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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANA CARLA BALTHAR BANDEIRA
AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DO LICOPENO EM UM MODELO DE
HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR PARACETAMOL EM CAMUNDONGOS
C57BL/6
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2017
ANA CARLA BALTHAR BANDEIRA
AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DO LICOPENO EM UM MODELO DE
HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR PARACETAMOL EM CAMUNDONGOS
C57BL/6
Tese apresentada à Universidade Federal de Ouro
Preto, como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas, para obtenção do
título de Doutor em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Bioquímica Metabólica e
Fisiológica
Orientadora: Profª Drª Daniela Caldeira Costa
Co-orientador: Prof. Dr. Frank Silva Bezerra
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2017
iii
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou
o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o
que era antes.”
Marthin Luther King
Dedicatória
Bandeira, A.C.B.
iv
À minha mãe, Ana Cristina, e ao meu marido, Frank.
A paciência, força e compreensão de vocês foram
imprescindíveis para que eu seguisse em frente.
Agradecimento Especial
Bandeira, A.C.B.
v
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora, Profª Drª Daniela Caldeira Costa, muito obrigada por esses
quatro anos que só fizeram me engrandecer como profissional e pessoa. Obrigada por me
receber de braços abertos em seu laboratório, quando nem mesmo me conhecia. Obrigada pela
confiança depositada em mim e por sempre acreditar que no final tudo daria certo. A sua
orientação foi essencial para que eu seguisse em frente. Sou grata por seus ensinamentos e
pelas discussões enriquecedoras. Sua dedicação, paciência, carinho e compreensão vão além
da orientação.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Frank Silva Bezerra, obrigada por, efetivamente, me
co-orientar. Nossas discussões foram essenciais para o meu crescimento intelectual e
profissional. Sem dúvidas, você contribuiu muito para o desenvolvimento dessa tese.
Obrigada pelas palavras de apoio que sempre se fizeram presentes nos momentos certos.
Durante essa árdua jornada eu não estive apenas com orientadores ao meu lado, estive
ao lado de amigos.
Agradecimentos
Bandeira, A.C.B.
vi
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus, a força divina que me guiou e me fez chegar até
aqui.
À minha mãe, mulher guerreira e sábia, que é tudo na minha vida. Obrigada pelo
incentivo que sempre me deu, pelas broncas, pelo amor e carinho, pelos conselhos e pelo colo
que nunca me negou. Se hoje sou o que sou eu devo a você. Amo-te incondicionalmente.
Agradeço ao meu marido, Frank, por tudo que nós sempre passamos juntos.
Obrigada por estar sempre ao meu lado, por torcer por mim e principalmente por acreditar em
mim. Você faz parte da minha vida e fez parte dessa etapa tão importante da minha história.
Tenho que agradecer o carinho, a paciência, a confiança, a amizade e as palavras de incentivo
tão importantes que você dispensou a mim nos momentos mais difíceis dessa jornada. Essa
conquista também é sua. Amo você!
Agradeço a minha família, em especial à minha avó, meu pai e meu tio, que são
pessoas que sempre torceram por mim e que rezam por mim todos os dias de suas vidas.
A toda equipe do Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM), Ana Carolina,
Karine, Pedro, Rafaella, Geisla, Karine Marinho, Sttefany. Aos novos e antigos integrantes,
obrigada pela ajuda, sugestões e amizade. Em especial agradeço ao Joamyr, Bruno, Carol,
Glaucy, Aline, Lorenza e Talita que apesar de não fazerem mais parte da equipe, foram
essenciais para o desenvolvimento desse projeto.
A equipe do Laboratório de Anatomia Humana da UFOP, obrigada pela
compreensão e apoio nos momentos nos quais tive que estar ausente.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, obrigada
pelos importantes ensinamentos dispensados aos seus alunos.
Aos membros dos laboratórios LAFEX, LABNEX, LBBM, LABIIN e LIP, obrigada
por ceder espaço e equipamentos para a realização dos experimentos. Em especial, agradeço a
Keila e a Vivian.
Ao Prof. Wanderson Geraldo de Lima e a Profª Silvia Dantas Cangussú, pela
essencial ajuda com as análises histológicas.
Agradecimentos
Bandeira, A.C.B.
vii
Ao Sr. Jair e ao Aldo pela essencial ajuda com os animais e pela companhia no
biotério.
A todos os funcionários e colegas do Departamento de Ciências Biológicas e Escola
de Medicina.
Aos colegas e professores do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB)
e a Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Aos meus velhos e eternos amigos, muito obrigada! O que seria da vida sem
amigos?! Especialmente Dani, Geísa, Carla, Akinori, Marco, Dudu, Jackson, Claudinha.
Apesar da distância sempre estiveram ao meu lado. Saudades...
Agradeço a empresa BASF por, gentilmente, nos ceder amostras do Lycovit
Dispersion 10 %, que foram essenciais para o desenvolvimento dos experimentos.
Enfim, a todos que fazem ou fizeram parte de alguma forma desse trabalho!!!
Agradecimentos aos Colaboradores
Bandeira, A.C.B.
viii
AGRADECIMENTO AOS COLABORADORES
Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX)
Laboratório de Fisiopatologia Experimental (LAFEX)
Laboratório de Imunobiologia da Inflamação (LABIIN)
Laboratório de Morfopatologia
Laboratório de Multiusuários/NUPEB
Muito obrigada pelo suporte necessário.
Apoio Financeiro
Bandeira, A.C.B.
ix
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM),
Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) e no Laboratório de Fisiopatologia
Experimental (LAFEX) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto com o auxílio financeiro da FAPEMIG (nº APQ-01440-13), CAPES,
CNPq e UFOP
Sumário
Bandeira, A.C.B.
x
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS............................................................................................... 13
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... 14
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. 16
RESUMO................................................................................................................... 20
ABSTRACT.............................................................................................................. 21
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 22
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................. 24
2.1 O fígado e o metabolismo de xenobióticos......................................................... 24
2.2 Lesões hepáticas induzidas por drogas e o paracetamol...................................... 25
2.3 Estresse Oxidativo............................................................................................... 29
2.3.1 Sistema antioxidante......................................................................................... 32
2.4 Licopeno.............................................................................................................. 36
3. OBJETIVOS.......................................................................................................... 41
3.1 Objetivo geral...................................................................................................... 41
3.2 Objetivos específicos........................................................................................... 41
4. METODOLOGIA.................................................................................................. 43
4.1 Reagentes............................................................................................................. 43
4.2 Experimento 1: Análise temporal dos efeitos de uma dose tóxica do
paracetamol em camundongos...................................................................................
43
4.2.1 Animais............................................................................................................. 43
4.2.2 Indução da hepatotoxicidade............................................................................ 43
4.2.3 Análises e processamento do material biológico............................................. 45
4.2.4 Análises sorológicas......................................................................................... 45
I. Alanina aminotransferase (ALT)............................................................................ 45
II. Aspartato transaminase (AST).............................................................................. 46
4.2.5 Análise das defesas antioxidantes.................................................................... 46
I. Sistema glutationa (GSHt, GSSG, GSH, e relação GSH/GSSG).......................... 46
4.3 Experimento 2: Análise dos efeitos protetores de uma dose única de licopeno
em camundongos eutanasiados 12 e 24 horas após a intoxicação por paracetamol..
47
4.3.1 Animais............................................................................................................. 47
4.3.2 Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade......................... 47
4.3.3 Análises sorológicas......................................................................................... 48
Sumário
Bandeira, A.C.B.
xi
I. Colesterol total....................................................................................................... 49
II. Colesterol HDL..................................................................................................... 49
4.3.4 Análise das defesas antioxidantes.................................................................... 50
I. Atividade da glutationa peroxidase (GPx)............................................................. 50
II. Atividade da glutationa redutase (GR)................................................................. 51
III. Atividade da catalase (CAT)................................................................................ 51
IV. Atividade da superóxido dismutase (SOD)......................................................... 52
4.3.5 Proteínas totais................................................................................................. 52
4.3.6 Marcadores de dano oxidativo......................................................................... 53
I. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)......................................... 53
II. Proteína carbonilada............................................................................................ 54
4.3.7 Zimografia........................................................................................................ 55
4.3.8 Análise histológica e morfométrica.................................................................. 56
4.4 Experimento 3: Análise dos efeitos protetores do pré-tratamento prolongado
com licopeno em camundongos eutanasiados 12 horas após intoxicação por
paracetamol................................................................................................................
56
4.4.1 Animais............................................................................................................. 56
4.4.2 Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade......................... 57
4.4.3 Atividade da superóxido dismutase (SOD)....................................................... 58
4.4.4 Dosagem de citocinas....................................................................................... 59
4.4.5 Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real................................................ 60
I. Extração de RNA total............................................................................................ 60
II. Síntese do DNA complementar (cDNA)................................................................ 60
III. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores........................................................ 61
IV. Curva de eficiência dos oligonucleotídeos iniciadores....................................... 61
V. RT-PCR quantitativa em tempo real..................................................................... 61
4.5 Análise estatística................................................................................................ 62
5. RESULTADOS.................................................................................................... 63
5.1 Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre a função hepática............... 63
5.2 Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa........... 64
5.3 Efeitos da dose única de licopeno sobre os parâmetros bioquímicos de função
hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após intoxicação com
paracetamol................................................................................................................
65
Sumário
Bandeira, A.C.B.
xii
5.4 Efeitos da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no fígado de
camundongos intoxicados com paracetamol.............................................................
68
5.5 Efeitos da dose única de licopeno sobre as enzimas de defesa antioxidante no
fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.............................................
69
5.6 Efeitos da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano oxidativo no
fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.............................................
71
5.7 Efeitos da dose única de licopeno sobre a atividade da gelatinase MMP-2 no
fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.............................................
73
5.8 Efeitos da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática de
camundongos intoxicados com paracetamol.............................................................
75
5.9 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os parâmetros
bioquímicos de função hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após
intoxicação com paracetamol....................................................................................
77
5.10 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o sistema
glutationa no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.......................
79
5.11 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre enzimas de
defesa antioxidante no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol........
81
5.12 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os marcadores
de dano oxidativo no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol..........
82
5.13 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o perfil
inflamatório em camundongos intoxicados com paracetamol..................................
83
5.14 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade da
gelatinase MMP-2 no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.........
86
5.15 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a necrose
tecidual hepática de camundongos intoxicados com paracetamol............................
88
6. DISCUSSÃO......................................................................................................... 91
7. CONCLUSÕES E SUMÁRIO.............................................................................. 103
8. LIMITAÇÕES DO ESTUDO............................................................................... 105
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 106
ANEXOS................................................................................................................... 120
Lista de Tabelas
Bandeira, A.C.B.
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Espécies reativas de oxigênio radicais e não radicais.............................. 32
Tabela 2. Principais antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos......................... 33
Tabela 3. Quantidade de licopeno em frutas e vegetais.......................................... 37
Tabela 4. Quantidade de licopeno em produtos derivados do tomate..................... 37
Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise qRT-PCR......... 61
Tabela 6. Parâmetros bioquímicos séricos.............................................................. 67
Tabela 7. Parâmetros bioquímicos séricos.............................................................. 78
Tabela 8. Razão da expressão de mRNA................................................................ 85
Tabela 9. Tabela comparativa dos efeitos do licopeno nos experimentos 2 e 3...... 104
Lista de Figuras
Bandeira, A.C.B.
14
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Metabolismo de xenobióticos.................................................................. 25
Figura 2. Ativação metabólica do paracetamol....................................................... 28
Figura 3. Estresse oxidativo mitocondrial e formação de peroxinitrito durante a
hepatotoxicidade induzida por APAP......................................................................
29
Figura 4. Sítios de produção fisiológica de EROs.................................................. 31
Figura 5. Mecanismos celulares de geração de oxidantes e sistema antioxidante.. 35
Figura 6. Fórmula estrutural representando as configurações all-trans e 5-cis-
licopeno....................................................................................................................
36
Figura 7. Desenho experimental representando o Experimento 1 e 2..................... 44
Figura 8. Cronologia experimental do Experimento 1............................................ 45
Figura 9. Cronologia experimental do Experimento 2............................................ 48
Figura 10. Desenho experimental representando o Experimento 3........................ 58
Figura 11. Cronologia experimental do Experimento 3.......................................... 58
Figura 12. Efeitos do paracetamol sobre a função hepática.................................... 63
Figura 13. Efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa................................ 65
Figura 14. Influência da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no
modelo de overdose por paracetamol.......................................................................
69
Figura 15. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de glutationa
peroxidase e glutationa redutase no modelo de overdose por paracetamol.............
70
Figura 16. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade da catalase e
do superóxido dismutase no modelo de overdose por paracetamol.........................
71
Figura 17. Influência da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano
oxidativo no modelo de overdose por paracetamol..................................................
72
Figura 18. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de MMP-2 no
modelo de overdose por paracetamol.......................................................................
74
Figura 19. Fotomicrografia representativa e porcentagem de área de necrose
hepática......................................................................................................................
76
Figura 20. Influência da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática
no modelo de overdose por paracetamol...................................................................
77
Figura 21. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o
sistema glutationa no modelo de overdose por paracetamol....................................
80
Figura 22. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a
Lista de Figuras
Bandeira, A.C.B.
15
atividade de enzimas antioxidantes no modelo de overdose por paracetamol......... 81
Figura 23. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre
marcadores de dano oxidativo no modelo de overdose por paracetamol................
83
Figura 24. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a
atividade de CCL2 e IL-22 no modelo de overdose por paracetamol.....................
84
Figura 25. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a
atividade de MMP-2 no modelo de overdose por paracetamol................................
86
Figura 26. Fotomicrografia representativa da área de necrose hepática................. 89
Figura 27. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a
porcentagem de área de necrose no modelo de overdose por paracetamol..............
90
Lista de Abreviaturas
Bandeira, A.C.B.
16
LISTA DE ABREVIATURAS
1O2 – Oxigênio singleto
A12 – Grupo paracetamol 12 horas
A24 – Grupo paracetamol 24 horas
ABTS – Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
AINES – Anti-inflamatórios não-esteroidais
ALT – Alanina aminotransferase
APAP – N-acetil-p-aminofenol (Paracetamol)
APO10LA – Ácido apo-10’-licopenóico
ARE – Elemento de resposta antioxidante
AST – Aspartato transaminase
Bcl-2 – Proteína célula-B de linfoma 2
BCO1 – β-caroteno 15,15 oxigenase
BCO2 – β-caroteno 9,10 oxigenase
BHT – Hidroxitolueno butilado
BSA – Albumina sérica bovina
C – Grupo controle
CaCl2 – Cloreto de Cálcio
CAT – Catalase
CCL-2 – Quimiocina ligante 2 (motivo C-C)
cDNA – DNA complementar
CEUA - Comitê de ética em pesquisa no uso de animais
CT – Colesterol total
CYP – Citocromo
DAMP – Padrões moleculares associados ao dano
DEPEC – Dietil pirocarbonato
DILI – Lesão hepática induzida por droga
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DNPH – 2,4-Dinitrofenilhidrazina
DNTB – Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
dNTPs – Desoxirribonucleotídeos fosfato
dT – Oligo
Lista de Abreviaturas
Bandeira, A.C.B.
17
EGTA – Ácido Bis(2- aminoetil) etilenoglicol-N,N,N',N'-tetraacético
ERNs – Espécies reativas de nitrogênio
EROs – Espécies reativas de oxigênio
FA – Frações aterogênicas
FDA – Food and Drug Administration
Fe2+ – Ferro
GCL – Glutamato cisteína ligase
GM-CSF – Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos
GPx – Glutationa peroxidase
GR – Glutationa redutase
GSH – Glutationa reduzida
GSHt – Glutationa total
GSSG – Glutationa oxidada
GST – Glutationa-s-transferase
H2O – Água
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
HCl – Ácido clorídrico
HDL – Lipoproteína de alta densidade
HE – Hematoxilina e eosina
HMGB1 – Proteína de alta mobilidade Box 1
HO-1 – Heme oxigenase-1
HOCl – Ácido hipocloroso
IGF-1 – Fator de crescimento insulina símile 1
IL-10 – Interleucina 10
IL-1β – Interleucina 1-beta
IL-22 – Interleucina 22
IL-4 – Interleucina 4
IL-6 – Interleucina 6
IL-8 – Interleucina 8
INFγ – Interferon gamma
IκB – Inibidor do kappa B
JNK – c-Jun N-terminal kinase
KCl – Cloreto de potássio
Lista de Abreviaturas
Bandeira, A.C.B.
18
L10+A12 – Grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h
L10+A24 – Grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 24 h
L100+A12 – Grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h
L100+A24 – Grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h
LDL – Lipoproteína de baixa densidade
LPS – Lipopolissacarídeo
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógenos
M-CSF – Fator estimulador de colônia de macrófagos
MgCl2 – Cloreto de magnésio
MMP-2 – Metaloproteinase de matriz 2
MTT – Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio]
NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADP – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NAN3 – Ázida de sódio
NaOH – Hidróxido de sódio
NAPQI – N-acetil-p-benzoquinona imina
NFR2 – Fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2
NFκB – Fator nuclear kappa B
NK – Natural killer
NKT – Célula T natural killer
NO – Óxido nítrico
O – Grupo óleo
O2 – Oxigênio molecular
O2˙ˉ – Radical superóxido
O3 – Ozônio
OH˙– Radical hidroxila
ONOOˉ – Peroxinitrito
ONOOH˙ – Ácido peroxinitroso
PBS – Tampão fosfato salino
PTP – Proteínas tirosina fosfatase
qPCR – Reação de cadeia de polimerase em tempo real
RNA – Ácido ribonucléico
Lista de Abreviaturas
Bandeira, A.C.B.
19
RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro
RO˙– Radical alcoxila
ROO˙ – Radical peroxila
RT-PCR – Transcriptase reversa-reação em cadeia de polimerase
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
SOD – Superóxido dismutase
SR-B1 – Receptor scavenger classe B tipo 1
SSA – Ácido sulfossalicílico
STAT3 – Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3
TBA – Ácido tiobarbitúrico
TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
Tc – Célula T citotóxica
TC – Threshold cycle
TCA – Ácido tricloroacético
TEA – Trietanolamida
TGFβ – Fator de crescimento e transformação beta
Th1 – Célula T helper 1
Th17 – Célula T helper 17
Th22 – Célula T helper 22
TNB – 5-tio-2-nitrobenzóico
TNF-α – Fator de necrose tumoral - alfa
Tx1 – Tioredoxina
UI – Unidades internacionais
VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade
Resumo
Bandeira, A.C.B.
20
RESUMO
O uso do paracetamol (APAP), um fármaco com efeitos antipiréticos e analgésicos, é a
principal causa de lesão hepática induzida por drogas. O modelo de lesão hepática induzida
por APAP é um dos modelos mais populares para testar potenciais agentes hepatoprotetores.
O licopeno é um carotenóide com alto poder antioxidante e, atualmente, vem sendo
amplamente estudado na prevenção de doenças. Estudos já demonstraram que o licopeno é
capaz de atuar modulando a expressão de enzimas do sistema citocromo P450 (CYP450) e
também a atividade de enzimas antioxidantes, ambas as vias relacionadas à inflamação
induzida pelo APAP. O presente estudo teve como objetivo estabelecer o modelo de
hepatotoxicidade induzida por APAP em camundongos e após o estabelecimento do modelo,
analisar os efeitos do pré-tratamento com o licopeno sobre a função e estrutura hepática de
camundongos intoxicados com APAP. Foram utilizados camundongos C57BL/6 machos e, no
Experimento 1, a eutanásia ocorreu 3, 6, 12 e 24 horas após a overdose de APAP (500 mg/kg,
dose única). No Experimento 2, os camundongos receberam as doses únicas (10 e 100 mg/kg)
de licopeno e foram eutanasiados 12 e 24 após a overdose de APAP. Finalmente, no
Experimento 3, os camundongos foram pré-tratados por 14 dias consecutivos com as doses de
licopeno (10 e 100 mg/kg) e posteriormente eutanasiados 12 horas após a overdose de APAP.
O Experimento 1 estabeleceu o modelo de intoxicação, onde observou-se a elevação das
enzimas ALT e AST, sendo que o pico do desequilíbrio redox ocorreu 12 horas após a
overdose, com a depleção do conteúdo de glutationa em sua forma reduzida (GSH). O
Experimento 2 mostrou que o licopeno regulou a GSH e a GSSG (glutationa oxidada),
reduziu o dano oxidativo sugerido pela diminuição principalmente da carbonilação de
proteínas, promoveu a redução da atividade de MMP-2 e reduziu as áreas de necrose hepática.
O Experimento 3 mostrou que o licopeno foi capaz de melhorar o desequilíbrio redox,
diminuindo a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas e aumentando a atividade da
CAT e o conteúdo de GSH. Ainda, diminuiu a expressão do RNAm de IL-1β e a atividade de
MMP-2. Sendo assim, observamos em nosso estudo que o licopeno foi capaz de melhorar os
biomarcadores de estresse oxidativo causados pela intoxicação por APAP em camundongos
C57BL/6.
