Aminosavak HPLC elemzése 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-származékokként

Doktori értekezés

Jámbor Andrea

Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Perlné Dr. Molnár Ibolya, D.Sc.

Hivatalos bírálók: Dr. Bősze Szilvia, Ph.D. Dr. Gazdag Mária, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Klebovich Imre, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Török Ilona, Ph.D. Dr. Józan Miklós, Ph.D.

Eötvös Lóránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék

Budapest

2009

1

Tartalomjegyzék

1. Rövidítések jegyzéke ............................................................................... 5

2. Irodalmi áttekintés .................................................................................. 7

2.1 Az aminosavak meghatározása a gázkromatográfia (Gas Chromatography,

GC) felhasználásával .......................................................................................... 7

2.2 Az aminosavak meghatározása a folyadékkromatográfia (Liquid

Chromatography, LC) módszereivel ................................................................ 8

2.2.1 Az ioncsere folyadékkromatográfia (Ion Exchange Chromatogaphy, IEC); az

aminosav analizátor ........................................................................................ 8

2.2.2 A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC) ............................................................................. 10

2.2.3 Az ultra nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (Ultra Performance

Liquid Chromatography, UPLC).................................................................. 10

2.2.4 Az aminosavak elemzése származékképzés nélkül ....................................... 11

2.2.5 Az aminosavak elemzése oszlop előtti származékképzéssel ......................... 12

2.2.5.1 Származékképzés 5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-kloriddal (5-

dimethylaminophthalene-1-sulfonyl chloride, DANSYL-Cl)................ 13

2.2.5.2 Származékképzés 4-dimetil-amino-azobenzol-4’-szulfonil-kloriddal (4-

dimethylaminoazobenzene-4’-sulfonyl chloride, DABSYL-Cl)............ 13

2.2.5.3 Származékképzés fenil-izotiocianáttal (phenyl isothiocyanate, PITC) .. 14

2.2.5.4 Származékképzés 6-amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamáttal

(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC) ............... 14

2.2.5.5 Származékképzés orto-ftálaldehiddel (ortho-phthalaldehyde, OPA)

kéntartalmú segédanyagok jelenlétében ................................................. 15

2.2.5.6 Származékképzés 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-kloriddal (9-

fluorenylmethyloxycarbonyl chloride, FMOC-Cl)................................. 16

a) A puffer és a pH szerepe ........................................................................ 19

b) Az FMOC reagens oldószere, a reakcióelegy fázisaránya ..................... 20

c) A műveleti üres kérdése ......................................................................... 20

2

d) Az FMOC és az aminosavak reakciója .................................................. 21

e) Az FMOC feleslegének elvétele............................................................. 22

f) A His és a Tyr kérdése............................................................................ 22

g) A származékok stabilitása ...................................................................... 24

2.3 Az aminosavak meghatározása a vékonyréteg kromatográfia (Thin Layer

Chromatography, TLC) felhasználásával ...................................................... 24

2.4 Az aminosavak meghatározása a kapilláris elektroforézis (Capillary

Electrophoresis, CE) felhasználásával............................................................ 24

2.5 Az aminosavak meghatározása a mágneses magrezonancia spektroszkópia

(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) felhasználásával........ 26

2.6 A plazma szabad aminosav (Plasma Free Amino Acid, PFAA) tartalmának

meghatározása .................................................................................................. 27

2.6.1 A PFAA mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel ........ 27

2.6.2 Egyidejű fehérjementesítés és származékképzés........................................... 29

2.6.3 A daganatos betegek aminosav anyagcseréjének változása .......................... 30

3. Célkitűzések ...........................................................................................33

4. Kísérleti rész ..........................................................................................34

4.1 Vegyszerek........................................................................................................... 34

4.2 A minták .............................................................................................................. 34

4.3 A modell oldatok................................................................................................. 34

4.4 A puffer oldatok.................................................................................................. 34

4.5 A reagens oldatok ............................................................................................... 35

4.6 Származékképzés ................................................................................................ 35

4.6.1 A reagens oldatok jellemzése ........................................................................ 35

4.6.2 Optimális származékképzés és fehérjementesítés ......................................... 35

4.7 Kromatográfiás körülmények ........................................................................... 36

4.8 A pH-mérő készülék ........................................................................................... 38

3

5. Kísérleti eredmények és következtetések............................................39

5.1 Az aminosavak és az FMOC reakciójának tanulmánya és az abból eredő

következtetések ................................................................................................. 39

5.1.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői ................................. 39

5.1.2 A pH változás értékelése ............................................................................... 41

5.1.3 A műveleti üres szennyezőinek értékelése .................................................... 42

5.1.4 Az FMOC reagens feleslegének elvétele....................................................... 45

5.1.5 A FL- és az UV válaszjelek összehasonlítása ............................................... 46

5.1.6 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az FMOC reagens

abszolút koncentrációjának és az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának

függvényében ............................................................................................... 47

5.1.7 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő a puffer pH

értékének és az FMOC reagens oldószerének függvényében ...................... 51

5.1.8 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az aminosavak

tulajdonságainak függvényében ................................................................... 53

5.1.9 A His és a Tyr kérdése................................................................................... 54

5.1.10 A Cys mérése............................................................................................... 67

5.1.11 Reprodukálhatósági vizsgálatok .................................................................. 69

5.2 Az FMOC-aminosavak elválasztásának optimálása ....................................... 71

5.2.1 Az oszlopok tulajdonságainak hatása az elválasztás hatékonyságára ........... 71

5.2.2 A hőfok hatása az elválasztás hatékonyságára .............................................. 75

5.2.3 Az eluens pH értékének hatása az elválasztás hatékonyságára ..................... 76

5.2.4 Az eluens összetétel hatása az elválasztás hatékonyságára ........................... 78

5.3 Módszerfejlesztés, plazma minta előkészítése: az egyidejű származékképzés

és fehérjementesítés optimálása ...................................................................... 80

5.3.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői ................................. 80

5.3.2 A fehérjementesítés és a származékképzés optimálása ................................. 82

5.3.3 A módszer validálása..................................................................................... 83

5.3.4 Emlőrákos betegek plazma szabad aminosav tartalma műtét előtt és után ... 86

4

6. Összehasonlító tanulmány: az aminosavak meghatározása OPA/tiol,

OPA+FMOC, valamint FMOC származékképző szerekkel............89

6.1 A reagensek jellemzői......................................................................................... 91

6.2 A reakció, valamint a képződött fő- és melléktermékek jellemzői................. 91

6.3 A származékok elválasztásának gyakorlati tapasztalatai ............................... 93

6.4 Alkalmazhatóság a különböző biológiai mátrixok esetében, összegzés ......... 94

7. Összefoglalás, az értekezésben foglalt új tudományos eredmények 95

8. Summary, new scientific statements....................................................96

9. Irodalomjegyzék ....................................................................................97

9.1 Hivatkozott irodalmak jegyzéke ....................................................................... 97

9.2 Saját közlemények jegyzéke ............................................................................ 109

10. Köszönetnyilvánítás ..........................................................................110

5

1. Rövidítések jegyzéke ACN acetonitril

ADAM 1-aminoadamantán

AMQ 6-amino-kinolin

AQC 6-amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamát

CE kapilláris elektroforézis

CLND kemilumineszcens nitrogén detektor

Cys-(FMOC)2 N,S-(FMOC)2-cisztein

(Cys)2-(FMOC)2 N,N-(FMOC)2-cisztin

CZE kapilláris zónaelektroforézis

DABSYL-Cl 4-dimetil-amino-azobenzol-szulfonil-klorid

DAD fotódiódasoros detektor

DANSYL-Cl 5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-klorid

EC elektronbefogásos detektor

ELSD gőzfázisú fényszórás detektor

EtOH etanol

FID lángionizációs detektor

FL fluoreszcens

FMOC-Cl 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-klorid

GC gázkromatográfia

HEPA heptilamin

His-1 N-FMOC-hisztidin

His-2 N,NH-(FMOC)2-hisztidin

HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

HPTLC nagyhatékonyságú vékonyréteg kromatográfia

IEC ioncsere folyadékkromatográfia

LC folyadékkromatográfia

LED fénykibocsátó dióda

LID lézerindukált fluoreszcenciás detektor

LOQ mennyiségi mérés határértéke

MCE 2-merkapto-etanol

6

MEKC micellás elektrokinetikus kromatográfia

MeOH metanol

MRM többszörös ionkövetéses

MS tömegszelektív detektor

MS-MS tandem tömegspektrometria

NMR mágneses magrezonancia spektroszkópia

NP-HPLC normál fázisú folyadékkromatográfia

OPA orto-ftálaldehid

PAD pulzáló amperometriás detektálás

PFAA plazma szabad aminosavak

PITC fenil-izotiocianát

RP-IP-HPLC fordított fázisú ionpár-folyadékkromatográfia

RSD relatív standard deviáció

SFI szelektív ionkövetéses

SSA szulfoszalicilsav

TBDMS terc-butil-dimetilszilil

TCA triklór-acetát

TFEA trifluorecetsav anhidrid

THF tetrahidrofurán

TLC vékonyréteg kromatográfia

TMS trimetil-szilil

Tyr-1 N-FMOC-tirozin

Tyr-2 N,O-(FMOC)2-tirozin

UPLC ultra nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

UV ultraibolya

Az aminosavak az IUPAC szerinti nemzetközi hárombetűs kóddal rövidítettek [1].

7

2. Irodalmi áttekintés

Az irodalmi áttekintés során az aminosav meghatározására alkalmazott eljárásokat

mutatom be, különös tekintettel a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)

területén alkalmazott különböző származékképzési módszerekre.

Az élő szervezet testnedveiből és szöveteiből a szabad- és a fehérje hidrolizátumok

aminosav tartalmának minőségi-mennyiségi meghatározása, valamint a fehérjék

aminosav- sorrendjének ismerete a modern biokémia, az orvostudomány, a klinikai

diagnosztika, a genetika, a taxonómia, az élelmiszeripar, a vegyipar és a gyógyszeripar

számára alapvetően nélkülözhetetlen. Az aminosavak nem csak a fehérjék építőkövei,

hanem energiaforrásként szolgálnak, egyes neurotranszmitterek, porfirinek, poliaminok

és nitrogén-oxidok bioszintézisének prekurzorai [2].

A kromatográfiás technikák fejlődésével lehetőség nyílt a sokösszetevőjű minták

érzékeny meghatározására, valamint hatékony királis aminosav elválasztási módszerek

fejlesztésére.

Az eltérő célú aminosav-tartalom elemzések a kromatográfiás technikát is

meghatározhatják. Először a gázkromatográfia, majd a folyadékkromatográfia

módszereit ismertetem.

2.1 Az aminosavak meghatározása a gázkromatográfia (Gas Chromatography,

GC) felhasználásával

A GC az aminosavak elválasztására széleskörűen, sokféle detektálással alkalmazott

eljárás [2]: hátránya a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) módszereivel

szemben, hogy az aminosavak mindkét csoportjának előzetes származákká alakítását

igényli. Az aminosavak GC meghatározásának klasszikus alapjait, és nagyszámú

származékképzési technikát ismertet az 1987-ben, Gehrke szerkesztésével megjelent

három kötetes mű [3]. A GC technika egyik jelentős eredményét holdkőzetek lehetséges

aminosav tartalmának meghatározása jelentette. A kőzeteket az Apollo 11 hozta a 17.

útjáról [4,5].

8

Az aminosavak klasszikus GC meghatározása a két lépésbeni – munka- és időigényes –

származékkészítésen alapszik. Első lépcsője a karboxilcsoport észteresítése, amelyet az

aminocsoport acilezése követ. Az észteresítésre leggyakrabban használt alkoholok a n-

butanol [6], a n-propanol [7] és az izobutanol [8]. Az acilezési lépés mind ecetsav-

anhidriddel [9,10], mind propionil-kloriddal [11] megvalósítható. Leggyakrabban a

perfluoroacil [12] vegyületekkel acileznek, amelyek lehetővé teszik a lángionizációs

detektornál (FID) nagyobb érzékenységű elektronbefogási detektor (EC) használatát. A

fehérjealkotó aminosavak eltérő szerkezetű oldalláncai megnehezítik az acilezés során

alkalmazható körülmények (hőfok, reakcióidő) egységesítését: az Arg és a His

származékká alakulása szempontjából optimális hőfokon a Trp már bomlásnak indul. A

leggyakrabban trifluorecetsav anhidridben (TFEA) [13], metilén-klorid/TFEA

elegyében [6], vagy acetonitril (ACN)/TFEA elegyében acileznek [14,15].

Az aminosavak egylépcsős származékká alakítása trimetil-szilil- (TMS) [12,16,17] és

terc-butil-dimetilszilil reagensekkel (TBDMS) [18-20] széleskörben alkalmazott

módszer, amely sajnálatos módon egynél több terméket ad [21].

Az 1990-es évek elején írták le az aminosavak egylépcsőbeni észteresítését és

alkilezését az alkil-kloroformát vegyületekkel [22-24]. A reakció a víz-alkohol-piridin

megfelelő arányú elegyében egyszerűen kivitelezhető, melynek során a megfelelő N-

(O,S)-alkiloxi-karbonil-alkil-észterek keletkeznek, a termékek szerves oldószerbe

átrázhatóak [2,23]. A kloroformát kiterjesztette a GC-vel vizsgálható aminosavak

spektrumát: kiküszöbölték ezzel a módszerrel az N-metil-His, a Ser és a Gln részleges

veszteségét vagy teljes elbomlását az injektorban [25].

2.2 Az aminosavak meghatározása a folyadékkromatográfia (Liquid

Chromatography, LC) módszereivel

2.2.1 Az ioncsere folyadékkromatográfia (Ion Exchange Chromatogaphy, IEC); az

aminosav analizátor

Az aminosavak minőségi-mennyiségi meghatározására kidolgozott automatikus

aminosav analizátorok ötven éve működnek, az IEC elvén. Hosszú ideig az egyetlen

9

módszer volt ezen a területen [26]. Az ioncserélő kromatográfia őse, a nátrium-

aluminínium-szilikát, mint cserélő mátrix, az 1850-es években jelent meg. Fejlődésének

óriási lendületet adott az Adams és Holmes által elkészített szintetikus organikus

ioncserélő gyanta [27]. Az IEC módszer lényege, hogy különböző pH értékű puffer

oldatokkal, kationcserélő oszlopon választják el az aminosavakat, majd az effluenst

ninhidrin reagensbe vezetik, ezt követi az UV detektálás (440-570 nm) [2,28]. A

ninhidrinnel festési eljárás a primer aminosavak esetében bíbor színű (abszorpciós

maximum = 570 nm) terméket eredményez. A szekunder Pro és a Hyp sárga

(abszorpciós maximum = 440 nm) színnel festődik [2].

A kromatográfiás elválasztást követő származékkészítés hátránya a kémiai reakció

kivitelezéséhez szükséges többlet műszerezettség magas költségigénye. A reagens

oldatot kiegészítő pumparendszerrel kell az oszlop eluátumhoz adni, ezen kívül szükség

van keverőre és termosztálható reaktorra is.

Az oszlop utáni származékképzést először az aminosavak IEC meghatározásánál

alkalmazták. E technika ma is fontos szerepet játszik az elemzésekben, bár az eredeti,

Spackman és munkatársai által kidolgozott módszert [29] a nagyobb érzékenység, a

gyorsabb elemzés és a nagyobb fokú automatizálás érdekében tovább fejlesztették [30-

32]. Növényi szövetek szabad aminosavait – mintegy 59 komponenst – választottak el a

Pickering rendszer használatával [32], 42ºC hőfokon, ninhidrin reagenssel, oszlop utáni

származékkészítéssel. A detektálás érzékenységének növelése céljából először a

fluoreszkamin reagenst [33], majd az orto-ftálaldehidet (OPA) és valamely tiol tartalmú

segédanyagot [34] alkalmazták ninhidrin helyett.

Az aminosav analizátorok használata háttérbe szorult az 1960-as években, először a GC,

majd az 1970-es évektől a HPLC vette át a vezető szerepet az aminosav elemzésekben.

Ennek oka egyrészt a hosszas elemzési időkben, s a kizárólagos elemzési feladatra való

alkalmasságában keresendő. További hátránya, hogy a ninhidrin reagál a biológiai

mátrix egyéb összetevőivel is [2].

10

2.2.2 A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC)

Az elmúlt negyven évben az LC nagymértékű fejlődésével korlátlan lehetőségek nyíltak

a preparatív és az analitikai kémiai célú aminosav elemzések előtt. A modern,

nagyteljesítményű HPLC módszerek elterjedésével, a detektálási lehetőségek

bővülésével, az egyre jobb minőségű és szélesebb választékú kromatográfiás oszlopok

alkalmazásával, valamint a számítástechnika előretörésével - az adatgyűjtés és az

adatfeldolgozás területén - az elemzési költségek és idők nagymértékű csökkenését

tapasztalhattuk. Mindezen tényezők ugrásszerűen növelték a kutatások és a gyakorlati

alkalmazások fejlődésének ütemét is.

Az aminosavak HPLC elemzésének két nagy területét különíthetjük el:

a) a származékképzés nélküli elválasztásokat (2.2.4 fejezetben részletezett),

valamint

b) a származékokkénti elemzéseket (2.2.5 fejezetben részletezett).

2.2.3 Az ultra nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (Ultra Performance

Liquid Chromatography, UPLC)

Az UPLC készülék, amely a Waters terméke, hatékonyabban és gyorsabban választ el,

mint a klasszikus HPLC [35]. Előnyének lényege, hogy az alkalmazott elválasztó

kolonna töltete kis szemcseátmérőjű (1,7 µm [36]), nagy külső felületű, ezáltal - a van

Deemter összefüggés értelmében - nagy kinetikai hatékonyság érhető el. A kisebb

szemcseméret szűk kromatográfiás zónákat eredményez, így egységnyi idő alatt több

összetevőt tudunk elválasztani [37]. Az UPLC magas nyomáson dolgozik (15000 psi).

A napjainkban kifejlesztett technikát alkalmazták aminosavak meghatározására 6-

amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamát (AQC)-származékokként (UV

detektálással) [36], valamint származékképzés nélkül (tandem MS módszerrel) [38].

11

2.2.4 Az aminosavak elemzése származékképzés nélkül

Az elmúlt húsz évben több módszert javasoltak az aminosavak származékképzés nélküli

HPLC meghatározására [39-46]. E módszerek előnye, hogy kiküszöbölik a reagens

feleslege/ bomlása vagy a minta egyéb összetevőivel alkotott vegyületek okozta

szennyező csúcsok zavaró hatását.

Mind normál fázisú folyadékkromatográfiás (NP-HPLC) [39], mind fordított fázisú

ionpár-kromatográfiás (RP-IP-HPLC) [40] elválasztásra tettek javaslatot, de a

módszerek a rossz reprodukálhatóságuk miatt nem terjedtek el.

Az aminosavak többsége, az aromás gyűrűt tartalmazó Phe-t, Tyr-t és Trp-t kivéve, nem

fluoreszkál, érzékeny és szelektív meghatározásuk optikai detektorral nem lehetséges.

Néhány biológiailag aktív, kéntartalmú aminosav [Cys, (Cys)2, Met és glutation] nagy

érzékenységű mérését írták le [41] pulzáló amperometriás detektálással (PAD) [42]. A

HPLC elválasztásoknál az univerzális detektorokat, mint a gőzfázisú fényszórás

detektort (ELSD) [40,46], a tömegszelektív detektort (MS) [43] és a kemilumineszcens

nitrogén detektort (CLND) [44,45] is használják.

A felsorolt detektorok közül az MS a legelterjedtebb, mivel a biológiai minták gyakran

tartalmaznak olyan egyéb összetevőket, melyek az aminosavak meghatározását

zavarhatják. Ez elkerülhető az MS detektorok alkalmazásával. További nagy előnye,

hogy különbséget tesz az izotóp és az izobár aminosavak (Ile-Leu) között. Anyagcsere

vizsgálatra kiválóan alkalmas: izotópjelzett szubsztrátok kimutathatók [2].

Az MS detektorok szelektív ionkövetéses (SFI) üzemmódja lehetővé teszi az el nem

váló komponensek minőségi – és mennyiségi azonosítását [47]. A tandem

tömegspektrometria (MS-MS) alkalmazásával a módszer érzékenysége tovább

növelhető [48]. 21 aminosavat elemeztek narancslében 40 perc alatt [49]. A mérési idő

csökkenthető, 1,5 perc alatt 19 aminosav meghatározását is megvalósították [50].

Többszörös ionkövetéses (MRM) technikával a komponensek száma növelhető, 76

aminosavat elemeztek 20 perc alatt [51].

12

2.2.5 Az aminosavak elemzése oszlop előtti származékképzéssel

Az aminosavak HPLC elemzése körében az oszlop előtti származékképzés a

leggyakoribb. Elterjedtségét a rendelkezésre álló származékképző szerek

sokféleségével, a fordított fázisú oszlopok eredményezte hatékonyabb elválasztásokkal

és az általánosan használt, ugyanakkor megfelelően érzékeny detektorok (UV, FL)

alkalmazásával magyarázhatjuk. A származékká alakítás előnye, hogy a

származékképző csoportok egyszerre hidrofóbok és kromofórok, jelentős mértékben

növelhetik a retenciós tényezők közötti különbséget, javítják a detektálás érzékenységét

és szelektivitását. A felhasználók általában a célfeladatnak megfelelően és a

rendelkezésre álló műszereik alapján választanak. Így napjainkban is újabb és újabb

lehetőségek után folynak kutatások. Az ideális származékképző szernek a következő

tulajdonságokkal kellene egyidejűleg rendelkeznie:

a) gyors és kvantitatív reakciót adjon az aminosavakkal;

b) lehetőleg vizes közegben, szobahőfokon végbemenjen a származékképzés;

c) stabil származékot képezzen;

d) mind a primer, mind a szekunder aminosavakkal reagáljon;

e) feleslege és az esetleges mellékreakciók ne zavarják a kromatográfiás

elválasztást;

f) az oldalláncukon egyéb reaktív csoportot tartalmazó aminosavakkal egy-egy

csúccsal eluálódó származékot adjon;

g) megfelelő érzékenységű, szelektivitású, lehetőleg fluoreszkáló származékot

képezzen;

h) a módszer gazdaságos legyen.

Ezen legfontosabb feltételek alapján rendszerezhetjük és értékelhetjük a leggyakrabban

alkalmazott származékképző szereket.

Az elmúlt tíz év irodalmi adatait tekintve megállapítható, hogy a szobahőfokon

kivitelezhető reakciókat előnyben részesítik: a legtöbbször alkalmazott származékképző

szer az OPA+tiol (36%-a az összes HPLC elválasztásoknak 1999. és 2009. március

között). (Tudományos keresőprogramok: SCOPUS, Web of Science alapján

feldolgozott adatok.) Ezt követik az egyre elterjedtebb FMOC-Cl (19%), valamint az

egyre kisebb jelentőségű DABSYL-Cl és DANSYL-Cl (együttvéve 19%) alkalmazások.

13

2.2.5.1 Származékképzés 5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-kloriddal (5-

dimethylaminophthalene-1-sulfonyl chloride, DANSYL-Cl)

A DANSYL-Cl-dal származékképzést Gray és munkatársai vezették be 1963-ban [52].

O2S

N CH3CH3

NH CH COOH

R

SO2Cl

N CH3CH3

NH2 CH COOH

R

+

1. ábra: DANSYL-Cl reakciója aminosavakkal

Előnye, hogy reagál mind a primer, mind a szekunder amino csoporttal [52]. Királis

elválasztás céljából γ-CD-el alkalmazzák [53,54]. Jellemzője, hogy a reakció pH 9,5-10

értékű, adott arányú szerves/vizes oldatokban zajlik [55]. Hátránya, hogy szobahőfokon

24 óra alatt teljes [55]; emelve a hőfokot a reakcióidő csökken (60 perc) [56-58]; 80ºC

hőfokon 30 perc alatt kvantitatív a származékképzés [59,60]. A reakció során

fluoreszkáló melléktermékek (DANSYL-OH és DANSYL-NH2) keletkeznek, melyek

az aminosav-származékokkal együtt eluálódnak, az elválasztást zavarják [55]. Alacsony

a származékok UV érzékenysége [55].

2.2.5.2 Származékképzés 4-dimetil-amino-azobenzol-4’-szulfonil-kloriddal (4-

dimethylaminoazobenzene-4’-sulfonyl chloride, DABSYL-Cl)

A DABSYL-Cl-ot 1975-ben Lin és munkatársai alkalmazták először [61].

N N SO2ClNCH3

CH3

NH2 CH COOH

R

+

N N SO2NCH3

CH3

NH CH COOH

R 2. ábra: DABSYL-Cl reakciója aminosavakkal

14

Előnye, a DANSYL-Cl-hoz viszonyítva, hogy a DABSYL-Cl-dal képzett termékek

fluoreszkálnak. Mind a primer, mind a szekunder amino csoporttal reagál; a képződött

származékok stabilak. UV- és FL detektálással egyaránt mérhetőek [55], a képződött

szulfonamid 420 és 450 nm közötti abszorpciója miatt a biológiai eredetű mintákban

jelenlévő kisebb hullámhosszakon abszorbeáló szennyezők zavaró hatása

elhanyagolható [62-65]. Jellemzője, hogy a kvantitatív származékképződéshez a

szerves/vizes oldat térfogataránya 1:1, a használt puffer pH értéke 8,5-9,5 [55].

Hátránya, hogy nagy hőfokon teljes a reakció (67ºC, 10 perc [66]; 70 ºC, 15 perc [67]).

2.2.5.3 Származékképzés fenil-izotiocianáttal (phenyl isothiocyanate, PITC)

Az aminosavak feniltiokarbamoil származékokkénti HPLC elemzését 1977-ben

Zimmerman és munkatársai írták le [68].

N C S NH C

S

NH CH COOH

R

NH2 CH COOH

R

+

3. ábra: PITC reakciója aminosavakkal

Előnye, hogy reagál mind a primer, mind a szekunder aminocsoporttal; a reakció

szobahőfokon 5 perc alatt teljes; a képződött származékok stabilak, vízmentes

közegben, mélyhűtőben korlátlan ideig eltarthatóak [55]. Hátránya, hogy

a) a származékképzés során sok zavaró melléktermék képződik, melyeket a

kromatográfiás oszlop védelme érdekében vákuum segítségével el kell távolítani

[69], valamint hogy

b) a keletkezett származékoknak kicsi az érzékenysége [70].

2.2.5.4 Származékképzés 6-amino-kinolin-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamáttal (6-

aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC)

Az AQC és az amino csoport reakciótermékek HPLC elemzését Cohen dolgozta ki

1993-ban [71]. A módszer továbbfejlesztett UPLC változatát Duchateau írta le [36].

