AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE … · 2013-03-25 · Aflatoxinas Ocratoxina...
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AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE MICOTOXINAS EM PRODUTOS DE ORIGEM
VEGETAL
Segurança alimentar e alimentos seguros
ElieneElieneElieneEliene Alves dos SantosAlves dos SantosAlves dos SantosAlves dos SantosFiscal Agropecuário (IMA) - MASP 969101-5
Acordo de Cooperação Técnica 21000.002461/2006-91Lacqsa/Lanagro-MGOutubro - 2009
SeguranSegurançça como Fator de Qualidadea como Fator de Qualidade
QUALIDADE
Controle de perigosquímicos, físicos
e biológicos
SEGURANÇAcorsaborconsistênciatamanhoaspecto
nutrição
SEGURANÇA :Controle de perigosquímicos, físicos
e biológicos
Substâncias químicas produzidas naturalmente por fungos.
Ocorrem em alimentos sob certas condições de umidade e temperatura.
Podem ocorrer no campo, durante o transporte e armazenamento (Soliman etal., 2002).
Causam sérios problemas a saúde humana e de animais (Micco et al., 1989).
MicotoxinasMicotoxinas
Controle de perigosquímicos, físicos
e biológicosMicotoxinasMicotoxinas
Aflatoxinas
Ocratoxina
Zearalenona
Fumonisinas
Desoxinivalenol
Patulina ...
Controle de perigosquímicos, físicos
e biológicos
PaPaííses com e sem regulamentos ses com e sem regulamentos
para para micotoxinasmicotoxinas
6
FAO
2003
Controle de perigosquímicos, físicos
e biológicos
7
Exemplos: Exemplos:
EU: 2 µg/kg para B1 e 4 µg/kg de total
Brasil: Limite máximo de 30µµµµg/kg para aflatoxinas B1 + G1
em produtos para consumo humano, segundo Resolução nº34/76, MS/CNNPA, publicada no Diário Oficial da União em 19/01/77, Seção 1, Parte V.
Limite máximo de 50 µµµµg/kg para aflatoxina total (B1, B2, G1
e G2) em produtos para consumo animal, segundo Portaria MA/SNAD/SFA, nº 07, de 09/11/88, publicada no Diário Oficial da União em 14/11/88.
Mercosul (25/02): 20 µµµµg/kg para aflatoxina total (B1, B2, G1
e G2) em amendoim, milho e derivados.
Limites para Limites para micotoxinasmicotoxinas
O estabelecimento de limites
pressupõe a disponibilidade
de planos de amostragemplanos de amostragem e de
mméétodos analtodos analííticosticos
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
não homogênea homogênea
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinasEvento raroEvento raro
Lote = 10 ppbProporção = 3/10.000 = 0.03%
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
Alimentos não processados – heterogênea (FAO, 1993; Whitaker, 1996)
� Distribuição binomial (milho, amendoim, nozes de árvores)
� Binomial Negativa (castanha-do-brasil)
� Weibel� Lognormal (café)� Gamma
Depende de fatores como composição do produto, tamanho, safra, condições climáticas e outros.
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
Amostra(? kg)
� Lote (µg/kg)(ppb) = amostra ppb ?
� Amostra ppb ≤≤≤≤ Limite ?
Avaliação da contaminação do lote
(25 000 kg)(µg/kg) =? (µg/kg)
Lote
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
Amostra(? kg)
� Lote (ng/g)(ppb) = 10-9g de toxina em 1g de amostra
Avaliação da contaminação do lote
(25 000 kg)(µg/kg) =?