Palavras-chave: Paracetamol; APAP; Estresse oxidativo; Hepatotoxicidade; Licopeno;
Antioxidante
Abstract
Bandeira, A.C.B.
21
ABSTRACT
The use of acetaminophen (APAP), a drug with antipyretic and analgesic effects, is the main
cause of drug-induced liver injury. The APAP-induced liver injury model is one of the most
popular models to test potential hepatoprotective drugs. Lycopene is a carotenoid with high
antioxidant properties and currently has been widely studied in the prevention of diseases.
Studies have shown that lycopene can act by modulating the expression of cytochrome P450
system (CYP450) and also the activity of antioxidant enzymes, both pathways related to
inflammation induced APAP. This study aimed to establish the model of APAP-induced liver
injury in mice and, after that, to analyze the effects of the lycopene pretreatment in mice after
APAP overdose. Male C57BL/6 mice were used. In Experiment 1, euthanasia occurred 3, 6,
12 and 24 hours after APAP overdose (500 mg/kg, single dose). In Experiment 2, mice
received single doses (10 and 100 mg/kg) of lycopene and were euthanized 12 and 24 hours
after APAP overdose. Finally, in Experiment 3, mice were pre-treated for 14 consecutive days
with the doses of lycopene (10 and 100 mg/kg) and then euthanized 12 hours after APAP
overdose. The Experiment 1 established the hepatotoxicity model and it was observed the
elevation of ALT and AST enzymes. It was observed that the peak of the redox imbalance
occurred 12 hours after the overdose, showing GSH depletion. Experiment 2 showed that
lycopene regulated GSH, GSSG and CAT activity, reduced oxidative damage by decreasing
mainly protein carbonylation, caused a decrease in MMP-2 activity and reduced areas of liver
necrosis in C57BL/6 mice. Experiment 3 showed that lycopene has been able to improve the
redox imbalance, reducing lipid peroxidation and protein carbonylation and increasing the
activity of CAT and the content GSH. Also, decreased mRNA expression of IL-1β and MMP-
2 activity. Lycopene is a natural compound able to ameliorates the damage caused by APAP
overdose in C57BL/6 mice.
Keywords: Antioxidant; APAP; Oxidative stress; Hepatotoxicity; Lycopene; Acetaminophen
Introdução
Bandeira, A.C.B.
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1. INTRODUÇÃO
O fígado é um órgão essencial para a manutenção do metabolismo corporal. Ele tem
estreita relação com o sistema imune inato auxiliando na remoção de estímulos nocivos. A
inflamação do fígado surge a partir de quaisquer agentes exógenos, tais como toxinas
ambientais ou a exposição a espécies reativas de oxigênio (EROs) endógenas (Lam et al.,
2016). Portanto, ele é particularmente suscetível a agressões e, a gravidade da lesão hepática
induzida por substâncias químicas varia entre pequenas modificações na estrutura e função
desse órgão à lesões agudas, cirrose e tumores malignos, no casos mais graves (Gu e
Manautou, 2012).
O organismo é constantemente exposto a uma variedade de xenobióticos (substâncias
químicas que não são produzidas normalmente pelo organismo) e, muitos deles são
conhecidos por serem potencialmente hepatotóxicos (Iovdijová e Bencko, 2010).
A utilização do paracetamol (APAP), um fármaco de efeito antipirético e analgésico
(Hinson et al., 2010), é a principal causa da falência hepática aguda nos EUA e em outras
nações ocidentais (Sarges et al., 2016). O APAP, especificamente, é responsável por 80.000
atendimentos de emergência, 2.500 hospitalizações e 500 intoxicações fatais nos EUA,
anualmente (Mühl, 2016). Um estudo analisou, entre os anos de 2005 e 2007, países europeus
selecionados e, foram encontrados documentados 114 casos de falência hepática aguda
relacionados à overdose de drogas que demandaram transplante (de um total de 600 casos).
Noventa e sete por cento (97 %) desses foram causados pelo APAP (111 casos) (Gulmez et
al., 2015). Na Alemanha, 850 internações por ingestão de APAP foram registradas em 2012
em pacientes com seguro de saúde (Mühl, 2016). A ingestão de APAP com concomitante
lesão hepática pode ser de caráter intencional (por tentativa de suicídio) ou acidental (por
exemplo, por ingestão do medicamento inadvertidamente durante dias seguidos (Licata,
2016).
O APAP é metabolizado pelo sistema citocromo P450 (CYP450) formando um
metabólito reativo, o N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI). O NAPQI é detoxificado pela
glutationa (GSH), causando sua depleção. Consequentemente, o NAPQI se liga
covalentemente a proteínas celulares, principalmente as proteínas mitocondriais, levando a
lesão hepática (Saito et al., 2010; Jaeschke et al., 2011). Portanto, a overdose por APAP
Introdução
Bandeira, A.C.B.
23
desencadeia a ativação de cascatas de sinalização celular e o estabelecimento do estresse
oxidativo.
Diversas pesquisas vêm utilizando o modelo experimental de intoxicação por APAP a
fim de estudar novos compostos. Logo, esse modelo de toxicidade tornou-se um dos métodos
mais populares para o estudo de potenciais agentes hepatoprotetores, especialmente de alguns
produtos naturais (Jaeschke et al., 2011).
O efeito protetor de alguns alimentos naturais é atribuído à presença de compostos
fitoquímicos como carotenóides, tocoferóis e polifenóis, os quais possuem propriedades
antioxidantes (D'angelo et al., 2009). Um importante carotenóide que não possui atividade
pró-vitamina A, é o licopeno.
Atualmente, o licopeno vem sendo amplamente estudado, principalmente em relação
às suas características preventivas. Hoje, sabe-se que ele tem ótimas respostas frente às
doenças crônicas. Sua ação foi descrita e bem estabelecida em estudos de câncer de próstata
(Giovannucci, 1999; Ono et al., 2015; Wang et al., 2015) e doenças cardiovasculares (Rao,
2002; Jacques et al., 2013; Vilahur et al., 2015). Apesar de seus efeitos benéficos, ainda há
controvérsias quanto ao seu mecanismo de ação. Acredita-se que ele possa atuar modulando
as junções comunicantes (gap juctions), os hormônios, o sistema imune e diferentes vias
metabólicas, porém o que mais se destaca na literatura são as suas ações antioxidantes (Di
Mascio et al., 1989; Giovannucci, 1999; Rao, 2002).
Escolhemos trabalhar com o licopeno por esse ser um composto comum na dieta e
também o carotenóide com maior atividade antioxidante, capaz de neutralizar espécies
reativas. Estudos já demonstraram que o licopeno é capaz de atuar inibindo a expressão de
enzimas do sistema CYP450 e também aumentando a atividade de enzimas antioxidantes,
ambas as vias relacionadas à inflamação induzida pelo APAP (Palozza et al., 2012).
Revisão Bibliográfica
Bandeira, A.C.B.
24
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. O fígado e o metabolismo de xenobióticos
O fígado não é apenas um órgão que participa dos processos digestórios, ele é um
órgão essencial para a manutenção do metabolismo corporal, sendo responsável por funções
vitais como: o metabolismo e a detoxificação de xenobióticos (substâncias químicas que não
são produzidas normalmente pelo organismo), o metabolismo da glicose, a síntese de
hormônios, a síntese e a degradação de proteínas plasmáticas e também participa da regulação
do sistema imune (Nemeth et al., 2009).
Ele é particularmente susceptível a agressões, pois é um dos primeiros órgãos a
manter contato com substâncias ingeridas oralmente como, por exemplo, bebidas alcoólicas,
fármacos, entre outros (Gu e Manautou, 2012), por isso, também é conhecido como sendo a
primeira linha de defesa contra micro-organismos e toxinas que atravessam a barreira
intestinal (Ramaiah e Jaeschke, 2007).
Neste sentido, sabe-se que o organismo é constantemente exposto a uma variedade
de xenobióticos e muitos deles são conhecidos por serem potencialmente hepatotóxicos
(Iovdijová e Bencko, 2010).
A metabolização de produtos exógenos no fígado ocorre através de dois mecanismos
(Figura 1). Durante a fase 1 do metabolismo, grupos polares são adicionados às moléculas por
oxidação, redução ou hidrólise. Essas reações são catalisadas pelo sistema do CYP450, uma
família de hemoproteínas ligadas à membrana, localizadas no retículo endoplasmático liso de
hepatócitos centrolobulares. Essa enzima utiliza a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD)
ou nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) como cofatores para adicionar um
grupo reativo, como hidroxila por exemplo. Esse processo permite que esses compostos sejam
excretados, mas também pode produzir compostos reativos nocivos. Se essas moléculas não
forem metabolizadas pelas enzimas de fase 2, elas podem causar danos a proteínas, ao ácido
desoxirribonucléico (DNA) e ao ácido ribonucléico (RNA) (Walgren et al., 2005; Larson,
2007). Durante a fase 2 do metabolismo, moléculas são conjugadas com o ácido glicurônico,
sulfatos, ou GSH através das UDP-glicuronil transferases, sulfotransferases e glutationa S-
transferase (GST) (Walgren et al., 2005; Larson, 2007). Sendo assim, as enzimas de fase 2 do
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Bandeira, A.C.B.
25
metabolismo além de defenderem as células contra compostos gerados na fase 1 também
agem sobre as espécies reativas produzidas endogenamente.
Figura 1. Metabolismo de xenobióticos. Reações da fase 1 são catalizadas pelo citocromo
P450 (CYP450). Reações da fase 2 são catalisadas por várias enzimas, como UDP-
Glicuronil-transferase, sulfotransferases e glutationa-s-transferase (GST). Os metabólitos
tóxicos que são formados podem levar a lesão hepática (Adaptado de Walgren et al., 2005;
Larson, 2007).
2.2. Lesões hepáticas induzidas por drogas e o paracetamol
A lesão hepática induzida por droga (DILI – drug-induced liver injury) engloba
reações adversas a medicamentos envolvendo o fígado após a administração de xenobióticos
como um fármaco ou um fitoterápico e/ou suplemento dietético (Björnsson, 2015). As DILIs
podem ser classificadas como: intrínsecas/dose dependente ou idiossincráticas/dose
independentes. As formas idiossincráticas são consideradas, atualmente, como formas que
raramente ocorrem, porém devem sempre ser consideradas no momento do diagnóstico,
independente da presença ou não de doenças hepáticas subjacentes (Licata, 2016).
Muitos fármacos são associados às DILIs. Os antibióticos são responsáveis por mais
de 46% dos casos nos EUA (Chalasani et al., 2014). Anti-inflamatórios não esteroidais
(AINES), estatinas e fitoterápicos e/ou suplementos dietéticos também podem levar ao
desenvolvimento da DILI (Navarro et al., 2014). Mecanismos multifatoriais estão associados
ao aparecimento das DILIs, como características químicas das drogas, dose, via de
administração e duração do tratamento. Da mesma forma, existem os fatores relacionados ao
indivíduo como, por exemplo, idade, sexo, genética, episódio prévio de DILI e doença
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hepática crônica subjacente. E ainda, os fatores ambientais, como o tipo de dieta, etilismo,
tabagismo, poliquimioterapia, estado imunológico e estado nutricional (Chen et al., 2015).
Quase todas as classes de drogas podem estar envolvidas no desenvolvimento da
DILI. O paracetamol (N-acetil-p-aminofenol, acetaminofeno, APAP) representa um dos
melhores exemplos de DILI preditiva (Licata, 2016).
O APAP é um fármaco analgésico e antipirético amplamente utilizado para o alívio
de dores e redução da febre. Foi primeiramente prescrito em 1955 e, subsequentemente,
aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em 1960. Normalmente, o APAP é
seguro quando consumido nas doses prescritas (1-4 g por dia). Em adultos, doses únicas de
mais de 10 a 15 g levam a lesão hepática severa ou fatal, secundária à necrose hepática
massiva. Intoxicações desencadeadas por doses terapêuticas também podem ocorrer em
determinadas condições fisiológicas e ambientais, como alcoolismo, idade, condições
nutricionais, doença hepática pré-existente, genética do indivíduo, entre outros (Larson,
2007).
Em 1966, Davidson e Eastham foram os primeiros a descrever o APAP como sendo
hepatotóxico em overdose. Muitos outros casos de overdose foram relatados desde então
(Davidson e Eastham, 1966).
Em janeiro de 2014, a FDA emitiu um comunicado recomendando a interrupção do
uso de APAP acima de 325 mg quando em combinação com outro fármaco (Toska et al.,
2014).
Em humanos, a overdose de APAP inicia-se com sintomas de náuseas e vômitos
dentro de 2 a 3 horas após a ingestão do medicamento, seguidos por dor abdominal. A injúria
hepática ocorre dentro das primeiras 24 horas, alcançando seu pico máximo em 3 a 4 dias.
Ocorre aumento nos níveis sorológicos de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
transaminase (AST), hiperbilirrubinemia e alguns pacientes podem desenvolver
nefrotoxicidade além da hepatotoxicidade (Hinson et al., 2010).
A hepatotoxicidade também pode ser observada em roedores. Os ratos demonstram
certa resistência, ao contrário de camundongos e hamsters que são modelos experimentais
extremamente sensíveis. Histologicamente, pode ser observada a perda de glicogênio e a
vacuolização de hepatócitos centrolobulares nas primeiras 2 horas, modificações nucleares e
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células picnóticas na região centrolobular em 3 horas e vasta necrose na mesma região em 6
horas. Sabe-se que, nesse modelo, as células morrem majoritariamente por necrose. O número
de células com características morfológicas que determinam a apoptose é inferior a 1% em
todo o parênquima e os níveis de caspase 3 não se encontram aumentados em fígado de
camundongos intoxicados com APAP (Malhi et al., 2006; Kon et al., 2007).
No organismo, cerca de 80% a 90% do APAP administrado é metabolizado por meio
da via de conjugação. Dois terços são metabolizados através da glicoronidação (UDP-
glicoruniltransferases) e um terço é metabolizado através da sulfatação (sulfotransferases). Os
conjugados inativos não-tóxicos são amplamente excretados pela urina e pela bile. Uma
pequena fração é metabolizada pelo sistema CYP450, principalmente pelas isoformas
CYP2E1 e CYP1A2, formando um metabólito reativo, o NAPQI. O NAPQI é conjugado e
detoxificado pela GSH e, posteriormente, excretado pela urina como ácido mercaptúrico e
conjugados de cisteína (Figura 2).
Doses terapêuticas de APAP resultam em pequenas quantidades de NAPQI que são
facilmente detoxificadas pela GSH. Doses excessivas de APAP levam à saturação das vias do
ácido glicurônico e do sulfato, sobrecarregando o sistema CYP.
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Figura 2. Ativação metabólica do paracetamol (APAP) (Adaptado de Jaeschke et al., 2011).
Após uma overdose de APAP, o excesso de NAPQI formado leva à depleção da
GSH. Consequentemente, o NAPQI se liga covalentemente a proteínas celulares,
principalmente as proteínas mitocondriais, levando a uma disfunção mitocondrial,
caracterizada pela formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e peroxinitrito, dano ao
ácido desoxirribonucléico (DNA) mitocondrial, liberação de proteínas mitocondriais
intermembrana, que translocam-se para o núcleo, causando a fragmentação do DNA nuclear e
culminando na abertura dos poros de transição mitocondriais e no colapso do potencial de
membrana (Figura 3) (Larson, 2007; Saito et al., 2010; Jaeschke et al., 2011). A morte celular
por necrose é desencadeada em meio à ativação das cascatas de sinalização celular e o
estabelecimento do estresse oxidativo.
Sabe-se que a overdose por APAP causa estresse oxidativo com concomitante
inflamação. As células necróticas liberam padrões moleculares associados ao dano (DAMPs)
que induzem a liberação de citocinas e quimiocinas pelas células de Kupffer e outras células
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Bandeira, A.C.B.
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imunes inatas que, consequentemente, levam a ativação e ao recrutamento de células
inflamatórias (Adams et al., 2010; Jaeschke e Ramachandran, 2011; Krenkel et al., 2014).
Está envolvida nessa sinalização uma grande quantidade de citocinas e quimiocinas como, por
exemplo, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, CCL2, CCL5, CXCL1, CXCL8, IL-10 entre outras
(Krenkel et al., 2014)
Figura 3. Estresse oxidativo mitocondrial e formação de peroxinitrito durante a
hepatotoxicidade induzida por paracetamol (APAP)(Adaptado de Jaeschke et al., 2011).
2.3. Estresse oxidativo
O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a quantidade de
oxidantes e antioxidantes (Sies e Cadenas, 1985). Essa definição criada por Helmut Sies, em
1985, foi muito importante durante duas décadas para o desenvolvimento de pesquisas nessa
área, porém Jones, em 2006, propôs uma definição mais atual, classificando-o como uma
perturbação do controle e da sinalização redox. Este desequilíbrio vem sendo relacionado com
diferentes quadros patológicos (Jones, 2006). Atualmente, sabe-se que a atividade de muitas
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proteínas envolvidas na sinalização celular são reguladas pelo estado redox de seus resíduos
tióis oxidáveis que atuam como alvos moleculares redox-sensíveis (Ray et al., 2012). O
estresse oxidativo, portanto, também pode ocorrer na ausência de danos estruturais diretos. A
interrupção dos circuitos redox, que regulam muitas vias de sinalização, também caracterizam
o estresse oxidativo (Jones e Go, 2010).
O estresse oxidativo é um evento intimamente relacionado à presença de radicais
livres. Um radical livre é qualquer espécie que contém um ou mais elétrons desemparelhados
em sua última camada. Devido a esta característica, os radicais livres são altamente reativos e
instáveis, podendo atacar alvos celulares diversos (proteínas, fosfolipídeos de membrana e
ácidos nucléicos) com o objetivo de estabilizarem sua estrutura molecular. Há uma ampla
variedade dessas moléculas nos seres vivos, porém nem todas são radicais. Dessa forma, tem
sido utilizada a denominação EROs como um termo coletivo que inclui não apenas radicais de
oxigênio, mas também algumas espécies não-radicalares derivadas do oxigênio, como o
peróxido de hidrogênio, ácido hipocloroso e ozônio (Tabela 1) (Halliwell e Gutteridge, 2007).
O oxigênio molecular (O2) é uma molécula fundamental para a sobrevivência de
organismos aeróbios, sendo necessária durante diversos processos vitais como: respiração
celular, produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização
intracelular e síntese de substâncias biológicas. Ao mesmo tempo, é uma molécula capaz de
gerar substâncias tóxicas a nível intracelular e extracelular (Circu e Aw, 2010; Jaeschke et al.,
2012).
A redução molecular do O2 resulta na formação de EROs, incluindo o ânion
superóxido, o peróxido de hidrogênio e os radicais hidroxila (Figura 5). Portanto, a
mitocôndria é uma importante fonte intracelular de EROs (Figura 4). Do total mitocondrial de
O2 consumido, 1 a 2% é desviado para a formação destas espécies, principalmente a nível do
complexo I e III da cadeia respiratória (Circu e Aw, 2010; Jaeschke et al., 2012; Mello et al.,
2016). Porém, as EROs não são formadas apenas durante o processo de respiração celular.
Espécies reativas também podem ser geradas pela mieloperoxidase a partir do peróxido de
hidrogênio, originando o ácido hipocloroso e pela peroxidação lipídica, que produz
hidroperóxidos lipídicos e os radicais alcoxila. A combinação de dois radicais, superóxido e
óxido nítrico, resulta na formação de peroxinitrito, uma espécie reativa de nitrogênio (ERN)
(Jaeschke et al., 2012; Mello et al., 2016).
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As EROs também são formadas pelo CYP450 e suas redutases, bem como a partir de
oxidases no interior das células, como por exemplo, as oxidases lipídicas nos peroxissomos
(Figura 4). Em condições patológicas, oxidases adicionais podem ser ativadas e tornar-se uma
origem de EROs, como a xantina oxidase e a NADPH oxidase. Essa última está presente em
fagócitos e é responsável por liberar ânion superóxido no interior do fagossoma ou fora da
célula quando os fagócitos estão ativados. Certas drogas podem ser reduzidas pelas enzimas
do CYP450 e formar radicais instáveis, que ao transferirem seus elétrons para o O2 formam o
radical superóxido. Portanto, existe um grande número de origens de EROs e ERNs em
diferentes locais, intracelulares e extracelulares (Jaeschke et al., 2012; Mello et al., 2016).
Várias fontes endógenas de EROs e ERNs contribuem para a carga oxidante total. Fontes
exógenas incluem, por exemplo, a exposição à radiação ionizante e não ionizante, poluição
atmosférica e gases tóxicos (Lykkesfeldt, 2007).