15

N

NH

O

ON

O

O

N

NH

O

NH CH COOH

R

OH N

O

O

NH2 CH COOH

R

+

+

4. ábra: AQC reakciója aminosavakkal Előnye, hogy az AQC hidrolíziséből képződő 6-amino-kinolin (AMQ) és az aminosav-

származékok emissziós spektrumának maximumai 60 nm-re térnek el egymástól, így

nem zavarja az elválasztást. A keletkezett származékok stabilak [71,72]. Ezzel a

módszerrel igen alacsony kimutatási határt értek el, érzékenysége fmól tartományba

esik [55]. Jellemzője, hogy a származékképzés széles pH tartományban (pH 8,0-10,5)

kvantitatív [55]. Hátránya, hogy 10 perc alatt 55ºC hőfokon teljes a reakció [73,74],

valamint az Orn-nal nem reagál [71].

2.2.5.5 Származékképzés orto-ftálaldehiddel (ortho-phthalaldehyde, OPA)

kéntartalmú segédanyagok jelenlétében

Az első cím szerinti összetétel, Roth ajánlásában, 1971-ben az OPA/2-merkaptoetanol

(MCE) volt [75].

CHO

CHON

S R1

CH COOH

RR

1SH NH2 CH COOH

R

+ +

5. ábra: OPA+tiol tartalmú segédanyag reakciója aminosavakkal

Előnye, hogy a reakció gyors (1-2 perc); szobahőfokon teljes; nincs szükség a

reagensfelesleg eltávolítására; FL- és UV detektálás egyaránt alkalmazható, s a módszer

érzékeny [76-79]. Jellemzője, hogy vizes közegben, pH 9-10 értékű oldatokban reagál

az aminosavakkal. Hátránya, hogy csak a primer aminocsoportúakkal képez

származékot [55], melyek nem stabilak [78]; mind az OPA-, mind a tiol tartalmú

segédanyag feleslege másodlagos termékek keletkezéséhez vezet [55].

16

Az OPA/tiol-módszer hiányosságát kiküszöböljék – miszerint a szekunder

aminocsoportú Pro és Hyp nem mérhetők -, az OPA-t 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-

kloriddal (FMOC-Cl) párosítva, kétlépcsős származékképzést javasoltak [80]. Első

lépésben az OPA a primer amino csoportokkal, második lépésben az FMOC a

szekunder amino csoportokkal reagál. A módszer hátránya, hogy mérés közben

hullámhossz-váltást kell beiktatni [81,82].

2.2.5.6 Származékképzés 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-kloriddal (9-

fluorenylmethyloxycarbonyl chloride, FMOC-Cl)

Az FMOC egy 3 gyűrűs (6+5+6), poliaromás vegyület nagy kiterjedésű, delokalizált

elektronrendszerrel. Az FMOC-ot 1972-ben írták le Carpino és munkatársai a

peptidkémiában az amin védőcsoportjaként [83]. Majd 1979-ben mutattak rá, hogy a

primer és a szekunder aminokkal egyaránt fluoreszkáló terméket eredményez [84].

Származékképző reagensként a folyadékkromatográfia területére 1983-ban Einarsson

vezette be [85].

O

O Cl

O

O NH CH COOH

R

NH2 CH COOH

R+

6. ábra: FMOC-Cl reakciója aminosavakkal

Előnye, hogy mind a primer, mind a szekunder amino csoporttal reagál, a reakció

szobahőfokon gyors [83], az FMOC reagens elkészítése egyszerű [85], a származékok

néhányat kivéve stabilak [85]. Jellemzője, hogy adott arányú szerves/vizes közegben

teljes a reakció, az enyhén lúgos közeg kedvező [55]. Hátránya, hogy a kromatogramon

a reagens hidrolízisterméke, az FMOC-OH, széles csúccsal eluálódik [85,86]. Számos

módszert javasoltak az FMOC-OH nem kívánatos zavaró hatásának kiküszöbölésére

[85,87-95], a maradéktalan eltávolítása nem megoldott.

17

O

O Cl

OH

+ OH2 + CO2 ClH+

7. ábra: FMOC-Cl hidrolízise

Az irodalomban alkalmazott reakciókörülményeket az 1. táblázat tartalmazza,

amelyeket az (a-g) pontok alapján értékelek.

18

1. táblázat: Az aminosavak és az FMOC-Cl reakciójának származékképzési és kromatográfiás körülményei: irodalmi adatok

Jelölések: V=víz; AC=aceton; ACN=acetonitril; sav=10 μL jégecettel savanyított; ADAM=1-aminoadamantán.HCl; HEPA=heptilamin; *a puffer, a reagens és a reagensfelesleg eltávolítására szolgáló vegyület koncentrációja a reakcióelegy össztérfogatára vonatkoztatva; [As]T=az aminosavak együttes mennyisége; 90:10v=9:10 (v/v); No/perc=az összetevők száma/elúciós idő percben kifejezve; m=’mono-származék’ (N-FMOC-hisztidin, N-FMOC-tirozin); d=’di-származék’ [N,NH-(FMOC)2-hisztidin, N,O-(FMOC)2-tirozin]; 240f=csepegtetve; b=borát; k=karbonát; #=aminosavak és aminok együtt; =N-(9-fluorenilmetoxikarboniloxi)szukcinimid; &=40C-os hőfokon.

Származékképzés feltételei Puffer

M* Só pH Oldószer: (v/v) FMOC: mM*;

[FMOC]/[As]T Idő: mp

Reagensfelesleg eltávolítása (mM)*: Tyr His No/

perc

Műve-leti

üres

Hivat- kozás

0,1 b 7,7 AC:V=1:1 7,5; 31,25:1 30-40 extr: C5H12 ; sav m d 20/20 - [85] 0,1 b 7,7-8,0 AC:ACN:V=1:1:2 7,5; 37,5:1 40 extr: C5H12 ; sav m - 21/92 - [96] 0,1 b 6,0-8,5 AC:V=1:1 3,75-30; 15,6–125:1 15-120 extr: C5H12 m - 19/54 - [97] 0,1 b 7,7 AC:V=1:1 7,5; 31,25:1 40 extr: C5H12 - - 12/50 - [98]

0,01 b 7,7 AC:V=1:1 0,5; 11,4:1 45 ADAM (20) m+d m+d 19+2/30 - [88] 0,05 b 9,5 THF:V=1:1 3,9; 1,54:1 240f - - - 9/24 - [95] 0,05 k 8,0 AC:V=1:1 2; 16:1 600 extr: C5H12 :EtAc =90:10v m+d d 20+1/35 - [93] 0,1 b 7,85 AC:ACN:V=1:1:2 2; 20:1 600 extr: C5H12 m+d d 18+1/40 - [99]

0,05 b/k 8,0 AC:V=1:1 3; 7,2:1 60 extr: C5H12 or, ADAM (30) m+d m+d 20+2/45 - [100] 0,1 b 8,5 ACN:V=1:1 8; 16,7:1 90 NH2OH+NaOH (50) m+d m+d 30/30 - [89,101] 0,1 b 7,7 AC:V=1:1 7,5; 2,3:1 40 extr: C6H14 m - 13/25 - [87] 0,1 b 8,5 ACN:V=1:1 8; 16,7:1 90 NH2OH+NaOH (50) m m 15/30 - [102]

0,11 b 8,5 AC:V=2:2,5 1,33; 5:1 180 HEPA (10,5) m d 24/75# - [91] 0,18 b 8,0 AC:V=5:6 1,36; 97:1 120 ADAM (12,5) m+d d 16+1/45 - [103] 0,05 b 8/11,4 AC:V=1:1 3; 75:1 2-40perc extr: C5H12 m+d m+d 19+2/40 + [104]

0,125 b 8,8 ACN:V=1:1 7,75; 18:1 90 NH2OH+NaOH (33) m m 17/35 - [105] 0,166 b 8,0 AC:V=1:2 0,33-4; 1; 5,5-66,6:1 45-300 ADAM (3) m d 16/50 + [106] 0,16 b 9,9 ACN:V=2:3 4; 4:1 60 Extr. C7H16 m m+d 25+1/80 - [94] 0,08 b 10,0 ACN:V=2:3 6; 24-120:1 300 ADAM (86) m d 16/40 + [107]

0,035 b 9,0 ACN:V=4,5:5,5 1,9; 1:1 60 ciszteinsav (4,7 ) m - 18/80 - [90] 0,325 k 10,2 AC:V=1:1 1,7; 72:1 1200 cc.HCl (460) m m 25/32# + [92] 0,125 b 8,5 ACN:V=1:1 7,75; 69:1 90 NH2OH+NaOH (30) m m 16/43 - [108] 0,143 k 10,2 AC:V=1,15:1 2,67; 31,4:1 600 & cc.HCl (357) m d 27/43# - [109]

0,1 b 8,0/9,0 ACN:V=1:1; AC:V=1:1 0,25- 5; 2,75–55:1 1-20perc ADAM (6,2) vagy HEPA (7,8) m+d m+d 22+2/40 + [110]

19

a) A puffer és a pH szerepe

A leggyakrabban alkalmazott puffer a borát puffer (1. táblázat), melynek kapacitása a

reakciónak kedvező pH 8,5 - 9,5 tartományban optimális [111].

A pH 6 [97] - pH 11,4 [104] értékű pufferek alkalmazásával a reakcióelegyre

vonatkoztatott puffer koncentráció 0,01 M [88] – 0,325 M [92] között változott. 11

esetben pH 8 értékű [85,87,88,93,96,98-100,103,104,106], 8 esetben pH 9 értékű [89-

91,101,102,105,108,110], 5 esetben pH 10 értékű [92,94,95,107,109] puffert használtak.

4 esetben karbonát puffert alkalmaztak [92,93,100,109]. A gyakorlat során a borát

puffer előnyösebbnek bizonyult. Használata előtt nem kell semlegesíteni a mintát, s a

mérés kedvezőbb, ugyanis a karbonát puffer alkalmazása során felszabaduló CO2 zavar

[100].

Jóllehet a reakciónak a lúgos közeg kedvez, mégis a ≥ pH 10 értékű puffer kedvezőtlen

választás lenne. Számos hátránya van, melyek egymásból következnek, úgymint:

1. a reagens hidrolízisének sebessége a pH érték emelésével nő,

2. a gyorsuló hidrolízis miatt nagyobb FMOC koncentrációt kellene alkalmazni,

mely több FMOC-OH képződésével jár,

3. az FMOC-OH szélesebb csúccsal eluálódik a kromatogramon,

4. mely megnehezíti a szomszédos aminosavak elválasztását (hogy mely és mennyi

aminosavval euálódik együttesen, függ az alkalmazott grádienstől).

Az irodalmi adatok alapján pH 6 - pH 11,4 értékű puffer oldatokat választottak, melyek

számított átlaga pH 8,5. A reakcióelegy tényleges pH értékéről irodalmi adat nincs.

Schilb egyedi módszert dolgozott ki, mely szerint cseppenként adagolta az FMOC

reagenst az aminosavakat tartalmazó oldathoz, és az egyes frakciók között 15 mp-et

várt. Célja volt, hogy a reagens melléktermékeit csökkentse, mert úgy gondolta, az

FMOC az aminosavakkal gyorsabban reagál, mint ahogy elhidrolizál [95].

Brückner vizsgálta a hőfok hatását (4-60ºC) a származékképzés sebességére:

szignifikáns különbséget az aminosav-származékok válaszjelében nem tapasztalt, ezért

a kvantitatív reakcióhoz a szobahőfokot találta kedvezőnek [103]. Lozanov 40ºC

hőfokot javasolt a reakció kivitelezéséhez (10 perc, 2,7 mM acetonban oldott FMOC

reagens, pH 10,2) [109].

20

Az FMOC-aminosavak királis elválasztását foglalja össze Péter Antal visszatekintő

tanulmánya [112].

b) Az FMOC reagens oldószere, a reakcióelegy fázisaránya

Az FMOC szerves oldószerben oldódik, vízzel hidrolizál; a származékképzési

reakciónak a vizes elegy kedvez. Következésképpen, kevés kivételtől eltekintve, a

szerves és a vizes fázis térfogataránya 1:1 (1. táblázat). 3 esetben tértek el a fenti

aránytól: szerves/vizes = 1:2 [106] és 2:3 [94,107] térfogatarányt javasolnak. Minél

nagyobb a vizes fázis aránya, annál nagyobb az FMOC-OH mennyisége.

Az FMOC reagens oldószere aceton és ACN, egy esetben használtak THF-t [95]. Az 1.

táblázatban részletezett 24 esetből 13 esetben alkalmaztak acetont [85,87,88,91-

93,97,98,100,103,104,106,109] és 7 esetben ACN-t [89,90,94,102,105,107,108]. Egy

esetben összehasonlító kísérletet végeztek a két oldószerre vonatkozóan, mely szerint az

aceton elegyében gyorsabb a reakció, mint ACN tartalmúban [89]. Aceton tartalmú

reakcióelegyet alkalmazva egy nagy műveleti üres csúcs zavarja az elválasztást, mely az

FMOC-OH és az FMOC feleslege és/vagy származékai között eluálódik. Ezt a nagy

csúcsot és az egyéb szennyező csúcsok megjelenését korábban is tapasztalták, de

részletesen nem írtak róla [104].

c) A műveleti üres kérdése

Az FMOC reagensből származó műveleti üres tekintetében kevés irodalmi adat áll

rendelkezésre. Jóllehet a pmól tartományban mérés esetén a szennyező csúcsok

figyelembe vétele kötelező. A szennyezésre vonatkozó irodalmi megjegyzések

[92,104,106,107] mennyiségi számításokat nem tartalmaznak, miszerint:

1. a megállapítások választott tartományokra vonatkoznak [104],

2. a mennyiségi mérés határértékeit (LOQ) befolyásolják [106],

3. bemutattak egy műveleti üres kromatogramot, s további részletes elemzésük

nélkül megjelöltek három ismeretlen csúcsot [107],

21

4. megjegyezték, hogy FMOC-Cl alkalmazása esetén sok ismeretlen csúcs

eluálódik a poliaminok tartományában [92].

Kísérletes munkám során – jóllehet HPLC tisztaságú vegyszereket és hidrogén-

peroxiddal tisztított edényeket használtam - számos, az egyes aminosavakkal együttesen

eluálódó szennyező csúcsokat mértem. Megállapítható, hogy a mérések hiteles

értékelésének és az eredmények reprodukálhatóságának érdekében a szennyező csúcsok

mennyiségi ismerete alapvetően nélkülözhetetlen.

d) Az FMOC és az aminosavak reakciója

Az irodalmi adatok e tekintetben a legkuszábbak: látszólag egymásnak ellentmondó

szélsőséges reakciókörülményeket találunk (1. táblázat). Az irodalmi feltételeket

elemezve az alábbi következtetéseket vonhatjuk le:

1. Az FMOC koncentrációt a reakcióközegre vonatkoztatva, mM-ban fejeztem ki,

hogy a reakciókörülmények összehasonlíthatóak legyenek. Irodalmi adatok

alapján 0,5 mM [88] az alkalmazott legkisebb, és 8,0 mM [101,102] a

legnagyobb reagens koncentráció.

2. Egyetlen tanulmányt kivéve, ahol az FMOC/aminosav mólaránya 1:1 [90],

minden esetben kisebb-nagyobb feleslegben alkalmazták a reagenst. Kritikus

pont a reakciókörülmények optimálási folyamatában, hogy mekkora a szükséges

minimális mólfelesleg, ahol a reakció kvantitatív.

3. A kvantitatív származékképzéshez szélsőséges, 30 mp [85] és 40 perc [104]

közötti reakcióidőket javasolnak. Az irodalmi adatokat tanulmányozva kitűnt,

hogy az idő megválasztása kritikus az Asp, a Glu, az Asn, a Gln, a Ser, és a Thr

esetében. Leglassúbb a reakciója a dikarbonsav aminosavaknak, az Asp-nak és a

Glu-nak [88,89].

Az irodalomban javasolt tisztázatlan, szélsőséges reakciókörülmények tették

szükségessé a kvantitatív származékképzés eléréséhez a minimális FMOC/aminosav

mólarány, az FMOC reagens koncentráció és a szükséges reakcióidő optimálását.

22

e) Az FMOC feleslegének elvétele

Az FMOC-OH folyamatos képződését elkerülendő az aminosavak kvantitatív

származékképzése után a reagens feleslegének eltávolítása előnyös. Erre a célra kétféle

javaslatot ismerünk:

1. az FMOC-ot szerves oldószerbe extraháljuk [85,87,93,94], vagy

2. az FMOC feleslegét aminocsoportúakkal [88,89,91] elvesszük (1. táblázat).

1. Az extrakcióhoz szerves oldószerként pentánt [85,93,96-100,104], pentán/etil-

acetát elegyét [93], hexánt [87], vagy heptánt [94] alkalmaztak. Az extrakció

hátránya, hogy az aminosav-származékok csak veszteséggel jutnak a szerves

fázisba, különösen a két FMOC csoportúak [85]. A hiány aceton tartalmú

reakcióelegyből származékkészítés után nagyobb, mint ACN tartalmúból [85].

Továbbá minél nagyobb az extrakciós oldat polaritása, annál nagyobb a

veszteség (dietil-éter esetében 25%) [85]. Pentánt alkalmazva a ≤20 pmól/

aminosav/ injektált mennyiség esetén a His, az Orn és a Lys 50-75%-a elvész

[113]. Miller a pentán/etil-acetát = 9:1 térfogatarányú eleggyel javasolta az

extrakciót, ilyenkor nincs mérhető veszteség, jóllehet az FMOC-OH

mennyiségét nem sikerült jelentős mértékben csökkenteni [93].

2. Az FMOC felesleg eltávolítására aminocsoportúakat: 1-aminoadamantánt

(ADAM) [88,100,103,106,107], NaOH-ban oldott NH2OH-t

[89,101,102,105,108] és heptilamint (HEPA) [91]; ciszteinsavat [90] vagy

tömény sósavat [92,109] használtak. A sósav kivételével reakciótermékeik a

kromatogramon zavaró csúcsokként eluálódnak [88-91]. Betnér -

összehasonlító tanulmánya alapján - az FMOC feleslegének elvételére az

ADAM-t javasolja: az FMOC-származéka stabil, a reakció során más

melléktermék nem keletkezik, és borát pufferben jól oldódik [113].

f) A His és a Tyr kérdése

A His és a Tyr két FMOC-cal is reagálhat. Az első FMOC a primer amino csoporttal: N-

FMOC-hisztidin (His-1) és N-FMOC-tirozin (Tyr-1), míg a második a His esetében az

oldallánci imidazol csoport N-jével: N,NH-(FMOC)2-hisztidin (His-2) és a Tyr esetében

az oldallánc aromás hidroxil csoportjával: N,O-(FMOC)2-tirozin (Tyr-2) reagál [86].

23

Következésképpen a két aminosavnak négy formája lehet, melyek négy csúccsal

eluálódhatnak [88,89,100,104]. Elválasztásukat a többi aminosav-származékkal mind

pmól- (21 FMOC-származék, azaz 19+2 csúcs [88]), mind nmól tartományban (22

FMOC-származék, azaz 20+2 csúcs [100]) bemutatták, képződésük és átalakulásuk

folyamatait nem elemezték [88,100]. Két részletesebb tanulmány készült a His és a Tyr

mono- és di-származékainak képződéséről és átalakulásáról [89,104].

1. Ha az FMOC feleslegét pH 10 és 12 értékű oldatokban NaOH és hidroxilamin

elegyével reagáltatjuk, 1 perc reakcióidő letelte után a di-származékok

hidrolizálnak, a fő termékek a mono-származékok [89]. - A His-1 2,5-szer

nagyobb válaszjelű csúcsot adott, mint a His-2; a Tyr-1 2,3-szor nagyobbat,

mint a Tyr-2. Látható, hogy Haynes [89] elképzelése a magasabb pH értéket

illetően nem valósult meg, miszerint pH 10 és 12 közötti oldatokban a His-2 és

a Tyr-2 mennyiségileg visszaalakult volna His-1-gyé és Tyr-1-gyé. Továbbá

ezen a pH értéken a többi FMOC-aminosavnak mintegy 25%-a bomlik [89].

2. Bank [104] a származékképzést pH 8,0 és 11,4 értékű pufferben, mindkét

esetben 2 és 40 perc reakcióidő után vizsgálta.

A His esetében pH 8,0 értékű puffert alkalmazva mind 2, mind 40 perc

után a His-2 válaszjele a domináns. 2 perc után a His-1 csupán a huszada

lehet a His-2 területének, míg 40 perc után a mono-származék csúcsa

nem mérhető.

pH 11,4 értékű puffer esetében 2 és 40 perc után a His-1 és a His-2

területének összege közel egyenlő. A területarányuk idővel nő: His-

1/His-2 = 1:1 (2 perc) és His-1/His-2 = 8:1 (40 perc).

A Tyr esetében pH 8,0 értékű puffert alkalmazva 2 perc után nagyobb a

Tyr-1 területaránya: Tyr-1/Tyr-2 = 2:1; 40 perc után a Tyr-2 válaszjele a

jelentős: Tyr-1/Tyr-2 = 1:4.

pH 11,4 értékű puffer esetében mind 2, mind 40 perc után a Tyr egy

csúcsként, Tyr-2-ként eluálódik [104].

24

g) A származékok stabilitása

Az irodalmi adatok egyöntetűen azt mutatják, hogy az FMOC-származékok, a His-2-t

kivéve, szobahőfokon-hűtőszekrényben (4ºC), világosban-sötétben 13 napig stabilak. A

His-2 bomlási félideje: szobahőfokon 5-6 nap, hűtőszekrényben 4 hét (aceton/víz = 1:1

térfogatarányú, pH 7,7 értékű borát puffer elegyében). A fény nem katalizálja a bomlást

[85].

2.3 Az aminosavak meghatározása a vékonyréteg kromatográfia (Thin Layer

Chromatography, TLC) felhasználásával

Minőségi vagy fél-kvantitatív meghatározásra ma is széleskörben alkalmazzák a TLC-t,

mind a szabad- [114,115], mind az aminosav-származékok [116-119] elválasztására. Az

első esetben az egy- [120], vagy kétdimenziós [121] kromatográfiás fejlesztést a

ninhidrin reagenssel festési eljárás követi [2] (2.2.1 fejezetben részletezett). A módszer

előnye, hogy egyszerre nagyszámú minta és modell oldat futtatható azonos

körülmények között, csökkentve az elemzések idejét és költségeit egyaránt.

Sokösszetevőjű minták elemzésében [118,119] a TLC és a nagyhatékonyságú

vékonyréteg kromatográfia (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

jelentősége másodrendű. Elfogadható elválasztások megvalósításában sem a különleges

állófázisok [122,123], sem a különböző származékképzési reakciók [116-119]

alkalmazása nem hozott megoldást.

2.4 Az aminosavak meghatározása a kapilláris elektroforézis (Capillary

Electrophoresis, CE) felhasználásával

A CE különösen hasznos biológiai eredetű minták elemzésében [124]. Az aminosavak

elválasztását mind a kapilláris zónaelektroforézis (CZE), mind ennek micellás

elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) változatát [125] alkalmazzák. A CZE esetében

25

mind származékképzés nélkül (15 aminosav, UV detektálás 185 nm-en) [126], mind

különböző származékok [127-130] formájában elválasztották a vizsgált aminosavakat.

A CE technikánál általában a kapillárison kivitelezett UV detektálást alkalmazzák. A

hagyományos lézerindukált fluoreszcenciás detektor (LID) [129] érzékenysége tovább

növelhető fény kibocsátó diódával (LED) [130], mely mind UV, mind látható

fénytartományban működik. További előnye, hogy stabil és kedvező a költsége [2,131].

Az érzékenység MS detektorral is fokozható [131]: az aminosavakat 18-korona-6-

tetrakarbonsavval (18-C-6-TCA) alkotott komplex formában vizsgálták vörösvértestben

[132]. Alkalmazásáról Morton részletes visszatekintő tanulmányt készített [133].

Jóllehet, származékképzés nélkül is meghatározhatóak CE-sel az aminosavak, a

származékképzés nagy előnye, hogy ezáltal érzékenyebbé válik a módszer [2]. A HPLC

meghatározásoknál már részletesen ismertetett származékképző szerek használata a CE

technikában is elterjedtek, úgymint:

a) az L-/D-Ser meghatározására OPA/MCE reagenst és 2-hidroxipropil-γ-

ciklodextrint, mint királis szelektort alkalmaztak UV detektálással [127];

b) 6 pár L-/D-aminosav DANSYL-származékkénti elválasztását mono-6-N-

alkilammónium-6-dezoxi-ß-CD-klorid királis szelektor segítségével UV

detektálás követte [128];

c) 18 FMOC-aminosav származékot választottak el LID detektor alkalmazásával

[129];

d) mintegy 17 fluoreszcein-izotiocianát (FITC) aminosav elválasztását optimálták

az elektrolit rendszerhez adagolt szerves módosítok segítségével, LED

detektálást alkalmazva [130];

e) 13 aminosavat választottak el naftalin-2,3-dikarbaldehid (NDA)

származékokként nátrium-dodecil-szulfát (SDS), mint felületaktív anyag,

segítségével (MEKC), LED detektort használtak [125].

Összefoglalóan elmondhatjuk, hogy a CE technikában még sok kérdést kell megoldani,

úgymint:

1) a származékképzés helyének optimálása (kapilláris előtt, kapilláris után, vagy

közvetlenül a kapillárison történjen);

2) a mennyiségi értékelés és a migrációs idők reprodukálhatóságának javítása;

3) az elválasztandó aminosav összetevők számának növelése;

26

4) a nagyszámú, kísérleti állapotú technika gyakorlati hasznosítása, valamint

széleskörű felhasználása a mindennapos analitikai feladatok megoldására.

Királis elválasztásoknál előszeretettel használják a CE technikát mind direkt, mind

indirekt formában. A direkt elválasztásoknál királis szelektor vegyületeket alkalmaznak

[134-137], míg az indirekt módszernél diasztereomer párokat képeznek

származékképzéssel, melyeket akirális körülmények között kromatografálnak

[135,138,139].

2.5 Az aminosavak meghatározása a mágneses magrezonancia spektroszkópia

(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) felhasználásával

Az elmúlt években több módszert dolgoztak ki az aminosavak NMR meghatározására

[140-143]. A módszer előnye, hogy egy minta összes proton tartalmú összetevőjét

egyidejűleg detektálni lehet [2]. Különböző biológiai minták aminosav tartalmát

kvantitatívan meghatározták mind 1H NMR technikával: sörben [141], ecetben [140],

szérumban [142]; mind szimultán 13C NMR és 1H NMR csatornán patkány

agyszövetében [143]. A fiziológiás oldatok direkt analizálhatóak [2,140-142], és az

érzékenysége nem függ a fizikai-kémiai jellemzőktől, mint a hidrofobicitás, a pK érték

[2]. További előnye, hogy az összetevők elválasztás nélkül meghatározhatóak. Az

eredmények reprodukálhatóak. Az NMR hátránya, hogy a módszer nem érzékeny és

hosszú a mérési idő [2].

