênio total (Kjeltec TM 2300).
Concentrações de Cu e Zn (Page et al., 1982).
Metais pesados (IVP-OES; OPTIMA 2100).
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Lipídios totais: 5 g de solo.
Frações polares de ácidos graxos de fosfolipídios: separadas,
quantificadas, identificadas por cromatografia gasosa.
Análise da biomassa microbiana
Atividade da nitrogenase
Realizada in situ.
Valores médios obtidos foram convertidos em input de
fixação biológica de N2.
ANÁLISESANÁLISES
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DNA total da comunidade microbiana: 0,5 g de solo/amostra.
Amplificação da região do gene nifH (365 pb) com os primers:
PolF e PolR (Poly et al., 2001).
Primer PolF foi rotulado em 5’ com FAM (6-carboxifluoresceina).
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Extração do DNA Extração do DNA Análises de T-RFLPAnálises de T-RFLPTriplicata de PCR
por amostra
Os tamanhos dos fragmentos e a
intensidade de fluorescência foram
analisados pelo software GENESCAN.
Perfil de RFLP
Purificação
Digestão: 37 ºC/6 h Enzima HaeIII.
EletroforeseABI 3730xl
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A abundância relativa dos fragmentos de restrição terminal
individual (T-RFs) foi calculada pela % do perfil da altura dos
picos.
Apenas os T-RFs com abundância relativa > 1% foram analisados.
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As bibliotecas de clones foram construídas das amostras:
Resíduos SC, alga+musgo, musgo, sítio de referência.
Os fragmentos de nifH foram amplificados (igual à extração), com
primers sem fluoróforos.
Purificação das triplicatas de PCR.
Clonagem de nifH, com o kit TOPO TA.
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Clonagem do gene Clonagem do gene nifHnifH
Os clones representantes de cada padrão único de RFLP foram sequenciados (ABI 3730xl)
Comparação manual do resultado do perfil de RFLP
Amplificação das inserções dos clones de nifH recombinantes
Digestão enzimática dos clones com endonucleases HhaI e HaeIII
Determinação em eletroforese (gel de agarose, 2%)
As UTOs foram definidas com pelo menos 95 % de sequências de nucleotídeos similares (sotware DOTUR)
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Comparação das sequências de nifH no GenBank, BLAST.
Tradução das sequências em aminoácidos (MEGA 3.1).
Construção da árvore filogenética, usando distâncias de correção
Poisson.
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A abundância do gene nifH foi quantificada.
Primers idênticos ao RFLP.
Reações padrão (LightCycler 480).
Confirmação em gel de agarose.
Controles negativos sem DNA.
Análises estatísticas: correlação entre densidade de nifH e
propriedades físico-químicas do solo.
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As sequências nifH foram depositadas:
EMBL/GenBank/DDBJ
Número de acesso: FN985167-FN985220.
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RESULTADOSRESULTADOS
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Total de T-RFs em todos os perfis: 45 (3 comuns, 9 únicas), média = 13.
Diversidade de nifH indicado pelos três índices calculados: não mostrou
grande significância (+/-) nos locais com resíduos.
Índices de Diversidade das Comunidades Diazotróficas
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Riqueza e Diversidade das sequências de nifH
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* Análises comparativas de
sequências de 204 clones nifH
das 4 bibliotecas revelaram
54 filotipos únicos.
* A maioria distribuída em
Proteobacteria, Cyanobacteria
e Firmicutes.
* 44% das UTOs foram
relacionados à bactérias
desconhecidas, representando
novos filotipos.
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Sequências de nifH filiadas a
Cyanobacteria foram detectadas
somente nos solos com ABio,
constituindo 23-39% das
bibliotecas de clones.
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A abundância relativa de
nifH pode ser correlacionada
com o progresso da sucessão
microbiana e da atividade da
nitrogenase.
5.06
x 1
05
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ResultadosResultados
Houve correlação positiva entre TOC, TN, NO3- com o número de
cópias de nifH.
A relação C/N teve correlação negativa com a abundância de nifH.
O pH e os metais pesados mostraram efeitos negativos sobre a
abundância de nifH.
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CONCLUSÕESCONCLUSÕES
Análises de T-RFLP revelaram diversidade crescente:
resíduos nus agregados biológicos
Nenhuma UTO encontrada foi comum para todas as amostras,
indicando que o progresso da sucessão pode abrir novos nichos.
A sucessão da colonização nos resíduos de minas de cobre
geralmente é acompanhada por mudanças nas suas características
físico-químicas.
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CONCLUSÕESCONCLUSÕES
A natureza heterogênea dos resíduos pode ser afetada pela idade e
presença de plantas pioneiras.
Variações nas condições ambientais podem influenciar a
diversidade e abundância de microrganismos indígenas, inclusive
os envolvidos no Ciclo do nitrogênio.