Figura 4. Sítios de produção fisiológica de espécies reativas de oxigênio (EROs). EROs
formadas nas membranas plasmáticas desativam PTPs (Proteínas tirosina fosfatase) e
permitem a transdução de sinais (por exemplo, pela insulina ou fator de crescimento
insulina-símile 1[IGF-1]) após a ativação do receptor de tirosina-quinase. A mitocôndria
produz EROs durante a respiração celular e a atividade metabólica. EROs são produzidas no
retículo endoplasmático durante o dobramento da proteína e detoxificação pelo sistema do
citocromo P450 (CYP450). Os lisossomos são necessários para o metabolismo do ferro e a
remoção de componentes celulares danificados por autofagia. Peroxissomos produzem EROs
durante atividades metabólicas ou de detoxificação (Adaptado de Mello et al., 2016).
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Sabe-se que o excesso de espécies reativas é prejudicial às estruturas celulares,
podendo promover alterações nos componentes lipídicos, protéicos e no DNA. Logo, os seres
aeróbios desenvolveram um complexo sistema antioxidante para controlar essas reações e
reparar os danos causados à maquinaria biológica.
2.3.1 Sistema antioxidante
A exposição a uma ampla variedade de origens de EROs e ERNs levou o organismo a
desenvolver uma série de mecanismos de defesa (Cadenas, 1997). Portanto, esses mecanismos
de defesa contra o estresse oxidativo envolvem diversas etapas: mecanismos preventivos,
mecanismos de reparo, mecanismos de defesa física e defesas antioxidantes (Valko et al.,
2007).
O organismo aeróbio conta com um complexo sistema de substâncias especializadas
em neutralizar as espécies reativas formadas, os antioxidantes.
Antioxidante é qualquer substância que presente em baixas concentrações quando
comparada a do substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira
eficaz (Halliwell e Gutteridge, 1991). Logo, os antioxidantes são importantes na manutenção
do status redox fisiológico.
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Os antioxidantes podem ser enzimáticos ou não enzimáticos. Alguns exemplos são
apresentados na tabela a seguir (Valko et al., 2006; Valko et al., 2007):
Tabela 2. Principais antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos.
ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS E NÃO-ENZIMÁTICOS.
Antioxidantes Enzimáticos Antioxidantes não-enzimáticos
Superóxido Dismutase (SOD) Ácido ascórbico (Vitamina C)
Glutationa Peroxidase (GPx) α-tocoferol (Vitamina E)
Catalase (CAT)
Antioxidantes Tiols (Glutationa,
Tioredoxina, Ácido lipóico)
Carotenóides
Flavonóides e outros Fonte: (Valko et al., 2006; Valko et al., 2007)
Alguns antioxidantes são de origem endógena e outros são de origem exógena,
provenientes da alimentação ou de suplementos. O melhor exemplo de antioxidantes
endógenos é o sistema de defesa antioxidante primário, composto por três importantes
enzimas que previnem a formação e promovem a neutralização de espécies reativas: a
glutationa peroxidase (GPx), que promove a redução de peróxidos, a catalase (CAT), que
converte peróxido de hidrogênio em água e O2 e a superóxido dismutase (SOD), que converte
o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio. O organismo ainda conta com outras
substâncias antioxidantes endógenas como, por exemplo, o sistema glutationa. A glutationa
possui um papel fundamental na prevenção contra o estresse oxidativo e na eliminação e
biotransformação de xenobióticos. É um tripeptídeo altamente abundante no meio
intracelular, formado pelos aminoácidos glutamato, cisteína e glicina. Sua atividade se
expressa pela redução das EROs e conseqüente oxidação da GSH a glutationa oxidada
(GSSG). Para que esse ciclo catalítico da GSH seja mantido, a atividade de três enzimas é
fundamental: a glutationa oxidase (GO), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase
(GR). GO e GPx catalisam a oxidação de GSH a GSSG e, a GR promove a regeneração da
GSH, a partir da GSSG, na presença de NADPH. A regulação do desequilíbrio redox baseia-
se na atividade de sistemas contra as EROs, o que envolve a GSH e as enzimas relacionadas
(Huber e Almeida, 2008).
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Por outro lado, defesas antioxidantes exógenas, como vitaminas e alguns minerais
também auxiliam nesse sistema. Exemplo de antioxidantes exógenos são os carotenóides.
Esses são um grupo de pigmentos naturais sintetizados por plantas e micro-organismos
(Rahman, 2007; Carocho e Ferreira, 2013).
Algumas defesas antioxidantes são extremamente importantes, pois representam uma
remoção direta de substâncias pró-oxidantes, promovendo o máximo de proteção para os
sistemas biológicos. Um bom antioxidante deve ter as seguintes características:
I- Eliminar os pró-oxidantes de maneira específica;
II- Quelar metais redox;
III- Interagir com outros antioxidantes (regenerar) dentro de uma “rede de
antioxidantes”;
IV- Ter efeito positivo na expressão gênica;
V- Ser facilmente absorvido;
VI- Ter uma concentração fisiológica relevante em tecidos e biofluidos;
VII- Ser eficaz em ambientes aquosos e/ou domínios de membrana (Valko et al., 2006).
Os antioxidantes atuam através de três diferentes mecanismos moleculares. No
primeiro mecanismo (Equação 1), o antioxidante (AH) doa um único elétron ao radical livre
(R˙). Durante esse processo de transferência de elétron, o caráter radical é transferido para o
antioxidante, formando um radical derivado de antioxidante, um radical menos reativo (A˙)
(Cadenas, 1997). O α-tocoferol, por exemplo, atua através desse mecanismo, formando o
radical α-tocoferoxil, que é recuperado à α-tocoferol pelo ácido ascórbico (Willson et al.,
1985)
AH + R˙ → A˙ +RH (Equação 1)
No segundo mecanismo, ocorre também transferência do caráter radical, porém com a
formação de um radical derivado de antioxidante estável ou inerte. Um exemplo desse
mecanismo ocorre com os radicais nitrona traps, que formam um aduto estável (Equação 2)
(Cadenas, 1997)
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(Equação 2)
Por fim, no terceiro mecanismo, pequenas moléculas antioxidantes atuam
mimetizando a ação de enzimas. Nitróxidos e aminoxils são miméticos da SOD que atuam
catalizando a dismutação do ânion superóxido (Equação 3 e 4) (Krishna et al., 1992; Krishna
et al., 1996)
(Equação 3)
(Equação 4)
Figura 5. Mecanismos celulares de geração de oxidantes e sistema antioxidante
(Adaptado de Jaeschke et al., 2012).
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Atualmente existem diversos estudos na literatura que avaliam as características dos
carotenoides como antioxidantes exógenos. Um importante carotenóide muito presente na
nossa dieta e que vêm sendo amplamente estudado é o licopeno.
2.4. Licopeno
Atualmente, mais de 700 carotenóides foram descritos na natureza e desses, 50
variedades tornaram-se presentes na dieta humana. Os mais importantes incluem: β-caroteno,
α-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina, β-criptoxantina, α-criptoxantina, γ-caroteno,
neurosporeno, ζ-caroteno, fitoflueno e fitoeno (Fiedor e Burda, 2014).
O licopeno é um composto pertencente à família dos carotenóides, responsável pela
cor vermelha de muitas frutas e vegetais. Seu grande representante é o tomate (Lycopersicum
esculentum) (Tabela 3 e 4). O licopeno é um hidrocarboneto altamente insaturado de cadeia
linear contendo 13 ligações duplas, sendo onze ligações duplas conjugadas linearmente e duas
ligações duplas não conjugadas. Apresenta um peso molecular de 536,9 g/mol e uma absorção
máxima de 470 nm. As duplas ligações podem existir na configuração trans e cis (Figura 6).
All-trans, 5-cis, 9-cis, 13-cis e 15-cis são as formas isoméricas mais comumente identificadas
(Rao et al., 2006). A configuração all-trans é encontrada no tomate in natura, porém a
molécula é susceptível a isomerização durante processamentos alimentícios (exposição ao
calor, luz, ácidos e oxigênio). Ainda, quando ingerido, o licopeno tende a se transformar na
forma mais bioativa cis (Rao e Rao, 2007; Friedman, 2013; Fiedor e Burda, 2014). A
conversão da forma isomérica do licopeno all-trans, presente nos tomates crus, para a forma
isomérica cis é relevante, visto que a forma cis apresenta maior biodisponibilidade. Em
relação à estabilidade dos isômeros do licopeno, sabe-se que a forma 5-cis é a mais estável
seguida, imediatamente, das formas all-trans, 9-cis, 13-cis, 15-cis, 7-cis e 11-cis (Nguyen e
Schwartz, 1998).
Figura 6. Fórmula estrutural representando as configurações all-trans e 5-cis-licopeno
(Adaptado de Friedman, 2013).
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Tabela 3. Quantidade de Licopeno em frutas e vegetais
Quantidade de Licopeno
(mg/100g de peso úmido) Origem
0,7 – 20 Tomates frescos
3,7 Tomates cozidos
2,3 – 7,2 Melancia fresca
2,0 – 5,3 Mamão fresco
5,2 – 5,5 Goiaba vermelha fresca
0,4 – 3,4 Uva rosa
0,01 – 0,05 Damasco Fonte: (Rao e Rao, 2007)
Tabela 4. Quantidade de licopeno em produtos derivados do tomate
Quantidade de Licopeno
(mg/100g) ± Desvio Padrão Origem
9,27 ±1,02 Tomates crus
17,23±2,18 Ketchup
15,99±0,90 Molho de espaguete
55,45±4,33 Extrato de tomate
16,67 Purê de tomate
17,98±1,47 Molho de tomate Fonte: (Rao e Rao, 2007)
A absorção do licopeno pela mucosa intestinal é auxiliada pela formação de micelas
lipídicas e de ácidos biliares. Acreditava-se que o licopeno fosse absorvido nas células da
mucosa intestinal por difusão passiva (Boileau et al., 2002), porém, estudos recentes indicam
a participação de um processo ativo via receptor scavenger classe B tipo 1 (SR-B1). Esse
receptor é encontrado no intestino delgado de humanos, bem como no fígado, glândulas
supra-renais, ovários, placenta, rins, próstata e cérebro. Portanto, SR-B1 pode ser
parcialmente responsável pelo transporte de carotenóides a partir de lipoproteínas para os
tecidos e dos tecidos para lipoproteínas (Wang, 2012). Após a sua absorção, o licopeno é
clivado principalmente pela enzima β-caroteno 9,10 oxigenase (BCO2) e em menor ou quase
nenhuma atividade pela enzima β-caroteno 15,15 oxigenase (BCO1), formando metabólitos
ou sendo incorporado em quilomícrons, que são secretados no sistema linfático e
transportados para o fígado. O licopeno é então transportado por lipoproteínas no plasma para
ser distribuído a outros órgãos (Boileau et al., 2002; Wang, 2012). As concentrações mais
elevadas de licopeno são encontradas nos testículos, glândulas supra-renais, fígado e próstata
(Rao e Agarwal, 2000).
Revisão Bibliográfica
Bandeira, A.C.B.
38
Em humanos, a absorção do licopeno é em torno de 10 a 30% do que foi ingerido,
sendo o restante excretado pelas fezes e urina. Muitos fatores biológicos e do estilo de vida do
indivíduo afetam a absorção do licopeno incluindo idade, sexo, status hormonal, massa
corporal, níveis lipídicos sanguíneos, tabagismo, etilismo e a presença de outros carotenóides
no alimento consumido (Stahl e Sies, 1992; Rao e Agarwal, 2000).
O licopeno é o carotenóide mais predominantemente encontrado no plasma humano,
com um tempo de meia vida de 2 a 3 dias segundo estudos de Stahl e Sies (Stahl e Sies,
1996). Porém sabe-se que o tempo de meia vida varia de acordo com a forma isomérica
presente. No plasma humano, o licopeno encontra-se como uma mistura de formas
isoméricas, sendo encontrados 50% na forma cis (Rao e Agarwal, 2000). Análises da
quantidade de licopeno sérico e tecidual mostraram a presença do isômero cis em modelos
experimentais alimentados predominantemente com a forma all-trans do licopeno, mostrando
que a conversão também ocorre após a ingestão do alimento (Jain et al., 1999).
O licopeno é um composto altamente lipossolúvel que se organiza na parte interna da
bicamada lipídica das membranas celulares. Acredita-se que essa característica do licopeno de
incorporar-se a membrana celular seja um fator importante na proteção contra as EROs (Rao e
Rao, 2007; Friedman, 2013; Fiedor e Burda, 2014).
Quanto à segurança do composto para os seres humanos, diversos estudos já foram
realizados. Em estudo de Mellert et al., duas origens de licopeno sintético da BASF, lycopene
10 CWD e lycovit 10%, cada um contendo aproximadamente 10 % de licopeno, foram
testados em ratos. Após ingestão do produto por 13 semanas com uma ingesta diária superior
a 3000 mg/kg, nenhum efeito adverso foi observado (Mellert et al., 2002). McClain e Bausch
publicaram um estudo utilizando o licopeno sintético e nenhum efeito teratogênico foi
observado em duas gerações de ratos estudadas. A deposição do licopeno nos tecidos
corporais também não apresentou efeitos adversos (Michael Mcclain e Bausch, 2003). Em
consideração as inúmeras pesquisas realizadas avaliando a segurança da ingestão do licopeno
para o consumo humano, a FDA dos EUA concedeu ao licopeno o status de seguro como um
suplemento nutricional, classificando-o como uma substância bem tolerada (Rao et al., 2006;
Holzapfel et al., 2013).
Estudos recentes sugerem que uma dieta rica em licopeno é capaz de reduzir os riscos
de doenças graves como o câncer (Giovannucci, 1999; Ono et al., 2015; Wang et al., 2015) e
Revisão Bibliográfica
Bandeira, A.C.B.
39
doenças cardiovasculares (Rao, 2002; Jacques et al., 2013; Vilahur et al., 2015). Muitos
mecanismos são atribuídos aos seus benefícios, como a modulação das junções comunicantes
(gap juctions), dos hormônios, do sistema imune e das vias metabólicas, porém acredita-se
que suas potentes propriedades antioxidantes estão primariamente envolvidas na prevenção de
algumas doenças. É o carotenóide de maior eficiência na supressão do oxigênio singleto (1O2),
sendo duas vezes mais potente que o β-caroteno e 10 vezes mais potente que o α-tocoferol
(Di Mascio et al., 1989). Além disso, ele parece intervir em reações iniciadas por radicais
livres, como o radical hidroxila e os radicais peróxidos. O licopeno atua sobre o 1O2 como na
equação 5 (Holzapfel et al., 2013).
1O2 + LYC → 3O2 + 3LYC
3LYC → LYC + calor (Equação 5)
A molécula de licopeno ganha o excedente de energia atingindo o estado tripleto, que
é perdido através de interações vibracionais e rotatórias com o solvente, resultando na
liberação de energia através de calor. Uma única molécula de licopeno pode extinguir cerca
1000 moléculas de 1O2 (Holzapfel et al., 2013).
Alguns estudos relatam que os carotenóides, em geral, são capazes de induzir
atividades enzimáticas associadas ao sistema do CYP450 (Palozza et al., 2012). Astorg et al.,
propuseram que o licopeno apresentou mecanismo protetor ao modular CYP2E1 em modelo
de lesão pré-neoplásica induzida por carcinógeno em fígado de ratos (Astorg et al., 1997).
Além disso, já foi visto que a administração de licopeno em ratos induziu a atividade de
isoformas de CYP (1A1/2, 2B1/2 3A) de forma dose-dependente, mostrando que esse
carotenóide, mesmo que em pequenas quantidades, pode ser relevante no metabolismo que
envolve o CYP450 (Breinholt et al., 2000).
Ainda, estudos têm demonstrado que o licopeno apresenta características anti-
inflamatórias, atuando em importantes vias de sinalização, inibindo a sinalização de JNK (c-
Jun N-terminal kinase) e NF-κB (fator nuclear kappa B) (Ip e Wang, 2014). Os
apolicopenóides, metabólitos do licopeno, mostraram-se eficientes na supressão da expressão
de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina (IL) -6 e IL-1β em adipócitos estimulados
com fator de necrose tumoral – alfa (TNF-α) (Gouranton, Aydemir, et al., 2011). Ip et al.,
demonstraram que o metabólito ácido apo-10’-licopenóico (APO10LA) na concentração de
Revisão Bibliográfica
Bandeira, A.C.B.
40
10 mg/kg na dieta foi capaz de reduzir a inflamação hepática (diminuiu focos inflamatórios,
TNF-α, IL-6, NF-κB, expressão protéica de p65 e ativação do transdutor de sinal e ativador da
transcrição 3 [STAT3]) e a tumorigênese em modelo de camundongos obesos por dieta
hiperlipídica (Ip et al., 2013).
Tendo em vista que o APAP é metabolizado pelo CYP450 e que um dos mecanismos
de hepatotoxicidade induzida por esse fármaco é a depleção de GSH com concomitante
aumento do estresse oxidativo e, sabendo das características do licopeno como um eficiente
antioxidante e possível modulador da atividade de isoformas do CYP450, nossa meta foi
verificar os possíveis efeitos protetores do licopeno em um modelo de intoxicação por APAP.
Objetivos
Bandeira, A.C.B.
41
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar o efeito protetor do licopeno no modelo de hepatotoxicidade induzida por
APAP em camundongos C57BL/6.
3.2. Objetivos específicos
Experimento 1: Análise temporal dos efeitos de uma dose tóxica do paracetamol
em camundongos.
• Em amostras de soro:
- Avaliar as enzimas hepáticas (ALT e AST) dos animais em diferentes tempos
após a intoxicação por APAP.
• Em amostras de fígado:
- Avaliar a resposta do sistema glutationa em diferentes tempos após a
intoxicação por APAP.
Experimento 2: Análise dos efeitos protetores de uma dose única de licopeno em
camundongos eutanasiados 12 e 24 horas após a intoxicação por paracetamol.
• Em amostras de soro:
- Avaliar o efeito do licopeno sobre as enzimas hepáticas (ALT e AST);
- Avaliar o efeito do licopeno sobre o perfil lipídico (Colesterol Total [CT],
lipoproteínas de alta densidade [HDL] e frações aterogênicas [FA]).
• Em amostras de fígado:
- Quantificar o conteúdo de glutationa total (GSHt), fração oxidada (GSSG),
fração reduzida (GSH) e relação GSH/GSSG;
- Quantificar a atividade de enzimas antioxidantes (GPx, GR, CAT e SOD);
Objetivos
Bandeira, A.C.B.
42
- Quantificar os marcadores de dano oxidativo (substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico [TBARS] e proteínas carboniladas);
- Quantificar a atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2);
- Avaliar a estrutura do parênquima hepático.
Experimento 3: Análise dos efeitos protetores do pré-tratamento prolongado com
licopeno em camundongos eutanasiados 12 horas após intoxicação por paracetamol.
• Em amostras de soro:
- Avaliar o efeito do licopeno sobre as enzimas hepáticas (ALT e AST);
- Avaliar o efeito do licopeno sobre o perfil lipídico (CT, HDL e FA).
• Em amostras de fígado:
- Quantificar o conteúdo de GSHt, GSSG, GSH e relação GSH/GSSG;
- Quantificar a atividade de enzimas antioxidantes (CAT e SOD);
- Quantificar os marcadores de dano oxidativo (TBARS e proteínas
carboniladas);
- Avaliar a expressão gênica de IL-1β, IL-6 e IL-10;
- Quantificar a [CCL-2] e IL-22;
- Quantificar a atividade da MMP-2;
- Avaliar a estrutura do parênquima hepático.
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
43
4. METODOLOGIA
4.1. Reagentes
Foram utilizadas amostras de LycoVit® Dispersion 10%, ©BASF S.A., Alemanha
(ANEXO 1), óleo de girassol Mazola, ©Cargill do Brasil, óleo de girassol, ACQ & GBM
Comércio e Desenvolvimento Ltda, paracetamol suspensão oral de 100 mg/ml, Medley
Industria Farmacêutica Ltda, kits Labtest Diagnóstica S.A.® (Lagoa Santa, MG, Brasil) para
dosagens bioquímicas, kit #CS0260, Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO) para dosagem de
glutationa, “Superoxide Dismutase assay Kit” (Chemical Cayman, MI, EUA), “Glutathione
peroxidase assay kit” (kit ab102530, Abcam®) e “Glutathione reductase assay kit” (kit
ab83461, Abcam®) para dosagens de enzimas antioxidantes, Kit ELISA Murine JE/MCP-1
(900-K126, Peprotech®) e Kit ELISA Murine IL-22 (900-K257, Peprotech®) para dosagens
de marcadores inflamatórios, Trizol (Invitrogen Life Technologies, CA, USA), kit “Hight-
Capacity cDNA Reverse Transcription” (Applied Biosystems, Foster City, CA) e Power
SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) para dosagem
de transcriptase reversa-reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) quantitativa em tempo
real.