25kg (µg/kg)
Lote 1000 100000 250g
(µg/kg)
1g (µg/kg)
250
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
Aflatoxinas
Contaminações determinadas (µg/kg)
• Amostras (5 kg)• Moinho do USDA• 275 g sub-amostra• análises por TLC
0 0 0 0 3 13 19 41 43 69
Apresentação realizada por Thomas Whitaker USDA/ARS em Belo Horizonte em 16-06-2004, workshop de amostragem em café: Sampling Agricultural Commodities for Mycotoxins
Variabilidade dos resultados
DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas
Aflatoxinas
16
Contaminações determinadas (µg/kg)
0,11
0,52
0,55
0,76
1,06
1,23
1,251,74
2,06 4,33 5,9617,17
39,26
38,11
21,55
19,33
40,38
30,93
35,21
100,93
Amostra: 200kg
Média (µg/kg) =18,12Mediana (µg/kg) = 5,15
CV (%) = 124,4Valor mínimo (µg/kg) = 0,11Valor máximo (µg/kg) =
100,93Variância observada = 612,59
Variabilidade dos resultados
Lote : 4000kg
17
AflatoxinasAflatoxinas –– distribuidistribuiçção Afla totalão Afla total
Amostra: 200kg
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,000,00
0,00 0,00 0,00 0,00
0,62
0,02
0,00
0,00
0,81
0,00
0,00
88,23
Contaminações determinadas (µg/kg)
Média (µg/kg) = 4,48
Mediana (µg/kg) = 0,00
CV (%) = 868,4
Valor mínimo (µg/kg) = 0,00
Valor máximo (µg/kg) = 88,23
Variância observada = 388.60
Lote 25: 4000kg
Variabilidade dos resultados
18
MicotoxinasMicotoxinas -- DISTRIBUIDISTRIBUIÇÇÃOÃO
Variabilidade entre os resultados dos testes
�Grande
�Aumenta com a contaminação do lote
DON (trigo), afla (milho e amendoim), FB (milho) e OTA (café)
�Mais resultados abaixo da contaminação
esperada para o lote - mediana < media
(Risco do comprador)
19
AFLATOXINAS AFLATOXINAS -- DISTRIBUIDISTRIBUIÇÇÃOÃO
19
Contaminações determinadas (µg/kg)Média = 18,8µg/kg mediana = 8 µk/kg
• Amostras (5 kg)• Moinho do USDA• 275 g sub-amostra• análises por TLC
0 0 0 0 3 13 19 41 43 69
AflatoxinasAflatoxinas –– distribuidistribuiçção Afla totalão Afla total
É impossível determinar a verdadeira contaminação
do lote devido àvariabilidade associada com a amostragem,
preparo das amostras e amostragem
21
Limite µg/kg0
Bons Ruins
Lotes aceitos
Lotes bons rejeitados x
x
(Risco do vendedor)
(Risco do comprador)Lotes aceitos
Lotes ruins rejeitados
ConseqConseqüüência da variabilidade ência da variabilidade dos resultadosdos resultados
22
Erros na determinaErros na determinaçção de ão de micotoxinasmicotoxinas
ERRO TOTAL
Lote AmostraSub-
Análise
Amostragem
Erro de Sub-
Análise
90% 10%
Erro total
LoteSub-
Análise
Amostragem
Erro de Sub-
Análise
90% 10%
Lote amostra Sub amostragem
Análise
Erro de amostragem
Erro Preparode amostra
Erro Analítico
90% 10%
amostragem - 90% métodos analíticos - 10%
(Whitaker e Park, 1994) (Whitaker e Park, 1994) (Whitaker e Park, 1994) (Whitaker e Park, 1994)
23
Fontes da variabilidadeFontes da variabilidade
Lote Amostra Preparação Análises
Variância Total
VariânciaAmostragem
VariânciaPreparo de amostras
Variância analítico
ppb(µg/kg)
24
Plano de amostragemPlano de amostragem
O plano de amostragem projetado O plano de amostragem projetado deve definirdeve definir
� os critérios de aceitação do lote em relação a uma probabilidade determinada (normalmente 95%)
�característica estatística de desempenho ou de uma curva operação característica
25
Plano de amostragemPlano de amostragem
Conjunto de procedimentos planejados
�amostragem
�preparo de amostra
� método analítico