27

2.6 A plazma szabad aminosav (Plasma Free Amino Acid, PFAA) tartalmának

meghatározása

A plazma szabad aminosav tartalmának meghatározására a HPLC területén

alkalmazott különböző származékképzési és fehérjementesítési eljárásokat mutatom

be. Kitérek a meghatározás jelentőségére, a daganatos betegek aminosav

anyagcseréjének változására.

2.6.1 A PFAA mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel

Az aminosavak HPLC elemzése körében az oszlop előtti származékképzés a

legelterjedtebb, a 2.2.5 fejezetben részletezett. A 2. táblázat az elmúlt tíz évben (1999.

és 2009. március között) a plazma szabad aminosav meghatározására használt

származékképző szereket és az alkalmazott fehérjementesítő vegyületeket foglalja

össze, mely szerint:

a) Előnyben részesítik az OPA+tiol reagenst (59%-a az összes PFAA

elemzésekor alkalmazott származékképző szereknek), ezt követi az FMOC-Cl

(14%).

b) Fehérjementesítő vegyületként szerves- (SSA, TCA) és szervetlen (HClO4,

HCl) savakat, valamint semleges szerves oldószereket (ACN, MeOH, EtOH)

használtak közel egyenlő megoszlásban. A fehérjét vegyszer nélkül,

molekulasúly szerinti szeparáció elve alapján is leválasztották a plazmától.

28

2. táblázat: A plazma szabad aminosav tartalmának mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel (1999-2009. március)

Fehérje-mentesítő szer/p,

(v/v)

Származék- képző szer Kísérlet tárgya: mért As No/

perc RSD%;

vny Hiv.

ACN/p=1:1 FMOC, pentán kirázás kérődző: Pip, Lys 20/40 0,84;

97,5±1,3 [144]

0,1M HCl/ p=3,3:1 PITC juharfaszörp-betegség:

Val, Ile, Leu -/- - [145]

30 g/v% SSA/ p=1:10 OPA/ MPA

piridoxin és folsav hatása: Met, Glu, Cys, Hcy, Tau,

Ser, Gly 16/10 - [146]

jéghideg MeOH/ p=4:1 OPA/ MCE Nephros Norvegicus,

parazita fertőzés: PFAA 12/- - [147]

centr. szűrés* (5000 Da,

5000xg), 120 perc OPA/ MPA izomfehérje szintézis

stimulálás: EAs/NEAs 19/- - [148]

MeOH/p= 4:1 OPA/ MCE KV: Hcy, Cys, Glu, Asp, Asn, Ser, Gln 7/30 2,6-5,8; - [149]

SSA/p=11:1 OPA/ MCE patkány, hiperleucinémia: Ser, His, Ala, Tyr, Met,

Val, Phe, Ile, Leu 18/45 - [150]

jéghideg MeOH/ p=4:1

(I) OPA/ jodoacetát (II) DNFB

veleszületett metabolikus rendellenesség: PFAA 22/45 -; 97-101 [151]

10% TCA/p=1:1 SBD-F enzimműködés: GSH, Cys, CysGly 3/- -; 101±9,6 [152]

60% HClO4/ p=1:10 DVS aromás-,elágazó szénláncú

As 15/15 -; 95,1-102 [45]

ACN/p= 1:1,5 OPA/ MPA izomfehérje szintézis: EAs, NEAs -/- - [153]

10% TCA/ p=5:1 FMOC plazma fehérje hidrolizátum: CML 1/30 pontosság:

≤10% [154]

jéghideg EtOH/ p=1:1 OPA/ MPA p: Arg és metabolitjai 9/35 r=0,99 [155]

centr. szűrés (20800xg),

15 perc, 10ºC

OPA/ MPA + FMOC

módszerkidolgozás, -összehasonlítás (IEC):

PFAA 24/18 pontosság:

≤10% [156]

MeOH/p= 3:1 OPA/ IBC glutamáterg rendszer: L-,D-Ser, Glu, Gln, Gly 5/35 r>0,99 [157]

2,0 M HClO4/ p=3:10

FMOC; 40°C; ccHCl módszerkidolgozás: PFAA 27/43 0,4-7,6; - [109]

29

2. táblázat (folytatás): A plazma szabad aminosav tartalmának mérése HPLC módszerrel, oszlop előtti származékképzéssel (1999-2009. március)

Fehérje-mentesítő szer/p,

(v/v)

Származék- képzőszer Kísérlet tárgya: mért As No/

perc RSD%;

vny Hiv.

6% SSA/p=1:1 OPA/ MPA placentán keresztüli As csere vizsgálata: PFAA -/- 2-5;- [158]

0,5 M HClO4/ p=1:1 OPA/ MPA módszerkidolgozás: PFAA 22/35 5,2;

91-108 [159]

1M HClO4/ p=1:1 OPA/ MPA gyógyszer hatása, ráktípusok szerint: PFAA 14/- - [160]

jéghideg 5% HClO4/p=1:1 BCEOC módszerkidolgozás,

patkány: PFAA 20/65 0,9995≤r≤0,9999 [161]

ACN/p=1:1,5 OPA/ MPA 1 óra stressz hatása: Leu, Ile, Val, Gln 4/- - [162]

Jelölések: mint 1. táblázatban, továbbá p=plazma; SSA=szulfoszalicilsav; *=molekulatömeg szeparáció elve szerinti fehérjementesítés; TCA=triklórecetsav; DNFB=dinitro-fluoro-benzén; SBD-F=ammónium-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-szulfonát; IBC=N-izobutiril-l-cisztein; BCEOC=1,2-benzo-3,4-dihidrokarbazol-9-etil-kloroformát; As=aminosav; EAs=esszenciális aminosavak; NEAs=nemesszenciális aminosavak; KV=kardiovaszkuláris betegek; GSH=glutation; BCAA=elágazó szénláncú aminosavak; CML=NΣ-karboxi-metil-lizin; -=nincs adat; r=regressziós koefficiens; vny=visszanyerhetőség, %; Hiv.=hivatkozás.

2.6.2 Egyidejű fehérjementesítés és származékképzés

Az irodalmi adatok, melyek a plazma szabad aminosav szintjének meghatározására

javasolnak módszereket, a fehérjementesítést és a származékképzést elkülönítik.

Egylépéses eljárást nem alkalmaztak. Becslésem szerint az esetemben a két lépés

kombinálása kézenfekvő volt annak ismeretében, hogy

a) a rendszerint használt fehérjementesítő vegyület az ACN; (hígított) plazma/ACN

= 1:1 (v/v) arányban alkalmazott [144,163-165], ez a minimális aránya az ACN-

nek, mely szükséges a fehérjék kicsapásához [164];

b) az aminosavak az FMOC-cal adott arányú reakcióelegyben [víz/szerves = 1:1

(v/v); 2.2.5.6. b fejezetben részletezett] reagálnak;

c) az FMOC reagens oldószere ACN [110].

30

A szimultán módszert különböző biológiai mátrixok előkészítésének leegyszerűsítésére

már alkalmazták, úgymint:

1) Amfetamint határoztak meg HPLC analízissel humán vizeletben aceton-

DANSYL-Cl oldat direkt hozzáadását követően [166].

2) GC-MS-sel formiátot és acetátot mértek vérben, ezeket pentafluorobenzil-

bromiddal alkilezték aceton és foszfát puffer elegyében [167].

3) Ecetsavanhidriddel szimultán fehérjementesítettek és származékképeztek plazma

metformin tartalmának HPLC analíziséhez [168].

4) Szintén humán plazmában mérték meg a ketontest szintet p-nitrofenil-

diazónium-származék formájában, szimultán szűrve a kicsapódott fehérjét és a

reagensfelesleget [169].

2.6.3 A daganatos betegek aminosav anyagcseréjének változása

A tumor-diagnosztizált betegek esetében az aminosav metabolizmus, következésképpen

a plazma aminosav profilja eltér az egészséges egyedekétől [170]. A daganatos betegek

szervezetében az alábbi anyagcsere-folyamatok változnak:

a) az elégtelen táplálkozás következtében az aminosavbevitel csökken;

b) a májban megnövekszik a glukoneogenezis, az aminosavakat glükózzá alakító

folyamat;

c) intenzívebb a máj protein szintézise;

d) csökken az izomfehérje szintézise, ezzel egyidejűleg fokozódik a lebontása;

e) megnövekszik a teljes test aminosav forgalma és -szintézise [171-173].

Következésképpen a PFAA forgalma is nagyobb rákos betegekben egészséges

egyedekével összehasonlítva [174]. Az intenzíven osztódó sejtek nagy mennyiségű saját

fehérjét szintetizálnak, aminosav- és energia felhasználásuk folyamatosan nő. Normál

sejtekben a fő aminosav- és energiaforrás a citromsavciklus (8. ábra), mely az akut

oxigénhiány következtében a tumorsejtekben csökkent intenzitású normál sejtekével

összehasonlítva.

31

oxálacetát

fumarát

szukcinil-CoA

α-keto-glutarát

citrátkör

piruvát acetil-CoA acetoacetil-CoA

Asp

Glu

Asn

Gln

HisPro

Arg

metil-malonil-CoA

Val Met Thr Ile*

SerGly

Ala

Trp*Cys Ile* Leu Lys

Trp*

Tyr*

Phe*

Tyr*Phe*

8. ábra: Az aminosavak belépése a citromsavciklusba [175]

A hiányzó nemesszenciális- és esszenciális aminosavakat a vérből veszik fel. Az

agresszív tumor ektópiás hormonok és mediátorok közvetítésével a gazda szervezet

sejtjeit saját energiaforrásának biztosítására és építő anyagainak termelésére kényszeríti,

aminosavakat von el a szervezet többi részéről [174,176]:

1) A máj a vérből Ala-t és Gly-t vesz fel, melyek a fokozott glukoneogenezis fő

szubsztrátjai [170]. A folyamat terméke, a glükóz, a tumor intenzíven növekvő

energiaigényét nem tudja kielégíteni.

2) A további energiaforrást a szervezet saját vázizomzat fehérjéinek lebontásából

származó elágazó szénláncú aminosavai biztosítják, melyek a vérbe áramlanak

[172]. A tumor növekedése Gln-t, Asn-t, Gly-t és Asp-t igényel a purin- és

pirimidin termeléshez; Ser-t a membrán lipid komponensének szintéziséhez

[177]. Gln-t és Asn-t nem tud a daganatos sejt szintetizálni, így ezek teljes

mennyiségét a gazdaszervezet biztosítja számára [170,172,176].

32

3) Az ureaciklusban az argináz enzim és a NO szintáz enzim aktivitása nő, melyek

az Arg-t alakítják át rendre Orn-né és ureává, valamint Cit-ná és NO-dá,

következésképpen az Arg koncentrációja a plazmában csökken. Az Orn fontos

metabolitja a Glu-, a Pro és egyes poliaminok bioszintézisének [178,179].

4) A Cys a glutátion prekurzora, mely intracelluláris antioxidáns, fontos detoxikáló

ágens karcinogenezisben. Gyorsítja a nehézfémek, metabolitok és egyéb

karcinogén anyagok kiürülését. A folyamat során a Cys-ből Met keletkezik hCys

intermedieren keresztül [155].

Tehát az (1-4) pontok alapján látható, hogy a tumormassza intenzív növekedése

felborítja a teljes test aminosav forgalmát. Felmerül a kérdés, vajon létezik-e

rákspecifikus aminosav, melynek plazma szintje szignifikánsan változik. Jelentősége –

természetesen több esetszámra kiterjesztett kutatások eredményeképpen – a klinikai

diagnosztikában lehet.

33

3. Célkitűzések

Célom az irodalmi adatok alapján egymásnak ellentmondó reakciókörülmények

tisztázása.

Az FMOC és az aminosavak reakcióját optimálom:

a) az alkalmazott borát puffer pH értékének (pH 8, 9, 10),

b) az FMOC reagens oldószerének (aceton, ACN) és

c) az FMOC koncentrációjának (0,25 - 5 mM) függvényében.

d) Vizsgálom az [FMOC]/[aminosav]T mólarány hatását, és meghatározom

e) a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt.

f) Figyelembe veszem a szennyező csúcsok és az FMOC-OH

reakciókörülményektől függő mennyiségét.

g) Tanulmányozom a két csúccsal eluálódó aminosav-származékok (His-1, His-2

és Tyr-1, Tyr-2) keletkezését és mennyiségi meghatározásuk lehetőségeit.

A kidolgozott módszert a gyakorlatban alkalmazom: plazma minták szabad aminosav

koncentrációját határozom meg.

34

4. Kísérleti rész

4.1 Vegyszerek

Az FMOC-Cl, az aminosavak, az ADAM, a HEPA, a HPLC tisztaságú ACN, metanol,

aceton és tetrahidrofurán (THF) részben a Sigma (St. Louis, MO, USA), részben a

Serva (Heidelberg, Németország) termékei voltak. Valamennyi használt vegyszer az

analitikailag legtisztább minőségű volt. A vízmentes nátrium-acetát, a bórsav, a kálium-

klorid, a kálium-hidroxid, a nátrium-hidroxid és a sósav a Reanal termékei (Budapest,

Magyarország).

4.2 A minták

A szérum mintákat az Országos Onkológiai Intézettől kaptam. A vért mellrákban

szenvedő, 55-65 év közötti, posztmenopauzás nőbetegektől vették le közvetlenül a

műtét előtt és a műtét után 3 héttel. A betegek onkológiai kezelést nem kaptak. A

vérmintát centrifugálták (4000 rpm, 4ºC, 10 perc), a felülúszót mélyhűtőben tároltuk. A

mintákat felolvasztás után közvetlenül használtam.

4.3 A modell oldatok

Az aminosavak analitikai pontossággal mért, 0,03 M koncentrációjú, 0,1 M sósavval

készült oldatait hűtőszekrényben (4ºC) tároltam, és használat előtt desztillált vízzel

hígítottam.

4.4 A puffer oldatok

A borát pufferek 25 ml, a bórsavra és a kálium-kloridra egyaránt 0,8 M tartalmú oldat és

0,8 M nátrium-hidroxid elegyítésével készültek. Az oldatok pH értékeit a 0,8 M

nátrium-hidroxid oldattal pH 8,00-, pH 9,00- vagy pH 10,00 értékekre állítottam, majd

desztillált vízzel 50 ml térfogatra egészítettem (a továbbiakban 0,4 M borát puffer).

35

4.5 A reagens oldatok

Az FMOC oldat: az analitikai pontossággal mért, 0,026 g FMOC-Cl-ot 5,0 ml ACN-

ben, vagy acetonban oldottam (20 mM), s használat előtt hígítottam.

Az ADAM oldat: a 0,06 g, analitikai pontossággal mért, ADAM.HCl-ot az ACN/0,2 M

sósav = 1:1 térfogatarányú elegye 5,0 ml-ében oldottam (80 mM), s a továbbiakban nem

hígítottam.

A HEPA oldat: a 0,058 g, analitikai pontossággal mért heptilamint desztillált vízben

oldottam (100 mM), s a továbbiakban nem hígítottam.

.

4.6 Származékképzés

4.6.1 A reagens oldatok jellemzése

Műveleti üres felvételeket a reagens oldatokkal naponta legalább kétszer készítettem.

(Az automata mintaadagolót +20ºC hőfokra termosztáltam.)

4.6.2 Optimális származékképzés és fehérjementesítés

Modell oldat esetén a származékképzést az optimális feltételek szerint végeztem: 1 ml

térfogatú automata mintaadagoló ampullába (Waters, Milford, MA, USA) rendre 150 µl

aminosav oldatot (5,4x10-8 mól aminosav desztillált vízben), 150 µl borát puffert (0,4

M, pH 9), 300 µl FMOC reagenst (ACN-ben vagy acetonban oldva) elegyítettem (3x10-7

mól, FMOC [FMOC]/[aminosav]T = 5,5:1). A reakciót 20 perc elteltével 50 µl ADAM-

vagy HEPA oldattal állítottam meg.

Plazma minták esetében mindenben a fentiek szerint jártam el azzal a különbséggel,

hogy:

- a plazma minta különböző hígításait (7,5x, 15x, 30x) használtam;

- a plazma mintát hozzáadott aminosav standarddal (szabad aminosav tartalom ≤

4x10-8 mól) vagy anélkül mértem;

- az FMOC mennyisége a reakcióelegyben 1,8 mól volt ([FMOC]/[aminosav]T =

47:1);

36

- a reakcióelegyet a centrifuga szűrőre (cellulóz membrán, 850 μl, pórusátmérő

0,45 μm; W. R. Grace & Co, Deerfield, Conn. USA) juttattam, és centrifugáltam

(5000 rpm, 10 perc; Zuglói Gépgyár, Budapest, Magyarország). Ezután a

fehérjementes aminosav-származékokat tartalmazó mintát az automata

mintaadagoló ampullájába juttattam.

A modell vizsgálatokat eltérő reakciókörülmények között, minden esetben azonos

térfogatú reakcióelegyekben készítettem, melyek az egyes fejezetekben részletezettek.

4.7 Kromatográfiás körülmények

Waters HPLC rendszert (Waters Pharmaceutical Division, Milford, MA, USA)

használtam, amely a Waters 996 fotódiódasoros (DAD)- és a Waters 474

fluoreszcenciás (FL) detektorokból, a Waters 600 vezérlő „négyfejes”

pumparendszerből (szabályozható hőfokú kolonnatartóval), Waters 717plus

termosztálható automata mintaadagolóból áll. A számítógép program a Millennium 2.10

(1992-95) volt. A DAD és FL detektorokat a felsorolási rendben, egyidejűleg

használtam. A műveleti üres- és az aminosav-származékok mérései 190 és 400 nm

közötti felvételek voltak (DAD). A DAD kromatogramokat 262 nm-en értékeltem. A

FL felvételeket az optimális excitáció/emisszió hullámhosszakon készítettem

(λEx/Em=254/313 nm).

Az oszlopok: (I) Hypersil-120 ODS (5 μm, 150 x 4,6 mm; BST, Budapest,

Magyarország) és (II) Thermo Hypersil-100 ODS (5 μm, 150 x 4,6 mm; Thermo Fisher

Scientific Inc. Waltham, MA, USA) voltak. Az előtét oszlopok Hypersil ODS töltetet

tartalmaztak (5 μm, 30 x 4,6 mm; BST, Budapest, Magyarország).

Három eluensrendszert használtam, az elúciót 50ºC hőfokon végeztem, grádiens

módban [3-5. táblázatok, a nátrium-acetát oldat és a desztillált víz szűrt (0,7 μm); az

eluensek levegőmentesítése He-mal biztosított].

37

3. táblázat: Az optimális grádiens 22 aminosav elválasztására (tartalmazza a His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2 származékokat is) az (I) oszlopon, melynek hőfoka: 50C

Eluens,% Áramlási sebesség, ml/perc

Idő, perc A B C

1,5 0 70 30 0 1,5 2 63 37 0 1,0 14 27 73 0 1,0 23 0 100 0 1,5 28 0 100 0 1,5 29 0 0 100 1,5 34 0 0 100 1,5 35 70 30 0 1,5 40 70 30 0

Eluensek A: 0,05 M nátrium acetát oldat, pH 7,20; B: 0,10 M nátrium acetát oldat/ ACN =

23:22 (v/v), pH 7,20; C: ACN

4. táblázat: Az optimális grádiens a His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2 elválasztására az (I) oszlopon, az áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, az oszlop hőfoka: 50C

Eluens,% Idő, perc A B

0 100 0 2,5 100 0 6,6 93 7 8,2 93 7 8,3 86 14 8,4 79 21 10 79 21

10,1 83 17 20 50 50

21,5 0 100 24 0 100 26 100 0 31 100 0

Eluensek A: 0,1 M nátrium acetát/THF/ACN =

15:3:2 (v/v), pH 4,40; B: ACN/THF = 17:3 (v/v)

38

5. táblázat: Az optimális grádiens 22 aminosav elválasztására a (II) oszlopon, melynek hőfoka: 50C

Eluens, % Áramlási sebesség, ml/perc

Idő, perc A B C D

1,5 0 70 30 0 0 1,5 2 63 37 0 0 1,0 15 50 50 0 0 1,0 19 38 62 0 0 1,0 25 0 0 100 0 0,8 25,1 0 0 100 0 0,8 26 0 0 100 0 0,8 37 0 0 14 86 1,5 38 0 0 0 100 1,5 43 0 0 0 100 1,8 44 70 30 0 0 1,8 50 70 30 0 0 1,5 50,1 70 30 0 0

Eluensek A: 0,05 M nátrium acetát, pH 7,20; B: 0,1 M nátrium acetát/ACN = 23:22 (v/v), pH 7,20; C: 0,1 M nátrium acetát/ACN/THF = 23:11:11 (v/v), pH 7,20; D: ACN/desztillált víz = 80:20 (v/v)

4.8 A pH-mérő készülék

Az oldatok pH értékét Radelkis OP-208/1-es típusú precíziós pH-mérővel állítottam be.

2 pontos kalibrációt végeztem: K-91 (pH 9,28) és K-21 (pH 2,06) jelzésű kiforralt

desztillált vízzel megfelelően hígított Radelkis puffer koncentrátummal; naponta

ellenőriztem K-71 (pH 7,03) jelzésűvel.

39

5. Kísérleti eredmények és következtetések

5.1 Az aminosavak és az FMOC reakciójának tanulmánya és az abból eredő

következtetések

Ebben a fejezetben a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt elemzem az

FMOC koncentrációjának (0,25 – 5 mM), az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának, a

puffer pH értékének (pH 8, 9, 10), valamint a reagens oldószerének (ACN, aceton)

függvényében, az FMOC hidrolízisének és a szennyező csúcsok nagyságának

figyelembevételével. Részletesen kitérek a két csúccsal eluálódó aminosavak, a His és a

Tyr származékainak jellemzésére.

5.1.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői

Grádienst (3. táblázat) dolgoztam ki a 22 FMOC-aminosav elválasztására (5.2

fejezetben részletezett), optimális körülmények közötti származékkészítést követően

(4.6.2 fejezet), különös tekintettel a His-2, a Tyr-1 és a Tyr-2 elválasztására a

szomszédjaiktól (megjegyzés: a His-1 mennyiségileg átalakult His-2-vé, a retenciós

idejét feltüntettem; 9. ábra, 5.1.9 fejezetben részletezett). A szennyező csúcsokkal

együttesen eluálódó FMOC-aminosavak csillaggal jelöltek, szaggatott vonallal

ábrázoltam a műveleti üres kromatogramot (a szennyező csúcsok mennyiségi

tanulmánya az 5.1.3 fejezetben részletezett).

40

0 5 10 15 20 25 30 35 400,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

His

-2

FMOC-aminosavak mûveleti üres

(Cys

) 2

Ala

*

Lys

*

Orn

*

Phe

Trp

Tyr

-2

Tyr

-1*

Pro*

Leu

*Il

e*M

etV

al*

Arg

*

Hyp

Gln

Thr

Asp

*

FMOC-ADAMFMOC-OH

Gly

*Se

r*

Asn

*

Glu

*

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

His

-1

9. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) (I) oszlopon FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 3. táblázat szerint (Megjegyzés: a csillaggal jelölt aminosavak a műveleti üres szennyezőivel együttesen eluálódnak.)

41

5.1.2 A pH változás értékelése

Mielőtt részletes elemzésbe merülnénk, fontos kitérnünk a pH változás jelenségére,

megkülönböztetni a puffer-, a látszólagos- és a reakcióelegy-, a valódi pH érték

fogalmát. A pH érték változásáról és hatásáról irodalmi adatot nem találtam.

Mit jelent ez? A puffer pH értékének (pH 8 és 9) és az alkalmazott reagens

oldószerének (ACN és aceton) függvényében jóllehet különböző mértékben, de a

reakcióelegy pH értéke nő. Következésképpen az aminosavak és az FMOC a valódi pH

értékén reagálnak egymással. Az FMOC feleslegének elvétele előtt megmértem a

reakcióelegy pH értékét különböző körülmények között: rögtön elegyítés után, majd 40

perccel elegyítés után, mind az aminosav standardot tartalmazó elegy, mind a műveleti

üres esetében (6 táblázat). A mért pH értékek reprodukálhatóak: ≤0,54% RSD.

6. táblázat: A látszólagos (a puffer) és a valódi (a reakcióelegy) pH értékeinek, valamint a két érték különbségének nyomon követése a puffer oldat és a reakcióelegy oldószer tartalma függvényében Puffer pH

értéke FMOC reagens

oldószere Reakcióelegy pH

értéke* pH érték

növekedése RSD %*

aceton 10,1 2,1 0,46 8,0 acetonitril 9,8 1,8 0,43

aceton 10,8 1,8 0,54 9,0 acetonitril 10,6 1,6 0,43 Jelölések: *=az egyes elegyek pH értékeinek átlagai (legkevesebb három párhuzamos mérés alapján, mind a műveleti üresé, mind az aminosavak származékképzési közegé, elegyítés után azonnal, illetve 40 perc eltelte után; ez összesen 12 mérés átlagát jelenti ugyanazon a napon kivitelezve); az FMOC reagens koncentrációja 0,5 mM a reakcióelegy össztérfogatára vonatkoztatva.

Ezen eredmények alapján azt találtam, hogy:

a) minél alacsonyabb a látszólagos pH érték, annál nagyobb a pH növekmény;

b) aceton hatására 0,2 - 0,3 egységgel nagyobb mértékben változik a pH érték (pH

8: 2,1 és pH 9: 1,8 egység), ACN tartalmúval összehasonlítva (pH 8: 1,8 és pH

9: 1,6 egység).

42

Nem tapasztaltam különbséget a műveleti üres, valamint az aminosav standardot

tartalmazó reakcióelegy pH értékében, és a tekintetben sem, hogy elegyítés után

azonnal, vagy 40 perccel utána mértem meg.

5.1.3 A műveleti üres szennyezőinek értékelése

Az irodalmi adatokat elemezve kitűnik, hogy 4 dolgozat kivételével, ezekben is az

említés sorrendjében [92,104,106,107], a műveleti üres kérdését elhanyagolják (2.2.5.6

c fejezetben részletezett). A műveleti üres kromatogramon az FMOC-OH széles csúcsán

kívül, az aminosavakkal együttesen egyéb, reagensből származó szennyező csúcsok

eluálódnak (9. ábra).

Munkamenetünk során meggyőződtünk arról, hogy amikor a vizsgált minta aminosav

tartalmát állandó reagens koncentráció alkalmazásával, a pmól tartományban mérjük, a

szennyező csúcsok mennyiségi ismerete elengedhetetlen. Következésképpen, a

származékképzési optimálási folyamat során a különböző reakciókörülmények között az

FMOC-aminosavakkal párhuzamosan műveleti üres kromatogramot vettem fel.

Megmértem a szennyező csúcsok nagyságát az együttesen eluálódó aminosavak

válaszjelével számítva, pmólban kifejezve: az alkalmazott puffer pH értékének (pH 8,

pH 9), a reagens oldószerének (ACN, aceton) és koncentrációjának (0,5 mM – 5 mM)

függvényében a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőben, mind UV,

mind FL detektálás esetén (7. táblázat).