4.2. Experimento 1: Análise temporal dos efeitos de uma dose tóxica do
paracetamol em camundongos.
4.2.1. Animais
Sabendo que o objetivo principal do Experimento 1 foi realizar uma análise temporal
dos efeitos de uma dose tóxica do APAP, foram utilizados camundongos machos (n = 30) da
linhagem C57BL/6, de 8-12 semanas, com média de peso 20-30g. Os animais foram alocados
no Biotério da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), com
temperatura e umidade controladas (21 ± 2 ºC, 50 ± 10%, respectivamente) e foram
submetidos aos ciclos claro/escuro de 12 h (luzes artificiais, 19 - 7 h) e exaustão 15 min/h. O
presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFOP,
protocolo 2012/41 (ANEXO 2).
4.2.2. Indução da hepatotoxicidade
Para a indução da hepatotoxicidade nos camundongos C57BL/6 foi utilizado o modelo
de overdose por APAP já estabelecido na literatura (Jaeschke et al., 2011; Singh et al., 2011;
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
44
Chen, P. et al., 2012; Marques et al., 2012). Os animais foram distribuídos nos seguintes
grupos experimentais (Figura 7):
Grupo Controle (C) – recebeu o veículo (água filtrada);
Grupo APAP – recebeu o APAP na concentração de 500 mg/kg em dose única.
Todos os tratamentos foram administrados nos animais em jejum de 12 horas por
gavagem orogástrica.
Os animais do grupo paracetamol foram eutanasiados, aleatoriamente, através de
inalação de isofluorano seguida de exsanguinação, nos tempos 3h, 6h, 12h e 24h após a
administração do fármaco (Figura 8).
Figura 7. Desenho experimental representando o Experimento 1 e 2.
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
45
Figura 8. Cronologia experimental do Experimento 1.
4.2.3. Análises e processamento do material biológico
Foram coletadas amostras de sangue e de fígado dos animais. O sangue foi coletado
através da punção cardíaca e logo em seguida centrifugado a 10.000g por 15 minutos a 4ºC
para a obtenção do soro. O fígado foi extraído e imediatamente pesado. Todas as amostras
foram armazenadas em freezer -80˚C para posterior realização das análises.
4.2.4. Análises sorológicas
As análises bioquímicas para obtenção da concentração das enzimas hepáticas ALT e
AST foram realizadas no soro utilizando kits comerciais Labtest Diagnóstica S.A.® (Lagoa
Santa, MG, Brasil).
I. Alanina aminotransferase (ALT) (Kit ref. 53)
A ALT promove a transferência de grupamentos amina de α-aminoácidos para α-
cetoácidos. O piruvato formado é medido através da formação de hidrazona, a qual tem
intensidade de cor em meio alcalino.
L-Alanina + α-cetoglutarato𝐴𝐿𝑇→ Glutamato + Piruvato
Resumidamente, foi adicionado 0,1 mL do Reagente nº 1 (TGP substrato) e transferido
para o banho-maria a 37ºC. Esperou-se 2 minutos e adicionou-se 0,02 mL da amostra ao
microtubo com reagente nº 1. As amostras permaneceram mais 30 minutos no banho-maria a
37ºC. Posteriormente, o microtubo foi retirado do banho-maria e adicionou-se 0,1 mL do
Reagente nº 2 (reagente de cor), que foi homogeneizado e incubado em temperatura ambiente
por 20 minutos. Após o tempo determinado, foi adicionado 1 mL de hidróxido de sódio
(NaOH) de uso às amostras, que foram homogeneizadas e incubadas por mais 5 minutos para
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
46
a realização da leitura a 505 nm. Os valores são expressos em Unidades/mL. Conversão para
Unidades Internacionais (UI): Unidades/mL x 0,482.
II. Aspartato transaminase (AST) (Kit ref. 52)
A AST promove a transferência de grupamentos amina de α-aminoácidos para α-
cetoácidos.
L-aspartato + α-cetoglutaratoAST→ Glutamato + Oxalacetato
Resumidamente, foi adicionado 0,1 mL do Reagente nº 1 (TGO substrato) e
transferido para o banho-maria a 37ºC. Esperou-se 2 minutos e adicionou-se 0,02 mL da
amostra ao microtubo com reagente nº 1. As amostras permaneceram mais 60 minutos no
banho-maria a 37ºC. Posteriormente, o microtubo foi retirado do banho-maria e adicionou-se
0,1 mL do Reagente nº 2 (reagente de cor), que foi homogeneizado e incubado em
temperatura ambiente por 20 minutos. Após o tempo determinado, foi adicionado 1 mL de
NaOH de uso às amostras, que foram homogeneizadas e incubadas por mais 5 minutos para a
realização da leitura a 505 nm. Os valores são expressos em Unidades/mL. Conversão para
UI: Unidades/mL x 0,482.
4.2.5. Análise das defesas antioxidantes
I. Sistema Glutationa (GSHt, GSSG, GSH e relação GSH/GSSG)
A GSH está presente nas células principalmente na sua forma reduzida representando
em torno de 90%, o restante aparece na forma de GSSG. Esta dosagem foi adaptada do kit
comercial Sigma #CS0260, e utiliza um método cinético para mensurar os níveis de GSHt
(GSH+GSSG) em amostras biológicas, através da redução do Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-
nitrobenzóico) (DTNB) à 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB).
Para realizar a dosagem, amostras de 100 mg de tecido hepático foram
homogeneizadas com 1 mL de ácido de sulfosalicílico 5% (SSA), e em seguida centrifugadas
a 10.000 g por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e utilizado como amostra
biológica.
A dosagem é realizada em microplaca de 96 poços. Inicialmente são adicionados aos
poços 150 μl da mistura de trabalho que contém glutationa redutase (GR), DTNB, e 100 mM
tampão fosfato de potássio. Em seguida, adiciona-se 10 μl de amostra para os testes e 10 μl de
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
47
100 mM tampão fosfato de potássio para o branco. As amostras são incubadas por 5 minutos
e, em seguida, a reação é iniciada com a adição de 50 μl de solução de NADPH. Com o início
da reação, a absorbância foi imediatamente medida a 405 nm utilizando um leitor de placa de
ELISA (Biotek ELx808). Foram realizadas 6 leituras com intervalo de 1 minuto entre cada
leitura.
Para mensurar os níveis de GSSG, o procedimento foi o mesmo, porém a amostra
biológica passou por um processo de derivatização antes do início da dosagem. Para isso foi
feita uma alíquota de 100 μl de amostra e acrescentou-se à esta 2 μl de vinilpiridina e 5 μl de
trietanolamida (TEA). Esta nova amostra apresentou o pH entre 6 e 7 e ficou incubada por
uma hora. Após esse período, utilizou-se 10 μl desta nova amostra para reagir com a mistura
de trabalho, como anteriormente descrito.
As concentrações de GSHt e GSSG foram obtidas através de uma curva padrão
realizada para cada uma das dosagens. A subtração da concentração de GSSG do valor da
concentração da GSHt forneceu o valor da concentração da GSH e, a relação GSH/GSSG
obteve-se através da divisão dos resultados de concentração de GSH pelos resultados de
GSSG.
4.3. Experimento 2: Análise dos efeitos protetores de uma dose única de licopeno
em camundongos eutanasiados 12 e 24 horas após a intoxicação por paracetamol.
4.3.1. Animais
Sabendo que o objetivo principal do Experimento 2 foi analisar os efeitos preventivos
de uma dose única do licopeno no fígado de camundongos, 12 e 24 horas após a intoxicação
com APAP, foram utilizados camundongos machos (n = 56) da linhagem C57BL/6, de 8-
12 semanas, com média de peso 20-30g. Os animais foram alocados no Biotério da Escola de
Nutrição da UFOP, com temperatura e umidade controladas (21 ± 2 ºC, 50 ± 10%,
respectivamente) e foram submetidos aos ciclos claro/escuro de 12 h (luzes artificiais, 19 - 7
h) e exaustão 15 min/h. O presente estudo foi aprovado pelo CEUA da UFOP, protocolo
2012/41 (ANEXO 2).
4.3.2 Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade
Os camundongos foram distribuídos de acordo com o tratamento recebido nos
seguintes grupos (Figura 7):
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
48
Grupo controle (C) – recebeu água filtrada (veiculo do APAP);
Grupo Óleo (O) – recebeu óleo de girassol (veículo do licopeno);
Grupo APAP (A12 e A24) – recebeu o APAP na dose de 500 mg/kg em dose única;
Grupo APAP + Licopeno 10 mg (L10+A12 e L10+A24) – recebeu o licopeno (10 mg/kg)
1 (uma) hora antes da administração do APAP na dose de 500 mg/kg;
Grupo APAP + Licopeno 100 mg (L100+A12 e L100+A24) – recebeu o licopeno (100
mg/kg) 1 (uma) hora antes da administração do APAP na dose de 500 mg/kg.
Todos os tratamentos foram administrados nos animais em jejum de 12 horas por
gavagem orogástrica.
Os animais foram eutanasiados, aleatoriamente, através de inalação de isofluorano
seguida de exsanguinação, nos tempos 12h e 24h após a administração do APAP (Figura 9).
Figura 9. Cronologia experimental do Experimento 2.
A coleta e o processamento do material biológico, assim como as análises sorológicas
de ALT e AST e as análises do sistema glutationa seguiram o mesmo padrão do Experimento
1 e estão descritos nas páginas anteriores. A seguir, estão descritas as metodologias das
demais análises utilizadas no Experimento 2.
4.3.3 Análises sorológicas
As análises bioquímicas para obtenção do conteúdo de CT e HDL foram realizadas no
soro utilizando-se kits comerciais Labtest Diagnóstica S.A.® (Lagoa Santa, MG, Brasil). A
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
49
fração aterogênica (lipoproteínas de baixa densidade [LDL] + lipoproteínas de muito baixa
densidade [VLDL]) obteve-se através da subtração dos resultados de concentração de CT
pelos resultados de HDL. Os protocolos serão descritos abaixo.
I. Colesterol Total (Kit ref. 76)
O CT é determinado de acordo com as seguintes reações:
Ésteres de colesterol 𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝐸𝑠𝑡𝑒𝑟𝑎𝑠𝑒→ Colesterol + Ácidos graxos
Colesterol + O2
𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑂𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Colest-4-en-ona + H2O2
2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina 𝑃𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Antipirilquinonimina + 4H2O
A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração de
CT na amostra.
Resumidamente, foram adicionados em três tubos de ensaio os seguintes reagentes:
As amostras foram misturadas e os tubos colocados em banho-maria a 37ºC por 10
minutos. Foram determinadas as absorbâncias do teste e do padrão em 500 nm ou filtro verde
(490 a 510 nm), acertando o zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos.
Cálculos: CT mg/dL= 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑇𝑒𝑠𝑡𝑒
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜×200
II. Colesterol HDL (Kit ref. 13)
As VLDL e as LDL são quantitativamente precipitadas e, após centrifugação, o
colesterol ligado ao HDL é determinado no sobrenadante.
Branco Teste Padrão
Amostra ----- 0,01 mL -----
Padrão (nº 2) ----- ----- 0,01 mL
Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
50
Inicialmente foi realizada a separação das frações de colesterol, misturando-se o soro
com o reagente precipitante em um microtubo. Após a agitação vigorosa no vórtex, essa
amostra foi centrifugada a 3.500 rpm por 15 minutos e para a dosagem utilizou-se o
sobrenadante resultante.
Em três tubos de ensaios foram adicionados os seguintes reagentes, como a seguir:
Branco Teste Padrão
Sobrenadante ---- 0,1 mL ----
Padrão (nº2) ---- ---- 0,1 mL
Reagente (nº1) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Cálculos: HDL mg/dL=𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑇𝑒𝑠𝑡𝑒
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜×40
4.3.4. Análise das defesas antioxidantes
I. Atividade da glutationa peroxidase (GPx)
A atividade da GPx foi determinada utilizando o “Glutathione peroxidase assay kit”
(kit ab102530, Abcam®). Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeneizados
em 0,2 mL de tampão de ensaio gelado e centrifugados a 10.000 rpm durante 15 min a 4ºC. O
sobrenadante foi coletado e utilizado para a análise como na descrição a seguir. Cinco (5) µL
de homogenato foram adicionados aos poços da microplaca e o volume final completado para
50 µL de tampão de ensaio. No branco, adicionou-se 50 µL de tampão de ensaio, 40 µL de
mix de reação (tampão de ensaio, 40 mM de NADPH, GR e GSH) e, após mistura, a placa foi
incubada por 15 min em temperatura ambiente. Posteriormente, adicionou-se 10 µL de
hidróxido de cumeno nos poços e, as absorbâncias foram imediatamente lidas em intervalos
de 1 minuto durante 5 minutos à temperatura de 25ºC à 340 nm em um leitor de placa de
ELISA (Biotek ELx808).
Para a curva padrão, o NADPH 40 mM foi diluído em água destilada para gerar um
padrão de NADPH a 1 mM. Adicionou-se 0, 20, 40, 60, 80 e 100 µL do padrão de NADPH a
1 mM na placa de 96 poços, em duplicata, e completou-se o volume final até 100 µL com
tampão de ensaio. A leitura foi realizada a 340 nm nas mesmas condições anteriores e, traçou-
se a curva padrão que foi utilizada como base no cálculo.
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
51
Aplicou-se o ∆A340 à curva padrão para obtenção de B e a atividade de GPx foi
obtida através da divisão de B pelo tempo da primeira leitura diminuído do tempo da segunda
leitura multiplicado pelo volume da amostra e pela diluição.
II. Atividade da glutationa redutase (GR)
A atividade da GR foi determinada utilizando o “Glutathione reductase assay kit” (kit
ab83461, Abcam®). Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeneizados em 1
mL de tampão de ensaio gelado e centrifugados a 10.000 rpm durante 15 min a 4ºC. O
sobrenadante foi coletado e as amostras tratadas para a destruição da GSH antes do inicio do
ensaio. 5 µL de H2O2 a 3 % foram adicionados a 100 µL de amostra que foi incubada a 25ºC
durante 5 minutos. Após esse tempo, 5 µL de CAT foram adicionados ao microtubo e
novamente a amostra foi incubada a 25ºC durante 5 minutos. Para o ensaio, 5 µL das amostras
tratadas foram pipetados nos poços de uma microplaca e 50 µL do mix de reação (tampão de
ensaio, DNTB, NADPH-GNERAT e GSSG) e em seguida foi realizada a leitura a 405 nm em
um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808). As absorbâncias foram lidas em intervalos de
1 minuto durante 10 minutos a 25ºC.
Para a curva padrão, adicionou-se 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µL de TNB nos poços da
microplaca e completou-se o volume final para 100 µL com tampão de ensaio. A leitura foi
realizada a 405 nm nas mesmas condições anteriores e traçou-se a curva padrão que foi
utilizada como base no cálculo.
Aplicou-se o ∆A405 à curva padrão para obtenção de ∆B e a atividade de GR foi
obtida através da divisão do ∆B pelo tempo da segunda leitura subtraído do tempo da primeira
leitura multiplicado por 0,9, pelo volume da amostra pré-tratada e pelo fator de diluição.
III. Atividade da catalase (CAT)
A determinação da atividade da enzima CAT é baseada na sua capacidade de clivar o
peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e O2, conforme descrito por Aebi (Aebi, 1984).
Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foi homogeneizado em 1 mL de tampão
fosfato a 100 mM (pH 7,2) e em seguida centrifugado a 10.000 g por 10 minutos à 4ºC. O
sobrenadante foi coletado e utilizado como amostra biológica. Em um microtubo foram
adicionados 50 μL de tampão fosfato a 100 mM (pH 7,2) e 40 μL de água destilada e 10 μL
da amostra. A reação foi iniciada pela adição de 900 μL de H2O2 a 5 mM. As absorbâncias
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
52
foram determinadas a cada minuto, durante três minutos, a 240 nm. Água destilada foi
utilizada como branco.
Uma unidade (U) de CAT é equivalente a hidrólise de 1mol de H2O2 (ε = 39,4 L.mol-
1. cm-1) por minuto (Aebi, 1984). A atividade da CAT foi calculada segundo a lei de Lambert
Beer. A absorbância utilizada para o cálculo é o delta obtido das três absorbâncias lidas
(absorbância final – absorbância inicial).
IV. Atividade da superóxido dismutase (SOD)
A atividade da SOD total foi determinada utilizando o “Superoxide Dismutase assay
Kit” (Chemical Cayman, MI, EUA). Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram
homogeneizados em 1 mL de tampão HEPES 20 mM, gelado, pH 7,2, contendo 1 mM de
Ácido Bis(2- aminoetil) etilenoglicol-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), 210 mM de sacarose e
70 mM de manitol. O homogenato foi centrifugado a 12.000 g por 10 minutos em centrífuga
refrigerada a 4˚C e o sobrenadante foi retirado para ser utilizado como amostra biológica.
Para a realização do ensaio foi utilizado 10 µL de sobrenadante. A reação iniciou-se
pela adição da xantina oxidase. A placa foi incubada em um agitador a temperatura ambiente
por 20 minutos e a absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de placa de ELISA
(Biotek ELx808).
4.3.5. Proteínas Totais
A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o método de Lowry
(Lowry et al., 1951). O princípio do método baseia-se na redução do reagente Folin Ciocalteu,
ao reagir com aminoácidos aromáticos, catalisada por íons cobre, em meio alcalino, formando
uma coloração azul.
Inicialmente são preparadas as soluções de trabalho conforme descrito abaixo:
- Reagente A: dissolve-se 0,25 g de sulfato de cobre e 0,5 g de citrato de sódio em 100
mL de água destilada. A solução deve ser armazenada, no escuro, em temperatura ambiente.
- Reagente B: dissolve-se 5 g de carbonato de sódio e 1 g de hidróxido de sódio em
250 mL de água destilada. Deve ser armazenada a temperatura ambiente.
- Reagente C: adiciona-se 1 mL do reagente A em 50 mL do reagente B. Deve ser
preparado na hora do teste.
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
53
- Reagente D: dissolve-se 1 mL de Folin-Ciocateau em 1 mL de água destilada. Deve
ser preparado na hora do teste.
Foram realizados quatro pontos para a construção da curva padrão para proteínas
totais, pelo seguinte procedimento:
P1- 25 μL de uma solução estoque de proteínas a 0,2 mg/dL e o volume completado
com água destilada para 100 mL. A concentração final obtida deste ponto é de 0,05 mg/mL.
P2- 7,5 μL de uma solução estoque de proteínas a 2 mg/dL e o volume completado
com água destilada para 100 mL. A concentração final obtida deste ponto é de 0,15 mg/mL.
P3- 15 μL de uma solução estoque de proteínas a 2 mg/dL e o volume completado
com água destilada para 100 mL. A concentração final obtida deste ponto é de 0,30 mg/mL.
P4- 25 μL de uma solução estoque de proteínas a 2 mg/dL e o volume completado
com água destilada para 100 mL. A concentração final obtida deste ponto é de 0,5 mg/mL.
Para a realização da dosagem, foram adicionados 10 μL de amostra ou padrão em
tubos de polipropileno, e completados para 100 μL com água destilada. O branco, usado para
zerar o espectrofotômetro, foi feito apenas com 100 μL de água destilada. Posteriormente
adicionou-se 1 mL do reagente C em todos os tubos (incluindo branco e padrões). A mistura
foi agitada no vórtex e mantida a temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, foi
adicionado em cada tubo 100 μL do reagente D. O volume foi misturado e incubado a
temperatura ambiente, no escuro, por 30 minutos. Em seguida, realizou-se a leitura em
espectrofotômetro a 660 nm.
Após as leituras, foi feito um gráfico expressando a concentração do padrão (Eixo Y)
versus absorbância do padrão (Eixo X). A equação da reta gerada foi utilizada para determinar
a concentração de proteínas totais no homogenato. Todas as concentrações foram obtidas em
mg/mL.
4.3.6. Marcadores de dano oxidativo
I. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
A técnica do TBARS avalia os produtos da peroxidação lipídica ocasionada por EROs,
dentre eles o malondialdeído. Quando esses produtos reagem com o ácido tiobarbitúrico
(TBA) em meio aquecido, dão origem a uma reação colorimétrica que pode ser lida por
espectrofotometria, como descrita por Draper et al. (Draper et al., 1993). Resumidamente,
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
54
100 mg de tecido foram homogeneizados em 1 mL de tampão Tris ácido clorídrico (HCL) a
20 mM, pH 7,4, e centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
coletado e, para o ensaio foram pipetados nos microtubos 500 µL de amostra. Em seguida,
adicionou-se às amostras 250 µL de ácido tricloroacético (TCA), 250 µL de TBA, 125 µL de
hidroxitolueno butilado (BHT) a 5 mM e, após mistura, as amostras foram incubadas por 15
minutos a 95ºC. Após o tempo de incubação, as amostras foram colocadas em banho de gelo
para a interrupção da reação química. Em seguida, foram centrifugadas por 10 minutos a
13.000 rpm e o sobrenadante foi coletado e pipetado nos poços da microplaca para leitura a
535 nm em um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808).