Procedimento teste para micotoxinas
Limites de aceitação e rejeição de lotes
26
Procedimentos planejadosProcedimentos planejados
26
a- seleção do lote
b- Retirada da amostra
c- Preparo: moagem/ pasta (~20 mesh) d - Análises e
quantificação
e - Avaliação estatística
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 10 20 30 40 50 60
Aflatoxin Concentration (C) - ppb
Accep
tan
ce P
rob
ab
ilit
y
False Positives
False Negatives
C > C g = Unacceptable
Lots C ≤ C g = Acceptable
Lots
C a = C g
Composto de 5 estComposto de 5 estáágiosgios
27
Lote 1 Lote i Lote n
Amostras 1,3,5,…,x-1 Amostras 2,4,6,…,x
Moagem
Subamostra 2Subamostra 1
ExtratoExtrato
Aliq 2Aliq 1 Aliq 1
Moagem
Subamostra 1
Extrato
Aliq 1
“Design” de Nested, desbalanceado, para amostragem
28
Medida da variância relativa ao processo de amostragem
Medida de variância relativo ao preparo
Medida da variância relativa a análise
Variância total do processo
Dados de análises
29
Teoria estatística
Avaliação do modelo
30
Castanha-do-brasil sem casca
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 1 2 3 4 5 6 7
Sample Aflatoxin Concentration - x (ppb)
Pro
babili
ty o
f O
bta
inin
g x
or Less
Observed
Cg025Pred
Ln2Pred
NbPred
Lot 10 Shelled Brazil Nuts
N=20, Mean = 1.01
Obs Variance = 2.893
Sample: 10 kg (ns = 1,850)
31
Castanha-do-brasil sem casca
Distribuição de aflatoxina total em castanha-do-brasilsem casca
Gama Composta
Binomial Negativa
Lognormal
3232
s s2 = 4,8616C
1,889
R = 0,80
0,1
1
10
100
1000
10000
0,1 1 10 100
Afla total µg/kg
Va
riâ
ncia
da
am
ostr
a -
ss2
Aflatoxina T otal
Lots > 0,39 µg/kg
F itted by GLM, log
Variância da amostracastanha-do-brasil
33
s s s2 = 0,0306C
0,632
R = 0,24
0,001
0,01
0,1
1
10
0,1 1 10 100
Aflatoxina total (µg/kg)
Va
riâ
ncia
do
pre
pa
ro d
a a
mo
str
a s
ss2
Aflatoxina T otal
Lotes > 0,39 µg/kg
F itted by GLM, log
Variância do preparo da amostra castanha-do-brasil
3434
sa2 = 0,0164C
1,117
R = 0,43
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
0.1 1 10 100
Vari
anci
a A
nal
itica
-sa
2
Aflatoxina total (µg/kg)
Aflatoxina Total
Lotes > 0.39 µg/kg
Fitted by GLM, log
Variância do preparo da amostra castanha-do-brasil
3535
Plano de amostragemCurva operacional para aflatoxinas em milho
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 10 20 30 40 50 60
Concentração de aflatoxina no lote (µg/kg)
Probabilidade de aceite
1 kg 5 kg 20 kg Limite
Risco do vendedorLotes bons rejeitados
Lotes ruins aceitos -Risco do Comprador
3636
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg)
Accept P
robabili
ty (
%)
DFP - Shelled Brazil Nuts
BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted
Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion
Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD
Maximum Level = 20 Total Aflatoxin (ug/kg)
Accept/Reject Limit = 20 (ug/kg)
Maxim
um
Lim
it
1
2
3
6
4
1 - 1x20 kg < 20 ug/kg
2 - 1x30 kg < 20 ug/kg
3 - 1x40 kg < 20 ug/kg
4 - 2x20 kg < 20 ug/kg
5 - 2x10 kg < 20 ug/kg
6 - 3x10 kg < 20 ug/kg
5
Plano de amostragemCurva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca
3737
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg)
Accept
Pro
babili
ty (
%)
DFP - Shelled Brazil Nuts
BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted
Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion
Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD
Maximum Level = 15 Total Aflatoxin (ug/kg)