43

7. táblázat: A műveleti üres szennyezőinek válaszjelei, az adott üres csúccsal együttesen eluálódó aminosav válaszjelével számolva, pmól-ban kifejezve, a pH érték és az FMOC reagens oldószerének (aceton, ACN) függvényében (egy adott feltételnél a kvantitatív reakcióhoz szükséges időben)

Jelölések: As=adott aminosavval együttesen eluálódó üres csúcsok; *= FMOC koncentráció a reakcióközeg össztérfogatára vonatkoztatva (600 µL); AC = aceton/víz=1:1 (v/v); ACN = acetonitril/víz=1:1 (v/v); F-OHUV = a reagens hidrolízistermékének mennyisége UV detektálással mérve, 262 nm-en, a Phe válaszjeléből számolva (a fluoreszcenciás detektáláskor tapasztalt óriási csúcs kívül esik a csillapítási határon, ezért nem lehet kvantitatívan mérni); Ü.cs.**=üres csúcs az Orn válaszjelével számolva; Ü.cs.T***=az üres csúcsok összege, kivéve az F-OHUV-t; tR=az adott aminosav retenciós ideje.

[FMOC] mM 0,5 1,5 3 5

pH 8 pH 9 pH 9, ACN AC, 10 perc ACN, 30 perc AC, 5 perc ACN, 20 perc 5 perc 3 perc 1 perc UV FL UV FL UV FL UV FL FL

As tR, perc

pmól-ban kifejezve, az együttesen elulódó aminosavak válaszjeleiből számítva Asp 4,67 0 1,58 0 0,93 0 0,91 0 0,66 1,17 1,37 4,04 Glu 5,58 0 0,67 0 0,59 0 0,32 0 0,22 0,61 0,64 1,40 Hyp 8,98 1,93 0 1,89 0 2,23 0 2,66 0 0 0 0 Asn 9,67 0 0,45 0 0,45 0,50 0,25 0 0,17 0,15 0,32 0,94 Gln 10,17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,10 Ser 10,73 11,29 11,14 11,79 11,14 6,72 6,89 5,99 5,88 11,99 10,84 11,03 Gly 11,72 10,00 8,39 11,20 8,51 5,88 5,66 4,71 4,72 8,97 7,14 9,84 Arg 12,48 1,08 1,93 2,24 2,12 0,66 0,74 0,94 0,95 1,11 1,33 3,67 Ala 13,18 2,70 2,98 2,96 2,82 1,60 1,84 1,57 1,57 3,00 2,56 3,20 Pro 13,62 1,37 2,56 2,21 2,09 1,15 1,70 1,58 2,01 3,30 3,36 8,77

Tyr-1 14,52 1,40 2,01 2,46 3,64 0,28 2,00 5,91 8,78 2,91 6,14 3,60 Val 16,83 2,82 1,75 3,17 1,70 2,42 1,37 2,87 1,57 2,63 3,38 2,36 Ile 18,93 2,97 0,65 3,16 0,72 2,71 0,49 3,50 0,58 0,63 0,52 0,79

Leu 19,33 0,60 0,81 1,33 1,07 0,76 0,61 1,35 0,87 0,84 0,99 1,69 Trp 19,92 3,30 0 5,25 0 0,69 0 0,50 0 0 0 0 Phe 20,23 0,33 0,27 0,14 0,16 0 0 0 0 0 - -

F-OHUV 21,03 3,4×103 2,5×103 4,3×103 2,8×103 5,4×103 9,5×103 26×103

(Cys)2 22,70 0,11 0 0,20 0 0,37 0 0,74 0 0 0 - Orn 27,22 1,78 2,15 2,13 2,33 1,42 1,63 0,95 1,31 2,34 1,97 3,55 Lys 27,65 1,48 1,27 2,43 3,53 1,05 1,33 3,69 3,45 8,59 17,11 3,86

Ü.cs.** 30,03 96,7 109,3 0 0 110,7 99,1 0 0 0 0 0 Ü.cs.T*** 140 148 52,6 40,7 139 123 37,0 32,5 44,9 57,7 59,9

44

A 7. táblázat adatait az alábbiak szerint értékelem:

a) A FL és UV detektálás során mért szennyező csúcsok intenzitása jóllehet, eltérő,

de az összegük (az FMOC-OH-ot kivéve) szignifikánsan nem változik (utolsó

sora a 7. táblázatnak).

b) A pH 8 és 9 értékű puffer alkalmazása során mért szennyező csúcsok

nagyságában azonos reakciókörülmények között, a kvantitatív

származékképzéshez szükséges idő tekintetében számottevő különbség nem

található.

c) A legnagyobb különbség, ACN tartalmúval összehasonlítva, az aceton tartalmú

reakcióelegy műveleti üres felvételében megjelenő aminosav nagyságú jelentős

szennyező csúcs [tR = 30,03 perc, 96,7 – 110,7 pmól/ injektált térfogat a

szomszédos (FMOC)2-Orn válaszjelével számolva (9. ábra, 7. táblázat, 185

integrátor egység (i.e.)/pmól)]. Ennek a szennyező csúcsnak a nagysága

független volt az eltelt reakcióidőtől, a puffer pH értékétől, az alkalmazott

detektálástól és a HPLC tisztaságú aceton gyártójától (4.1 fejezetben

részletezett). Következésképpen a szennyező csúcsok összege aceton tartalmú

reagens esetén, ACN tartalmúval összehasonlítva, 3-4-szer nagyobb. További

hátránya, hogy a Tyr-2 elválasztását zavarja.

d) Az FMOC reagens koncentráció (pH 9 értékű puffer, ACN tartalmú FMOC

reagens: 0,5 mM – 5 mM, a kvantitatív származékképzéshez szükséges

reakcióidő: 1-20 perc, FL detektálás során mért adatok) és a reagens elkészítése

óta eltelt idő nagyságával a szennyező csúcsok válaszjele nő, beleértve az

FMOC-OH-t is.

Az optimális származékképzési körülmények megválasztásánál kulcskérdés volt a

kromatogram közepén (tR = 21,03 perc) eluálódó FMOC-OH csúcsának szélessége.

Ugyanis, minél szélesebb a hidrolízistermék csúcsa, annál nehezebb a szomszédos

aminosav-származékoktól elválasztani. Az FMOC-OH UV detektálás során mért

válaszjele (az FMOC-aminosavak UV válaszjelének átlagából, 1,41 i.e./pmól, számítva)

tájékoztat a FL detektálás alkalmazása során fellépő zavaró hatásáról: lévén sokkal

nagyobb, mint a mért aminosav-származékok válaszjele (40 pmól/ aminosav/ injektált

térfogat, vagy kevesebb). Következésképpen a kvantitatív származékképzés esetében a

45

minél kisebb mennyiségű hidrolízistermék jelenléte alapvető szempont az optimum

reakciókörülmény megválasztása során (8. táblázat).

5.1.4 Az FMOC reagens feleslegének elvétele

Az FMOC kvantitatív származékképzést követő hidrolízisének megakadályozása

céljából, a reagens feleslegének elvétele szükséges, e célra a 2.2.5.6 e fejezetben

részletezett eljárásokat írták le: (1) a szerves oldószerbe extrakcióját; vagy (2)

aminocsoportúakkal való reakcióját javasolják. Az aminosav veszteség miatt az

extrakciós módszert elvetettem (2.2.5.6 e fejezetben részletezett).

Követelmény az FMOC feleslegével képződő termék esetén, hogy:

a) az aminosav-származékok elválasztását ne zavarja: előttük vagy utánuk

eluálódjon,

b) az FMOC-cal gyorsan és kvantitatívan reagáljon,

c) az aminosavak meghatározását ne zavarja.

Az FMOC feleslegének további hidrolízisét ADAM-mal (1 perc [88]) vagy HEPA-val

(3 perc [91]) állítottam le, aminek következtében:

1) a feleslegelvétel a kromatogram közepén eluálódó FMOC-OH csúcsának

alakjára és szélességére kedvezően hatott, az irodalomnak megfelelően [106]:

leszálló szára meredekebb lett;

2) következésképpen a csúcs alapvonalon mért szélessége mintegy 1,5 perccel

csökkent, az elúciós profil javult;

3) egy-egy széles csúcsként eluálódtak a kromatogram végén, az elválasztást nem

zavarták;

4) a szennyező csúcsok mennyiségét nem csökkentették;

5) az aminosav-származékok válaszjelét nem befolyásolták;

Az ADAM származékképzési reakciója gyorsabb, ezért ennek használata kedvezőbbnek

bizonyult.

46

5.1.5 A FL- és az UV válaszjelek összehasonlítása

Az irodalmi adatok alapján FL és UV detektorokkal mérték az FMOC-származékok

válaszjelét. Az 1. táblázatban részletezett dolgozatok közül 15 esetben FL, 7 esetben

UV és 4 esetben egyidejű [85,88,89,180] detektálást alkalmaztak. A válaszjelek

arányára (FL válaszjel/ UV válaszjel = RR = 25) egyetlen utalás található [89].

22 FMOC-aminosavat szimultán detektálással mértem optimális reakciókörülmények

között. A 10. ábrán foglaltam össze az eredményeket (a hasáb csíkos része a FL-, fekete

része az UV válaszjelek nagyságát jelenti aminosav-származékokként). Az egyes

oszlopok fölött számértékek i.e./pmól-ban kifejezve, s azok arányai szerepelnek, 1

ml/perc áramlási sebességre vonatkoznak.

113/

1,28

=89

116/

1,34

=87

103/

1,21

=85

84/1

,03=

8286

/1,0

4=82

92/1

,13=

8193

/0,8

8=10

510

7/1,

28=8

411

8/1,

27=9

313

3/1,

44=9

275

/1,0

3=74

88/1

,11=

8080

/1,1

6=69

125/

1,34

=93

117/

1,41

=83

1,14

/1,6

5=0,

6912

7/1,

44=8

812

,6/2

,49=

5,1

22,9

/0,8

0=28

,618

5/2,

32=8

016

3/2,

20=7

416

1/2,

20=7

3

Asp Glu

Hyp Asn Gln

Ser

Gly

Thr

Arg Ala

Pro

Val

Met Ile Leu

Trp

Phe

(Cys

)2H

is-2

Orn Lys

Tyr-2

FL/U

V v

álas

zjel

, int

egrá

tor e

gysé

g/pm

ól

é

UV válaszjelFL válaszjel

10. ábra: Az egyes aminosav-származékok FL és UV válaszjelei integrátor egység/ pmól-ban kifejezve, valamint ezek aránya

47

a) A FL válaszjelek 1,14 (Trp) és 185 (Orn) i.e./pmól közötti értékek, átlaguk 99,9

i.e./pmól.

b) Az UV válaszjelek 0,80 (His-2) és 2,49 [(Cys)2] i.e./pmól közöti értékek,

átlaguk 1,41 i.e./pmól.

c) Az RR értékek 3 kivételtől - a Trp-tól (0,69), a (Cys)2-től (5,1) és a His-2-től

(28,6) - eltekintve, 69 (Met) és 105 (Gly) közötti értékek, átlaguk 70,9. Az

irodalomban számított RR = 25 értéknél 2,8-szor nagyobb (70,9/25 = 2,8). Az

alacsonyabb értékek [Trp, (Cys)2, His-2] az alacsonyabb FL válaszjelekből

adódnak, melynek oka az intramolekuláris hasadás a detektorban [88].

5.1.6 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az FMOC reagens

abszolút koncentrációjának és az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának

függvényében

E kísérletekben azt vizsgáltam, hogy az FMOC reagens koncentrációja (reakcióelegyre

vonatkoztatva: 0,25 – 5 mM), egyúttal az [FMOC]/[aminosav]T mólaránya (2,75:1 –

55:1) milyen hatással van a reakció sebességére állandó aminosav koncentráció, ACN

tartalmú reagens és pH 9 értékű puffer alkalmazása esetén (8. táblázat).

A 8. táblázat az egyes aminosavak válaszjelét tartalmazza a reakcióidő és az FMOC

koncentráció függvényében, i.e./pmól-ban kifejezve (a műveleti üres értékek

levonásával, a 3. táblázatban részletezett grádiens alapján 1 ml/perc áramlási sebességre

számítottak).

Kvantitatív reakció esetén a válaszjelek reprodukálhatóak (≤6,0% RSD, számított átlag:

1,51% RSD). A kvantitatív származékképzési reakció a következő elvárásoknak kell,

megfeleljen:

a) a szükséges reakcióidő, valamint

b) a hidrolízistermék mennyisége minél kisebb legyen, s

c) a His és a Tyr származékait (His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2; 5.1.9 fejezetben

részletezett) mennyiségileg tudjuk értékelni.

Jelölések: mint a 7. táblázatban, továbbá a dőlt betűvel szedett értékeket figyelmen kívül hagytam az átlag számításakor; ()=zárójelben az RSD % értékek; -=nincs adat; His-1#, His-2#, Tyr-1# és Tyr-2#, =számított értékek, a His-2 és a Tyr-2 alapján, amikor utóbbiak egy csúccsal eluálódnak, ezekben az esetekben a His-1 és Tyr-1 0 értékkel jelezve (kiegészítések 17.a,b-24.a,b ábrák). 48

8. táblázat: A válaszjelek értékei (integrátor egység/pmól-ban kifejezve). Reakciókörülmények: ACN/víz = 1:1 (v/v), pH 9, az össztérfogatra számított FMOC koncentráció (0,25 5 mM)* és a kölcsönhatás idejének (1 60 perc) függvényében, állandó aminosav koncentráció mellett (aminosav mennyisége: 5,4 10-8 mól)

FMOC, mM*; zárójelben: [FMOC]/[aminosav]T mólaránya 0,25; {2,8:1} 0,5; {5,5:1} 1,5; {16,5:1} 3; {33:1} 5; {55:1}

Reakcióidő, perc 1 30 60 15 20 30 1 3 5 10 1 3 5 10 1 10

Átlag (RSD%)

Amino- savak

tR, perc

integrátor egység (i.e.)/pmól aminosav Asp 4,67 14,48 63,94 63,89 106,6 113,2 111,9 71,20 100,3 109,9 109,6 94,75 115,2 116,1 114,6 113,8 115,6 113,3 (2,11) Glu 5,58 23,00 84,76 85,42 117,8 115,1 117,4 94,95 114,4 118,2 117,7 111,1 118,1 115,4 117,3 114,0 115,4 116,1 (1,89) Hyp 8,98 104,6 104,5 104,9 101,8 102,4 101,9 101,7 102,6 101,7 103,9 103,6 101,7 103,5 104,9 104,1 102,4 103,0 (1,18) Asn 9,67 17,14 61,55 63,56 82,50 82,87 83,60 72,73 84,53 85,05 86,03 83,04 83,38 81,84 85,96 85,67 84,64 84,1 (1,65) Gln 10,17 28,02 77,15 76,80 85,30 85,93 86,80 80,47 85,87 86,22 86,38 84,44 85,76 84,25 85,39 85,47 83,71 85,5 (1,07) Ser 10,73 33,19 92,58 92,23 91,95 92,43 92,20 91,27 91,51 91,59 92,20 92,26 92,55 90,87 90,79 90,69 90,56 91,7 (0,78) Gly 11,72 88,11 93,34 93,15 93,63 93,34 92,98 91,36 89,75 90,10 91,44 92,59 95,92 92,72 95,33 91,99 92,07 92,7 (1,80) Thr 12,12 67,64 106,1 106,7 109,3 106,4 106,2 107,8 109,6 108,3 108,4 104,9 108,0 106,9 108,5 107,0 107,1 107,4 (1,20) Arg 12,48 101,7 119,7 120,1 114,3 120,0 113,8 121,7 119,7 120,3 121,3 118,0 113,6 118,7 114,2 117,6 118,7 118,1 (2,37) Ala 13,18 83,88 132,4 128,9 133,6 134,1 131,1 132,7 134,1 134,4 134,4 132,8 131,2 132,9 135,6 136,0 131,5 133,1 (1,40) Pro 13,62 33,97 75,67 72,03 76,38 76,70 76,67 77,50 74,66 75,12 76,15 74,75 72,33 73,94 77,34 75,14 76,85 75,4 (2,22) Val 16,83 58,24 89,45 89,75 86,95 90,61 87,67 89,10 89,22 88,45 88,36 88,03 87,43 85,87 86,47 88,93 85,56 88,1 (1,66) Met 17,22 47,01 81,05 81,94 79,7 83,26 79,00 80,99 80,56 79,79 79,61 79,70 79,51 80,10 79,14 80,75 80,83 80,4 (1,41) Ile 18,93 91,27 126,3 126,6 128,8 129,2 124,7 128,9 124,8 124,3 124,4 122,1 123,5 119,7 124,6 127,5 122,3 125,2 (2,18)

Leu 19,33 75,69 118,3 120,5 115,9 121,6 114,7 119,4 120,8 118,2 114,6 116,6 114,2 113,4 116,1 116,7 118,6 117,3 (2,15) Trp 19,92 1,16 1,10 1,16 1,11 1,14 1,13 1,14 1,17 1,12 1,18 1,15 1,16 1,09 1,09 1,17 1,11 1,14 (2,65) Phe 20,23 97,67 127,2 128,6 127,4 126,0 126,8 122,4 - 127,7 125,7 - - - - - - 126,5 (1,49)

(Cys)2 22,70 - - - 13,80 13,12 13,00 12,60 13,18 12,40 12,79 12,08 12,34 12,28 11,82 - - 12,64 (3,14) Orn 27,22 144,8 184,9 185,2 188,5 184,0 182,9 187,6 183,4 185,1 184,0 181,0 181,8 187,0 183,9 185,5 183,1 184,5 (1,12) Lys 27,65 96,03 158,4 160,2 159,9 162,5 162,3 165,0 161,4 161,7 165,0 163,6 161,0 161,2 165,0 161,1 165,6 162,5 (1,20)

F-OHUV 21,03 0,87×103 1,8×103 2,1×103 2,4×103 2,8×103 3,1×103 2,8×103 4,2×103 5,3×103 7,9×103 5,5×103 9,4×103 12×103 18×103 9,4×103 26×103 - His-1# 11,30 1,09 6,72 6,69 6,72 0 0 7,30 6,86 0 0 0 0 0 0 0 0 6,86 (3,73) His-2# 25,60 0 22,90 22,91 22,70 22,67 22,82 22,91 22,91 22,24 23,27 22,74 23,13 22,71 22,98 23,48 22,88 22,9 (1,23) Tyr-1# 14,52 24,8 48,9 48,9 67,0 52,2 50,0 52,2 56,2 58,8 65,5 48,7 42,9 51,9 51,9 51,8 0,00 51,9 (6,0) Tyr-2# 30,96 160,3 160,5 160,5 160,7 160,6 160,8 160,6 160,8 160,5 160,5 160,5 160,5 160,4 160,5 161,0 160,5 160,6 (0,10)

49

A 8. táblázatban összefoglalt eredmények alapján az alábbi következtetések vonhatók

le:

1) 0,25 mM reagens koncentráció, jóllehet, az FMOC-OH csúcsa a legkeskenyebb,

elégtelennek bizonyult: a karboxil- (Asp, Glu) és a savamid (Asn, Gln) csoportot

tartalmazó aminosavak reakciója 60 perc után sem teljes. Ezért ezt a reagens

koncentrációt elvetettem.

2) Növelve az FMOC koncentrációját (0,5 – 5 mM) az [FMOC]/[aminosav]T

mólarány is nőtt (5,5:1 – 55:1), a kvantitatív reakcióhoz szükséges idő csökkent

(0,5 mM: 20 perc; 1,5 mM: 5 perc; 3 mM: 3 perc; 5 mM: 1 perc után teljes a

származékképzési reakció). Tehát a 7. és 8. táblázat alapján (az FMOC-OH

szélesedésével és a szükséges reakcióidővel számolva) az optimum koncentráció

0,5 mM (20 perc).

3) Az optimálási vizsgálatok során kitűnt, hogy a His és a Tyr mono- és di-

származékai reprodukálhatóan mérhetőek, azaz képződésük és átalakulásuk

analitikailag nyomon követhető.

A származékképzési reakció optimálásának második lépéseként vizsgáltam, vajon a

reakcióelegy FMOC koncentrációja és/vagy az [FMOC]/[aminosav]T mólaránya szabja

meg a reakció sebességét? A kérdést megválaszolandó, állandó FMOC koncentráció

mellett változtattam az aminosavak mennyiségét. A két sebesség-meghatározó

dikarbonsav aminosav (Asp, Glu) [89] részletesebb vizsgálatát két irányból

közelítettem, alapul véve két, bizonyítottan kvantitatív, szélsőséges reakciókörülményt

(8. táblázat, 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc és 5 mM, 1 perc):

a) 0,5 mM FMOC koncentráció esetében az Asp reakcióideje 20 perc, a Glu-é 15

perc [FMOC]/[aminosav]T = 5,5:1 mólarány mellett. Csökkentettem a teljes

aminosav mennyiséget állandó FMOC koncentráció mellett, így a mólarány

5,5:1-ről 25:1-en keresztül 66:1-re nőtt, de az Asp és a Glu származékképzése

ugyanúgy rendre 20 és 15 perc után teljes (11. ábra).

50

b)

0

5

10

15

20

25

Asp Glu

Rea

kció

idő,

per

c

FMOC, 0.5 mM; [FMOC]/[AAs]T=5.5/1FMOC, 0.5 mM; [FMOC]/[AAs]T=25/1FMOC, 0.5 mM; [FMOC]/[AAs]T=66/1FMOC, 5 mM; [FMOC]/[AAs]T=5.5/1

FMOC, 5 mM; [FMOC]/[AAs]T=55/1

FMOC, 0,5 mM; [FMOC]/[As]T=5,5:1FMOC, 0,5 mM; [FMOC]/[As]T=25:1FMOC, 0,5 mM; [FMOC]/[As]T=66:1FMOC, 5 mM; [FMOC]/[As]T=5,5:1FMOC, 5 mM; [FMOC]/[As]T=55:1

11. ábra: Az Asp és a Glu reakcióideje az FMOC reagens koncnetrációjának, valamint az [FMOC]/[aminosav]T mólarányának függvényében, ahol [As]T = az aminosavak együttes mennyisége

b) 5 mM FMOC koncentráció esetében [FMOC]/[aminosav]T = 55:1 mólarány

mellett a szükséges reakcióidő 1 perc. Az aminosav mennyiségét növeltem

állandó FMOC koncentráció mellett, így a mólarány csökkent 5,5:1-re, de a

kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő 1 perc maradt (11. ábra).

A legkevésbé reaktív aminosavak, az Asp és a Glu válaszjeleinek eredménye alapján

(természetesen a többi 20 aminosavat is figyelembe véve) egyértelműen az alábbi

következtetések vonhatók le:

1) Minél nagyobb az FMOC reagens koncentrációja, annál gyorsabb a reakció.

51

2) Azaz növelve a mólarányt 0,5 mM FMOC koncentráció esetében, a szükséges

reakcióidő minden esetben 20 perc.

3) Csökkentve a mólarányt 5 mM FMOC koncentráció esetében, 1 perc reakcióidő

elégségesnek bizonyult.

A fenti részletes vizsgálatok eredményeit összefoglalva:

i. állandó aminosav koncentráció mellett, az FMOC mennyiségét változtatva;

ii. állandó FMOC koncentráció mellett, az aminosav mennyiségét változtatva

ebben a mérési tartományban az FMOC reagens abszolút koncentrációja

határozza meg a reakció sebességét.

Ezen mérési eredmények birtokában tisztázhatóak az irodalomban tapasztalt látszólag

ellentmondó reakciókörülmények (2.2.5.6 d fejezetben részletezett). Például Grzywacz-

[102], López-Cervantes és munkatársai [108] pH 8,5 értékű puffert és 8 mM ACN

tartalmú FMOC reagenst alkalmaztak, jóllehet az [FMOC]/[aminosav]T mólarány

eltérő: az előbbinél 16,7:1, az utóbbinál 69:1, de a javasolt reakcióidő ugyanannyi: 90

mp [102,108].

.

5.1.7 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő a puffer pH

értékének és az FMOC reagens oldószerének függvényében

Az irodalomban néhány kivételtől eltekintve borát puffert alkalmaztak (2.2.5.6 a

fejezetben részletezett), így a puffer típusának tanulmányozására nem tértem ki. A

kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt vizsgáltam a puffer pH értékének

(pH 8, 9, 10), valamint az FMOC reagens oldószerének függvényében.

pH 10 értékű puffert, 0,5 mM koncentrációjú FMOC reagenst alkalmazva (ACN

tartalmú, [FMOC]/[aminosav]T = 25:1) a reakció nem kvantitatív. Ennek oka, hogy az

FMOC hidrolízise annyira felgyorsul, hogy az [FMOC]/[aminosav]T mólarány az

optimális alá csökken. A pH 10 értékű puffert elvetettem.

pH 9 értékű puffert alkamazva, aceton tartalmú reakcióelegyben 5 perc, ACN

tartalmúban 20 perc; míg pH 8 értékű puffert használva aceton tartalmú

reakcióelegyben 10 perc, ACN tartalmúban 30 perc szükséges az összes aminosav

kvantitatív származékképzéséhez (12. ábra).

52

Tehát mind az aceton, mind az ACN tartalmú reakcióelegyben, pH 9 értékű puffer

oldatokban csökken a származékképzéshez szükséges idő, pH 8 értékűvel hasonlítva,

azonos reakciókörülmények között (12. ábra; 0,5 mM FMOC reagens,

[FMOC]/[aminosav]T = 25:1). Ennek oka, hogy a származékképzési reakció során az

aminosavak amino csoportjainak deprotonált-protonált egyensúlya lúgosabb közegben a

deprotonált felé tolódik.

Asp GluAsn Gln Se

rTh

rArgAlaGly

Hyp Pro

ValM

et Ile Leu

Trp

Phe

(Cys

)2OrnLy

sHis-

(1+2

)Ty

r-(1+

2)

0

5

10

15

20

25

30

Rea

kció

idő,

per

c

pH 9, acetonpH 8, acetonpH 9, ACNpH 8, ACN

12. ábra: Az egyes aminosavak reakcióidejének összehasonlítása a pH érték (8 és 9), valamint az FMOC oldószerének (ACN és aceton) függvényében

Az irodalomban az egy THF kivételtől eltekintve ACN és aceton FMOC reagenst

alkalmaztak (2.2.5.6 b fejezetben részletezett). Jóllehet, az a tény, hogy acetonban

gyorsabb a származékképzési reakció, mint ACN-ben, ismert [89]: részletes

összehasonlító elemzés nincs. E két oldószer hatását a származékképzés sebességére a

12. ábrán mutatom be, szigorúan azonos mérési körülmények között, pH 8 és 9 értékű

puffert alkalmazva. Mind pH 8, mind pH 9 értékű puffer esetén, aceton tartalmú

reakcióelegyben valóban gyorsabb a származékképzés, mint ACN tartalmúban, az „1

perces aminosavakat” kivéve (pH 8: a Hyp, a Pro, az Ile, a Leu, a Trp; pH 9: a pH 8-nál

53

felsoroltakon kívül a Gly és a Phe). Az esetükben annyira gyors a reakció (1 perc), hogy

ilyen mérési módszer mellett nem látható az esetleges időbeli különbség.