O valor de TBARS se dá pela multiplicação da absorbância da amostra pelo valor do
coeficiente de extinção molar e dividindo-se este resultado pelo valor de proteínas totais na
amostra.
II. Proteína carbonilada
Proteína carbonilada é um marcador da oxidação de proteína por EROs. Derivados
carbonílicos podem ser mensurados por métodos sensitivos, particularmente aqueles que
utilizam o 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Neste método o DNPH reage com grupos
carbonílicos gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada
espectrofotometricamente (Levine et al., 1994).
Para a realização da dosagem, uma amostra de 400 mg de tecido hepático foi
homogeneizada em 2 mL de tampão fosfato 50 mM, pH 6,7, e em seguida o homogenato foi
centrifugado a 10.000g por 15 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e utilizado no
procedimento experimental. 500 μL do sobrenadante do homogenato foram transferidos para
dois microtubos denominados Amostra (A) e Controle (C). A cada tubo foi adicionado igual
volume de TCA 10% e após centrifugação a 5.000g por 10 minutos a 4°C, o sobrenadante foi
descartado. Em seguida foram adicionados ao tubo A 500 μL de DNPH a 10 mM em 2 M de
HCl, e ao tubo C 500 μL de HCL 2 M. Ambos foram mantidos no escuro à temperatura
ambiente por um período de 30 minutos sofrendo agitação a cada 15 minutos. No passo
seguinte foram adicionados 500 μL de TCA 10% em cada tubo. Em seguida, os tubos foram
centrifugados a 5.000 g por 10 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram novamente
descartados. Os precipitados em ambos os tubos foram lavados com 1 mL da mistura
etanol/acetato de etila, na proporção de 1:1, misturados no vórtex e novamente centrifugados
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
55
conforme descrito na etapa anterior, o sobrenadante foi descartado. Este último passo foi
repetido duas vezes. Ao final do processo de lavagem, foram adicionados em ambos os tubos
1 mL de SDS 6%, misturados no vórtex e centrifugados à 10.000 g por 10 minutos à 4°C.
Finalmente as absorbâncias dos sobrenadantes foram determinadas a 370 nm. Os resultados
são expressos em nmol de proteína carbonilada por mg de proteína.
O conteúdo de DNPH incorporado foi calculado utilizando o coeficiente de extinção
molar do DNPH (22000 M-1cm-1) segundo a lei de Lambert Beer.
4.3.7. Zimografia
As amostras de fígado foram pesadas e homogeneizadas (na proporção de 100 mg/400
µL) em tampão RIPA, acrescido de coquetel inibidor de protease (1:1000) a 4ºC. Após a
centrifugação (10 min, 10.000g), o sobrenadante foi coletado e usado imediatamente para
dosagem de proteínas. A concentração protéica foi determinada utilizando-se uma curva
padrão de albumina pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951), utilizando-se o programa
Microsoft Excel.
As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente descrito por Sung
(Sung et al., 2007) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio) a 8% contendo gelatina do tipo A de pele
suína (Sigma Chem. Co, St. Louis, Mo. EUA) na concentração de 2 mg/mL e os géis de
entrada poliacrilamida 5% (w/v) em placas de 0,75mm. A eletroforese foi realizada com a
concentração de 30 µg de proteína para cada amostra, acrescido (de acordo com cálculos
realizados para cada amostra) de tampão RIPA e tampão de amostra para SDS-PAGE. Antes
da aplicação no gel as mesmas foram aquecidas por dois minutos a 37ºC no banho úmido. Um
volume de 10 μL do marcador padrão de massa molecular (BLUeye Prestained Protein
Ladder – Genedirex) foi utilizado em todas as corridas.
A corrida da eletroforese foi realizada durante 120 minutos a 100 V. Após a
eletroforese os géis foram cuidadosamente lavados 3 vezes em 2.5% Triton X-100 para total
remoção do dodecil sulfato de sódio (SDS) seguido de incubação a 37◦C por 18h em tampão
contendo o substrato (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM cloreto de cálcio (CaCl2), 0.05%
ázida de sódio (NaN3), pH 7.5). SDS é o agente responsável pela ativação das
metaloproteinases (MMPs) mesmo na forma inativa sem clivagem proteolítica (Talhouk et al.,
1991). Os géis foram corados com 0,05% de Coomassie Brilliant blue G-250 por 3 horas e
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
56
descorados com solução descorante (4% metanol, 8% ácido acetico e água). A atividade da
gelatinase foi visualizada por bandas não marcadas em um fundo azul representando áreas de
proteólise no substrato de proteína. As MMPs são secretadas na forma latente e necessitam da
clivagem do terminal peptídico NH2 para ativação.
Após descorar o gel da zimografia, os mesmos foram escaneados e as bandas
marcadas foram quantificadas com auxílio do software Quantity One (BioRad) e do software
ImageJ versão 1.32j de domínio público http://rsb.info.nih.gov.ij/ onde a densidade óptica de
cada banda foi detectada. Utiliza-se como parâmetro para análise o volume ajustado das
bandas, que significa o volume total, diminuído do background. Inicialmente o sistema de
análise calcula a média dos valores de densidade óptica para a região delimitada pelo
operador. Esta região deve ter uma área suficiente para abrigar todas as bandas (uma de cada
vez) visíveis no filme, não devendo ser alterada, quando se passa a analisar outra banda.
4.3.8. Análise histológica e morfométrica
O fígado dos camundongos foi removido ao final de cada experimento e fixado em
formol tamponado a 4%. O tecido hepático foi fixado e processado em série decrescente de
álcoois e posteriormente embebido em parafina. Secções parafinadas de aproximadamente 4
μm foram obtidas em micrótomo semi-automático, a as lâminas foram coradas pela técnica de
Hematoxilina & Eosina (HE), para visualização da histoarquitetura do parênquima hepático.
Fotomicrografias foram obtidas em microscópio óptico Leica acoplado a câmera digital
DM5000, com o software de análises Leica Aplication Suite. A análise morfométrica para
quantificação das áreas de necrose foi realizada com o auxílio do software ImageJ, versão
1.32j.
4.4. Experimento 3: Análise dos efeitos protetores do pré-tratamento prolongado
com licopeno em camundongos eutanasiados 12 horas após intoxicação por paracetamol.
4.4.1. Animais
Sabendo que o objetivo principal do Experimento 3 foi analisar os efeitos do pré-
tratamento do licopeno por 14 dias consecutivos no fígado de camundongos eutanasiados 12
horas após a intoxicação com APAP, foram utilizados camundongos machos (n = 35) da
linhagem C57BL/6, de 8-12 semanas, com média de peso 20-30g. Os animais foram alocados
no Biotério da Escola de Nutrição da UFOP, com temperatura e umidade controladas (21 ± 2
ºC, 50 ± 10%, respectivamente) e foram submetidos aos ciclos claro/escuro de 12 h (luzes
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
57
artificiais, 19 - 7 h) e exaustão 15 min/h. O presente estudo foi aprovado pelo CEUA da
UFOP, protocolo 2012/41 (ANEXO 3).
4.4.2. Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade
Os camundongos foram distribuídos de acordo com o tratamento recebido nos
seguintes grupos (Figura 10):
Grupo controle (C) – recebeu água filtrada (veículo);
Grupo Óleo (O) – recebeu óleo de girassol (veículo do licopeno);
Grupo APAP (A12) – recebeu o APAP na dose de 500 mg/kg em dose única;
Grupo APAP + Licopeno 10 mg (L10+A12) – recebeu o licopeno (10 mg/kg) por 14 dias
consecutivos e, 1 hora após a última dose de licopeno, foi intoxicado com APAP na dose de
500 mg/kg;
Grupo APAP + Licopeno 100 mg (L100+A12) – recebeu o licopeno (100 mg/kg) por 14 dias
consecutivos e, 1 hora após a última dose de licopeno, foi intoxicado com APAP na dose de
500 mg/kg.
Todos os tratamentos foram administrados por gavagem orogástrica e os animais
permaneceram por um período de 15 horas de jejum antes da eutanásia.
Os animais foram eutanasiados, aleatoriamente, através de inalação de isofluorano
seguida de exsanguinação, 12 horas após a administração do APAP (Figura 11).
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
58
Figura 10. Desenho experimental representando o Experimento 3
Figura 11. Cronologia experimental do Experimento 3.
A coleta e o processamento do material biológico, assim como as análises seguiram o
mesmo padrão do Experimento 2 e estão descritos nas páginas anteriores. A seguir, serão
descritas as metodologias das demais análises utilizadas no Experimento 3.
4.4.3. Atividade da superóxido dismutase (SOD)
A detecção da atividade da SOD utilizada nesse experimento baseia-se na capacidade
da enzima dismutar o ânion superóxido resultando na diminuição da taxa de auto-oxidação do
pirogalol como descrito por Marklund e Marklund (Marklund e Marklund, 1974).
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
59
Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeneizados em 1 mL de tampão
fosfato a 50 mM e centrifugados por 10 minutos a 12.000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi
coletado e utilizado para o ensaio. Em microplaca de 96 poços foram pipetados os
sobrenadantes das amostras e os reagentes conforme a tabela abaixo:
Amostra - µL Tampão - µL MTT (1,25 mM) - µL Pirogalol (100 mM) - µL
Branco - 144 6 -
Padrão - 129 6 15
Amostra 30 99 6 15
Após essa etapa a placa foi incubada por 5 min na estufa a 37 ºC. Em seguida, a reação
foi parada através da adição de 150 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e imediatamente foi
realizada a leitura a 570 nm em um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808).
A atividade enzimática da SOD foi calculada através multiplicação da absorbância da
amostra por 1 U de SOD e dividido pela absorbância do padrão. O resultado final foi dividido
pela quantidade de proteínas totais no tecido.
4.4.4. Dosagem de citocinas
Foi realizada a dosagem de IL-22 e CCL2 no soro dos camundongos pelo método
imunoenzimático de ELISA através de kits da Peprotech ®.
Em microplacas de alta sensibilidade foram adicionados 100 µl de anticorpo
monoclonal contra a proteína (ou peptídeo) a ser dosada, diluídos em tampão fosfato salino
(PBS) contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO),
sendo estas placas incubadas por 12 horas à temperatura ambiente. Anticorpos não adsorvidos
pelas placas foram descartados, por inversão e sucessivas lavagens em PBS-Tween e as placas
bloqueadas com 300 µl/poço de uma solução contendo PBS-BSA 1%, durante 1 hora a
temperatura ambiente. A seguir as placas foram novamente lavadas. As amostras de plasma
foram aplicadas em um volume de 25 µl para cada poço. Paralelamente, a proteína
investigada foi diluída em várias concentrações para o estabelecimento da curva padrão.
Os anticorpos secundários, após os poços serem devidamente lavados, foram diluídos
em PBS-BSA 0.1% e incubados por duas horas à temperatura ambiente. Finalmente, 100 µl
de estreptavidina ligada à peroxidase na diluição de 1:2000 em PBS-BSA 0.1% foram
adicionados à placa e a mesma foi incubada por 30 minutos, em abrigo da luz.
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
60
Após a lavagem das placas foram adicionados 100 µl/poço do substrato ABTS - 2,2′-
Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, Sigma®). Após 20 minutos de incubação
em ausência de luz, a leitura da intensidade de coloração foi realizada em leitor de ELISA
(Microplate Reader, model 680 BioRad) utilizando-se o comprimento de onda de 405 nm.
4.4.5. Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real
I. Extração do RNA total
O RNA total foi extraído do fígado fresco de camundongos (50 mg) usando Trizol
(Invitrogen Life Technologies, CA, USA) de acordo com as recomendações do fabricante.
Resumidamente, as amostras foram transferidas para tubos de polipropileno e foram
adicionados 500 μL de trizol às amostras lentamente. Estas foram deixadas no gelo por 10
minutos para completa dissociação de complexos nucleoprotéicos. Foram adicionados 100 μL
de clorofórmio em cada tubo, misturou-se por 10 minutos e incubou-se no gelo por mais 10
minutos. Na sequência, os tubos foram centrifugados por 15 minutos a 12.000g a 4 ºC. Após a
centrifugação, foi removida a fase aquosa (contendo o RNA). Esta fase foi transferida para
outro tubo, sendo adicionados 250 μL de isopropanol. A solução foi homogeneizada e
incubada por 45 minutos a -20 ºC. Em seguida, foi centrifugada por 15 minutos a 12.000g a 4
ºC e o sobrenadante descartado. Foi adicionado 1 mL de etanol a 75%, misturado por inversão
e centrifugado por 10 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o
pellet seco em temperatura ambiente. O RNA foi ressuspendido em 30 μL de água DEPEC
(dietil pirocarbonato). Por último, foi determinada a concentração e pureza do RNA, em
espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare, UK).
II. Síntese do DNA complementar (cDNA)
O cDNA foi sintetizado a partir de 1μg de RNA total, utilizando oligo (dT) (Applied
Biosystems, Foster City, CA) e o kit “Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription” (Applied
Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O meio de reação
continha 2 μL de tampão 10x (500 mM de cloreto de potássio (KCl), 100 mM deTris-HCl, 25
mM de cloreto de magnésio (MgCl2), pH 8,3), 0,8 μL da mistura de desoxiribonucleotídeos
trifosfato (dNTPs) 100 mM, 1 μL de oligo (dT), 1 μL da enzima transcriptase reversa
MultiScribe (50 U/μL). A reação foi realizada nas seguintes condições: 10 minutos a 25°C,
seguido de 120 minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C em termociclador Biocycler modelo
MJ96+.
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
61
III. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores
Os iniciadores utilizados para amplificar o gene de referência endógena, β-actina, e os
genes IL-1β, IL-6 e IL-10 foram desenhados com base nas sequências de Mus musculus,
disponíveis no banco de dados do GenBank (National Center for Biotechnology Information).
As construções foram feitas com o auxílio do programa Primer-BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) (Tabela 5).
Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise qRT-PCR
Gene Oligonucleotídeos iniciadores (sequência 5’
para 3’)
β-actina (forward) CTGAGCTGCGTTTTACACC
β-actina (reverse) CGCCTTCACCGTTCCCAGTT
IL-1β (forward) AGAGCCCATCCTCTGTGACT
IL-1β (reverse) GGAGCCTGTAGTGCAGTTGT
IL-6 (forward) ACTTCCATCCAGTTGCCTTCT
IL-6 (reverse) AGTCTCCTCTCCGGACTTGT
IL-10 (forward) TGGGTTGCCAAGCCTTATCG
IL-10 (reverse) CAGCTTCTCACCCAGGGAAT
IV. Curva de eficiência dos oligonucleotídeos iniciadores
Para determinar a eficiência da amplificação dos genes alvo e do gene de referência
endógena foram construídas curvas padrões para cada amplificado, a partir de diluições
seriadas do cDNA de uma mesma amostra. A análise de regressão linear dos valores de
Threshold Cycle (TC) em função do logaritmo da respectiva diluição forneceu o coeficiente
angular da reta (a, em y = ax+b) que foi utilizado para o cálculo da eficiência de amplificação
do produto pelos iniciadores.
V. RT-PCR quantitativa em tempo real
Para a análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica de PCR em
tempo real (qPCR). A quantificação dos produtos formados durante os ciclos de amplificação
foi realizada com o reagente Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,
Metodologia
Bandeira, A.C.B.
62
Foster City, CA, USA). As reações foram realizadas em placas de 96 poços, sendo
adicionados em cada poço 2 μL de cDNA (100 ng), 0,48 μL de cada primer (forward e
reverse, 10 μM), 6 μL Power de SYBR® Green Master Mix e volume final de água livre de
DNAse para 12 μL. As reações foram realizadas nas seguintes condições, 50°C por 2min, 95°
C por 10 min e então 40 ciclos de 95°C por 15s (desnaturação) e 60°C por 1min (anelamento
dos iniciadores e extensão dos produtos) no termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems,
CA, USA). O gerenciamento do termociclador e a coleta dos dados gerados durante a
amplificação foram realizados pelo programa 7000 System SDS Software (Applied
Biosystems). Todas as análises foram realizadas em triplicata. A especificidade dos produtos
obtidos foi confirmada pela análise das curvas de dissociação do produto amplificado ao final
de cada reação.
Os dados obtidos foram analisados utilizando o método de quantificação relativa da
expressão gênica (TC comparativo ou ΔΔTC), que permite quantificar diferenças no nível de
expressão de um gene específico entre as diferentes amostras. A expressão dos genes alvo foi
determinada em função da expressão do gene de referência endógena β-actina e uma amostra
normalizadora (grupo C) foi utilizada como base para os resultados de expressão comparativa.
De posse dos valores de TC, que corresponde ao número de ciclos na fase exponencial da
PCR em que a fluorescência ultrapassa o valor basal, foi calculado o ΔTC de cada amostra, na
qual o valor do TC do gene de referência endógena foi subtraído do TC do gene alvo. Em
seguida foram calculados os valores de ΔΔTC, na qual o valor do ΔTC da amostra
normalizadora (grupo C) foi subtraído do ΔTC das amostras teste (demais grupos
experimentais). Os valores do ΔΔTC obtidos foram utilizados em uma fórmula aritmética
para o cálculo final da diferença de expressão dos genes entre as amostras analisadas, dada
por 2ΔΔTC.
4.5. Análises estatísticas
Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média (dados paramétricos) ou
mediana [valor mín./valor máx.] (dados não paramétricos). Utilizamos P<0,05 como valor de
significância e o teste estatístico one-way ANOVA seguido do pós-teste de Tukey para dados
paramétricos ou o teste de Kruskal Wallis seguido do pós-teste de Dunns para dados não
paramétricos. A análise estatística foi realizada com o auxílio do software GraphPad Prism
versão 5.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
63
5. RESULTADOS
5.1. Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre a função hepática
Para caracterização do modelo de hepatotoxicidade induzido por APAP foi realizada a
dosagem sérica das enzimas hepáticas ALT (A) e AST (B), sendo os resultados expressos em
UI (Figura 12). Em relação à atividade de ALT, foi observado que essa enzima manteve-se,
significativamente, elevada em 3h, 6h, 12h e 24h após a overdose de APAP quando
comparada ao grupo C. A atividade da enzima AST, também, mostrou-se elevada em 3h, 6h,
12h e 24h após a overdose de APAP quando comparada ao grupo C. O pico da atividade foi
observado 3 horas após intoxicação, mostrando uma queda em 6 horas. A atividade elevou-se
em 12 horas quando comparada às 6 horas e, retornou a decair em 24 horas quando
comparada as 3 e 12 horas após a intoxicação.
Os resultados mostraram que a dose de APAP administrada foi capaz de gerar uma
injúria hepática, caracterizando o modelo de hepatotoxicidade.
Figura 12. Efeitos do paracetamol sobre a função hepática.(A) Atividade sérica de alanina
aminotransferase (ALT) e (B) aspartato transaminase (AST) de camundongos C57BL/6
eutanasiados em diferentes tempos após a intoxicação com paracetamol (APAP). C: Grupo
Controle; 3h: camundongos eutanasiados 3 horas após a intoxicação; 6h: camundongos
eutanasiados 6 horas após a intoxicação; 12h: camundongos eutanasiados 12 horas após a
intoxicação; 24h: camundongos eutanasiados 24 horas após a intoxicação. Os resultados são
expressão em média ± erro padrão da média (n = 6), P <0,05 e a ≠ de C, b ≠ de 3h, c ≠ 6h, d
≠ 12h.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
64
5.2. Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa
Sabendo que este modelo de hepatotoxicidade causa desequilíbrio redox e a depleção
inicial da GSH devido ao metabolismo do APAP, a análise do sistema GSH é, também, uma
forma de validar o modelo experimental. Ainda, através da análise temporal foi possível
entender o status redox no tecido hepático e escolher dois tempos para o estudo dos possíveis
efeitos protetores do licopeno.
Nos experimentos cujos resultados são apresentados na figura 13 analisamos as
concentrações de GSHt (A), GSH (B), GSSG (C), e relação GSH/GSSG (D) no fígado de
camundongos C57BL/6 eutanasiados em diferentes tempos após intoxicação com APAP.
A concentração de GSHt (A) apresentou uma diminuição evidente no fígado 3 horas
após a administração do APAP (Grupo 3h) quando comparada ao C e seus níveis foram
reestabelecidos nos demais tempos (Grupos 6h, 12h e 24h). Ainda, o grupo 12 horas
apresentou um aumento nos níveis de GSHt quando comparado ao grupo 6h.