Accept/Reject Limit = 15 (ug/kg)
Maxim
um
Lim
it
1
23
5
4
1 - 1x20 kg < 15 ug/kg
2 - 1x30 kg < 15 ug/kg
3 - 1x40 kg < 15 ug/kg
4 - 2x20 kg < 15 ug/kg
5 - 3x10 kg < 15 ug/kg
Plano de amostragemCurva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca
3838
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg)
Accept P
robabili
ty (%
)
Export
BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted
Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion
Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD
Maximum Level = 10 ng/g Total Aflatoxin
Accept/Reject Limit = 10 ug/kgM
axim
um
Lim
it
1x10 kg
2 x10 kg
3x10 kg
4x10 kg
Plano de amostragemCurva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca
39
ReduReduçção dos riscosão dos riscosProcedimento Variância
5 kg 521,4
Subamostra 250g – M1 59,2
TLC 1 alíquota 50,1
Total 630,7
2o kg 130,4
Subamostra 100g – M2 25,5
HPLC 1 alíquota 20,1
Total 176,0
4040
Método de amostragem
Conjunto de procedimentos planejados que permitem fazer a tomada de amostras REPRESENTATIVAS de um determinado lote ou sublote;Indica o número, a massa e a frequênciados incrementos a serem retirados em cada amostragem
4141
LOTE (t)
Incrementos (g)
Amostra global(kg)
Amostragem
Quantidade de produto retirada em um só ponto do lote ou sublotepara formar a amostra global
Formada pela totalidade dos incrementos colhidos em um lote ou sublote
Formada a partir da amostra global, podendo ser igual a estaLaboratório
Quantidade de produto com características definidas sob
condições essencialmente iguais
Amostra de trabalho (kg)
4242
•Representativa
�Aleatória
�Chance igual
�Não tendenciosa
Amostragem
Retirada da amostra
43
• Lote apresentar as condições necessárias;
• Incrementos devem ser retirados de vários pontos cobrindo completamente o lote;
• Equipamentos apropriados
Amostragem
4444
Armazenamento e amostragem de café para análise de ocratoxina A
4545
4646
Amostragem em big bag
4747
Os caladores ou coletores de incrementos deverão ser definidos de acordo com o local da coleta, o tipo de grão e deverão ser adequados para coletar incrementos (g).
Atingir o máximo de profundidade.
Amostragem
4848
Cálculo da frequênciade amostragem
Verificar
� Massa do lote
� Massa da amostra global
� Massa do incremento
Amostragem
4949
Lotes: sacas, caixas, big bags, etc.
Calcular a freqüência da amostragem:
Freqüência da amostragem
(F)=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg)
Amostra global(kg) X capacidade da embalagem(kg)
Em que:
F = freqüência de amostragem: indica a frequência ou
intervalos regulares de amostragem ou o número de
embalagens individuais das quais será colhido um
incremento.
As casas decimais serão arredondadas para o número
inteiro mais próximo.
Calcular o número de incrementos a serem retirados;
5050
Exemplo: Lote = 25 toneladas de amendoimMassa do incremento = 200gMassa da amostra global = 20kgCapacidade da embalagem = 60kg
F=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg)Amostra global(kg)Xcapacidade da embalagem(kg)
F= 25.000 kg x 0,200kg = 4,16 ~= 520kg x 60 kg
a cada 5 sacos será retirado um incremento de 200g
No final: 25.000 kg divididos por 60 kg = 416 sacosDos quais 100 serão amostrados: 20 kg
Coleta das amostras de amendoim - IN 03
�Mercado Interno e países do MERCOSUL – anexo II
�Mercado Interno (varejo) – anexo III
�Mercado Internacional (exceto MERCOSUL e União Européia)