Az oldószertől függő eltérő reakciósebesség egyik oka, hogy a polárosabb aceton

kedvezőbb közeget biztosít az FMOC ionos intermedier képződésének. Másik oka az

oldószer okozta eltérő pH növekmény (5.1.2 fejezet, 6. táblázat).

A reakció sebességén és a szennyező csúcsok mennyiségén túl az FMOC reagens

stabilitását is befolyásolja az alkalmazott oldószer. ACN-ben oldva legalább 6 hónapig

hűtőben stabil, míg acetonban 2 hónap után elkezd bomlani. A reagens eltarthatósága az

oldószer víztartalmával (aceton: 0,5 v/v%, ACN: 0,02 v/v%) függhet össze.

5.1.8 A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidő az aminosavak

tulajdonságainak függvényében

Minden reakciókörülményt figyelembe véve (5.1.6 és 5.1.7 fejezetekben részletezett) a

sebesség-meghatározó aminosav az Asp. A vizsgált aminosavak eltérő sebességgel

reagálnak az FMOC-cal, az amino csoport nukleofilitását az alábbi szerkezeti

tulajdonságok határozzák meg:

a) Az aminosavak amino csoportjának pK értékei (9. táblázat), melyek a

deprotonált-protonált egyensúly állapot eltolódását meghatározzák, eltérőek.

b) Az oldalláncon a poláros csoportok (Asp, Glu: kaboxil-; Asn, Gln: savamid-;

Ser, Thr: hidroxil csoport) nemkötő elektronpárjai hidrogén hidat létesítenek az

amino csoporttal, csökkentve annak nukleofilitását.

c) Az oldallánci alkil csoport elektronküldő jellege szintén befolyásolja az amino

csoport nukleofilitását, ezzel együtt

d) az FMOC sztérikus gátlását is okozza.

54

9. táblázat: Az aminosavak disszociációs állandói (pK) [181]

Aminosav pK1 (α-COOH) pK2 (α-NH2) pKr (R) Ala 2,35 9,87 Arg 1,82 8,99 12,48 Asn 2,14 8,72 Asp 1,99 9,90 3,90 Cys 1,92 10,70 8,37

GABA 4,03 10,55 Gln 2,17 9,13 Glu 2,10 9,47 4,07 Gly 2,35 9,78 His 1,80 9,33 6,04 Hyp 1,82 9,66 Ile 2,32 9,76

Leu 2,33 9,74 Lys 2,16 9,06 10,54 Met 2,13 9,28 Orn 1,71 8,69 10,76 Phe 2,20 9,31 Pro 1,95 10,64 Ser 2,19 9,21 Thr 2,09 9,10 Trp 2,46 9,41 Tyr 2,20 9,21 10,46 Val 2,39 9,74

Jelölések: pK1 (α-COOH)=az aminosav α-karboxil csoportjának disszociációs állandója; pK2 (α-NH2)= az aminosav α-amino csoportjának disszociációs állandója; pKr (R)=az aminosav oldallánci csoportjának disszociációs állandója.

5.1.9 A His és a Tyr kérdése

Részletesen vizsgáltam a His és a Tyr mono- és di-származékainak képződését és

átalakulását. His esetében az első FMOC molekula az amino csoporttal reagál: N-

FMOC-hisztidin (His-1) (13. ábra), míg a második az oldallánci imidazol gyűrű N-

jével: N,NH-(FMOC)2-hisztidin (His-2) (14. ábra).

55

O

NH2NH

N

OH

O

OCl

+O

NHNH

N

OH

O

O

His

FMOC-Cl

His-1

13. ábra: A His-1 képződése

ONH

NH

N

OH

O

O+

O

OCl

ONH

N

N

OH

O

O

OO

ONH

NH

N

OH

O

O

+

OH

His-1 FMOC-Cl

His-2

His-1FMOC-OH

bomlás

14. ábra: A His-2 képződése és bomlása

Tyr esetében az első FMOC molekula szintén az amino csoporttal reagál: N-FMOC-

tirozin (Tyr-1) (15. ábra), míg a második az oldallánci fenolos hidroxil csoporttal: N,O-

(FMOC)2-tirozin (Tyr-2) (16. ábra).

56

ONH2 OH

OH

+ ONH OH

O

O

OH

O

OCl

Tyr

FMOC-ClTyr-1

15. ábra: A Tyr-1 képződése

ONH OH

O

O

OH

O

O Cl

+ ONH O

O

O

OH

O

O

Tyr-1 FMOC-Cl Tyr-2

16. ábra: A Tyr-2 képződése

Ahhoz, hogy a négy formát (His-1, His-2, Tyr-1, Tyr-2) reprodukálható és

összehasonlítható válaszjelekkel jellemezni tudjuk, az alábbi feltételeknek kell

teljesülniük:

a) Legyen egy grádiens program, mely a négy forma alapvonali elválasztását

biztosítja (4. táblázat).

b) Legalább egy olyan reakciókörülmény legyen, mely esetben a két aminosav egy-

egy származéka (His-2, Tyr-2) kizárólagosan mérhető, ebből mind a négy forma

számítható.

c) A His-2 és a Tyr-2 az analitikailag elfogadható idő intervallumban (20-60 perc)

stabil és kvantitatív célú mérésre alkalmas legyen.

Mind a három feltételnek (a-c) eleget tettem a származékképzés optimálása során (5.1.6

fejezetben részletezett, 8. táblázat), kiegészítve a His és a Tyr származékainak

részletezett képződésével és átalakulásával. A részletes vizsgálatot 0,5 mM FMOC

57

koncentráció esetében mind pH 8 és 9 értékű puffer, mind ACN (17.a,b-20.a,b ábra) és

aceton (21.a,b-24.a,b ábra) tartalmú reagens alkalmazásával elvégeztem.

58

2,5 3,0 20,0 20,5

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

His-2

His-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

His-1His-2

17. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

59

2,5 3,0 20,0 20,5

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

His-2

His-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

His-1His-2

18. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

60

8,5 9,0 9,5 22,5 23,0 23,50,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Tyr-2

Tyr-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 60 perc 10 perc 30 perc 5 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

Tyr-1Tyr-2

19. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

61

8,5 9,0 9,5 22,5 23,0 23,50,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Tyr-2

Tyr-1Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 20 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

Tyr-1Tyr-2

20. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, ACN tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

62

2,5 3,0 20,0 20,5

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

His-2

His-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60Reakcióidő, perc

pmól

His-1His-2

21. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

63

2,5 3,0 20,0 20,5

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

His-2

His-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

His-1His-2

22. ábra: A His-1 és a His-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

64

8,5 9,0 9,5 22,5 23,0 23,50,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Tyr-2

Tyr-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

Tyr-1Tyr-2

23. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 8 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

65

8,5 9,0 9,5 22,5 23,0 23,50,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Tyr-2

Tyr-1

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

1 perc 3 perc 5 perc 10 perc 30 perc 60 perc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 10 20 30 40 50 60

Reakcióidő, perc

pmól

Tyr-1Tyr-2

24. ábra: A Tyr-1 és a Tyr-2 képződésének és átalakulásának (a) termékei (vastaggal jelölve a kvantitatív származékképzéshez szükséges reakcióidőt), valamint (b) mennyiségi viszonyai pH 9 értékű pufferral készített, aceton tartalmú reakcióelegyben

(a)

(b)

66

Mind a His-, mind a Tyr-származékok képződésének és átalakulásának eltérő

sebességének oka, hogy a második FMOC molekula reakciója a His deprotonált

imidazol N-jével és a Tyr deprotonált fenolos hidroxil csoportjával lassúbb, mint az első

FMOC reakciója az α-amino csoporttal.

A származékképzési reakció optimálása során (5.1.6 fejezetben részletezett) a képződési

és átalakulási folyamatok termékei az egyes részletekben számítottak, ACN tartalmú

reakcióelegyben, pH 9 értékű puffert alkalmazva (8. táblázat, 18.a,b és 20.a,b ábra):

1) A His-2 kizárólagos megjelenése 16 reakciókörülményből 10 esetben

megvalósított (8. táblázat). A His-1 kvantitatív átalakulása 0-val jelölt. A His-2

válaszjele 22,9 i.e./pmól, megerősíti ezt a kiváló reprodukálhatósága (≤ 1,23%

RSD) és a stabilitása (8. táblázat, 18.a,b ábra).

2) A Tyr-2 kizárólagos megjelenése 2 esetben megvalósított. A Tyr-1 kvantitatív

átalakulása 0-val jelölt (8. táblázat, 5 mM FMOC reagens, 10 perc reakcióidő és

3 mM, 20 perc), szélsőségesen nagy FMOC koncentrációt, speciális reakcióidőt

és megfelelő pH értékű puffert igényel. A Tyr egy csúcsként, Tyr-2-ként mért

válaszjel ismeretének birtokában, a továbbiakban a többi értékek ebből

számítottak (8. táblázat, Tyr-1: 0, Tyr-2: 160,5 i.e./pmól), elfogadható

reprodukálhatóságot és stabilitást eredményezve, melyek a Tyr-1 + Tyr-2

összege alapján jellemzettek (8. táblázat, 20.a,b ábra).

A His és a Tyr származékainak válaszjeleit elemezve (17.a,b-24.a,b ábrák), az alábbi

következtetések vonhatók le:

a) Számértékkel kifejezve a képződött és átalakult termékeket, a di-származékok

nagyobb intenzitásúak (8. táblázat, His-1/His-2 = 6,86/22,9 = 1:3,3 és Tyr-

1/Tyr-2 = 51,9/161 = 1:3,2) a második FMOC csoportnak köszönhetően. A His

és a Tyr kvantitatív meghatározására érzékenység szempontjából rendre a His-2

és a Tyr-2 forma kizárólagos megjelenése az előnyösebb.

b) A His-1, a His-2 és a Tyr-1, a Tyr-2 képződésének és átalakulásának elúciója,

valamint pmólban kifejezett mennyiségi viszonya hasonló tendenciát mutat a pH

függvényében. Azonos körülmények között, az alkalmazott puffer pH értékét

kivéve (pH 8 és 9), a származékok képződésének és átalakulásának sebessége

nagyobb pH értékű puffer esetében gyorsabb. Ez a jelenség feltehetően a

67

származékok deprotonált formájának nagyobb arányú jelenlétével függ össze: a

nagyobb pH értékű reakcióelegyben a második FMOC reakciója kedvezőbb.

c) A His és a Tyr képződése és átalakulása aceton tartamú reagens alkalmazása

esetén gyorsabb, ACN tartalmúval összehasonlítva - az oldószerek polaritásbeli

különbségének és a pH változásnak köszönhetően (5.1.7 fejezetben részletezett,

6. táblázat) -, kvantitatív meghatározás céljára kevéssé alkalmas (5.1.3

fejezetben részletezett).

A származékképzési folyamatokat részletesen vizsgáltam (0,5 mM FMOC reagens,

[FMOC]/[aminosav]T = 25:1), az alábbi következtetéseket vontam le:

1) Összehasonlítva a His-1 és a His-2 egymásba alakulását, a His-2 kvantitatív

képződéséhez szükséges reakcióidő ACN tartalmú reakcióelegyben pH 8 értékű

puffert alkalmazva 60 perc (17.a,b ábra), pH 9 értékű puffer esetében 20 perc

(18.a,b ábra); míg aceton tartalmúban pH 8 értékű puffer esetében 10 perc

(21.a,b ábra). Jóllehet aceton, pH 9 esetében a His-2 képződése gyorsabb, de

egyúttal megkezdődik a bomlása is His-1-gyé (22.a,b ábra).

2) A Tyr-1 és a Tyr-2 megoszlását tükrözik a 19.a,b, 20.a,b, 23.a,b, 24.a,b ábrák.

ACN tartalmú reakcióelegyben a Tyr-2 mennyiségi növekedése lassúbb, az

aceton tartalmúval összehasonlítva. Aceton tartalmú reakcióelegyben pH 8

értékű puffer esetében 27-28 perc (23.a,b ábra), míg pH 9 esetében már 7-8 perc

(24.a,b ábra) után egyenlő a Tyr-1 és a Tyr-2 mennyisége.

5.1.10 A Cys mérése

A Cys (monomer forma) spontán intramolekuláris oxidációja vizes közegben ismert

[182,183], mennyiségét (Cys)2-ként (dimer forma) mértem (25. ábra).

A két forma [Cys és (Cys)2] együttes meghatározása kvantitatív és reprodukálható

abban az esetben, ha az oxidáció teljes.

a) A Cys-nek oldatkészítéstől számított 5 perc után több mint a fele (55%), 20 perc

alatt a teljes mennyisége dimerizálódik (pH 9 értékű puffer, 0,5 mM ACN

tartalmú FMOC reagens, [FMOC]/[aminosav]T = 12:1).

68

NH2 CH COOHCH2

SH

+

NH2 CH COOH

CH2

S

NH2 CH COOH

CH2

SO2 OH24 2 + 2

Cys

(Cys)2 25. ábra: A Cys oxidációja

b) A Cys esetében az első FMOC molekula az amino csoporttal reagál, míg a

második az oldallánci tiol csoporttal [94]: N,S-(FMOC)2-cisztein [Cys-

(FMOC)2] (26. ábra).

NH2 CH COOH

CH2

SHO

O Cl

NH CH COOH

CH2

S

OO

O

O+ 2

FMOC-Cl Cys-(FMOC)2

Cys

26. ábra: A Cys reakciója FMOC-cal

A (Cys)2 esetében két FMOC molekula reagál a két amino csoporttal: N,N-

(FMOC)2-cisztin [(Cys)2-(FMOC)2] (27. ábra).

NH CH COOH

CH2

S

NH CH COOH

CH2

S

OO

OO

NH2 CH COOH

CH2

S

NH2 CH COOH

CH2

S

O

O Cl

+ 2

(Cys)2-(FMOC)2

FMOC-Cl(Cys)2

27. ábra: A (Cys)2 reakciója FMOC-cal

69

A (Cys)2-(FMOC)2 és a Cys-(FMOC)2 származékok 130 percig stabilak.

c) A monomer forma származéka nagyobb intenzitású, mint a dimer formáé (Cys-

(FMOC)2/(Cys)2-(FMOC)2 = 9,8:1).

5.1.11 Reprodukálhatósági vizsgálatok

A származékképzés optimálási folyamata során az egy adott reakciókörülményhez

tartozó értékeket legalább három párhuzamos mérés átlagából számítottam. Az FMOC-

aminosavak válaszjelei relatív standard deviációval bizonyítottan reprodukálhatóak: ≤

4,0% RSD, átlagértékük: 1,0% RSD (10. táblázat).

Az FMOC-aminosavak mennyiségi mérési határa 23 vizsgált származék közül 17

esetben 1 pmól, kivételt képeznek a Ser, a Gly, a Val (LOQ = 2,5 pmól), a (Cys)2, a

His-2 (LOQ = 5 pmól) és a Trp (LOQ = 10 pmól; 10. táblázat).

70

10. táblázat: Az eltérő mennyiségű aminosavak válaszjelének reprodukálhatósága optimális reakciókörülmények* között mérve

Jelölések: mint a 7. és a 8. táblázatokban, továbbá *=pH 9 értékű pufferral készült, ACN tartalmú, a reakcióelegy össztérfogatára számított 0,5 mM FMOC koncentrációjú; Trp**=a Trp mennyisége 10 és 400 pmól/ injektált térfogat között változott.

Integrátor egység/1 pmól aminosav Aminosav injektált pmól 40 20 10 5 2,5 1 [FMOC]/[As]T 5,5:1 11:1 22:1 44:1 88:1 220:1

Átlag RSD %

Asp 119 118 116 118 114 120 117 1,9 Glu 119 117 119 118 116 113 117 2,0 Hyp 108 112 109 109 104 105 108 2,7 Asn 81,8 80,0 82,0 81,3 85,5 86,3 82,8 3,0 Gln 84,6 84,8 85,7 83,9 87,4 84,1 85,1 1,5 Ser 90,0 90,9 90,9 90,0 96,3 - 91,6 2,9 Gly 95,3 95,7 96,5 97,6 92,1 - 95,5 2,2 Thr 105 106 106 106 104 107 106 0,98 Arg 116 117 118 118 112 121 117 2,5 Ala 131 129 129 134 128 128 130 1,8 Pro 76,1 76,8 77,9 76,2 72,8 74,8 75,7 2,3 Val 90,0 89,7 90,0 90,0 93,6 - 90,7 1,8 Met 85,2 84,6 85,1 84,8 81,5 89,2 85,0 2,9 Ile 129 126 128 129 123 118 126 3,5

Leu 124 121 125 125 122 119 122 2,0 Trp** 1,17 1,16 1,15 1,11 1,06 1,18 1,14 4,0

Phe 131 127 131 131 124 132 129 2,4 (Cys)2 12,6 12,4 12,4 12,9 - - 12,6 1,9 Orn 186 186 188 185 178 179 184 2,3 Lys 168 168 168 170 166 170 168 0,89

His-2 27,2 23,3 22,6 22,0 - - 22,6 2,9 Tyr-1 51,1 51,0 51,0 48,8 - - 50,5 2,2 Tyr-2 156 161 163 169 167 165 163 3,1

71

5.2 Az FMOC-aminosavak elválasztásának optimálása

Az FMOC-aminosavak meghatározására kiindulópontként az irodalmi tapasztalat

szerinti legszebb elválásokat mutató kromatogramhoz tartozó grádienst alkalmaztam,

figyelembe véve a két csúccsal eluálódó aminosavak, a His és a Tyr, mono- és di-

származékainak jelenlétét és hatékony elválasztását [88].

21 FMOC-származékot, azaz 19+2 csúcs elválasztását valósították meg 30 perc alatt

pmól tartományban Gustavsson és munkatársai a 4. táblázatban részletezett grádiens

szerint 1,5 ml/perc áramlási sebesség mellett (ODS oszlop: 5 μm, 250 x 4 mm) [88]. Az

irodalomban javasolt elválasztási körülményt alkalmazva az Arg, a Ser és az Asp;

valamint a Trp és a Phe nem, a Glu, a Thr és a Gly, valamint az Ile és a Leu rosszul

váltak el (csúcsfelbontásuk: 0,64 R Glu/Thr ; 0,76 R Thr/Gly ; 0,69 R Ile/Leu ). A His-1, a

His-2, a Tyr-1 és a Tyr-2 alapvonalig elváltak. Az irodalmi optimált grádiens

reprodukálása nem sikerült. Az aminosav-származékok hatékony elválasztása érdekében

új grádienst készítettem, további aminosavakkal kiegészítve.

A készülék óvása érdekében a javasolt [88] állandó 15% THF tartalmú eluensek

összetételét megváltoztattam (A eluens: 0,05 M nátrium-acetát oldat, B eluens: 0,10 M

nátrium-acetát oldat/ACN/MeOH = 23:11:11 (v/v) [184]).

Az időigényes optimálási folyamatot lépésenként végeztem: mindig egy paramétert

változtattam, melyek az 5.2.1-5.2.5 fejezetekben részletezettek.

5.2.1 Az oszlopok tulajdonságainak hatása az elválasztás hatékonyságára

Az optimálási munkám az oszlopok tulajdonságainak változtatásával folytatódott.

a) Az oszlop hosszának hatását Hypersil 120-ODS 100, 150, 200 és 250 x 4 mm-

es, 5 μm töltetű oszlopon, Hypersil ODS 30 x 4 mm előtét oszloppal („Hypersil”

oszlopok, BST, Budapest, Magyarország), ugyanazon grádiens alkalmazásával

végeztem. Az oszlop hosszának növekedésével az elválasztás hatékonysága

javult, az aminosav-származékok retenciója nőtt. Az első aminosav pár, az Asp

és a Glu, 250 mm oszlopon későn, 9,8 és 10,4 percnél eluálódott, szemben a 100

mm oszlopon 4,1 és 5,1 perc retenciós idővel. Az oszlophossz tekintetében 150

72

mm volt az optimum érték [(I) jelű oszlop] az első aminosav pár (9. ábra, tR =

4,7 és 5,6 perc), valamint az elválasztás hatékonyságát figyelembe véve.

b) Az elválasztást Nucleosil 120-ODS 200 x 4 mm, 5 μm töltetű oszlopon

(„Nucleosil” oszlop, BST, Budapest, Magyarország) is vizsgáltam (28. ábra). A

Nucleosil típusú töltetek másodlagos szerkezetének hiánya miatt az oszlop nem

bizonyult tartósnak. Két aminosav (az Arg és a His-2) retenciós sorrendje más,

ugyanilyen tulajdonságú, „Hypersil” oszloppal összehasonlítva, az

oszlophossztól függetlenül. „Hypersil” oszlopon az Arg a Thr és az Ala között

eluálódott (9. ábra), Nucleosil töltetű oszlop az Arg-t nagyobb mértékben

tartotta vissza: a Tyr-1 és a Val között jelent meg a csúcsa (28. ábra). A His-2

Hypersil típusú töltet hatására az Orn előtt (9. ábra), míg „Nucleosil” oszlopon a

Lys és a Tyr-2 között (28. ábra) eluálódott.

Az (I) és (II) jelű oszlopokon összehasonlítva az Arg retencióját, a 100 Å

pórusátmérőjűn [(II) oszlop] kisebb mértékű: a Ser és a Gly között eluálódott (9.

és 30. ábra).

c) Oszlop tulajdonságainak hatását vizsgálva az elválasztás hatékonyságára, 22

FMOC-aminosav elválasztása elsőként optimált Hypersil 175-ODS 200 x 4 mm,

5 μm töltetű oszlopon („Hypersil Gold” oszlop, BST, Budapest, Magyarország

29. ábra), melyet BST Kft. (Budapest, Magyarország) bocsátott

rendelkezésemre. A töltet a legújabb technológiával készült, az oszlop

pórusátmérőjének szélsőséges értékre (175 Å) növelésével, a csúcsok

szélességének csökkentése céljából. Tapasztalataim szerint éles csúcsokkal

eluálódtak az FMOC-aminosavak, de az elválasztás hatékonyságán nem javított,

feltehetően a szélsőséges nagy felületi adszorpció miatt.

Az eltérő tulajdonságú oszlopokon kis mértékben eltérő válaszjeleket tapasztaltam

azonos körülmények között (értékük ≤8,6%).

Továbbiakban az (I) jelű oszlopon folytattam az optimálási lépéseket.

73

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500,0

0,2

0,4

0,6

0,8

xx

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

FMOC-aminosavak mûveleti üres

FMOC-OH FMOC-ADAM

x

Asp Glu

Hyp

Asn G

ln Ser

Gly

Thr A

laG

AB

A

Tyr

-1

Pro A

rg

Val

Met

Ile

Leu

Phe

(Cys

) 2

Orn

Lys

Tyr

-2H

is-2

28. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) „Nucleosil” oszlopon (5.2.1 fejezetben részletezett) FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint

74

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500,0

0,2

0,4

0,6

0,8

x

x

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

mûveleti üres FMOC-aminosavak

Glu

Asp Se

r

Pro

Hyp Asn

Gln G

ly

Arg

Thr

Ala GA

BA

Tyr

-1V

alM

etIl

e Leu Ph

e

(Cys

) 2

His

-2O

rnL

ysT

yr-2

FMOC-ADAMFMOC-OH

29. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) „Hypersil Gold” oszlopon (5.2.1 fejezetben részletezett) FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint

75

5.2.2 A hőfok hatása az elválasztás hatékonyságára

A hőfok emelésével az oldatok viszkozitása csökken [37]. Az elválasztás hatékonyságát

40, 45, 50, 55, 60ºC hőfokon vizsgáltam.

A oszlop hőfokának változtatása a Gly, a Thr, az Arg, az Ala és a Pro retenciójára volt

legnagyobb hatással. Az imént felsoroltak közül az első (Gly) és az utolsó (Pro)

aminosav között rendre 1,2 – 1,5 - 1,7 – 1,8 – 1,8 perc a retenciós időbeli különbség a

hőfok függvényében (40 - 60°C). Az elúciós profil tekintetében a 60ºC és az 55ºC

oszlop hőfok között nincs jelentős különbség, a 60°C további vizsgálatával nem

foglalkoztam.

A 11. táblázat tartalmazza a fent említett kritikus aminosav párok csúcsfelbontását,

továbbá a rosszul elváló Val és Met, valamint Ile és Leu csúcsfelbontásának értékeit az

oszlop hőfokának függvényében.

11. táblázat: Az oszlop hőfokának hatása a kritikus aminosav párok csúcsfelbontására,

az R értékre, mely a következő képlet alapján számított : 21

122WWtt

R RR

Az oszlop A hőfoka kritikus aminosav párok

40°C 45°C 50°C 55°C

Gly/Thr 0 0 0,65 0,22

Thr/Arg 0,77 0,61 0,62 0,79

Ala/Pro 0 0,59 0,70 0,81

Val/Met 0,64 0,66 0,64 0,65

Ile/Leu 0,61 0,72 0,72 0,73

Phe/F-OH 1,23 1,11 0,98 0,44

Jelölések: mint a 7. táblázatban, továbbá W=csúcs alapvonali szélessége percben kifejezve; F-OH=FMOC-OH; vastaggal jelölt az adott aminosav párhoz tartozó optimum R érték.

40ºC hőfokon a Gly és a Thr, valamint az Ala és a Pro együtt eluálódnak (11. táblázat,

40°C: 0R ,0R Ala/ProGly/Thr ). Jóllehet a hőfok emelésével az Ala és a Pro elválása

egyre jobb: 55ºC hőfok esetében RAla/Pro = 0,81; a Gly és a Thr maximális

76

csúcsfelbontása a vizsgált tartományban a 50°C oszlop hőfok esetében tapasztalható

(11. táblázat, 50°C: 70,0R ;65,0R Ala/ProGly/Thr ).

A további kritikus párok, a Val és a Met; a Thr és az Arg, valamint az Ile és a Leu

elválasztására az oszlop hőfok változtatásának nincs számottevő hatása (11. táblázat).

A 11. táblázat eredményeiből jól látható, hogy az oszlop hőfokának változására a

legnagyobb mennyiségben jelenlévő FMOC-OH retenciós ideje a legérzekenyebb. A

szomszédos Phe-lal a csúcsfelbontásuk a hőfokkal fordíottan arányos, az elválasztásuk

≤50°C esetén megvalósított.

Az összes, hőfok változásra érzékeny kritikus aminosav pár elválaszthatóságát tekintve

kijelenthető, hogy 50°C az ideális oszlop hőfok.

5.2.3 Az eluens pH értékének hatása az elválasztás hatékonyságára

Az elválasztás optimálása szempontjából kulcsfontosságú lépés az eluens pH értékének

megválasztása, mely az aminosav-származékok protonáltsági állapotát határozza meg.