Com resultado semelhante, a concentração da GSH (B) apresentou uma diminuição
evidente no fígado 3 horas após a administração do APAP (Grupo 3h) quando comparado ao
C e seus níveis foram reestabelecidos nos demais tempos (Grupos 6h, 12h e 24h). Esses
resultados confirmam a depleção da GSH nas horas iniciais após a overdose, confirmando o
modelo de hepatotoxicidade utilizado.
Com relação à GSSG (C), o gráfico mostra uma redução em sua concentração hepática
3 horas após a administração do APAP quando comparado ao C. Sua concentração parece se
reestabelecer a níveis semelhantes ao do C no tempo de 6 horas após a intoxicação e, há um
aumento de GSSG em 12 horas e 24 horas após intoxicação com APAP quando comparado
aos demais grupos (Grupos C, 3h e 6h). O pico de GSSG é observado após 12 h da
intoxicação com APAP.
Ao analisar a relação entre GSH/GSSG, foi observada uma diminuição da relação no
grupo 12h quando comparado aos grupos C, 3h e 6h, sugerindo que o desequilíbrio redox se
estabeleceu 12 horas após a intoxicação com APAP.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
65
Figura 13. Efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa. Quantidades de glutationa
total (GSHt)(A), reduzida (GSH) (B), oxidada (GSSG) (C) e relação GSH/GSSG (D) no
fígado de camundongos C57BL/6 eutanasiados em diferentes tempos após intoxicação com
paracetamol (APAP). C: Grupo Controle; 3h: camundongos eutanasiados 3 horas após a
intoxicação; 6h: camundongos eutanasiados 6 horas após a intoxicação; 12h: camundongos
eutanasiados 12 horas após a intoxicação; 24h: camundongos eutanasiados 24 horas após a
intoxicação. Os resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 6), P <0,05
e a ≠ de C, b ≠ de 3h, c ≠ 6h, d ≠ 12h.
5.3. Efeitos da dose única de licopeno sobre os parâmetros bioquímicos de função
hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após intoxicação com paracetamol
Através dos resultados do Experimento 1, que sugerem que o início do desequilíbrio
redox ocorre nas 12 horas após a intoxicação com APAP, optou-se por estudar os efeitos do
licopeno em fígado de camundongos, em 12 e 24 horas após intoxicação com APAP.
Em relação à enzima ALT (Tabela 6), foi observado um aumento significativo de sua
atividade em todos os grupos de 12 horas intoxicados com APAP (A12, L10+A12 e
L100+A12) quando comparados ao grupo C. Da mesma forma, em 24 horas a atividade de
Resultados
Bandeira, A.C.B.
66
ALT permaneceram elevadas em todos os grupos experimentais de APAP quando
comparados ao C.
Com resultado semelhante, a atividade de AST (Tabela 6) mostrou-se aumentada em
todos os grupos de 12 e 24 horas intoxicados com APAP (A12, L10+A12, L100+A12, A24,
L10+A24 e L100+A24) quando comparados ao grupo C.
Ainda na tabela 6, analisamos as concentrações de CT (mg/dL), colesterol HDL
(mg/dL) e a FA (CT – colesterol HDL).
Os grupos A24, L10+A24 e L100+A24 mostraram uma diminuição do CT, em 24
horas, quando comparados ao C.
Em relação ao HDL, o grupo que recebeu apenas óleo de girassol (grupo O), obteve
um aumento sérico dessa lipoproteína quando comparado ao C. E tanto em 12 horas quanto
em 24 horas, os grupos experimentais APAP apresentaram uma diminuição de HDL quando
comparados ao grupo C e ao grupo O, com exceção do grupo L100+A12, que em 12 horas,
teve uma diminuição do HDL apenas quando comparado ao grupo O. Ainda, o grupo
L100+A24 apresentou um diminuição significativa de HDL em 24 horas quando comparado
ao seu par no tempo 12 horas.
Ao analisar a FA, foi observado que o grupo experimental L100+A12 apresentou um
aumento dessa fração quando comparado ao C. Não houve diferença entre os grupos
experimentais APAP, em 24 horas, quando comparados ao C.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
67
Tabela 6. Parâmetros bioquímicos séricos
C O A12 L10+A12 L100+12 A24 L10+A24 L100+A24
ALT (UI) 11,2±1,7 19,3±3,7 157,5±4,5a 153,0±5,4a 161,1±2,3a 142,0±0,8a 143,2±1,2a 145,9±0,8a
AST (UI) 38,6±6,1 71,4±5,3 169,4±18,3a 181,2±3,7a 188,0±2,2a 97,4±10,6a 109,0±1,6a 111,9±3,7a
CT (mg/dL) 76,0±2,7 96,2±3,5 62,6±4,3 65,5±7,3 98,6±10,2 43,4±4,4a 46,9±5,2a 40,5±3,5a
HDL (mg/dL) 53,7±1,7 68,0±3,2a 32,4±2,9a,b 24,1±3,9a,b 43,3±2,6b 20,0±2,7a,b 20,4±5,0a,b 16,0±4,9a,b
FA (mg/dL) 22,3±2,1 27,4±3,6 35,9±5,2 35,6±8,9 47,5±11,4a 28,9±2,5 26,5±2,4 37,0±6,4
Abreviações: ALT: Alanina aminotransferase; AST: Aspartato transaminase; CT: Colesterol total; HDL: lipoproteína de alta densidade; FA:
Frações aterogênicas; C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12
h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10 mg/kg +
paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. One-way-ANOVA seguido do pós-teste de tukey (P < 0,05). a ≠
do C; b ≠ do O (n = 7).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
68
5.4. Efeitos da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no fígado de
camundongos intoxicados com paracetamol
Sabendo que o licopeno apresenta uma relevante ação antioxidante como uma das suas
principais características, nós analisamos a sua influência no desequilíbrio redox hepático
induzido pela overdose de APAP. Na figura 14, analisamos os níveis de GSHt (A), GSH (B),
GSSG (C) e a relação GSH/GSSG (D).
Em relação à GSHt, os grupos experimentais L10+A12 e L100+A12 apresentaram
uma diminuição de GSHt comparados ao A12. Em 24 horas, os grupos A24, L10+A24 e
L100+24 apresentaram um aumento significativo de GSHt quando comparados ao C e apenas
L10+A24 e L100+24 mostraram-se aumentados quando comparados aos seus respectivos
grupos em 12 horas (L10+A12 e L100+12) (Figura 14A).
A concentração de GSH apresentou-se diminuida no grupo L100+A12 quando
comparado a A12. Em 24 horas, os grupos L10+A24 e L100+A24 apresentaram um aumento
de GSH quando comparados aos seus respectivos grupos em 12 horas (L10+A12 e L100+12)
(Figura 14B).
Os níveis de GSSG mostraram-se alterados na maioria dos grupos experimentais
APAP, com aumento de sua concentração em ambos os tempos, de 12 e 24 horas, quando
comparados ao C. Em 12 horas apenas observamos que houve uma diminuição de GSSG no
grupo L10+A12 quando comparado a A12. E em 24 horas, o grupo A24 apresentou uma
redução de GSSG quando comparado ao grupo A12 (Figura 14C).
Por fim, ao realizar a relação GSH/GSSG, observou-se uma diminuição da relação no
grupo A12 quando comparados ao grupo C. Os demais grupos não apresentaram diferenças
estatísticas quando comparados ao grupo C (Figura 14D).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
69
Figura 14. Influência da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no modelo de
overdose por paracetamol. (A) Concentração de Glutationa total (GSHt) (nmol/ml), (B)
Glutationa reduzida (GSH), (C) Glutationa oxidada (GSSG) e (D) Razão GSH/GSSG no
fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100
mg/kg) 1 hora antes da intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12
e 24 horas após overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h;
L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100
mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10
mg/kg + paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠
de A12, d ≠ L10+A12,e ≠ L100+A12.
5.5. Efeitos da dose única de licopeno sobre as enzimas de defesa antioxidante no
fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
A fim de avaliar o potencial antioxidante da dose única de licopeno no estresse
oxidativo induzido por APAP, a resposta de diferentes enzimas antioxidantes foi testada.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
70
Nos experimentos cujos resultados são apresentados na figura 15, analisamos as
enzimas GPx e GR.
Não foram observadas diferenças em relação a atividade da GPx em nenhum do
grupos experimentais quando comparados ao grupo C (Figura 15A).
Ao analisar a GR, foi observado um aumento de sua atividade nos grupos A12,
L10+A12 e L100+A12 quando comparados ao grupo C, porém, nos grupos eutanasiados 24 h
após a overdose de APAP, a atividade da enzima não foi estatisticamente diferente de C e
mostrou-se diminuida quando comparada aos demais grupos eutanasiados 12 horas após a
overdose de APAP (Figura 15B).
Na figura 16, analisamos as enzimas antioxidantes CAT e SOD.
As atividades da CAT e da SOD não apresentaram diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos experimentais e o grupo C.
Figura 15. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de glutationa peroxidase
e glutationa redutase no modelo de overdose por paracetamol. (A) Atividade de glutationa
peroxidase – GPx (U/mL) e (B) Glutationa redutase – GR (U/mL) no fígado de camundongos
C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100 mg/kg) 1 hora antes da
intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12 e 24 horas após
overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo
licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg +
paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10 mg/kg +
paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os resultados
são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12, d ≠
L10+A12,e ≠ L100+A12.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
71
Figura 16. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade da catalase e da
superóxido dismutase no modelo de overdose por paracetamol. (A) Atividade da Catalase –
CAT (U/mg ptn) e (B) Superóxido dismutase – SOD (U/mL) no fígado de camundongos
C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100 mg/kg) 1 hora antes da
intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12 e 24 horas após
overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo
licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg +
paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10 mg/kg +
paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os resultados
são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12.
5.6. Efeitos da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano oxidativo no
fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
Com o objetivo de avaliar a influência da dose única de licopeno no dano oxidativo
causado pela overdose por APAP, quantificamos os marcadores através do TBARS (Figura
17A) e da proteína carbonilada (Figura 17B).
Em relação ao TBARS, foi observado que houve um aumento significativo do dano no
grupo L10+A12 quando comparado ao grupo C. Em 24 horas, foi observado um aumento do
dano no grupo A24 quando comparado aos grupos C e A12. A dose única de licopeno na
menor concentração foi capaz de reduzir o dano causado pelo APAP 24 horas após a
intoxicação, ou seja, observou-se uma diminuição do TBARS no grupo L10+A24 quando
comparado ao grupo A24. O grupo L100+A24 não teve redução significativa em relação a
A24 e mostrou-se aumentado quando comparado a C.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
72
Ao quantificar as proteínas carboniladas não foi observada diferença estatistica nos
grupos eutanasiados 12 horas após overdose por APAP (A12, L10+A12 e L100+A12) quando
comparados ao grupo C. Já em 24 horas, a concentração de proteínas carboniladas em A24
apresentou aumento quando comparado ao grupo C e, ambas doses de licopeno foram capazes
de reduzir os níveis de carbonilação de proteínas. Logo, L10+A24 e L100+A24 mostraram
uma redução quando comparados ao grupo A24.
Os dados acima sugerem que o licopeno mostrou-se efetivo na proteção contra o dano
oxidativo causado pelo APAP.
Figura 17. Influência da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano oxidativo no
modelo de overdose por paracetamol. (A) Concentração de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico – TBARS (nmol/mg ptn) e (B) de proteínas carboniladas (nmol/mg ptn) no
fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100
mg/kg) 1 hora antes da intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12
e 24 horas após overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h;
L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100
mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10
mg/kg + paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠
de A12, f ≠ de A24.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
73
5.7. Efeitos da dose única de licopeno sobre a atividade da gelatinase MMP-2 no
fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
Para avaliar os efeitos da dose única de licopeno nos distúrbios da matriz extracelular
induzidos por APAP, a atividade de MMP-2 foi avaliada por zimografia em amostras de
fígado.
Ao analisar a intensidade das bandas claras (Figura 18A) e o gráfico densitométrico
(Figura 18B), observou-se uma atividade gelatinolítica elevada de MMP-2 no grupo O e nos
animais eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP (A12) quando comparados ao
grupo C. Além disso, a dose única de licopeno, na maior concentração (grupo L100+A12), foi
capaz de diminir significativamente a atividade de MMP-2 quando comparado ao grupo A12.
O grupo L10+A12 não alterou a atividade de MMP-2, sendo incapaz de reveter a desordem
estabelecida pelo APAP. Nos grupos eutanasiados 24 horas após a overdose de APAP (A24,
L10+A24 e L100+A24) não foram observadas diferenças significativas quando comparados
ao grupo C.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
74
Figura 18. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de MMP-2 no modelo de
overdose por paracetamol. (A) Bandas claras de 72 kDa no gel da zimografia (B) e gráfico
densitométrico demonstrando a atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) no
fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100
mg/kg) 1 hora antes da intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12
e 24 horas após overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h;
L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100
mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10
mg/kg + paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠
de A12.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
75
5.8. Efeitos da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática de
camundongos intoxicados com paracetamol
A fim de avaliar os efeitos da dose única de licopeno na lesão hepática induzida pela
overdose de APAP, secções do fígado foram coradas com HE para vizualização do
parênquima hepático.
As figuras 19A e 19B mostram a histologia com morfologia normal do tecido hepático
nos grupos C e O, respectivamente. Nos grupos A12 e A24 (Figuras 19C e 19F,
respectivamente), o dano celular é visível, observando-se grandes áreas de necrose,
hemorragia e áreas de degeneração hidrópica. Em ambos grupos pré-tratados com a dose
única de licopeno e expostos ao APAP (L10+A12 e L100+A12) (Figura 19D e 19E,
respectivamente) houve danos, porém, em menor extensão quando comparando-se ao A12.
Em 24 horas, somente a dose mais baixa de licopeno (L10+A24) (Figura 19G) foi capaz de
melhorar a aparência morfológica geral em comparação ao grupo A24. Esses resultados foram
confirmados através da quantificação da área de necrose através da análise morfométrica. A
figura 20, mostra a diminuição significativa da porcentagem da área de necrose nos grupos
pré-tratados com a dose única de licopeno (L10+A12 e L100+A12) quando comparados ao
grupo A12. Em 24 horas, a área de necrose foi menor no grupo L10+A24, porém, não no
grupo L100+A24 quando comparados ao grupo A24.
Esses dados mostraram que o licopeno parece ter um efeito protetor contra a
toxicidade exercida pelo APAP no tecido hepático.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
76
Figura 19. Fotomicrografia representativa e porcentagem de área de necrose hepática.
Secções de fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10
mg/kg e 100 mg/kg) 1 hora antes da intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e
eutanasiados em 12 e 24 horas após overdose. Figuras A e B retratam a histologia hepática
normal (grupos C e O, respectivamente), figuras C, D e E (grupos A12, L10+A12 e
L100+A12, respectivamente), figuras F, G e H (grupos A24, L10+A24 e L100+A24,
respectivamente). Coloração: hematoxilina e eosina (HE). Aumento: 400x. Setas: Áreas de
necrose.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
77
Figura 20. Influência da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática no
modelo de overdose por paracetamol. A figura I representa a porcentagem de área de
necrose hepática nos grupos experimentais. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo
paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12:
grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24:
grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg +
paracetamol 24 h. Os resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P
<0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12, e ≠ L100+A12, f ≠ A24.
5.9. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os parâmetros
bioquímicos de função hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após intoxicação
com paracetamol
Ainda com base no experimento 1 e após análise dos resultados do experimento 2,
optou-se pelo estudo do efeitos do pré-tratamento prolongado com licopeno em camundongos
C57BL/6 eutanasiados 12 horas após a intoxicação com APAP.
Na tabela 7 encontram-se os resultados relativos aos parâmetros bioquímicos séricos
(enzimas hepáticas ALT e AST, CT, HDL e FA).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
78
As enzimas hepáticas ALT e AST encontraram-se elevadas 12 horas após
administração do APAP (grupo A12) quando comparadas ao grupo C, mostrando a existência
da injúria do órgão. Não foi observada a diminuição da atividade da enzima nos grupos pré-
tratados por 14 dias com ambas doses de licopeno e posteriormente intoxicados com APAP
(L10+A12 e L100+A12) quando comparados ao A12, mostrando que o licopeno não teve
influência sobre a atividade dessas enzimas.
Em relação ao CT, nos grupos A12 e L10+A12 houve diminuição do conteúdo de CT
quando comparado ao grupo C. O grupo que recebeu pre-tratamento com a dose mais alta de
licopeno, L100+A12, não mostrou diminuição de CT quando comparado ao grupo C. Por
outro lado, houve um aumento de 38% do conteúdo de CT em L100+A12 quando comparado
ao grupo A12.
Todos os grupos expostos ao APAP apresentaram redução da quantidade de HDL
quando comparados ao grupo C, independente do pré-tratamento com o licopeno.
Ainda, a quantidade de FA não foi diferente em nenhum dos grupos experimentais
quando comparado ao grupo C.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
78
Tabela 7. Parâmetros bioquímicos séricos
C O A12 L10+A12 L100+A12
ALT (UI)
22,0±1,8
15,9±0,8
166,0±1,7a
162,0±2,7a
164,1±2,5a
AST (UI) 41,5±4,6 40,2±1,9 143,8±2,5a 139,6±1,6a 139,8±1,6a
CT (mg/dL) 69,3±3,5 82,8±3,6 42,2±3,5a 41,0±4,4a 58,2±5,8
HDL (mg/dL) 39,9±1,7 42,2±2,3 10,8±0,6a 9,0±0,9a 17,0±4,5a
FA (mg/dL) 29,4±4,8 41,0±2,3 28,8±2,6 30,0±2,8 41,1±3,5
Abreviações: ALT: Alanina aminotransferase; AST: Aspartato transaminase; CT: Colesterol total; HDL: lipoproteína de alta densidade; FA:
Frações aterogênicas; C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12
h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. One-way-ANOVA seguido do pós-teste de tukey (P < 0,05). a ≠ do C (n = 7).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
79
5.10. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o sistema
glutationa no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
A análise do sistema glutationa mostrou uma redução na quantidade de GSHt no grupo
A12 quando comparado ao grupo C, o que era esperado visto que a intoxicação por APAP
causa a depleção de GSH nas primeiras horas após a overdose. Essa redução de GSHt foi
revertida nos grupos pré-tratados com licopeno, portanto, houve um aumento de GSHt nos
grupos L10+A12 e L100+A12 quando comparado a A12 (Figura 21A).
O conteúdo da GSH mostrou resultado similar ao da GSHt. No grupo A12 houve
redução de GSH quando comparado ao grupo C e o pré-tratamento com o licopeno (L10+A12
e L100+A12) reverteu essa situação (Figura 21B).
A figura 21C mostra que houve um aumento de GSSG no grupo A12 quando
comparado ao grupo C e este aumento manteve-se no grupo L10+A12. No grupo pré-tratado
por 14 dias com a dose mais alta de licopeno (L100+A12) houve uma diminuição do
conteúdo de GSSG quando comparado ao grupo L10+A12, ainda não havendo diferença
estatística quando entre os grupos L100+A12 e C.
A relação GSH/GSSG mostrou-se diminuída no grupo A12 e no grupo L10+A12
quando comparados ao grupo C, representando um possível estado de desequilíbrio redox, o
que não foi observado no grupo L100+A12, já que esse foi estatisticamente igual ao grupo C.
Os resultados acima apresentados sugerem que o pré-tratamento durante 14 dias com o
licopeno teve efeitos importantes sobre o sistema glutationa.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
80
Figura 21. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o sistema
glutationa no modelo de overdose por paracetamol. (A) Concentração de Glutationa total
(GSHt)(nmol/ml), (B) Glutationa reduzida (GSH), (C) Glutationa oxidada (GSSG) e (D)
Razão GSH/GSSG no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos
com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C:
grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10
mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠
de A12, d ≠ L10+A12.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
81
5.11. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre enzimas de
defesa antioxidante no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
Sobre a atividade das enzimas CAT e SOD, os resultados podem ser observados nos
gráficos da figura 22.
A overdose por APAP reduziu a atividade da enzima CAT 12 horas após a intoxicação
quando comparado ao grupo C. Já o pré-tratamento durante 14 dias com o licopeno
reestabeleceu a atividade da enzima, logo, houve aumento de atividade nos grupos L10+A12
e L100+A12 quando comparados as grupos A12 (Figura 22A).
Em relação a SOD, observou-se um aumento de sua atividade no grupo A12 quando
comparado aos grupo C, bem como os grupos pré-tratados durante 14 dias com o licopeno,
L10+A12 e L100+A12, e porteriormente intoxicados com APAP, também apresentaram
aumento da atividade da SOD quando comparados ao grupo C. L10+A12 e L100+A12 não
foram diferentes de A12 (Figura 22B).
Esses dados confirmam que o pré-tratamento prolongado com licopeno exerce uma
influência sobre a atividade da CAT.