– anexo IV
�União Européia – anexo V
52
ANEXO IICritérios para amostragem de Lotes de Amendoim
Destinados ao Mercado Interno e países do MERCOSUL
Massa do loteMassa ou nºde sub-lotes
Nº de incrementos
Massa do increment
o
Massa da amostra global
Massa mínima da amostra de trabalho
Descascado Em casca
≥≥≥≥ 500 t 100 t
100 200 g 20 kg
5 kg 7 kg
> 100 e < 500 t 5 sub-lotes
≥≥≥≥ 25 e ≤ 100 t 25 t
> 15 e ≤ 25 t 1 sub-lote
> 10 e ≤ 15 t - 80 16 kg
> 5 e ≤ 10 t - 60 12 kg
> 1 e ≤ 5 t - 40 8 kg
53
ANEXO IIICritérios para amostragem de Lotes de Amendoim
Destinados ao Mercado Interno (varejo)
Massa do lote
Nº de incrementos
Massa do incremento
Massa da amostra global
Massa da amostra de trabalho
sem casca
com casca
sem casca
com casca
sem casca
com casca
> 0,5 e < 1 t
30
200 g 270 g
6 8,1 5 7
> 0,2 e < 0,5 t
20 4 5,4 4 5
> 0,1 e <0,2 t
15
3 4,0 3 4
< 0,1 102 2,7 2 2,7
54
ANEXO IVCritérios para amostragem de Lotes de Amendoim
Destinados ao Mercado Internacional(exceto MERCOSUL e União Européia)
Massa do loteMassa ou nº de
sub-lotesNº de
incrementos
Massa do incremento
(descascado)
Massa da amostra global
Massa da amostra de
trabalho
≥≥≥≥ 500 t 100 t
100
200 g
20 kg 20 kg
> 100 e < 500 t 5 sub-lotes
≥≥≥≥ 25 e ≤ 100 t 25 t
> 15 e ≤ 25 t 1 sub-lote
> 10 e ≤ 15 t - 80 16 kg 16 kg
> 5 e ≤ 10 t - 60 12 kg 12 kg
> 1 e ≤ 5 t - 40 8 kg 8 kg
≤ 1 t - 10 2 kg 2 kg
55
ANEXO VCritérios para amostragem de Lotes de Amendoim
Destinados à União Européia
Massa do loteMassa ou nºde sub-lotes
Nº de incrementos
Massa do incremento
Massa da amostra global 2
Massa da amostra de trabalho
≥≥≥≥ 500 t 100 t
100
300 g
30 kg 30 kg
> 100 e < 500 t 5 sub-lotes
≥≥≥≥ 25 e ≤ 100 t 25 t
> 15 e ≤ 25 t 1 sub-lote
> 10 e ≤ 15 t -
> 5 e ≤ 10 t - 80 24 kg 24 kg
> 2 e ≤ 5 t - 60 18 kg 18 kg
> 1 e ≤ 2 t - 40 12 kg 12 kg
> 0,5 e ≤ 1 t - 30 9 kg 9 kg
> 0,2 e ≤ 0,5 - 20 6 kg 6 kg
> 0,1 e ≤ 0,2 - 15 4,5 kg 4,5 kg
≤ 0,1 - 10 3 kg 3 kg
1 Adaptada do Regulamento CE nº 401/2006 da Comissão Européia de 23/02/2006.2 Nos casos de lotes vendidos a varejo, a massa da amostra global pode ser diferente.
Amostragem
Coleta de incrementos
Amostra global
Mercado interno e MERCOSUL Homogeneização
e fracionamento
Amostra de
trabalho
Mercado externo
(exceto MERCOSUL)
Amostra global = amostra de trabalho
Laboratório
57
Lote em movimento (por exemplo em
esteira) pode ser considerado estático se
a amostragem for realizada no saco
imediatamente após o ensacamento
senão calcular mediante a vazão da
esteira ou da quantidade que é ensacada
ou processada por dia.
Amostragem de lotes em movimento
58
Preparo da amostra
Preparo: moagem/pasta(~20 mesh)
MoagemPastaamendoim: água (1:1,5 v/v)
59
Preparo da amostra – Moinhos
Tipo Turrax
60
Preparo da amostra – Moinhos
61
ModeloCapacidade aproximada
Motor (rpm) Volt.Dimensões (cm)
Larg. x Prof.Altura (cm)
Peso (kg)
UM-12 12 l – 7 kg
1750 - 3500
Trifásica
220ou
380V
70 x 45 97 55
UM-25 25 l – 15 kg 80 x 77 120 125
UM-44 44 l – 27 kg 90 x 77 125 140
UM-130E 130 l – 80 kg 140 x 112 190 600
Preparo da amostra – Moinhos
Multiprocessadora de Alimentos Cutter Mixer(Linha UM)
62
Extração Purificação
Suporte sólido
Impureza
Anticorpo anti micotoxinas
Micotoxinas
Extrato da amostra
Ampliação após
passagem do extrato
da amostra na IAC
CLAE
Detecção quantificação
CCD
Detecção quantificação
Análises e quantificação de micotoxinas nas amostras