Az általunk választott ODS apoláros oszlopon az elválasztandó komponensek

visszatartását jelentős mértékben befolyásolja az adott vegyület polaritásának mértéke

[37]. Az aminosav-származékok protonálható csoportjai közül az α-karboxil csoport (9.

táblázat, pK értéke 1,7 és 2,6 közötti érték, kivéve a GABA: 4,03) deprotonált

állapotban van a vizsgált pH sorozaton (pH 8,20; 7,20; 6,20; 5,20; 4,20; 3,20), töltéssel

rendelkeznek. Polaritásbeli különbségüket az oldallánc, valamint az esetlegesen

protonálható csoport határozza meg.

A 9. és a 12. táblázatokat összevetve jól látható az összefüggés, az oldallánci csoportok

pK értékei hogyan befolyásolják a protonáltsági állapotot, a polározottság mértékét,

következésképpen az elúciós sorrendet, adott pH értéken, úgymint:

a) Az Asp és a Glu nagyobb pH értékű tartományban (pH 8,20 - 5,20) elsőként

eluálódnak. pH 4,20 és 3,20 értékeken az oldallánci karboxil csoport

protonálódásának (pK értékük rendre 3,90 és 4,07) következtében polaritásuk

csökken, visszatartásuk az oszlopon nő: a Ser és a Gly között eluálódnak.

b) Két aminosav pár, a GABA és a Pro, valamint a Val és a Met egymáshoz

viszonyított polaritásuk az eluens pH értékének függvényében változik: pH 8,20,

77

7,20, 6,20 értékeken az említett párok közül a GABA és a Val polárosabb, majd

pH 5,20, 4,20, 3,20 esetében a sorrend megfordul, a Pro-t követi a GABA, a

Met-t a Val.

c) Az FMOC-OH retenciója függ legnagyobb mértékben az eluens pH értékének

változásától. pH 8,20 értékű eluens esetén 19. összetevőként (tR = 22,8 perc),

míg pH 3,20 esetében 11. összetevőként (tR = 18,1 perc) eluálódik.

d) Az eluensek pH értéke a mért tartományon belül nem befolyásolja az aminosav-

származékok válaszjeleinek nagyságát.

A fent összefoglalt (a-d) pontok alapján a pH 8,20 és 7,20 értékű eluensek esetében

tapasztaltam a legkedvezőbb elválásokat. A továbbiakban az oszlop védelme érdekében

a pH 7,20 értékű eluensekkel folytattam az optimálási munkámat. A kritikus

aminosavak: a Gly, a Thr, az Arg, az Ala, a GABA és a Pro, valamint a Met és a Val

elválasztásának megoldása még további erőfeszítéseket igényel.

78

12. táblázat: Az FMOC-aminosavak elúciós sorrendje a felsorolás rendjében (fentről lefelé) az eluens pH értékének függvényében ugyanazon körülmények közötti felvételek alapján

pH 8,20 pH 7,20 pH 6,20 pH 5,20 pH 4,20 pH 3,20 Asp Asp Asp Asp Asn Asn Glu Glu Glu Glu Gln Gln Hyp Hyp Hyp Hyp Hyp Hyp Asn Asn Asn Asn Ser Ser Gln Gln Gln Gln Asp Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala

GABA GABA GABA Pro F-OH 21,0

F-OH 18,1

Pro Pro Pro GABA Pro Pro Val Val Val Met GABA GABA

Met Met Met F-OH 21,8 Met Met

Ile Ile Ile Val Val Val Leu Leu Leu Ile Ile Ile Trp Trp Trp Leu Leu Leu Phe Phe Phe Trp Trp Trp

F-OH 22,8

F-OH 22,5

F-OH 22,1 Phe Phe Phe

(Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 (Cys)2 His-2 His-2 His-2 His-2 His-2 His-2 Orn Orn Orn Orn Orn Orn Lys Lys Lys Lys Lys Lys

Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Tyr-2 Jelölések: F-OH=FMOC-OH; az utána szereplő, vastaggal jelölt számérték az FMOC-OH retenciós ideje percben kifejezve; dőlttel jelölt aminosavak viszonylagos tR értékét az eluens pH értéke befolyásolja; az egy cellában feltüntetett aminosavak együttesen eluálódnak.

5.2.4 Az eluens összetétel hatása az elválasztás hatékonyságára

Az A eluens változatlan összetételű: 0,05 M nátrium-acetát oldat, szervetlen só; a B

eluens a kiindulás szerint 0,1 M nátrium-acetát/ACN/MeOH = 23:11:11 (v/v), azaz 49%

szerves oldószer tartalmú. Az aminosav-származékok elválasztásának érdekében a

79

továbbiakban a B eluens szerves oldószer arányát és minőségét (ACN, MeOH, THF)

optimáltam. (A két eluens optimált pH értéke 7,20; oszlop hőfoka 50°C; 5.2.2 és 5.2.3

fejezetekben részletezettek; állandó áramlási sebesség mellett: 1,5 ml/perc).

a) A „kritikus aminosavak”: a Gly, a Thr, az Arg, az Ala, a GABA és a Pro,

valamint a Met és a Val elválasztását javította az eluens MeOH tartalmának

cseréje ACN-re.

b) Az induló grádiens arány csak 70% A eluens/ 30% B eluens bizonyult

optimálisnak az Asp és a Glu elválása érdekében.

c) Továbbiakban a szerves oldószer tartalmú B eluens percenkénti százalékos

emelkedés ütemét változtattam (0,4 és 9,7 %/perc között). Az optimális

értékeket a 3. és 5. táblázatban tüntettem fel.

Az eluens szerves oldószer tartalom optimálása során [(a-c) pont] a Phe összecsúszott az

FMOC-OH-dal, amit a szerves oldószer tartalom változtatásával nem sikerült

kiküszöbölni, így a továbbiakban az áramlási sebességet változtattam.

5.2.5 Az áramlási sebesség optimálása

Az áramlási sebesség - a vizsgált tartományon belül (0,8-1,7 ml/perc) – folyamatos

csökkentése tovább javította a Gly, a Thr és az Arg, valamint a Val és a Met

elválasztását; alacsony értéken tartása mellett a Phe és az FMOC-OH csúcsok

elválasztása megoldott (3. és 5. táblázat).

Megjegyzés: Az (I)-es jelű oszlop elhasználódott az 5.1 és 5.2 fejezetben részletezett

kísérleti munka során, ezért a (II)-es jelű oszlop eltérő tulajdonsága miatt módosítani

kellett a grádiensen (5. táblázat). Újabb eluenst iktattam be, a B eluens alapján az ACN

felét THF-ra cseréltem: a His-2-t el kellett választani az Orn-tól és a Lys-től.

80

5.3 Módszerfejlesztés, plazma minta előkészítése: az egyidejű származékképzés és

fehérjementesítés optimálása

Ebben a fejezetben a kidolgozott módszer gyakorlati alkalmazását mutatom be: plazma

mintát elemzek. Minden kulcskérdés, ami az aminosavak és az FMOC

reakciókörülményeihez, valamint a képződött származékok mennyiségi viszonyaihoz

kapcsolódik, tisztázott (5.1 fejezetben részletezett). Ezek az eredmények állandó

feltételeket biztosítanak a jelenlegi munkámhoz (műveleti üres, puffer pH értéke,

reagens oldószere, reakcióidő tekintetében), kivéve az FMOC koncentrációt. A minta

fehérjéinek FMOC fogyasztását figyelembe kell venni, az aminosavak kvantitatív

származékképzéshez szükséges FMOC mennyiségét ismét optimálom [185].

5.3.1 Az FMOC-aminosavak és a műveleti üres szennyezői

Grádienst (5. táblázat) dolgoztam ki a 22 FMOC-aminosav elválasztására (5.2

fejezetben részletezett), optimális származékkészítésük után (4.6.2 fejezetben

részletezett), különös tekintettel a His-2 és a Tyr-2 elválasztására a szomszédjaiktól.

Szaggatott vonallal ábrázoltam a műveleti üres kromatogramot (30. ábra).

81

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

x

FMOC-aminosavak mûveleti üres

x

x

FMOC-ADAMFMOC-OH

Tyr

-2

Lys

Orn

His

-2

GA

BA

ProA

laT

hrG

lyA

rgSer

GlnA

sn

Hyp

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

Val

Met

xA

sp Glu

Ile L

eu Phe

(Cys

) 2

30. ábra: Az FMOC-aminosavak kromatogramja (folyamatos vonal) a műveleti üressel (szaggatott vonal) (II) oszlopon FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 3 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint

82

5.3.2 A fehérjementesítés és a származékképzés optimálása

Ezen vizsgálatok során az FMOC koncentrációt változtattam, ACN oldószer, pH 9

értékű puffer, és állandó PFAA koncentráció alkalmazásával (azaz 150 µl, 15-szörös

hígítású, a 11 emlőrákos beteg közül 1, közvetlenül műtét előtti plazma mintát

használtam, a továbbiakban: 1-es számú beteg). Az FMOC reakcióelegyre

vonatkoztatott koncentrációját 0,5 és 7,5 mM között változtattam. A származékképzés

hatékonyságát az FMOC-származékok válaszjelének nagyságával jellemzem az 1-es

számú beteg plazmájának összetevői µmól/l-ben kifejezve (reakcióidő 20 perc, 13.

táblázat).

13. táblázat: Az 1-es számú beteg plazmájában talált szabad aminosavak mennyisége az FMOC reagens koncentráció függvényében

Amino- savak tR, perc Hígított (15x) plazma szabad aminosav tartalma [µmól/l]

[FMOC] mM* 0,5 1,5 3,0 5,0 7,5 Átlag RSD% Asp 10,2 9,52 27,1 42,0 39,2 39,4 40,2 3,9 Glu 11,2 105 139 164 166 168 166 1,2 Hyp 16,3 14,2 14,5 13,9 13,4 13,7 14,0 3,1 Asn 18,7 15,0 37,1 42,2 42,4 41,9 42,1 0,55 Gln 19,8 271 456 476 492 473 480 2,1 Ser 21,2 115 166 170 160 172 167 3,2 Arg 22,2 139 157 158 163 155 158 2,2 Gly 23,6 362 368 356 381 352 364 3,1 Thr 24,5 59,9 95,8 93,8 95 93,1 94,4 1,3 Ala 26,0 270 265 256 257 266 263 2,2 Pro 26,6 110 108 110 108 108 109 1,0 Val 30,6 147 151 148 150 146 148 1,4 Met 31,1 15,0 15,5 15,6 17,2 15,9 15,9 5,2 Ile 32,0 47,5 46,0 47,9 44,6 46,7 46,5 2,8

Leu 32,2 95,4 95,5 95,6 96,5 98,0 96,2 1,2 Phe 32,6 62,7 62,9 62,8 66,5 62,8 63,5 2,6

(Cys)2 33,4 176 179 179 178 187 180 2,3 His 36,5 75,5** 75,4** 72,1 74,0 73,7 74,1 1,9 Orn 36,7 88,0 81,6 88,4 82,3 89,4 85,9 4,3 Lys 37,0 121 123 122 120 124 122 1,3 Tyr 38,3 35,7** 36,1** 34,5 35,0 36,8 35,6 2,6

Jelölések: [FMOC] mM*=a reakcióelegyre vonatkoztatva értendő; dőlt betűvel jelzett értékek nem kvantitatív adatok, az átlagba nem számítottak; **His és **Tyr=His-2 és Tyr-2 formában mértek, kivéve ahol dupla csillaggal jelöltek [az adatok a His-1+His-2 és a Tyr-1+Tyr-2 összegéből számítottak: His-2/His-1=3,3:1 és Tyr-2/Tyr-1=3,2:1 (5.1.9 fejezetben részletezett)].

83

Az eredményekből következik, hogy a reakcióelegy FMOC koncentrációja legalább 3

mM kell, legyen: az aminosavak származékképzése teljes, valamint a His-1 és a Tyr-1

mennyiségileg átalakulnak His-2-vé és Tyr-2-vé (13. táblázat). 1,5 mM esetében a két

dikarbonav és a két savamid aminosav reakciója nem kvantitatív; 0,5 mM esetében az

előbbiek mellett a Ser, a Thr, az Arg reakciója sem teljes; valamint a His és a Tyr értéke

számított a His-1 + His-2 és a Tyr-1 + Tyr-2 válaszjeleiből (5.1.9 fejezetben

részletezett).

Tehát a származékképzés kvantitatív, a válaszjelek reprodukálhatóak, a párhuzamos

értékek mérési hibahatáron belül vannak, melyet relatív standard deviációval

jellemeztem (13. táblázat, ≤5,2% RSD, átlaga 2,2% RSD).

A plazma fehérjementesítése ACN-lel [plazma/ACN = 1:1 (v/v) arányban] és a PFAA

meghatározása FMOC-származékokként külön lépésenként kidolgozott módszere

ismert [144]. A két lépés együttesen 48 perc mintaelőkészítést vesz igénybe [144], ezt

az időt az egyidejű módszeremmel 30 percre csökkentettem.

5.3.3 A módszer validálása

Az egy lépésben történő fehérjementesítési és származékképzési módszer

megbízhatóságának bizonyításaképpen vizsgáltam a plazma minták aminosav

tartalmának visszanyerhetőségét, a mérések reprodukálhatóságát, valamint az FMOC-

aminosavak mennyisége és válaszjele közötti összefüggést (legalább három párhuzamos

mérés átlagából számított értékek, 14. és 15. táblázat).

Az aminosav-származékok válaszjeleit (i.e./pmól-ban kifejezettek) értékelve

elmondható:

a) A különböző koncentrációjú aminosav standard oldatok eredményei között az

összefüggés lineáris (14. táblázat, 2,5 és 80 pmól/ aminosav/ injektált térfogat

között számított regressziós koefficiens: 0,98156 ≤ r ≤ 0,99999).

b) Az 1-es számú beteg plazmájához hozzáadott aminosav standard oldat viszonya

szintén lineáris (14. táblázat, 5 és 40 pmól/ aminosav/ injektált térfogat között

számított regressziós koefficiens: 0,98700 ≤ r ≤ 0,99998).

Jelölések: mint a 13. táblázatban, továbbá As=aminosavak; dőlt betűvel jelzett értékek UV felvételből számítottak (OrnUV, LysUV); +=FL intenzitás a detektálási határon túl esik; *=a Tyr Tyr-2 formában mért, kivéve a csillaggal jelölt adatokat, ahol a Tyr-1+Tyr-2 összegéből számítottak (Tyr-2/Tyr-1(UV)=1,66:1); -=nem szignifikáns válaszjel az alacsony intenzitás vagy a kiindulási nagy mennyiségű aminosav miatt.

84

14. táblázat: Különböző mennyiségű aminosavak reprodukálhatósága, standard oldatokból, az 1-es számú beteg plazmájához hozzáadott standard oldatokból, valamint az eltérően hígított plazma mintából, FMOC-származékokként

Integrátor egység/pmól Talált [µmól/l] Amino savak Standard oldat Plazma (15x hígított) + As

standard oldat Hígított plazma

Injektált pmól 80 40 20 10 5 2,5 40 20 10 5

Átlag RSD%

30x 15x 7,5x

Átlag RSD%

Asp 96,9 96,6 100 96,5 101 100 100 102 100 101 99,5 1,9 40,1 39,8 38,4 39,4 2,2 Glu 96,5 101 103 99,4 106 96,3 96,2 102 98,7 102 100 3,3 167 165 165 166 0,69 Hyp 98,6 96,1 96,6 101 96,1 98,4 102 101 103 98,8 99,2 2,5 14,7 14,0 13,5 14,1 4,0 Asn 87,8 87,3 87,5 87,7 89,5 87,4 87,9 91,5 89,9 88,3 88,5 1,6 42,9 41,4 42,1 42,1 1,7 Gln 64,1 64,7 65,7 65,8 64,8 64,2 66,7 63,3 65,5 - 65,0 1,6 468 476 476 473 0,98 Ser 102 105 104 104 105 105 102 105 106 - 104 1,3 170 171 171 171 0,34 Arg 94,5 93,5 94,7 93,9 91,6 94,5 90,8 94,2 91,5 90,7 93,0 1,8 155 156 158 156 0,98 Gly 104 105 104 107 108 107 106 109 - - 106 1,7 369 368 363 366 0,88 Thr 104 103 107 104 108 104 103 107 107 108 106 2,1 92,6 95,1 94,9 94,2 1,5 Ala 122 124 123 118 118 123 117 121 117 - 120 2,4 274 271 273 272 0,56 Pro 98,2 98,1 98,6 95,3 96,8 96,0 96,6 101 98,1 - 97,6 1,7 111 110 109 110 0,91

GABA 105 104 107 107 105 105 108 106 104 - 106 1,3 LOQ LOQ LOQ LOQ Val 89,1 89,1 92,7 94,6 89,2 92,2 92,6 95,9 92,4 91,9 92,0 2,5 153 149 148 150 1,7 Met 81,2 80,3 83,5 84,5 80,5 81,0 82,0 84,9 83,3 80,6 82,2 2,1 16,9 16,1 15,7 16,2 3,9 Ile 95,3 94,9 99,4 98,3 96,9 95,8 95,7 95,6 98,6 96,2 96,7 1,6 43,9 46,1 47,9 46,0 4,4

Leu 102 102 104 105 104 102 102 107 106 105 104 1,8 99,1 95,6 95,7 96,8 2,0 Phe 99,4 99,7 100 103 105 101 103 108 106 104 103 2,8 65,0 63,2 63,7 64,0 1,5

(Cys)2 4,92 4,92 4,88 4,90 4,96 - 5,05 5,08 4,68 4,98 4,93 2,4 171 174 179 175 2,3 His 41,9 40,3 41,1 42,3 41,1 41,6 40,2 44,0 44,2 40,9 41,8 3,3 77,2 71,7 72,1 73,7 4,1 Orn + 172 176 180 169 174 + 180 181 172 176 2,5 92,0 91,5 + 91,5 0,63

OrnUV 2,55 2,56 2,56 2,60 2,63 - 2,50 2,60 2,56 2,72 2,59 2,4 LOQ LOQ 90,9 LOQ Lys + 216 219 218 212 217 + + 216 215 216 1,0 122 122 + 122 0,47

LysUV 3,06 3,02 3,13 2,96 2,92 - 3,17 3,14 2,99 2,96 3,04 3,1 LOQ LOQ 122,1 LOQ TyrUV 2,69 2,67 2,74 2,76 - - 2,63* 2,77* 2,80* - 2,72 2,4 34,2 35,6 36,8* 35,5 3,7

85

c) Az 1-es számú beteg különböző mértékben hígított plazma mintájából készült

aminosav-származékok válaszjelei a hígítással arányosan változnak (14. táblázat

utolsó öt oszlopa).

d) Az 1-es számú beteg 15-szörösére hígított plazma mintájához különböző

mennyiségben hozzáadott aminosavak visszanyerhetőek, átlaguk 100,8% (15.

táblázat).

15. táblázat: A páciens 1 15-szörösére hígított plazma mintához hozzáadott aminosavak visszanyerhetősége

Visszanyerhetőség, % Hozzáadott As/ injektált tf. Amino-

savak 40 pmól 20 pmól 10 pmól 5 pmól

Átlag RSD%

Asp 104 102 104 100 102 1,5 Glu 95,4 99,1 99,3 95,7 97,4 2,2 Hyp 107 105 101 103 104 2,2 Asn 101 105 103 98,6 102 2,5 Gln 103 96,4 99,5 - 99,6 3,3 Ser 96,6 101 102 - 100 3,0 Arg 97,2 99,4 97,5 99,0 98,3 1,1 Gly 101 105 - - 103 2,2 Thr 100 100 102 99,5 101 1,2 Ala 94,6 98,3 99,5 - 97,5 2,6 Pro 98,5 102 103 - 101 2,4

GABA 104 99,1 96,9 - 100 3,7 Val 104 104 97,7 103 102 2,8 Met 102 102 98,5 100 101 1,7 Ile 101 96,2 100 99,3 99,2 2,1

Leu 100 103 101 101 101 1,1 Phe 103 107 103 98,3 103 3,6

(Cys)2 103 104 95,4 100 101 3,8 His 99,6 107 104 99,4 103 3,7 Orn 97,6 105 101 101 101 2,9 Lys 105 100 99,4 101 102 2,4 Tyr 98,5 101 101 - 100 1,6

Jelölések: mint a 14. táblázatban.

Az értékek reprodukálhatósága relatív standard deviációval jellemzett, a kidolgozott

módszer alkalmazhatósága bizonyított, átlaguk a felsorolás rendjében a), b) 3,3% RSD

(14. táblázat 13. oszlopa); c) 4,4% RSD (14. táblázat, utolsó oszlop); d) 2,4% RSD (15.

táblázat).

86

5.3.4 Emlőrákos betegek plazma szabad aminosav tartalma műtét előtt és után

11 emlőrákos nőbeteg PFAA szintjét mértem közvetlenül műtét előtt és 3 héttel műtét

után (31. ábra, 16. táblázat).

Reprodukálható és megbízható méréseim alapján (16. táblázat, átlag: 2,1% és 3,0%

RSD) az alábbi következtetések vonhatók le:

a) Az irodalmi adatoknak megfelelően számottevő különbséget az aminosavak

plazma szintjében műtét előtt és után nem találtunk [174,186], mely tumor jelölő

vegyületként szolgálhatna.

b) A 11 beteg aminosav szintje jelentős egyéni változatosságot mutat, széles

tartományt ölel fel, mely a legkisebb és a legnagyobb mért értékkel jellemzett

mind műtét előtt, mind műtét után (16. táblázat, negyedik és hetedik oszlop).

c) A mért plazma aminosavak összegének halvány növekménye minden beteg

esetében megfigyelt: mind az átlagban (műtét előtt: 2849 µM; műtét után: 2967

µM), mind a sorozatban (műtét előtt: 2178-3479 µM; műtét után: 2300-3836

µM).

87

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 mûtét elõtt mûtét után

x

x

x

FMOC-ADAMFMOC-OH

Fluo

resz

cenc

iás i

nten

zitá

s

tR, perc

Hyp A

snG

lnSe

rA

rgG

lyT

hrA

la

Pro

Val1=Met

2=Ile3=Phe4=(Cys)2

1

2

4

His

-2O

rn

Lys

Tyr

-2

Leu

3 xA

spG

lu

31. ábra: Az 1-es számú beteg PFAA tartalmának kromatogramja közvetlenül műtét előtt (piros vonal) és három héttel műtét után (fekete vonal) (II) oszlopon FL detektálás alapján; az FMOC-aminosavak optimális körülmények között készültek (pH 9, ACN tartalmú 3 mM FMOC reagens, 20 perc); grádiens elúció: 5. táblázat szerint

88

16. táblázat: 11 emlőrákos beteg plazmájának szabad aminosav tartalma közvetlenül műtét előtt és három héttel műtét után

Talált aminosavak [µmól/l] Műtét előtt Műtét után

Amino- savak Átlag RSD%* (terjedelem) Átlag RSD%* (terjedelem)

Asp 43,9 3,4 (27,1 -79,6) 39,0 2,5 (25,4 – 75,1) Glu 163 2,0 (118 – 228) 163 3,4 (108 – 266) Hyp 10,9 2,6 (3,90 - 26,9) 14,1 3,4 (6,51 – 23,2) Asn 41,4 2,3 (29,8 – 54,8) 42,5 3,2 (28,4 – 60,9) Gln 480 1,5 (365 – 598) 446 2,7 (215 – 566) Ser 139 3,3 (94,0 – 187) 144 3,2 (82,7 – 220) Arg 145 3,1 (89,5 – 234) 147 3,3 (99,7 – 195) Gly 256 2,5 (164 – 401) 273 2,7 (134 – 430) Thr 92,5 2,7 (68,5 - 125) 96,2 3,1 (61,3 – 157) Ala 270 2,6 (177 – 464) 309 2,7 (199 – 487) Pro 187 2,8 (105 – 391) 212 2,8 (117 – 399) Val 189 1,9 (141 – 234) 212 3,1 (152 – 301) Met 17,0 3,3 (12,0 - 24,4) 22,8 3,8 (14,4 – 31,7) Ile 51,4 2,8 (37,0 – 61,8) 61,7 2,6 (45,3 – 84,7) Leu 111 2,8 (74,2 – 167) 121 2,8 (83,0 – 181) Phe 71,0 2,3 (48,2 – 114) 71,2 2,5 (51,0 – 120) Cys 208 2,4 (122 -308) 201 4,2 (137 – 340) His 79,2 3,3 (58,0 – 117) 92,9 3,5 (58,7 -127) Orn 90,8 2,7 (61,5 – 117) 87,6 2,5 (63,3 – 119) Lys 170 2,1 (122 – 208) 171 2,3 (136 – 212) Tyr 33,6 1,9 (24,4 - 50,8) 39,9 3,3 (26,1 – 57,4)

Totál 2849 (2178 – 3479) 2967 (2300 - 3836)

Jelölések: mint a 13. és a 14. táblázatban, továbbá *=az RSD% az egyes minták legalább három párhuzamos mérések RSD%-ainak átlaga.

89

6. Összehasonlító tanulmány: az aminosavak meghatározása OPA/tiol,

OPA+FMOC, valamint FMOC származékképző szerekkel

Az ELTE kutatócsoportja Perlné Dr. Molnár Ibolya irányítása alatt tíz éve foglalkozik

aminosavak különböző származékokkénti meghatározásával. Az elmúlt tíz évben a

leggyakrabban (36%-a az összesnek) alkalmazott származékképző reagens, az OPA és

valamilyen tiol tartalmú segédanyag részletes vizsgálatába, valamint az OPA+FMOC

kétlépcsős származékkészítési meghatározásba kapcsolódtam be, majd egy módszert

fejlesztettem az aminosavak FMOC-származékokkénti elemzéséhez (5. fejezetben

részletezett).

Ebben a fejezetben a három módszer - az OPA és valamilyen tiol tartalmú segédanyag

(5.ábra), az OPA+FMOC kétlépcsős eljárás, valamint az FMOC reagenssel

származékképzés (6.ábra; továbbiakban a felsorolás rendjében „OPA/tiol”,

„OPA+FMOC”, „FMOC”) - összehasonlító tanulmányát mutatom be a különböző

szempontok szerint, melyek a következőek (17. táblázat):

1. a reagensek jellemzői;

2. a reakció, valamint a képződő fő- és melléktermékek jellemzői;

3. az elválasztás gyakorlati tapasztalatai;

4. alkalmazhatóság a különböző biológiai mátrixok esetében, összegzés.

90

17. táblázat: Az ELTE kutatócsoportja által kidolgozott „OPA/tiol”-, „OPA+FMOC”- , „FMOC”-módszer összehasonlítása az aminosavak származékokkénti meghatározására, a reagens, a reakció és a keletkezett termékek jellemzői alapján

Vizsgált származékképző szerek Összehasonlítási szempontok OPA/tiol OPA+FMOC FMOC

Mért vegyület

primer amino csoport

1.lépés: OPA, primer-, 2.lépés:

FMOC, szekunder amino

csoport

primer és szekunder

amino csoport

elkészítése

OPA r.: sz. OPA MeOH-ban oldva

+ puffer + tiol segédanyag

OPA r. mint OPA/tiol; FMOC r.: sz. FMOC-Cl ACN-ben oldva

FMOC r.: sz. FMOC-Cl ACN-ben

oldva Reagens

stabilitása 2 nap OPA r.: 2 nap;

FMOC r.: 6 hónap

6 hónap

kivitelezés 1 lépés: OPA r. 2 lépés: OPA r. + FMOC r.