Esses fatores podem afetar positivamente a sucessão primária de
comunidades diazotróficas em locais altamente perturbados.
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Estudo de caso 3Estudo de caso 3
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ObjetivosObjetivos
Identificar relações importantes entre a comunidade bacteriana do
solo e seu meio ambiente.
Comparar a dinâmica da estrutura da comunidade bacteriana e da
atividade ao longo três épocas diferentes em dois locais
geograficamente distintos, alpes sem vegetação e local de geleira.
Destacar mudanças nos parâmetros climáticos, concentrações
nutricionais, e as respostas da comunidade bacterianas (estrutura e
atividade), que podem ocorrer durante sucessão sazonal.
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Local da coleta
Solo coletado em duas áreas geologicamente, química e biologicamente diferentes: duas geleiras alpinas, Suíça.
Damma Tsanfleuron
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Invernonão coletou
CLIMAPhttp://meteoswiss.ch
10 subamostrasde 0 - 5cm
Peneiradas (2 mm)coletados em sacos
plásticos
Alíquotas de 2 ml (tubos eppendorf)em gelo seco
Alíquotas foram armazenadas a -20°C para extração de DNA, e a -80°C para extração de RNA.
AMOSTRAGEM
Coletas emmaio – out/2008
Três estações:primavera (I), verão (II) e outono
(III)
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- Umidade: secagem em estufa por 3 dias, 60 °C.
- Nutrientes: cromatógrafo de íons (IC DIONEX 2300).
- NH4+ e PO4
3-: colorimetricamente (Mulvaney, 1996).
- pH: através de CaCl2 (Mettler Toledo XMP225).
- DOC: analisado por Shimadzu SSI TOC-5000.
- TC e TN: determinados por combustão (Leco 932CHNS).
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FDA (Fluorescein diacetate assay, Rosswall, 1982).
Atividades potenciais de enzimas por meio do ensaio de MUB
(Classen et al., 2006) com modificações:
Fosfatase alcalina.
Quitinase (N-acetil-glucosaminidase).
Sulfatase.
β-glucosidase.
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Número de células: Coloração DAPI (Bennett et al., 2006).
Concentração de DNA: utilizada como substituto para biomassa
microbiana (Marstorp e Witter, 1999).
Extração do DNA: por kit Zymo microbial DNA.
Quantificação do DNA: de acordo com Sandaa et al. (1998),
através de curvas de valores de fluorescência (0 a 100 ng µl-1).
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T-RFLPExtração do DNAPCR com primers marcadosSequenciamento
RT-T-RFLPExtração RNASíntese de cDNATranscrição reversa: SSII transcriptase reversa, com iniciador UNI-b-rev (Bundt et al., 2001).PCRSequenciamento
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Três bibliotecas: um ponto por estação
Purificação de cDNA Qiagen PCR Purification
Reação pGEM T-Easy vector
Eletroforese
Sequenciamento
Biblioteca de clones de cDNA e sequenciamento
Transformação em células JM109 (Promega)
Purificação das reações positivas ( Qiagen 96)
Definição dos filotipos
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GenBank
Número de acesso: HM623710-HM623763
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ResultadosResultados
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Grupo mais abundante: α-Proteobacteria.
Gêneros Methylobacterium sp. (AB252210) e Methylobacterium
aquaticum (AB252197), com sequências > 97 %.
Actinobacteria: 39,2 % - outono de Damma.
Actinobacteria: 39,1 % - verão de Tsanfleuron.
Corynebacterium tuscaniensis (AY677186) foi o mais comum
filotipo de Actinobacterium encontrado.
Firmicutes: frequente em ambos os locais (> 28 % do verão
Damma, do outono Tsanfleuron).
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Gênero Paenibacillus (amostras Damma).
Gêneros Bacillus e Paenibacillus (amostras Tsanfleuron).
Interessantemente, as bibliotecas de clones da primavera
apresentou uma variedade maior de filotipos em comparação
com estações seguintes:
Primavera Damma biblioteca, Rhodospirillales (e.g. DQ094180)
estavam entre os mais abundantes filotipos de α-Proteobacteria
detectados.
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Poucos estudos são realizados considerando-se as relações
entre variações físico-químicas do solo e das comunidades
bacterianas em ambientes áridos/estéreis.
A estrutura das comunidades bacterianas no verão
apareceram relacionadas principalmente às variáveis
climáticas.
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Comunidades de amostras nas estações da primavera e do
outono foram relacionadas à variações na composição de
nutrientes.
α-Proteobacteria foi a linhagem dominante ao longo de
todo o período de amostragem, sugerindo que populações
bacterianas viáveis em ambientes extremos são geralmente
capazes de sustentar fortes oscilações ambientais.
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Obrigado!!!