Figura 22. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade de
enzimas antioxidantes no modelo de overdose por paracetamol. (A) Atividade da Catalase –
CAT (U/mg ptn) e (B) Superóxido dismutase – SOD (U/mL) no fígado de camundongos
C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e
eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12:
grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h;
L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os resultados são expressão em
média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
82
5.12. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os marcadores
de dano oxidativo no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
Mais uma vez, a fim de avaliar o efeito do pré-tratamento durante 14 dias com o
licopeno sobre o dano oxidativo causado pela overdose de APAP, a quantidade de TBARS e
proteínas carboniladas foram avaliadas (Figura 23).
A análise de TBARS mostrou um aumento da peroxidação lipídica no grupo
intoxicado com APAP (A12) quando comparado ao grupo C. Os grupos L10+A12 e
L100+A12 apresentaram uma diminuição da peroxidação lipídica quando comparados ao
grupo A12, demonstrando um efeito protetor do licopeno (Figura 23A).
A figura 23B representa o resultado de carbonilação de proteínas que mostrou um
perfil similar ao resultado de TBARS. Houve um aumento de proteínas carboniladas no grupo
A12 quando comparado ao grupo C e uma diminuição no grupo L100+A12 quando
comparado ao grupo A12. Não houve diferenças estatísticas relacionadas ao grupo L10+A12.
Os dados acima sugerem que o pré-tratamento com o licopeno durante 14 dias foi
efetivo na proteção contra o dano oxidativo causado pela exposição ao APAP.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
83
Figura 23. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre marcadores de
dano oxidativo no modelo de overdose por paracetamol.(A) Concentração de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS (nmol/mg ptn) e (B) de proteínas carboniladas
(nmol/mg ptn) no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos
com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C:
grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10
mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠
de A12.
5.13. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o perfil
inflamatório em camundongos intoxicados com paracetamol
A intoxicação por APAP desencadeia um grande número de desordens hepáticas,
como por exemplo, desordens de caráter inflamatório. Sabendo disso, nosso trabalho analisou
o comportamento de CCL2 e IL-22 em amostras de soro e a expressão do RNAm de IL-1β,
IL-6 e IL-10 no fígado de camundongos pré-tratados durante 14 dias com licopeno e
posteriormente expostos ao APAP.
A quantidade de CCL2 mostrou-se elevada no grupo O quando comparado ao grupo C
e os demais grupos, A12, L10+A12 e L100+A12, apresentaram uma redução de CCL2
quando comparados ao grupo O, porém não houve diferenças em relação ao C (Figura 24A).
Em relação a IL-22, um aumento no grupo O quando comparado ao grupo C. Não
houve diferenças do conteúdo de IL-22 nos demais grupos quando comparados ao grupo C
(Figura 24B).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
84
A expressão do RNAm para IL-1β aumentou em 67% no grupo A12 quando
comparado ao grupo C, embora não tenha sido estatisticamente significativo. O pré-
tratamento com o licopeno reduziu a expressão de IL-1β, portanto, L10+A12 e L100+A12
apresentaram uma diminuição da expressão de IL-1β quando comparado ao grupo A12. Em
relação à expressão gênica de IL-6 observamos uma diminuição no grupo A12 quando
comparado ao grupo C e os grupos pré-tratados, L10+A12 e L100+A12, não apresentaram
diferenças em relação aos demais grupos. Ainda, a expressão da citocina IL-10 não
apresentou diferenças estatísticas entre os grupos (Tabela 8).
Figura 24. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade de
CCL2 e IL-22 no modelo de overdose por paracetamol (A) Atividade de CCL2 (quimiocina
ligante 2 (motivo C-C) (µg/mL) e (B) de IL-22 (Interleucina-22) (ng/mL) no soro de
camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos com 10 ou 100 mg/kg de
licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C: grupo controle; O: grupo
óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12
h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os resultados são expressão
em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, b ≠ de O.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
85
Tabela 8. Razão de expressão de mRNA
C O A12 L10+A12 L100+A12
IL-1β
1,00±0,0
1,01±0,6
1,67±0,4
0,68±0,4c
0,58±0,2c
IL-6
1,00±0,0
0,77±0,7
0,32±0,2a
0,37±0,3
0,40±0,4
IL-10
1,00±0,0
1,38±1,4
0,45±0,2
0,57±0,4
0,30±0,2
Abreviações: IL-1β: interleucina -1β; IL-6: interleucina- 6; IL-10: interleucina- 10; C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol
12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. One-way-ANOVA
seguido do pós-teste de tukey (P < 0,05). a ≠ do C; c ≠ do A12 (n = 7).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
86
5.14. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade da
gelatinase MMP-2 no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol
A fim de avaliar a influência do pré-tratamento durante 14 dias com o licopeno sobre a
atividade da MMP-2 no parênquima hepático após intoxicação com APAP, a técnica da
zimografia foi realizada (Figura 25).
A figura 25A mostra as bandas que foram analisadas pela intensidade da cor clara. No
gráfico obtido por densitometria (Figura 25B), houve um aumento da atividade da MMP-2 no
grupo A12 quando comparado ao grupo C. Os grupos pré-tratados com licopeno (L10+A12 e
L100+A12) foram capazes de reverter o aumento da atividade de MMP-2 provocado pela
overdose de APAP, mostrando que o licopeno tem um importante efeito de modulação
relacionado à MMP-2, como já foi visto no experimento 2 (Figura 18B).
Figura 25. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade de
MMP-2 no modelo de overdose por paracetamol. (A) Bandas claras de 72 kDa no gel da
zimografia (B) e gráfico densitométrico demonstrando a atividade de metaloproteinase de
matriz 2 (MMP-2) no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos
com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C:
grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10
mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠
de A12.
Resultados
Bandeira, A.C.B.
88
5.15. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a necrose
tecidual hepática de camundongos intoxicados com paracetamol
O APAP é um agente hepatotóxico que causa danos ao parênquima hepático, como já
foi observado nos resultados do experimento 2. A fim de avaliar o efeito do pré-tratamento
com licopeno durante 14 dias consecutivos sobre a porcentagem de área de necrose após
exposição ao APAP, foi realizada a análise das lâminas histológicas bem como a morfometria
das áreas de interesse. Os grupos C (Figura 26A) e O (Figura 26B) apresentaram histologia
hepática normal, enquanto os demais grupos que receberam APAP (A12, L10+A12 e
L100+A12) apresentaram grandes áreas de necrose (Figura 26C, 26D e 26E,
respectivamente). Os grupos A12 e L10+A12 apresentaram um aumento significativo da
porcentagem da área de necrose quando comparados ao grupo C. O grupo L100+A12 não se
mostrou significativimente diferente do grupo C e apresentou uma menor área de necrose
quando comparado ao grupo A12, apesar de não ser estatisticamente significante (Figura 27).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
89
Figura 26. Fotomicrografia representativa da área de necrose hepática. Secções de fígados de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias
consecutivos com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. Figuras A e B retratam a histologia
hepática normal (grupos C e O, respectivamente), figuras C, D e E (grupos A12, L10+A12 e L100+A12, respectivamente). Coloração:
hematoxilina e eosina (HE). Aumento: 400x. Setas: áreas de necrose. Abreviações: C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol
12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h (n = 7).
Resultados
Bandeira, A.C.B.
90
Figura 27. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a porcentagem
de área de necrose no modelo de overdose por paracetamol.(A) Porcentagem da área de
necrose no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos com 10
ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C: grupo
controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg
+ paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os
resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C.
Discussão
Bandeira, A.C.B.
91
6. DISCUSSÃO
O uso abusivo do APAP, seja por falta de conhecimento ou mesmo intencional, vem
sendo a principal causa de intoxicação e lesão hepática observada na clínica em muitos países
(Reuben et al., 2010). Desta forma, sabendo das propriedades antioxidantes do licopeno e dos
efeitos prejudicais do APAP no metabolismo redox, a hipótese da atual pesquisa foi verificar
se o pré-tratamento com o licopeno, seja ele em dose única ou mesmo um pré-tratamento
prolongado, seria capaz de modular e/ou melhorar o quadro de intoxicação.
Antioxidantes que podem mitigar os efeitos danosos de EROs têm sido o foco de
pesquisas recentes (Rao e Rao, 2007). O efeito protetor de alguns tipos de alimentos é
atribuído à presença de compostos fitoquímicos como carotenóides, tocoferóis e polifenóis, os
quais possuem propriedades antioxidantes. Com base nesses estudos, produtos alimentícios e
suplementos dietéticos com significante potencial antioxidante têm sido o foco de intensas
pesquisas (D'angelo et al., 2009).
O licopeno vem sendo amplamente estudado, principalmente em relação às suas
características preventivas. Esse composto é classificado como um carotenóide que possui
uma cadeia de hidrocarbonetos acíclicos altamente insaturados contendo onze (11) ligações
conjugadas e duas (2) ligações não conjugadas. Devido a essa característica de possuir uma
grande quantidade de ligações conjugadas, o licopeno apresenta uma potente capacidade
antioxidante (Trejo-Solís et al., 2013). Dentre os carotenóides, o licopeno é considerado o
mais poderoso antioxidante e, estudos já demonstraram seus efeitos protetores em diversas
doenças (Di Mascio et al., 1989; Jacques et al., 2013; Ono et al., 2015; Vilahur et al., 2015;
Wang et al., 2015).
O presente estudo foi dividido em três experimentos, de forma que o primeiro
experimento (Experimento 1) teve como objetivo o estabelecimento do modelo experimental
de toxicidade hepática e, para isso, foram avaliados os marcadores de função hepática e o
comportamento do sistema glutationa perante a intoxicação pelo fármaco APAP. Tendo
estabelecido o modelo, realizou-se o segundo experimento (Experimento 2) com o objetivo
principal de estudar o efeito da dose única de licopeno no modelo de hepatotoxicidade
induzido pelo APAP. Em seguida, realizou-se o último experimento (Experimento 3) que teve
como objetivo estudar o efeito de um pré-tratamento de 14 dias com o licopeno no modelo de
hepatotoxicidade. Em ambos os Experimentos 2 e 3, os grupos que receberam apenas o
Discussão
Bandeira, A.C.B.
93
licopeno nas doses de 10 ou 100 mg/kg foram realizados e não apresentaram diferenças
estatísticas quando comparados ao grupo controle (dados não mostrados).
O presente trabalho foi um estudo pioneiro, visto que foi a primeira vez que se
investigaram os efeitos do licopeno no modelo de hepatotoxicidade induzida por APAP, o que
pôde ser observado através de uma breve pesquisa na base de dados PubMed. Até a presente
data (Janeiro de 2017), foram encontrados apenas quatro artigos científicos ao utilizarmos
para a busca de pesquisa as palavras-chave “lycopene and acetaminophen” ou “lycopene and
APAP”. Destes quatro artigos indexados, dois foram produtos dessa tese, a saber: 1)
Lycopene pretreatment improves hepatotoxicity induced by acetaminophen in C57BL/6 mice;
2) Lycopene inhibits reactive oxygen species production in SK-Hep-1 cells and attenuates
acetaminophen-induced liver injury in C57BL/6 mice. Já os outros dois artigos apresentavam
objetivos distintos à nossa proposta. O primeiro artigo, de Le Marchand et al. (Le Marchand
et al., 1997), estuda os efeitos estimulantes do paracetamol e do café sobre a atividade da
enzima CYP1A2, sugerindo efeitos inibitórios dos estrogênios, alcoóis e fontes alimentares,
como tocoferóis, sobre a atividade desta enzima em humanos. O segundo artigo, de
Jamshidzadeh et al. (Jamshidzadeh et al., 2008), estudou os efeitos do extrato de tomate sobre
o estresse oxidativo, em diferentes órgãos, induzido por diferentes modelos de toxicidade em
ratos. Um dos modelos que foi utilizado é o modelo de intoxicação por APAP e, o extrato de
tomate foi utilizado como um tratamento durante 7 dias consecutivos após estabelecida a
hepatotoxicidade, o que figura uma importante limitação do estudo de Jamshidzadeh et al.,
visto que o modelo de overdose por APAP é um modelo reversível em ratos após a retirada do
insulto. A falta de estudos na literatura associando o licopeno ao paracetamol acabou por
limitar a presente discussão em alguns pontos, como a confrontação dos nossos dados com
outros resultados da literatura, porém, por outro lado, tornou o estudo inédito e de
significativa contribuição para a comunidade científica.
O modelo de overdose por APAP em roedores é um dos mais populares modelos in
vivo e amplamente utilizado para testes de novas estratégicas terapêuticas, que incluem
principalmente, os testes com produtos naturais (Jaeschke et al., 2011). A fim de estabelecer
esse modelo e adequá-lo ao nosso grupo de pesquisa, foi realizada uma análise temporal após
intoxicação com 500 mg/kg de APAP. Conforme esperado, a atividade de ALT e AST
mostrou-se aumentada em todos os tempos de eutanásia testados. Altas doses de APAP têm
sido associadas com a alta atividade de ALT e AST (Kozer et al., 2003).
Discussão
Bandeira, A.C.B.
94
O conteúdo de GSH apresentou uma depleção inicial. No entanto, em pouco tempo
esta foi restabelecida. Os dados da GSH e da relação GSH/GSSG mostraram que o pico do
desequilíbrio redox ocorreu 12 horas após intoxicação com APAP. O estudo de Jaeschke et al.
(Jaeschke et al., 2011) confirma que a lesão hepática, em modelos experimentais, se
desenvolve entre 3 e 5 horas, apresentando picos em torno das 12 horas após a overdose.
Essas características da intoxicação por APAP já estão bem estabelecidas na literatura
(Williams et al., 2014) e nossos achados estão de acordo com os dados de estudos
previamente publicados.
Muitos estudos correlacionam a toxicidade induzida pelo APAP ao estresse oxidativo
(Saito et al., 2010; Jaeschke et al., 2012; Mcgill et al., 2012). Devido aos efeitos antioxidantes
conhecidos do licopeno, o Experimento 2 foi realizado, associando o pré-tratamento com a
dose única de licopeno à lesão hepática induzida por APAP. Inicialmente, foi demonstrado
que o licopeno não foi capaz de reduzir a atividade de ALT e AST em 12 e 24 horas após
overdose de APAP. Similarmente, camundongos C3HeB/FeJ que receberam doses tóxicas de
APAP e foram pré-tratados com o antioxidante alopurinol não reduziram a atividade de ALT
a níveis basais (Williams et al., 2014). No entanto, em um estudo com camundongos
C57BL/6 pré-tratados com 5 mg/kg de sulforafano e intoxicados com 300 mg/kg de APAP 30
minutos após o pré-tratamento, mostrou que o sulforafano foi capaz de reduzir os níveis de
ALT e AST 6 horas após a overdose (Noh et al., 2015). Ainda, outro estudo com extrato de
Baccharis trimera, mostrou a diminuição da atividade de ALT e AST sérica em ratos Fisher
expostos a 835 mg/kg de APAP (Pádua et al., 2014). Os diferentes resultados encontrados na
literatura podem ser explicados pela utilização de diferentes compostos terapêuticos,
diferentes doses e modelos experimentais.
Nesse mesmo experimento, o perfil lipídico dos animais intoxicados apresentou
alterações. As concentrações de CT e de HDL apresentaram uma diminuição significativa. Já
está descrito na literatura que doenças hepáticas agudas e crônicas apresentam níveis
reduzidos dos componentes do perfil lipídico (Cicognani et al., 1997; Manka et al., 2014),
isto porque, nessas doenças, existe uma perda de funcionalidade tecidual, com uma
quantidade elevada de hepatócitos mortos (Manka et al., 2014), o que explica a redução de
HDL nos grupos que apresentaram dano hepático, visto que o fígado é o principal produtor de
apolipoproteínas (Tsai et al., 2009).
Discussão
Bandeira, A.C.B.
95
Posteriormente, nossos resultados demonstraram que o licopeno atuou sobre os
biomarcadores de defesas antioxidantes no modelo de overdose por APAP. A menor dose de
licopeno reduziu os níveis de GSSG no tempo de 12 horas. Gupta et al. (Gupta et al., 2013),
observaram que o hepatocarcinógeno N-nitrosodietilamina desencadeia estresse oxidativo no
fígado de camundongos fêmea balb/c e, o pré-tratamento com o licopeno foi capaz de
reestabelecer o equilíbrio do sistema de defesa antioxidante. Da mesma forma, o tratamento
com extrato de tomate por sete dias consecutivos após uma alta dose de APAP foi capaz de
previnir o estresse oxidativo em ratos Spraguey-Dawley (Jamshidzadeh et al., 2008).
No presente estudo, o licopeno demonstrou que possui um efeito protetor contra os
danos causados pelo estresse oxidativo, o qual é causado pelo modelo de toxicidade hepática
induzida pela overdose de APAP. Foi observado que o licopeno atuou reduzindo tanto a
peroxidação lipídica, quanto a carbonilação de proteínas. Nossos resultados corroboram com
os resultados do estudo apresentado por Pádua et al. (Pádua et al., 2014), no qual, ratos Fisher
pré-tratados com uma dose única de Baccharis trimera e intoxicados com APAP reduziram o
conteúdo de peroxidação lipídica e de proteínas carboniladas no fígado. Resultados
semelhantes, em relação à peroxidação lipídica, foram obtidos por Jamshidzadehet al.
(Jamshidzadeh et al., 2008). O tratamento com o extrato de tomate após a overdose de APAP
reduziu os níveis de TBARS em ratos Spraguey-Dawley.
Metaloproteinases de matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas responsáveis pela
clivagem de muitas proteínas de matriz extracelular (Toth e Fridman, 2001). Alguns membros
da família de MMPs, como a gelatinase MMP-2, estão associados com uma variedade de
doenças cardiovasculares (Sawicki, 2013; Liu et al., 2014), invasões tumorais e metástase
(Toth e Fridman, 2001). Ainda, existem evidências que o estresse oxidativo eleva a atividade
da MMP-2 (Kameda et al., 2003). Durante a intoxicação por APAP, as MMP-2 e MMP-9 são
encontradas elevadas indicando sua participação no desenvolvimento do dano hepatocelular e
da disfunção da microcirculação hepática (Ito et al., 2005). O presente estudo mostrou que em
animais intoxicados com APAP, houve um aumento da atividade de MMP-2 após 12 horas de
intoxicação e, a maior dose de licopeno foi capaz de reduzir a atividade da gelatinase a níveis
basais. Corroborando com o resultado em questão, um estudo demonstrou que a silimarina foi
capaz de melhorar a fibrose hepática induzida por tioacetamida através da supressão da
atividade de MMP-2 em ratos (Chen, I. S. et al., 2012). Com isso, nossos dados sugerem que
Discussão
Bandeira, A.C.B.
96
o licopeno tem um efeito protetor nos estágios iniciais do processo de reparo tecidual, visto
que ele foi capaz de reduzir a atividade da MMP-2.
A morte de hepatócitos e outros tipos celulares hepáticos é uma das características das
doenças hepáticas e já é bem estabelecido que as lesões hepáticas induzidas por fármacos
desencadeiam grandes áreas de necrose tecidual (Malhi et al., 2006). De acordo com a análise
histopatológica, o licopeno atuou protegendo o fígado de uma lesão ainda maior. Os
camundongos expostos ao APAP demonstraram uma extensa área de necrose e, o pré-
tratamento com a dose única de licopeno melhorou a aparência do parênquima hepático,
diminuindo a porcentagem de áreas de necrose.
Em nosso estudo observamos melhores resultados do licopeno 12 horas após a
intoxicação por APAP, quando comparamos 12 h vs 24 h. O que pode ser explicado pelo fato
das concentrações plasmáticas e teciduais do licopeno reduzirem entre 12 e 24 horas após a
overdose de APAP. Sabe-se que o licopeno é rapidamente metabolizado em modelos murinos,
tendo um pico plasmático de concentração de 4 a 8 horas e então rapidamente decaindo
(Mathews-Roth et al., 1990; Moran et al., 2013).
O efeito protetor do licopeno observado pode ser atribuído não somente às suas
propriedades antioxidantes, porém também, é possível que ele interfira no metabolismo do
APAP e/ou ainda participe do processo de reparo tecidual. Estudos têm demonstrado que os
carotenóides são capazes de inibir a atividade das enzimas do CYP450. Um estudo conduzido
por Astorg et al. (Astorg et al., 1997), sugere que o licopeno atue na proteção contra lesões
pré-neoplásicas causadas por carcinógenos via CYP2E1 em fígado de ratos. Portanto, sabendo
que a intoxicação por APAP é iniciada pelo NAPQI, um metabólito reativo formado pelo
CYP450 durante o metabolismo do APAP, as substâncias capazes de inibir ou modular a
atividade de CYP450, também seriam capazes de proteger o fígado contra a toxicidade do
APAP, o que poderia ser um dos mecanismos de proteção do licopeno durante o modelo de
overdose por APAP, em adição às suas propriedades antioxidantes. Durante a overdose do
APAP, o funcionamento das células hepáticas é completamente alterado devido à morte
celular por necrose, levando a liberação de mediadores inflamatórios como a proteína de alta
mobilidade Box 1 (HMGB1) (Scaffidi et al., 2002). As células de Kupffer, umas das
principais células envolvidas na defesa hepática, participam da geração de repostas
inflamatórias pelo recrutamento de neutrófilos, monócitos T ou B, linfócitos e células “natural
killer” (NK) ao sítio da lesão. Mediadores inflamatórios gerados pelas células de Kupffer
Discussão
Bandeira, A.C.B.