3 lépés: puffer + FMOC r. +

ADAM puffer típusa/pH borát/9-10 borát/10 borát/8-9

idő 1 perc 1 + 1 perc 20 + 1 perc

Reakció- körülmények

hőfok szobahőfok szobahőfok szobahőfok Származékok stabilitása 6 óra 6 óra/ 13 nap 13 nap

másodlagos termék(ek) képződése

van van nincs Reagens- felesleg elválasztás során

zavaró hatás nincs nincs van

Műveleti üres csúcsok vannak vannak vannak FL hullámhossz,

nm ex: 330/ em: 460 ex: 330/ em: 460; ex: 263/ em: 313

ex: 254/ em: 313

UV absz.max., nm 334 334, 262 262

Spektrális tulajdonság

RR érték 5,87 5,87/ 79,5* 70,9 Érzékenység (LOQ; FL) 30 pmól 30 pmól 2,5 pmól

aminosavak Orn, Lys, Gly, His - His, Tyr

csúcsterületek összege állandó - arányuk állandó Egynél több

származékot adó termékek egy-egy

származékot adjanak

80% MeOH tartalmú reagens -

nagyobb FMOC konc,

hosszabb reakcióidő

Megjegyzés fehérjealkotó Pro, Hyp nem mérhető

mérés közben hullámhosszt kell

váltani a FL detektoron

feleslegelvétel szükséges

Jelölések: sz.=szilárd; r.=reagens; RR=FL válaszjel/UV válaszjel; *=FMOC-Pro és FMOC-Hyp átlaga; absz.max.=abszorpciós maximum; LOQ=mennyiségi mérés határértéke, FL detektálás esetén.

91

6.1 A reagensek jellemzői

Az OPA és valamely tiol tartalmú segédanyag, valamint az FMOC reagens (a)

elkészítésének módját és időigényét, valamint (b) a kész reagensek eltarthatóságát

hasonlítom össze.

a) A reagensek elkészítésének módja és időigénye: Az OPA/tiol reagens elkészítése

többlépcsős folyamat, melynek során a megfelelő mennyiségű MeOH-ban oldott

OPA-t kell elegyíteni 1:4 térfogatarányban borát pufferrel (pH 9,3), valamint a

tiol tartalmú segédanyaggal. Az összetétel adott mólarányú: OPA/tiol = 1:10. Az

elkészítési idő átlagosan 30 perc.

Az FMOC reagens elkészítése egy lépésből áll: a megfelelő mennyiségű szilárd

FMOC-Cl-ot ACN-ben kell oldani, mely 10 percet vesz igénybe.

A reagensek összetevőinek minősége és aránya hosszas kutatómunka

eredményeképpen adott.

b) A reagensek eltarthatósága: Az OPA reagens 2 napig, az FMOC reagens 6

hónapig tartható el hűtőszekrényben (4ºC).

6.2 A reakció, valamint a képződött fő- és melléktermékek jellemzői

Az alábbi pontokban a három módszer reakcióinak gyakorlati vonatkozásait, azaz (a) a

mérhető vegyületeket, (b) a gyakorlati megvalósítást, (c) a kvantitatív

származékképzéshez szükséges reakciókörülményeket és -időt, (d) a reakció során

keletkező fő- és melléktermékek jellemzőit hasonlítom össze.

a) A mérhető vegyületek: Az OPA csak primer amino csoporttal reagál. Az

„OPA/tiol” ezen hiányosságát küszöböli ki az „OPA+FMOC”, melynek során a

második lépésben az FMOC reagál a szekunder amino csoportú Pro-nal és Hyp-

nal. Következésképpen az OPA reagens kiiktatásával az „FMOC” esetében egy

lépésben meghatározhatóak mind a primer, mind a szekunder amino csoportú

aminosavak.

b) A gyakorlati megvalósítás: Az „OPA/tiol” és az „OPA+FMOC” esetében az

OPA reagens tartalmazza a puffert, melyet „FMOC” esetében (pH 9) a modell

oldattal/mintával kell elegyíteni. Ezt követi az FMOC reagens hozzáadása, majd

92

a reagensfelesleg eltávolítása. Az „OPA+FMOC” esetében jóllehet, a puffert

nem kell külön elegyíteni, de két reagens alkalmazása szükséges. Tehát a

származékképzési reakció „OPA/tiol” esetében 1 lépésben, „OPA+FMOC”

esetében 2 lépésben, míg FMOC esetében 3 lépésben kivitelezhető.

c) A kvantitatív származékképzéshez szükséges reakciókörülmények és –idő:

Mind az OPA-, mind az FMOC reakciója aminosavakkal enyhén lúgos

közegben (rendre pH 9,3 és pH 9 értékű az alkalmazott puffer), adott arányú

szerves oldószer tartalmú vizes oldatban teljes.

A származékképzési reakció sebességét az OPA/tiol esetében az

[OPA]/[aminosav]T mólarány, FMOC esetében a reagens abszolút

koncentrációja határozza meg ([FMOC]/[aminosav]T ≥ 5,5:1) a vizsgált

analitikai tartományban.

Az amino csoport reakciója OPA-val szobahőfokon gyors (1 perc), FMOC-

cal a reagens koncentrációjától függően 1-20 perc.

d) A reakció során keletkező fő- és melléktermékek jellemzői: Az OPA és tiol

tartalmú segédanyagok feleslege másodlagos termékek keletkezéséhez vezet: a

Gly, az Orn, a Lys és a His izoindolszármazékával reagál a második OPA. A

képződött másodlagos termékek instabilak, a kromatogramon 7 perc után

mérhetőek a bomlástermékek. Az egy OPA-val reagáló származékok nagyobb

stabilitásúak (6 óra).

Az FMOC esetében a His, a Tyr, az Orn és a Lys két FMOC-cal reagál. Mind a

di-származékok, a His-t kivéve, mind az egy FMOC-cal reagáló származékok 13

napig stabilak. Az FMOC mellékreakciója, hidrolízise során zavaró

melléktermék (FMOC-OH) keletkezik. Következésképpen a kvantitatív

származékképzési reakció után az FMOC felesleg további hidrolízisét

megakadályozandó, a reagensfelesleget el kell távolítani.

93

6.3 A származékok elválasztásának gyakorlati tapasztalatai

Az alábbi fejezetben a kromatográfiás művelet során tapasztaltakat összegzem, úgymint

(a) a műveleti üres csúcsok (és az FMOC-OH), valamint (b) a több reagens molekulával

reagáló aminosavak kérdése, (c) a keletkezett származékok érzékenysége (FL/UV), (d)

egyéb szükséges művelet.

a) A műveleti üres csúcsok: Kutatócsoportunk bizonyította, hogy mindhárom

módszer esetében a reagensből származó, az aminosav-származékokkal

együttesen eluálódó műveleti üres csúcsok mennyiségi mérése pmól

tartományban alapvetően nélkülözhetetlen. Az FMOC hidrolízisének terméke,

az FMOC-OH széles csúcsként eluálódik a kromatogram közepén, mely a

szomszédos FMOC-aminosavak elválasztását zavarja.

b) A több reagens molekulával reagáló aminosavak kérdése: „OPA/tiol” és

„OPA+FMOC” esetében a két OPA-val reagáló Gly, Orn, Lys és His 7 perc után

több csúccsal eluálódik a kromatogramon, az egy aminosavhoz tartozó csúcsok

összege 6 óráig állandó.

„FMOC” esetében az Orn, a Lys és a Tyr di-származékai 13 napig stabilak, a di-

His 60 perc után elkezd bomlani mono-His-né. Az Orn és a Lys esetében a

második FMOC belépése ilyen mérési metodika mellett olyan gyors, hogy a

kromatogramon nem mutatható ki több csúcs. A His és a Tyr esetében a mono-

és a di-származékok jóllehet, eltérő intenzitásúak, de az arányuk állandó, így

értékük számítható.

c) A keletkezett származékok érzékenysége (FL/UV): Az OPA-származékok FL- és

UV válaszjelének aránya, RROPA = 5,87; az FMOC-származékok esetében

RRFMOC = 70,9 azonos mérési körülmények között (ugyanazon készüléken mért

értékek alapján, azonos érzékenységre beállítva). Az FMOC-származékoknak

FL detektálás esetén a mennyiségi mérés határértéke 12-szerese az OPA-

származékoknak (LOQOPA-származék = 30 pmól; LOQFMOC-származék = 2,5 pmól).

FMOC-származékok közül kivételt képez a Trp és a (Cys)2 származéka, melyek

FL válaszjele igen alacsony (LOQCys = 10 pmól; LOQTrp = 10 pmól).

d) Egyéb szükséges művelet: A kétlépéses „OPA+FMOC” esetében hullámhossz-

váltást kell beiktatni az FMOC-Pro és FMOC-Hyp eluálódásakor.

94

6.4 Alkalmazhatóság a különböző biológiai mátrixok esetében, összegzés

A fent részletezett tapasztalatok alapján összegzem az „OPA/tiol”-, az „OPA+FMOC”-,

valamint az „FMOC”-módszerek gyakorlati alkalmazhatóságának előnyeit, valamint

hátrányait.

Az „OPA/tiol”-módszer előnye az „FMOC”-cal szemben, hogy a reagens felesleget

nem kell eltávolítani, továbbá, az „OPA+FMOC”-cal is összehasonlítva, a reakció egy

lépésben, gyorsan kivitelezhető. Hátránya, hogy a reagens elkészítése időigényes, a kész

reagens rövid ideig tárolható, továbbá csak a primer amino csoporttal reagál, a

keletkezett származékok instabilak. Biológiai minták meghatározása során a szekunder

aminosavak (Pro és Hyp) és aminok nem mérhetőek, ezáltal kizárólagosan

meghatározhatóak a primer aminosavak.

Az „OPA+FMOC”-módszer „továbbfejlesztett” „OPA/tiol”-módszer: a szekunder

aminosavak és aminok is mérhetőek a biológiai mátrixokban. A képződött izoindol- és

fluorenil-származékok eltérő kémiai szerkezetűek, fluoreszcens tulajdonságaik

különbözőek, következésképpen az optimális excitáció/emisszó hullámhossz-váltás

beiktatása szükséges a FL detektoron.

Az „FMOC”-módszer előnye az „OPA/tiol”-lal és az „OPA+FMOC”-cal szemben,

hogy a reagens elkészítése egyszerű, sokáig eltartható, meghatározhatóak - egy lépésben

- mind a primer, mind a szekunder aminosavak és aminok. Hátránya, hogy a

reagensfelesleget el kell távolítani, valamint a kromatogramon megjelenő FMOC-OH

megnehezíti a szomszédos FMOC-származékok elválasztását.

95

7. Összefoglalás, az értekezésben foglalt új tudományos eredmények

Kutatómunkám során az aminosavak és a 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-klorid (FMOC-

Cl) reakciójának az irodalomban javasolt eltérő körülményeit tisztáztam.

1. Az FMOC és az aminosavak mennyiségi származékkészítése idejét, eltérő

reakció feltételek között mértem. Sebesség-meghatározó aminosav az aszparaginsav.

2. Optimális mennyiségi származékképzési feltételeket javasoltam (pH 9 értékű

borát puffer, ACN tartalmú 0,5 mM FMOC reagens, {[FMOC]/[aminosav]T = 5,5:1;

szerves/vizes = 1:1 (v/v)}, 20 perc reakcióidő, reagensfelesleg elvétele 1-

aminoadamantánnal).

3. Igazoltam, hogy a mennyiségi származékká alakulás reakcióidejét az FMOC

koncentrációja határozza meg: méréseim a 0,5 mM - 5 mM tartományban voltak.

4. Az [FMOC]/[aminosav]T mólviszonyt a 2,5:1 – 66:1 arányok szerint

változtattam. Kitűnt, hogy az FMOC felesleg biztosítása érdekében, az

[FMOC]/[aminosav]T ≥ 5,5:1 kell, legyen.

5. Az aminosav-származékokkal együttesen érkező szennyezőket,

mennyiségileg, elsőként mértem. Mind FL, mind UV detektálással bizonyítottam, hogy

számításba vételük elengedhetetlen.

6. Elsőként vizsgáltam és bizonyítottam, hogy az irodalomban megadott értékek,

kivétel nélkül, a puffer és az aminosavak vizes elegyének pH értékére vonatkoznak

(látszólagos pH). Az FMOC reagenssel elegyítés után a reakcióelegy pH értéke

késedelem nélkül nő, majd órákig változatlan (valódi pH). Optimált mérési feltételek

között, e növekmény értéke 1,6 pH egység, mely pH növekmény az FMOC reagens

oldószerétől és a puffer oldat eredeti pH értékétől függően változik.

7. 22 FMOC-aminosavat, pH 7,20 értékű eluensekkel, elsőként választottam el.

8. A két terméket adó hisztidin (His-1, His-2) és tirozin (Tyr-1, Tyr-2)

származékainak képződését és átalakulását mennyiségileg jellemeztem.

9. Egyidejű fehérjementesítési és származékképzési eljárást dolgoztam ki. A

módszert a plazma szabad aminosav tartalmának meghatározására hasznosítottam.

96

8. Summary, new scientific statements In the frame of my studies the controversial points of literature data about the reaction

conditions of amino acids and 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-chloride (FMOC-Cl) have been

critically evaluated.

1. The quantitative interaction between the amino acids and the FMOC reagent(s) has

been determined under various conditions: aspartic acid proved to be the rate limiting amino

acid.

2. The optimum derivatization conditions were defined (borate buffer pH 9, ACN

containing 0.5 mM FMOC reagent, {[FMOC]/[amino acids]T = 5.5:1, solvent/water = 1:1

(v/v)}, reaction time 20 min, reagent excess elimination by 1-aminoadamantane).

3. It has been proved that the reaction time of the quantitative derivatization is

determined by the FMOC concentration, while,

4. on the basis of derivatizations, performed under various molar ratios of the reactants

{[FMOC]/[amino acids]T = 2.5:1 – 66:1}, it has been confirmed that the reaction rate could not

been influenced by increasing these molar ratios. In addition, it turned out that in order to ensure

the necessary FMOC excess the ratio of [FMOC]/[amino acids]T should be ≥ 5.5:1.

5. Impurities, coeluting with the FMOC-amino acids, have been quantified for the first

time. Based both on FL and on UV detections it has been demonstrated that to take into

consideration the amount of these impurities is inevitable necessary.

6. As to the intrinsic phenomenon of the pH values of the derivatization reactions, it has

been studied and defined for the first time. It was shown that pH values, given in the literature,

are related to the aqueous mixture of the buffer and the amino acids (apparent pH values). After

mixing with the FMOC reagent, immediately, a considerable change in pH values takes place

and pH proved to be constant after any time (real pH values). Under optimum derivatization

conditions this increment of pH change proved to be 1.6 pH units.

7. The separation of 22 FMOC-amino acids was carried out by eluents of pH 7.2.

8. The formation and transformation of the single and two FMOC group containing

derivatives of histidine (His-1, His-2) and tyrosine (Tyr-1, Tyr-2) have been quantitatively

characterized.

9. The simultaneous deproteinization and derivatizations method was introduced and

applied to the quantitative determination of the plasma free amino acids.

97

9. Irodalomjegyzék

9.1 Hivatkozott irodalmak jegyzéke

1. Dixon HBF, Cornish-Bowden A, Liebecq C, Loening KL, Moss GP, Reedijk J,

Velick SF, Vliegenthart JFG. (1984) Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides. Eur J Biochem, 138: 9-37.

2. Kaspar H, Dettmer K, Gronwald W, Oefner P. (2009) Advances in amino acid analysis. Anal Bioanal Chem, 393: 445-452.

3. Zumwalt RW, Kuo KCT, Gehrke CW. Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. CrC Press, Boca Raton, Florida, 1987.

4. Gehrke CW, Wixom RL, Bayer E. Chromatography: a Century of Discovery 1900-2000. Elsevier, Amsterdam, 2001.

5. Gehrke CW, Zumwalt RW, Kuo KC, Ponnamperuma C, Shimoyama A. (1975) Search for Amino Acids in Returned Lunar Soil. Origins of Life, 6: 541-550.

6. Kaiser FE, Gehrke CW, Zumwalt RW, Kuo KC. (1974) Amino acid analysis: Hydrolysis, ion-exchange cleanup, derivatization, and quantitation by gas-liquid chromatography. J Chromatogr, 94: 113-133.

7. Wayne Moss C, Lambert MA, Diaz FJ. (1971) Gas-liquid chromatography of twenty protein amino acids on a single column. J Chromatogr A, 60: 134-136.

8. Desgres J, Boisson D, Padieu P. (1979) Gas-liquid chromatography of isobutyl ester, N(O)-heptafluorobutyrate derivatives of amino acids on a glass capillary column for quantitative separation in clinical biology. J Chromatogr B, 162: 133-152.

9. Coulter JR, Hann CS. (1968) A practical quantitative gas chromatographic analysis of amino acids using the n-propyl n-acetyl esters. J Chromatogr A, 36: 42-49.

10. McGregor RF, Brittin GM, Sharon MS. (1973) Determination of urinary amino acids by gas chromatography. Clin Chim Acta, 48: 65-75.

11. Dawson PSS. (1965) The intracellular amino acid pool of Candida utilis during growth in batch and continous flow cultures. Biochim Biophys Acta, 111: 51-66.

12. Sassaki GL, Souza LM, Serrato RV, Cipriani TR, Gorin PAJ, Iacomini M. (2008) Application of acetate derivatives for gas chromatography-mass spectrometry: Novel approaches on carbohydrates, lipids and amino acids analysis. J Chromatogr A, 1208: 215-222.

13. Darbre A, Blau K. (1965) Gas chromatography of volatile amino acid derivatives : I. Alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, serine and threonine. J Chromatogr A, 17: 31-49.

14. Gamerith G. (1983) Gas-liquid chromatographic determination of N(O,S)-trifluoroacetyl n-propyl esters of protein and nonprotein amino acids. J Chromatogr A, 256: 267-281.

15. Gamerith G. (1983) Derivatization of amino acids to their N(O,S)-acyl alkyl esters for gas-liquid chromatographic determination. J Chromatogr A, 256: 326-330.

98

16. Gehrke CW, Leimer K. (1970) Trimethylsilylation of amino acids : Effect of solvents on derivatization using bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide. J Chromatogr A, 53: 201-208.

17. Gehrke CW, Leimer K. (1971) Trimethylsilylation of amino acids derivatization and chromatography. J Chromatogr A, 57: 219-238.

18. Wittmann C, Hans M, Heinzle E. (2002) In vivo analysis of intracellular amino acid labelings by GC/MS. Anal Biochem, 307: 379-382.

19. Schwenk FW, Berg PJ, Beaufrere B, Miles JM, Haymond MW. (1984) Use of t-butyldimethylsilylation in the gas chromatographic/mass spectrometric analysis of physiologic compounds found in plasma using electron-impact ionization. Anal Biochem, 141: 101-109.

20. Chaves das Neves HJ, Vasconcelos AMP. (1987) Capillary gas chromatography of amino acids, including asparagine and glutamine: sensitive gas chromatogaphic-mass spectrometric and selected ion monitoring gas chromatographic-mass spectrometric detection of the N,O(S)-tert-butyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A, 392: 249-258.

21. Katona ZF, Molnár-Perl I. (2000) GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/ t-butyldimethylsilyl derivatives: in model solutions III. Chromatographia, 51: S228-S236.

22. Tao X, Liu Y, Wang Y, Qiu Y, Lin J, Zhao A, Su M, Jia W. (2008) GC-MS with ethyl chloroformate derivatization for comprehensive analysis of metabolites in serum and its application to human uremia. Anal Bioanal Chem, 391: 2881-2889.

23. Husek P. (1991) Rapid derivatization and gas chromatographic determination of amino acids. J Chromatogr A, 552: 289-299.

24. Kaspar H, Dettmer K, Gronwald W, Oefner PJ. (2008) Automated GC-MS analysis of free amino acids in biological fluids. J Chromatogr B, 870: 222-232.

25. Husek P, Simek P, Hartvich P, Zahradnickova H. (2008) Fluoroalkyl chloroformates in treating amino acids for gas chromatographic analysis. J Chromatogr A, 1186: 391-400.

26. Moore S, Spackman DH, Stein WH. (1958) Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. An improved system. Anal Chem, 30: 1185-1190.

27. Adams BA, Holmes EL. (1935) Absorptive properties of synthetic resins. J Soc Chem Ind, 54: 1T-6T.

28. Ettre LS, Gehrke CW. (2006) The development of the amino acid analyzer. LCGC North America, 24: 390-400.

29. Spackman DH, Stein WH, Moore S. (1958) Automatic Recording Apparatus for Use in Chromatography of Amino Acids. Anal Chem, 30: 1190-1206.

30. Iwase H, Ozawa S, Ikuta M, Ono I. (1995) Determination of amino acids in human plasma by liquid chromatography with postcolumn ninhydrin derivatization using a hydroxyapatite cartridge for precolumn deproteination. J Chromatogr B, 663: 15-24.

31. Csapó J, Csapó-Kiss Z, Martin TG, Folestad S, Orwar O, Tivesten A, Némethy S. (1995) Age estimation of old carpets based on cystine and cysteic acid content. Anal Chim Acta, 300: 313-320.

32. Grunau JA, Swiader JM. (1992) Chromatography of 99 amino acids and other ninhydrin-reactive compounds in the Pickering lithium gradient system. J Chromatogr A, 594: 165-171.

99

33. Stein S, Böhlen P, Stone J, Dairman W, Udenfriend S. (1973) Amino acid analysis with fluorescamine at the picomole level. Arch Biochem Biophys, 155: 203-212.

34. Roth M, Hampai A. (1973) Column chromatography of amino acids with fluorescence detection. J Chromatogr, 83: 353-356.

35. http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=513206. 36. Boogers I, Plugge W, Stokkermans YQ, Duchateau ALL. (2008) Ultra-

performance liquid chromatographic analysis of amino acids in protein hydrolysates using an automated pre-column derivatisation method. J Chromatogr A, 1189: 406-409.

37. Pokol G, Sztatisz J. Analitikai kémia I. Műegyetemi Kiadó, Budapest, 2006: 17. fejezet.

38. Demacker PNM, Beijers AM, van Daal H, Donnelly JP, Blijlevens NMA, van den Ouweland JMW. (2009) Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. J Chromatogr B, 877: 387-392.

39. Schuster R. (1980) Determination of free amino acids by high performance liquid chromatography. Anal Chem, 52: 617-620.

40. Petritis KN, Chaimbault P, Elfakir C, Dreux M. (1999) Ion-pair reversed-phase liquid chromatography for determination of polar underivatized amino acids using perfluorinated carboxylic acids as ion pairing agent. J Chromatogr A, 833: 147-155.

41. Vandeberg PJ, Johnson DC. (1993) Pulsed electrochemical detection of cysteine, cystine, methionine, and glutathione at gold electrodes following their separation by liquid chromatography. Anal Chem, 65: 2713-2718.

42. Thiele C, Gänzle MG, Vogel RF. (2002) Sample preparation for amino acid determination by integrated pulsed amperometric detection in foods. Anal Biochem, 310: 171-178.

43. Tripp JA, McCullagh JSO, Hedges REM. (2006) Preparative separation of underivatized amino acids for compound-specific stable isotope analysis and radiocarbon dating of hydrolyzed bone collagen. J Sep Sci, 29: 41-48.

44. Petritis K, Elfakir C, Dreux M. (2001) HPLC-CLND for the analysis of underivatized amino acids. LC-GC Europe, 14: 389-395.

45. Uchikura K. (2003) Determination of aromatic and branched-chain amino acids in plasma by HPLC with electrogenerated Ru(bpy)3

3+ chemiluminescence detection. Chem Pharm Bull, 51: 1092-1094.

46. Chaves das Neves HJ, Morais ZB. (1997) HPLC assay of underivatized free amino acids with column switching and evaporative light-scattering detection. J High Resolut Chromatogr, 20: 115-118.

47. Chaimbault P, Petritis K, Elfakir C, Dreux M. (1999) Determination of 20 underivatized proteinic amino acids by ion-pairing chromatography and pneumatically assisted electrospray mass spectrometry. J Chromatogr A, 855: 191-202.

48. Chaimbault P, Petritis K, Elfakir C, Dreux M. (2000) Ion-pair chromatography on a porous graphitic carbon stationary phase for the analysis of twenty underivatized protein amino acids. J Chromatogr A, 870: 245-254.

100

49. Gómez-Ariza JL, Villegas-Portero MJ, Bernal-Daza V. (2005) Characterization and analysis of amino acids in orange juice by HPLC-MS/MS for authenticity assessment. Anal Chim Acta, 540: 221-230.

50. Jander G, Norris SR, Joshi V, Fraga M, Rugg A, Yu S, Li L, Last RL. (2004) Application of a high-throughput HPLC-MS/MS assay to Arabidopsis mutant screening; evidence that threonine aldolase plays a role in seed nutritional quality. Plant J, 39: 465-475.

51. Piraud M, Vianey-Saban C, Bourdin C, Acquaviva-Bourdain C, Boyer S, Elfakir C, Bouchu D. (2005) A new reversed-phase liquid chromatographic/tandem mass spectrometric method for analysis of underivatised amino acids: evaluation for the diagnosis and the management of inherited disorders of amino acid metabolism. Rapid Commun Mass Spectrom, 19: 3287-3297.

52. Gray WR, Hartley BS. (1963) The structure of a chymotryptic peptide from pseudomonas cytochrome c-551. Biochem J, 89: 379-380.

53. Takeuchi T, Nagae N. (1992) Enantiomeric resolution of dansyl phenylalanine and analogs by microcolumn liquid chromatography with gamma-cyclodextrin as mobile phase additive. J High Resolut Chromatogr, 15: 121-123.

54. Takeuchi T, Miwa T. (1994) Effect of cyclodextrin as mobile phase additive on fluorescence intensity of dansylamino acids in microcolumn liquid chromatography. Anal Chim Acta, 292: 275-279.

55. Molnár-Perl I. Quantitation of amino acids and amines by chromatography: methods and protocols. Elsevier, Amsterdam, 2005.

56. Martins AR, Padovan AP. (1996) A practical approach to improve the resolution of dansyl-amino acids by high-performance liquid chromatography. J Liq Chromatogr Related Technol, 19: 467-476.

57. Takeuchi T, Miwa T. (1995) Effect of sodium dodecyl sulfate as stationary phase on signal intensities of dansylamino acids in microcolumn liquid chromatography with on-column fluorimetric detection. J Chromatogr A, 696: 185-192.

58. Takeuchi T, Miwa T. (1995) Fluorescence enhancement of dansylamino acids by bovine serum albumin as mobile phase additive in microcolumn liquid chromatography. Chromatographia, 40: 159-162.