97
incluem o NFκB, o TNF-α, a IL-1, a IL-6, quimiocinas e EROs. Esses mediadores, por
conseguinte, ativam macrófagos, levando a uma série de eventos que culminam na lesão
tecidual (Ramaiah e Jaeschke, 2007). Alguns estudos têm demonstrado a habilidade do
licopeno como anti-inflamatório, atuando em importantes vias de sinalização, inibindo a
sinalização de HMGB1 (Lee et al., 2012), JNK, NFκB (Ip e Wang, 2014), e IL-1 e IL-6
induzidos por TNF-α (Gouranton, Thabuis, et al., 2011). O NFκB, por exemplo, é um fator de
transcrição importante que coordena as respostas inflamatórias. Ele relaciona-se com as
respostas imune, inata e adaptativa, e ainda, diferenciação celular, proliferação e
sobrevivência em quase todos os organismos multicelulares. Sua atividade é regulada pela
degradação citoplasmática do inibidor do kappa B (IκB). Após estímulos inflamatórios, o IκB
sofre modificações através de fosforilação, liberando o dímero NFκB que, por conseguinte, se
transloca para o núcleo, causando transcrição de genes inflamatórios (Mitchell et al., 2016). A
JNK é um membro da superfamília da MAPK (proteína quinase ativada por mitógenos). A
JNK pode ativar uma grande variedade de cascatas de sinalização celular através de sua
fosforilação e, ainda, ativar membros da família da proteína célula-B de linfoma 2 (Bcl-2)
(Saito et al., 2010). Sobre a HMGB1, essa é uma proteína nuclear que participa de diversas
atividades no núcleo incluindo transcrição, replicação, reparo de DNA e montagem
nucleossomal. Além do seu papel no núcleo, a HMGB1 também pode se translocar para o
citoplasma, onde pode ativar o processo de autofagia ou, para o meio extracelular, onde ela
atua como uma molécula DAMP (padrão molecular associado ao dano) que alerta células
vizinhas e o sistema imune de um perigo imediato, desencadeando a inflamação. Portanto, no
meio extracelular, a HMGB1 está envolvida com o recrutamento de células inflamatórias para
o local da lesão, contribui para a resposta inflamatória promovendo a produção de citocinas e
quimiocinas pró-inflamatórias e, ainda, pode contribuir com o reparo tecidual e a cicatrização
(Venereau et al., 2016). O licopeno pode estar atuando em algumas dessas vias de sinalização,
modulando a inflamação, o que conseqüentemente, poderia estar melhorando o processo de
regeneração tecidual.
Igualmente ao observado no segundo experimento, no Experimento 3, o pré-
tratamento prolongado com o licopeno também não foi capaz de inibir a atividade das
enzimas ALT e AST elevadas pela overdose de APAP. Não existe um consenso acerca da
capacidade do licopeno modular a atividade de enzimas hepáticas. Na literatura, essa questão
tem sido observada em diferentes estudos que demonstram diferentes respostas enzimáticas.
Em um estudo com ratos Sprague-Dawley, o licopeno não reduziu a atividade da enzima AST
Discussão
Bandeira, A.C.B.
98
em um modelo de doença hepática gordurosa não alcoólica (Piña-Zentella et al., 2016). Da
mesma forma, Williams et al., não conseguiram demonstrar, em sua pesquisa, a redução da
atividade da ALT após o pré-tratamento com alopurinol ou oxipurinol no modelo de lesão
hepática induzido por APAP em camundongos C3HeB/FeJ, apesar de terem encontrado
resultados satisfatórios em outros parâmetros analisados (Williams et al., 2014). Em
contrapartida, o licopeno reduziu a atividade de ALT e AST em um modelo de
hiperhomocisteinemia em ratos (Yefsah-Idres et al., 2016). A atividade de ALT e AST são os
mais frequentes biomarcadores utilizados para avaliar lesões hepaticas. Porém, o mecanismo
celular que controla a liberação dessas enzimas ainda não é bem compreendido e sabe-se que
pode não ter relação direta com o ambiente redox hepático (Contreras-Zentella e Hernández-
Muñoz, 2016). Sendo assim, acreditamos que o licopeno atuou melhorando a lesão hepática
induzida pelo APAP, provavelmente influenciando vias que não tiveram relação direta com a
atividade sérica das enzimas ALT e AST.
No experimento 3, foram observadas modificações no perfil lipídico dos animais
tratados com a maior dose de licopeno. Em relação ao CT, foi observada a redução dos níveis
séricos nos grupos intoxicados, exceto no grupo pré-tratado com 100 mg/kg de licopeno. Os
níveis séricos de colesterol HDL também foram afetados nos grupos experimentais. Como já
foi discutido anteriormente, os resultados observados estão relacionados a grande perda de
funcionalidade hepática, o que leva a produção reduzida dos componentes do perfil lipídico
(Cicognani et al., 1997; Tsai et al., 2009; Manka et al., 2014).
A overdose por APAP desencadeia uma cascata de eventos que resultam na morte de
hepatócitos e, o estresse oxidativo tem um papel chave na exarcebação da doença, o que já foi
discutido anteriormente. Nesse experimento, houve modificações nos biomarcadores dos
animais que receberam apenas o APAP, resultante de danos e estresse oxidativo, o que já era
esperado. Já se sabe que o licopeno é o carotenóide mais eficiente na supressão do oxigênio
singleto, sendo duas vezes mais potente que o β-caroteno e dez vezes mais potente do que o
α-tocoferol, em estudos in vitro (Di Mascio et al., 1989). Ainda, ele pode atuar em reações
iniciadas por radicais livres como o radical hidroxila e os radicais peróxidos (Holzapfel et al.,
2013). Características do licopeno, como a sua lipossolubilidade e a sua estrutura química
podem estar relacionadas com o seu potencial na prevenção de doenças que envolvem o
estresse oxidativo como um dos fatores chave. Ele é incorporado nas membranas celulares e
esse é um importante fator de proteção. Ainda, como já foi visto, o licopeno contém um
grande número de duplas ligações, uma característica que reforça sua capacidade antioxidante
Discussão
Bandeira, A.C.B.
99
(Rao e Rao, 2007; Friedman, 2013; Fiedor e Burda, 2014). O pré-tratamento prolongado com
o licopeno foi efetivo na prevenção da oxidação dos lipídios de membrana e proteínas e
preveniu a redução de defesas antioxidantes como, CAT, SOD e GSH, em nosso modelo
experimental. Nossos resultados foram similares a outras publicações onde o licopeno foi
capaz de modular o desequilíbrio redox. Em um estudo com ratos Wistar
hiperhomocisteinêmicos tratados com licopeno (5 mg/kg) por 3 meses obsevou-se uma
redução na concentração de malondialdeído (Yefsah-Idres et al., 2016). Piña-Zentella et al.,
demonstraram que o tratamento com licopeno (20 mg/kg) por 4 semanas em ratos Sprague-
Dawley aumentou a atividade da SOD e da CAT em um modelo de doença hepática gordurosa
não alcóolica (Piña-Zentella et al., 2016). Em um modelo de isquemia/reperfusão hepática em
ratos, o licopeno reduziu os níveis de malondialdeído e aumentou a atividade da CAT
(Bayramoglu et al., 2015). A administração do licopeno em ratos Wistar com
hepatocarcinogênese induzida por dietilnitrosamina reduziu os níveis de malondialdeído,
reforçando a atividade da SOD, CAT e GPx e a quantidade de GSH (Sahin et al., 2014).
Ainda, Sheik-Abdulazeez et al., mostraram que o licopeno foi capaz de reduzir o estresse
oxidativo em um modelo de lesão hepática induzida por D-galactosamina/lipopolissacarídeo
em ratos Wistar, reduzindo a quantidade de malondialdeído e reforçando as defesas
antioxidantes, como CAT, SOD e GSH (Sheik Abdulazeez e Thiruvengadam, 2013).
A IL-22 é um membro da família da citocina IL-10 e representa uma molécula efetora
importante na ativação de células T helper (Th) 22, Th1 e Th17, células T citotóxicas (Tc),
células T gamma/delta (γδ), células NK e células T natural killer (NKT). A IL-22 é conhecida
por ter um papel chave nas defesas antimicrobianas, regeneração e proteção contra danos,
porém, já se sabe que essa citocina tem seu papel em distúrbios inflamatórios podendo atuar
tanto de forma protetora, quanto patogênica (Xing et al., 2011). O papel da IL-22 na
inflamação hepática ainda é obscuro (Park et al., 2011). A natureza dúbia dessa citocina
depende do órgão e das outras citocinas presentes. No fígado, a IL-22 parece atuar
positivamente sobre a sobrevivência dos hepatócitos (Xing et al., 2011). A IL-22 também
pode atuar como um mediador pró-inflamatório durante o desenvolvimento das lesões
hepáticas induzidas por fármacos através da ação sinérgica com as células Th17 (Lai et al.,
2015).
A CCL2 é um membro da família das quimiocinas. Ela pode ser secretada em resposta
a sinais emitidos por citocinas pró-inflamatórias, por exemplo. Tem um papel importante no
Discussão
Bandeira, A.C.B.
100
recrutamento seletivo de monócitos, linfócitos e neutrófilos. Portanto, a CCL2 é um
importante fator quimiotático e, com isso, tem um papel importante em várias condições
patológicas e em diferentes órgãos. Os principais indutores da expressão de CCL2 são a IL-1,
TNFα, interferon gamma (IFNγ), porém outras citocinas e fatores de crescimento como IL-4,
fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF), fator estimulador de colônia de
granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de
crescimento e transformação beta (TGF-β), bem como lipopolissacarídeos, EROs e
complexos imunes podem induzir a CCL2 (Haller et al., 2016).
No presente estudo foi observado que não houve diferença nos níveis de IL-22 e de
CCL2 sérico entre o grupo controle e os grupos que receberam APAP. Ainda, não foram
observadas diferenças na presença do pré-tratamento prolongado, mostrando que o licopeno
não teve influências em relação a IL-22 e CCL-2. Curiosamente, foi observado um aumento
significativo de IL-22 bem como de CCL2 no grupo tratado com o veículo do licopeno, o óleo
de girassol. O óleo de girassol é um óleo rico em ácidos graxos mono e poliinsaturados,
destacando-se o ácido linoléico, um membro da família ômega 6 (Masi et al., 2012). Os
ácidos graxos poli-insaturados ômega 6 e ômega 3 são ácido graxos essenciais que devem ser
obtidos através da dieta visto que os humanos e nem mesmo outros mamíferos são capazes de
sintetizá-los endogenamente devido a falta de enzimas específicas (Simopoulos, 2016). Sabe-
se que a presença do óleo de girassol na dieta reduz o conteúdo de triacilglicerol plasmático,
além de apresentar efeitos benéficos sobre o perfil lipídico. Porém, devido as suas
características químicas, o óleo de girassol pode atuar como pró-inflamatório, atuando
diretamente sobre os macrófagos (Masi et al., 2012). Um desequilíbrio da relação ômega
6/ômega 3 a favor do ômega 6 é considerado pró-trombótico e pró-inflamatório (Simopoulos,
2016).
Sabendo das características dos biomarcadores inflamatórios estudados, IL-22 e
CCL2, os quais podem atuar mediando eventos pró-inflamatórios e, das características do
óleo de girassol, é possível compreender os resultados observados no grupo controle negativo.
O óleo de girassol puro, em contextos específicos, pode ter favorecido eventos inflamatórios.
O mesmo foi observado no resultado da figura 15, onde se observou um aumento da atividade
da MMP-2 no grupo que recebeu o óleo. Sabe-se que a enzima MMP-2 também está
relacionada com eventos pró-inflamatórios.
Discussão
Bandeira, A.C.B.
101
A IL-1β atua como uma citocina pró-inflamatória (Laskin, 2009) e, já foi descrito na
literatura que a exposição ao APAP leva ao seu aumento na corrente sanguínea (Imaeda et al.,
2009). Nossos dados confirmaram que a lesão hepática induzida por APAP aumentou a
expressão do RNAm para IL-1β em 67% no fígado. Ainda, o pré-tratamento com o licopeno
foi capaz de diminuir a expressão do RNAm para IL-1β, mostrando uma possível ação
imunorregulatória do licopeno. A IL-10 é conhecida na literatura como uma citocina anti-
inflamatória (Laskin, 2009) e, em algumas pesquisas, utilizando camundongos deficientes
para IL-10 ou mesmo inibidores dessa citocina, foi observada uma exarcebação da
hepatotoxicidade induzida por fármacos (Bourdi et al., 2002; Kumagai et al., 2009). Já a
citocina IL-6 parece ter um papel dúbio nos sistemas biológicos, podendo atuar tanto como
pró-inflamatória, quanto anti-inflamatória (Scheller et al., 2011). Existem fortes evidências da
importância da IL-6 na modulação da inflamação em diferentes modelos experimentais, como
por exemplo, auxiliando no equilíbrio dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (Xing et al.,
1997; Petersen e Pedersen, 2006). Estudos têm demonstrado que a ausência de IL-6 pode
piorar o curso de uma doença (El-Assal et al., 2004; Deng et al., 2009), indicando que esta
possui importância como mediador anti-inflamatório. No presente estudo, a expressão gênica
de IL-6 encontrou-se diminuída após a intoxicação por APAP. Resultados semelhantes foram
encontrados por Goto et al., no qual culturas primárias de células de Kupffer intoxicadas com
APAP e expostas ao lipopolissacarídeo (LPS) apresentaram um aumento nos níveis de IL-1β
e, concomitantemente, uma redução de IL-6 e IL-10 (Goto et al., 2015). O pré-tratamento
prolongado com o licopeno não foi capaz de aumentar a expressão do RNAm para IL-6
quando comparado aos animais intoxicados, porém também não foi diferente do grupo
controle.
As metaloproteinases de matriz estão envolvidas na degradação da matriz extracelular,
como já foi discutido (Benyon e Arthur, 2001). Elas possuem uma importante ação tanto em
eventos fisiológicos como também em eventos patológicos. A MMP-2 é particularmente
importante na exarcebação dos processos inflamatórios, aumentando a atividade biológica de
IL-8, IL-1β, e TNF-α, e está relacionada à progressão, invasão e metástase de tumores
(Kurzepa et al., 2014). Nos casos de lesão hepática aguda, os hepatócitos, células sinusoidais
hepáticas e células inflamatórias contribuem, todas, para aumentar a expressão de MMP-2
(Benyon e Arthur, 2001). Os dados encontrados na literatura vão de encontro aos resultados
obtidos no estudo, onde a intoxicação por APAP levou a um aumento da atividade de MMP-
2. Em um estudo de Bhatia et al., camundongos fêmea balb/c que receberam N-
Discussão
Bandeira, A.C.B.
102
nitrosodietilamina, um indutor de carcinoma hepatocelular, foram tratados com o licopeno (5
mg/kg) três vezes ao dia, durante 10 semanas. Ao fim do experimento, observou-se uma
redução na atividade gelatinolítica da enzima MMP-2 (Bhatia et al., 2015). Similarmente,
nosso estudo encontrou uma diminuição na atividade da gelatinase após o pré-tratamento
prolongado com o licopeno, resultados que também observamos no experimento anterior.
A overdose por APAP é um modelo de lesão hepática rápida devido aos seus
mecanismos de lesões iniciais durante o metabolismo do fármaco. É possível observar as
modificações histológicas nas primeiras horas após a intoxicação. Em camundongos, grandes
áreas de necrose na região centrolobular podem ser encontradas após a overdose (Malhi et al.,
2006; Kon et al., 2007). Em nosso experimento, foi observado mais de 50% de áreas de
necrose 12 horas após overdose, o que demonstra a agressividade do modelo experimental em
questão. Infelizmente, não foi possível observar um efeito protetor do pré-tratamento
prolongado com o licopeno no parênquima hepático e, conseqüentemente, não houve
diminuição na porcentagem de área de necrose com nenhuma das doses utilizadas. Se as
análises histológicas tivessem sido realizadas em tempos diferentes, posteriores a intoxicação,
poderíamos ter observado melhores efeitos do licopeno no tecido hepático, visto que, foi
demonstrada a modulação de biomarcadores inflamatórios, especialmente dos parâmetros de
estresse oxidativo e da atividade de MMP-2 pelo pré-tratamento prolongado com o licopeno.
Conclusões
Bandeira, A.C.B.
103
7. SUMÁRIO E CONCLUSÕES
Os resultados apresentados nesse estudo concluem que:
No experimento 1, a intoxicação por APAP foi capaz de causar uma injúria hepática,
confirmada pela elevação das enzimas ALT e AST e, foi observado que a depleção da GSH
ocorre nas primeiras horas após a overdose. Esses resultados confirmam a eficácia do modelo
experimental.
No experimento 2, o licopeno reduziu o dano oxidativo sugerido principalmente pela
diminuição da carbonilação de proteínas e reduziu as áreas de necrose melhorando o aspecto
geral da lesão. Ainda, observamos que o licopeno atuou de forma mais evidente 12 horas após
intoxicação por APAP, provavelmente devido às concentrações plasmáticas e teciduais mais
altas do licopeno nas primeiras horas após intoxicação.
No experimento 3, o licopeno não reduziu a atividade das enzimas hepáticas ALT e
AST, como observado no experimento anterior, porém atuou mais uma vez como antioxidante
aumentando a atividade da CAT, aumentando o conteúdo de GSHt e GSH e reduzindo a
concentração de GSSG. O dano oxidativo foi reduzido, com diminuição de TBARS e
proteínas carboniladas. O licopeno atuou modulando aspectos inflamatórios e reduzindo a
atividade de MMP-2, provavelmente melhorando aspectos do reparo tecidual, apesar de não
se ter observado melhora nos aspectos histológicos.
O licopeno é um composto natural capaz de melhorar os danos causados pela
intoxicação por APAP em camundongos C57BL/6, como visto nesse estudo. Mais
experimentos são necessários para concretizar e compreender os efeitos hepatoprotetores do
licopeno nesse modelo animal.
Conclusões
Bandeira, A.C.B.
104
Tabela 9. Tabela comparativa dos efeitos do licopeno nos experimentos 2 e 3
Legenda - NR: não realizado; - : sem efeito; ↑: aumentou em comparação ao grupo intoxicado
com APAP; ↓: diminuiu em comparação ao grupo intoxicado com APAP
Dose única/10
mg/kg
Dose
única/100
mg/kg
14 dias/10
mg/kg
14 dias/100
mg/kg
12h 24h 12h 24h 12h 12h
ALT - - - - - -
AST - - - - - -
CT - - - - - -
HDL - - - - - -
FA - - - - - -
GSHt ↓ - ↓ - ↑ ↑
GSH - - ↓ - ↑ ↑
GSSG ↓ - - - - ↓
GSH/GSSG - - - - - -
GPX - - - - NR NR
GR - - - - NR NR
CAT - - - - ↑ ↑
SOD - - - - - -
TBARS - ↓ - - ↓ ↓
Proteínas
carboniladas
- ↓ - ↓ - ↓
CCL2 NR NR NR NR - -
IL-22 NR NR NR NR - -
IL-1β NR NR NR NR ↓ ↓
IL-6 NR NR NR NR - -
IL-10 NR NR NR NR - -
MMP-2 - - ↓ - ↓ ↓
Área de
necrose
↓ ↓ ↓ - - -
Limitações do Estudo
Bandeira, A.C.B.
105
8. LIMITAÇÕES DO ESTUDO
O presente estudo limitou-se, principalmente, por ser um estudo experimental
utilizando modelo animal, limitando uma possível comparação com resultados em seres
humanos. Ainda, foram utilizadas metodologias distintas para a dosagem da enzima
superóxido dismutase.
Referências Bibliográficas
Bandeira, A.C.B.
106
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA
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Anexos
Bandeira, A.C.B.
120
ANEXO 1
Anexos
Bandeira, A.C.B.
121
Anexos
Bandeira, A.C.B.
122
ANEXO 2
Anexos
Bandeira, A.C.B.
123
ANEXO 3
Anexos
Bandeira, A.C.B.
124
ANEXO 4
Anexos
Bandeira, A.C.B.
125
ANEXO 5