59. Kang X, Xiao J, Huang X, Gu Z. (2006) Optimization of dansyl derivatization and chromatographic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples. Clin Chim Acta, 366: 352-356.

60. Wang Y, Kang X-J, Ge W-H, Sun X-Z, Peng J. (2007) Simple, Rapid, and Accurate RP-HPLC Method for Determination of Cystine in Human Urine after Derivatization with Dansyl Chloride. Chromatographia, 65: 527-532.

61. Lin JK, Chang JY. (1975) Chromophoric labeling of amino acids with 4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride. Anal Chem, 47: 1634-1638.

62. Lin JK, Wang CH. (1980) Determination of urinary amino acids by liquid chromatography with "dabsyl chloride". Clin Chem, 26: 579-583.

63. Yang C-Y, Yang T, Yeh BK. (1993) Liquid chromatographic analysis of amino acids: Using dimethylamino-azobenzenesulfonyl chloride and hypersil ODS column to analyze the composition of apo B peptides. J Protein Chem, 12: 11-14.

101

64. Gorbics L, Urge L, Otvos L. (1994) Comparative and optimized dabsyl-amino acid analysis of synthetic phosphopeptides and glycopeptides. J Chromatogr A, 676: 169-176.

65. Krause I, Bockhardt A, Neckermann H, Henle T, Klostermeyer H. (1995) Simultaneous determination of amino acids and biogenic amines by reversed-phase high-performance liquid chromatography of the dabsyl derivatives. J Chromatogr A, 715: 67-79.

66. Syu K-Y, Lin C-L, Huang H-C, Lin J-K. (2008) Determination of Theanine, GABA, and Other Amino Acids in Green, Oolong, Black, and Pu-erh Teas with Dabsylation and High-Performance Liquid Chromatography. J Agric Food Chem, 56: 7637-7643.

67. Oliveira AP, Pereira DM, Andrade PB, Valentao P, Sousa C, Pereira JA, Bento A, Rodrigues MA, Seabra RM, Silva BM. (2008) Free Amino Acids of Tronchuda Cabbage (Brassica oleracea L. Var. costata DC): Influence of Leaf Position (Internal or External) and Collection Time. J Agric Food Chem, 56: 5216-5221.

68. Zimmerman CL, Apella E, Pisano JJ. (1977) Rapid analysis of amino acid phenylthiohydantoins by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 77: 569-573.

69. Molnár-Perl I. (1994) Advances in the high-performance liquid chromatographic determination of phenylthiocarbamyl amino acids. J Chromatogr A, 661: 43-50.

70. Morvai M, Fábián V, Molnár-Perk I. (1992) Buffer and pH dependence of the retention of phenylthiocarbamylamino acids in reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 600: 87-92.

71. Cohen SA, Michaud DP. (1993) Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, and Its application for the analysis of hydrolysate amino acids via high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 211: 279-287.

72. Cohen SA, De Antonis KM. (1994) Applications of amino acid derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate : Analysis of feed grains, intravenous solutions and glycoproteins. J Chromatogr A, 661: 25-34.

73. Bosch L, Alegría A, Farré R. (2006) Application of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods. J Chromatogr B, 831: 176-183.

74. Reverter M, Lundh T, Lindberg JE. (1997) Determination of free amino acids in pig plasma by precolumn derivatization with 6-N-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate and high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B, 696: 1-8.

75. Roth M. (1971) Fluorescence reaction for amino acids. Anal Chem, 43: 880-882. 76. Hanczkó R, Jámbor A, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Advances in the o-

phthalaldehyde derivatizations: Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. J Chromatogr A, 1163: 25-42.

77. Kutlán D, Presits P, Molnár-Perl I. (2002) Behavior and characteristics of amine derivatives obtained with o-phthaldialdehyde/3-mercaptopropionic acid and with o-phthaldialdehyde/N-acetyl-cysteine reagents. J Chromatogr A, 949: 235-248.

102

78. Molnár-Perl I, Bozor I. (1998) Comparison of the stability and UV and fluorescence characteristics of the o-phthaldialdehyde/3-mercaptopropionic acid and o-phthaldialdehyde/N-acetyl-cysteine reagents and those of their amino acid derivatives. J Chromatogr A, 798: 37-46.

79. Molnár-Perl I, Vasanits A. (1999) Stability and characteristics of the o-phthaldialdehyde/3-mercaptopropionic acid and o-phthaldialdehyde/N-acetyl-cysteine reagents and their amino acid derivatives measured by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 835: 73-91.

80. Schuster R. (1988) Determination of amino acids in biological, pharmaceutical, plant and food samples by automated precolumn derivatization and high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B, 431: 271-284.

81. Kőrös Á, Varga Z, Molnár-Perl I. (2008) Simultaneous analysis of amino acids and amines as their o-phthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives in cheese by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 1203: 146-152.

82. Kőrös Á, Hanczkó R, Jámbor A, Qian Y, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Analysis of amino acids and biogenic amines in biological tissues as their o-phthalaldehyde/ethanethiol/fluorenylmethyl chloroformate derivatives by high-performance liquid chromatography: A deproteinization study. J Chromatogr A, 1149: 46-55.

83. Carpino LA, Han GY. (1972) 9-Fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. J Org Chem, 37: 3404-3409.

84. Moye HA, Boning AJ. (1979) A versatile fluorogenic labelling reagent for primary and secondary amines: 9-fluorenylmethyl chloroformate. Anal Lett, 12: 25 - 35.

85. Einarsson S, Josefsson B, Lagerkvist S. (1983) Determination of amino acids with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 282: 609-618.

86. Matzner M, Kurkjy RP, Cotter RJ. (1964) The chemistry of chloroformates. Chem Rev, 64: 645-687.

87. Clapp CH, Swan JS, Poechmann JL. (1992) Identification of amino acids in unknown dipeptides: A derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chem Ed, 69: A122-A127.

88. Gustavsson B, Betnér I. (1990) Fully automated amino acid analysis for protein and peptide hydrolysates by precolumn derivatization with 9-fluorenyl methylchloroformate and 1-aminoadamantane. J Chromatogr A, 507: 67-77.

89. Haynes PA, Sheumack D, Kibby J, Redmond JW. (1991) Amino acid analysis using derivatisation with 9-fluorenylmethyl chloroformate and reversed-phase hogh-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 540: 177-185.

90. Hoeger U, Abe H. (2004) β-Alanine and other free amino acids during salinity adaptation of the polychaete Nereis japonica. Comp Biochem Physiol Mol Integr Physiol, 137: 161-171.

91. Kirschbaum J, Luckas B, Beinert WD. (1994) Pre-column derivatization of biogenic amines and amino acids with 9-fluorenylmethyl chloroformate and heptylamine. J Chromatogr A, 661: 193-199.

103

92. Lozanov V, Petrov S, Mitev V. (2004) Simultaneous analysis of amino acid and biogenic polyamines by high-performance liquid chromatography after pre-column derivatization with N-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimide. J Chromatogr A, 1025: 201-208.

93. Miller EJ, Narkates AJ, Niemann MA. (1990) Amino acid analysis of collagen hydrolysates by reverse-phase high-performance liquid chromatography of 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives. Anal Biochem, 190: 92-97.

94. Or-Rashid MM, R. Onodera, S. Wadud, Mohammed N. (2000) Convenient method of threonine, methionine and their related amino compounds by high-performance liquid chromatography and its application to rumen fluid. J Chromatogr B, 741: 279-287.

95. Schilb LA, Fiegel VD, Knighton DR. (1990) Hydroxyproline measurement by high performance liquid chromatography: An improved method of derivatization. J Liq Chromatogr, 13: 557-567.

96. Einarsson S, Folestad S, Josefsson B, Lagerkvist S. (1986) High-resolution reversed-phase liquid chromatography system for the analysis of complex solutions of primary and secondary amino acids. Anal Chem, 58: 1638-1643.

97. Näsholm T, Sandberg G, Ericsson A. (1987) Quantitative analysis of amino acids in conifer tissues by high-performance liquid chromatography and fluorescence detection of their 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives. J Chromatogr, 396: 225-236.

98. Keller H-J, Do KQ, Zollinger M, Winterhalter KH, Cuénod M. (1987) 9-fluorenylmethoxycarbonylpyroglutamate, a side-product of derivatization of glutamate with 9-fluorenylmethyl Chloroformate: A warning. Anal Biochem, 166: 431-434.

99. Fernández-Trapiella AC. (1990) Quantitative analysis of methionins, cysteine and lysine in feeds by reverse-phase liquid chromatography using precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate: Preliminary study. J Assoc Off Anal Chem, 73: 935-939.

100. Malmer M, Schroeder LA. (1990) Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography with methansulfonic acid hydrolysis and 9-fluorenylmethylchloroformate derivatization. J Chromatogr, 514: 227-239.

101. Haynes PA, Sheumack D. (1991) Applications of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chromatogr, 588: 107-114.

102. Grzywacz CM. (1994) Identification of proteinaceous binding media in paintings by amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 676: 177-183.

103. Brückner H, Lüpke M. (1995) Use of chromogenic and fluorescent oxycarbonyl chlorides as reagents for amino acid analysis by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 697: 295-307.

104. Bank RA, Jansen EJ, Beekman B, te Koppele JM. (1996) Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Improved derivatization and detection conditions with 9-fluorenylmethyl chloroformate. Anal Biochem, 240: 167-176.

104

105. Ou K, Wilkins MR, Yan JX, Gooley AA, Fung Y, Sheumack D, Williams KL. (1996) Improved high-performance liquid chromatography of amino acids derivatised with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chromatogr A, 723: 219-225.

106. Péter A, Tourwé D, Baumann MEM, Elskens M, Goeyens L. (1999) High performance liquid chromatographic determination of free amino acids in algae. J Liq Chromatogr Related Technol, 22: 1077-1093.

107. Fabiani A, Versari A, Parpinello GP, Castellari M, Galassi S. (2002) High-performance liquid chromatographic analysis of free amino acids in fruit juices using derivatization with 9-fluorenylmethyl-chloroformate. J Chromatogr Sci, 40: 14-18.

108. López-Cervantes J, Sánchez-Machado DI, Rosas-Rodríguez JA. (2006) Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 1105: 106-110.

109. Lozanov V, Benkova B, Mateva L, Petrov S, Popov E, Slavov C, Mitev V. (2007) Liquid chromatography method for simultaneous analysis of amino acids and biogenic amines in biological fluids with simultaneous gradient of pH and acetonitrile. J Chromatogr B, 860: 92-97.

110. Jámbor A, Molnár-Perl I. (2009) Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography after derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride: Literature overview and further study. J Chromatogr A, 1216: 3064-3077.

111. Bates RG. Determination of pH, theory and practice. John Wiley and Sons, New York, 1973: 83.

112. Ilisz I, Berkecz R, Péter A. (2008) Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: A review. J Pharm Biomed Anal, 47: 1-15.

113. Betnér I, Földi P. (1986) New automated amino acids analysis by HPLC precolumns derivatization with fluorenylmethyloxycarbonylchloride. Chromatographia, 22: 381-388.

114. Stahl E. Thin-Layer Chromatography. Springer, Berlin, 1969. 115. Simion G, Liana G, Letitia G. (2001) TLC of some free amino acids from

sanguine plasma. J Pharm Biomed Anal, 26: 681-685. 116. Wawrzycki S, Pyra E. (2000) Detection, separation and analysis of α-amino

acids by means of TLC using 4-diethylaminodiazabenzene-4′-isothiocyanate (DEABITC). Chromatographia, 51: S309-S312.

117. Zakrzewski R, Ciesielski W, KaĹşmierczak D. (2002) Application of the iodine-azide procedure for the detection of glycine, alanine and aspartic acid in planar chromatography. J Liq Chromatogr Related Technol, 25: 1599 - 1614.

118. Alaiz M, Navarro J L, Giron J, Vioque E. (1992) Quantitative HPTLC analysis of dansyl amino acids. J Planar Chromatogr - Mod TLC, 5: 143-146.

119. Das B, Shubhangi S. (1993) Quantitative HPTLC analysis of dansyl amino acids. J Planar Chromatogr - Mod TLC, 6: 294-295.

120. Devenyi T, Bati J, Kovacs J, Kiss P. (1972) Thin-layer ion-exchange chromatographic screening test for aminoacidemias in blood samples dried on filter paper. Acta Biochim Biophys Hung, 7: 237-9.

105

121. Yang Z, Rogers LM, Song Y, Guo W, Kolattukudy PE. (2005) Homoserine and asparagine are host signals that trigger in planta expression of a pathogenesis gene in Nectria haematococca. Proc Nat Acad Sci USA, 102: 4197-4202.

122. Bhushan R, Mahesh VK, Varma A. (1994) Improved thin layer chromatographic resolution of PTH amino acids with some new solvent systems. Biomed Chromatogr, 8: 69-72.

123. Norfolk E, Khan SH, Fried B, Sherma J. (1994) Comparison of amino acid separations on high performance silica gel, cellulose, and C-18 reversed phase layers and application of HPTLC to the determination of amino acids in Biomphalaria glabrata snails. J Liq Chromatogr, 17: 1317-1326.

124. Dadoo R, Yan C, Zare RN, Anex DS, Rakestraw DJ, Hux GA. (1997) Advances towards the routine use of capillary electrochromatography. LC-GC Europe, 10: 164-174.

125. Chiu TC, Chang HT. (2007) Stacking and separation of fluorescent derivatives of amino acids by micellar electrokinetic chromatography in the presence of poly(ethylene oxide). J Chromatogr A, 1146: 118-124.

126. Thorntion MJ, Fritz JS, Klampfl CW. (1997) Separation of native amino acids at low pH by capillary electrophoresis. J High Resolut Chromatogr, 20: 647-652.

127. Koval D, Jirásková J, Strísovský K, Konvalinka J, Kasicka V. (2006) Capillary electrophoresis method for determination of D-serine and its application for monitoring of serine racemase activity. Electrophoresis, 27: 2558-2566.

128. Tang W-H, Muderawan IW, Ong T-T, Ng S-C. (2005) Enantioseparation of dansyl amino acids by a novel permanently positively charged single-izomer cyclodextrin: mono-6-N-alkylammonium-6-deoxy-ß-CD chlorid by capillary electrophoresis. Anal Chim Acta, 546: 119-125.

129. Chan KC, Janini GM, Muschik GM, Issaq HJ. (1993) Laser-induced fluorescence detection of 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatized amino acids in capillary electrophoresis. J Chromatogr A, 653: 93-97.

130. Kostal V, Zeisbergerova M, Hrotekova Z, Slais K, Kahle V. (2006) Miniaturized liquid core waveguide-based fluorimetric detection cell for capillary separation methods: Application in CE of amino acids. Electrophoresis, 27: 4658-4665.

131. Poinsot V, Rodat A, Gavard P, Feurer B, Couderc F. (2008) Recent advances in amino acid analysis by CE (Review). Electrophoresis, 29: 207-223.

132. Moini M, Schultz CL, Mahmood H. (2003) CE/Electrospray ionization-MS analysis of underivatized d/l-amino acids and several small neurotransmitters at attomole levels through the use of 18-Crown-6-tetracarboxylic acid as a complexation reagent/background electrolyte. Anal Chem, 75: 6282-6287.

133. Morton MRN, Soga T. (2007) Metabolome analysis by capillary electrophoresis–mass spectrometry. J Chromatogr A, 1168: 237-246.

134. Lindner W, Böhs B, Seidel V. (1995) Enantioselective capillary electrophoresis of amino acid derivatives on cyclodextrin evaluation of structure-resolution relationships. J Chromatogr A, 697: 549-560.

135. Wan H, Andersson PE, Engström A, Blomberg LG. (1995) Direct and indirect chiral separation of amino acids by capillary electrophoresis. J Chromatogr A, 704: 179-193.

106

136. Kurosu Y, Murayama K, Shindo N, Shisa Y, Ishioka N. (1996) Optical resolution of phenylthiohydantoin-amino acids by capillary electrophoresis and identification of the phenylthiohydantoin-amino acid residue of [-Ala2]-methionine enkephalin. J Chromatogr A, 752: 279-286.

137. Wren SAC. (1997) Mobility measurements on dansylated amino acids. J Chromatogr A, 768: 153-159.

138. Tivesten A, Folestad S. (1997) Chiral o-phthaldialdehyde reagents for fluorogenic oncolumn labeling of D- and L-amino acids in micellar electrokinetic chromatography. Electrophoresis, 18: 970-977.

139. Liu Y-M, Schneider M, Sticha CM, Toyooka T, Sweedler JV. (1998) Separation of amino acid and peptide stereoisomers by nonionic micelle-mediated capillary electrophoresis after chiral derivatization. J Chromatogr A, 800: 345-354.

140. Caligiani A, Acquotti D, Palla G, Bocchi V. (2007) Identification and quantification of the main organic components of vinegars by high resolution 1H NMR spectroscopy. Anal Chim Acta, 585: 110-119.

141. Nord LI, Vaag P, Duus JO. (2004) Quantification of organic and amino acids in beer by 1H NMR Spectroscopy. Anal Chem, 76: 4790-4798.

142. Bharti S, Sinha N, Joshi B, Mandal S, Roy R, Khetrapal C. (2008) Improved quantification from 1H-NMR spectra using reduced repetition times. Metabolomics, 4: 367-376.

143. Risa Ř, Margareta T, Sonnewald MU. (2009) Quantification of amounts and 13C content of metabolites in brain tissue using high- resolution magic angle spinning 13C NMR spectroscopy. NMR Biomed, 22: 266-271.

144. Hussian-Yusuf H, Onodera R, Nasser MEA, Sato H. (1999) Simple method for the simultaneous analysis of pipecolic acid and lysine by high-performance liquid chromatography and its application to rumen liquor and plasma of ruminants. J Chromatogr B, 735: 63-72.

145. Surarit R, Srisomsap C, Wasant P, Svasti J, Suthatvoravut U, Chokchaichamnankit D, Liammongkolkul S. (1999) Plasma amino acid analyses in two cases of maple syrup urine disease. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 30: 138-139.

146. Suliman ME, Filho JCD, Barany P, Anderstam B, Lindholm B, Bergstrom J. (1999) Effects of High-Dose Folic Acid and Pyridoxine on Plasma and Erythrocyte Sulfur Amino Acids in Hemodialysis Patients. J Am Soc Nephrol, 10: 1287-1296.

147. Stentiford GD, Neil DM, Coombs GH. (1999) Changes in the plasma free amino acid profile of the Norway lobster Nephrops norvegicus at different stages of infection by a parasitic dinoflagellate (genus Hematodinium). Dis Aquat Organ, 38: 151-157.

148. Tipton KD, Gurkin BE, Matin S, Wolfe RR. (1999) Nonessential amino acids are not necessary to stimulate net muscle protein synthesis in healthy volunteers. J Nutr Biochem, 10: 89-95.

149. Tcherkas YV, Denisenko AD. (2001) Simultaneous determination of several amino acids, including homocysteine, cysteine and glutamic acid, in human plasma by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection. J Chromatogr A, 913: 309-313.

107

150. Araújo P, Wassermann GF, Tallini K, Furlanetto V, Vargas CR, Wannmacher CMD, Dutra-Filho CS, Wyse ATS, Wajner M. (2001) Reduction of large neutral amino acid levels in plasma and brain of hyperleucinemic rats. Neurochem Int, 38: 529-537.

151. Suresh-Babu SV, Shareef MM, Pavan A, Shetty K, Shetty KT. (2002) HPLC method for amino acids profile in biological fluids and inborn metabolic disorders of aminoacidopathies. Indian J Clin Biochem, 17: 7-26.

152. Yoshida Y, Ohiwa Y, Shimamura M, Izumi T, Yoshida S, Takahashi K, Miyairi S, Makimura M, Naganuma A. (2003) Optimum Conditions for Derivatization of Glutathione, Cysteine and Cysteinylglycine in Human Plasma with Ammonium 7-Fluorobenzo-2-Oxa-1,3-Diazole-4-Sulfonate for Accurate Quantitation by High-Performance Liquid Chromatography. J Health Sci, 49: 527-530.

153. Bohe J, Low A, Wolfe RR, Rennie MJ. (2003) Human muscle protein synthesis is modulated by extracellular, not intramuscular amino acid availability: a dose-response study. J Physiol, 552: 315-324.

154. van de Merbel NC, Mentink CJAL, Hendriks G, Wolffenbuttel BHR. (2004) Liquid chromatographic method for the quantitative determination of Nε-carboxymethyllysine in human plasma proteins. J Chromatogr B, 808: 163-168.

155. Zhang SM, Willett WC, Selhub J, Manson JE, Colditz GA, Hankinson SE. (2003) A prospective study of plasma total cysteine and risk of breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 12: 1188-1193.

156. Schwarz EL, Roberts WL, Pasquali M. (2005) Analysis of plasma amino acids by HPLC with photodiode array and fluorescence detection. Clin Chim Acta, 354: 83-90.

157. Grant SL, Shulman Y, Tibbo P, Hampson DR, Baker GB. (2006) Determination of D-serine and related neuroactive amino acids in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection. J Chromatogr B, 844: 278-282.

158. Cleal JK, Brownbill P, Godfrey KM, Jackson JM, Jackson AA, Sibley CP, Hanson MA, Lewis RM. (2007) Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J Physiol, 582: 871-882.

159. Frank MP, Powers RW. (2007) Simple and rapid quantitative high-performance liquid chromatographic analysis of plasma amino acids. J Chromatogr B, 852: 646-649.

160. Glazev AA, Nefyodov LI. (2008) Changes in amino acid patterns of blood plasma in tumor patients with the anticancer drug NSC-631570: possible approaches to cancer diagnostics. Biomed Chem, 2: 318-324.

161. Zhao X, Suo Y. (2008) LC determination of amino acids in rat plasma with fluorescence detection: Application to exercise physiology. Chromatographia, 67: 375-382.

162. Mero A, Leikas A, Knuutinen J, Hulmi JJ, Kovanen V. (2009) Effect of strength training session on plasma amino acid concentration following oral ingestion of leucine, BCAAs or glutamine in men. Eur J Appl Physiol, 105: 215-223.

163. Kondo K, Nakamura M, Nishioka R, Kawai S. (1985) Direct method for determination of valproic acid in serum by high performance liquid chromatography. Anal Sci, 1: 385-387.

108

164. Ralston PB, Strein TG. (1997) Deproteinization methods for serum protein removal. Microchem J, 55: 270-283.

165. Bugnon D, Giannoni E, Majcherczyk P, Glauser MP, Moreillon P. (2002) Pitfalls in Cefepime Titration from Human Plasma: Plasma- and Temperature-Related Drug Degradation In Vitro. Antimicrob Agents Chemother, 46: 3654-3656.

166. Wang TK, Fuh MS. (1996) Determination of amphetamine in human urine by dansyl derivatization and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J Chromatogr B, 686: 285-290.

167. Kage S, Kudo K, Ikeda H, Ikeda N. (2004) Simultaneous determination of formate and acetate in whole blood and urine from humans using gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B, 805: 113-117.

168. David V, Barcutean C, Sora I, Medvedovici A. (2005) Determination of metformin in plasma derivatization and precipitation with acetic anhydride. Rev Roum Chem, 50: 269-276.

169. Yamato S, Shinohara K, Nakagawa S, Kubota A, Inamura K, Watanabe G, Hirayama S, Miida T, Ohta S. (2009) High-performance liquid chromatography determination of ketone bodies in human plasma by precolumn derivatization with p-nitrobenzene diazonium fluoroborate. Anal Biochem, 384: 145-150.

170. Dank M. (2001) A tumoros anorexia-cachexia szindróma. Magyar Onkológia, 45: 431-436.

171. Kubota A, Meguid M, Hitch DC. (1992) Amino Acid Profiles Correlate Diagnostically With Organ Site in Three Kinds of Malignant Tumors. Cancer, 69: 2343-2348.

172. Levin L, Gevers W. (1981) Metabolic alterations in cancer, Part II. Protein and fat metabolism. S Afr Med J, 59: 553-556.

173. Okamoto N, Miyagi Y, Chiba A, Akaike M, Shiozawa M, Imaizumi A, Yamamoto H, Ando T, Yamakodo M, Tochikubo O. (2009) Diagnostic modeling with differences in plasma amino acid profiles between non-cachectic colorectal/breast cancer patients and healthy individuals. Int J Med Med Sci, 1: 001-008.

174. Lai H-S, Lee J-C, Lee P-H, Wang S-t, Chen W-J. (2005) Plasma free amino acid profile in cancer patients. Semin Canc Biol, 15: 267-276.

175. Ádám V, Dux L, Faragó A, Fésüs L, Machovich R, Mandl J, Sümegi B. Biokémia. Medicina Kiadó, Budapest, 2002: 246.

176. Henderson JF, LePage GA. (1959) The nutrition of tumors: a review. Cancer Res, 19: 887-902.

177. Proenza AM, Oliver J, Palou A, Roca P. (2003) Breast and lung cancer are associated with a decrease in blood cell amino acid content. J Nutr Biochem, 14: 133-138.

178. Vissers YLJ, Dejong CHC, Luiking YC, Fearon KCH, Meyenfeldt MFv, Deutz NEP. (2005) Plasma arginine concentrations are reduced in cancer patients: evidence for arginine deficiency? Am J Clin Nutr, 81: 1142-1146.

179. Porembska Z, Luboinski G, Chrzanowska A, Mielczarek M, Magnuska J, Baranczyk-Kuzma A. (2003) Arginase in patients with breast cancer. Clin Chim Acta, 328: 105-111.

109

180. Brückner H, Langer M, Lüpke M, Westhauser T, Godel H. (1995) Liquid chromatographic determination of amino acid enantiomers by derivatization with o-phthaldialdehyde and chiral thiols Applications with reference to food science. J Chromatogr A, 697: 229-245.

181. Furka Á. Szerves kémia. Tankönyvkiadó, Budapest, 1991: 840. 182. Mathews AP, Walker S. (1909) The spontaneous oxidation of cystin and the

action of iron and cyanides upon it. J Biol Chem, 6: 289-298. 183. Mathews AP, Walker S. (1909) The action of metals and strong salt solutions on

the spontaneous oxidation of cystein. J Biol Chem, 6: 299-312. 184. Vasanits A, Molnár-Perl I. (1999) Temperature, eluent flow-rate and column

effects on the retention and quantitation properties of phenylthiocarbamyl derivatives of amino acids in reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 832: 109-122.

185. Riedl J, Moll F. (1986) Quantitative Bestimmung von Gelatine in Arzneizubereitungen durch HPLC mit fluorimetrischer Detektion. Arch Pharm, 319: 89-91.

186. Minet-Quinard R, Praagh IV, Kwiatkowski F, Beaujon G, Feillel V, Beaufrére B, Bargnoux P-J, Cynober L, Vasson M-P. (2004) Pre- and postoperative aminoacidemia in breast cancer: A study vs. matched healthy subjects. Cancer Invest, 22: 203-210.

9.2 Saját közlemények jegyzéke

1. Kőrös Á, Hanczkó R, Jámbor A, Qian Y, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Analysis of amino acids and biogenic amines in biological tissues as their o-phthalaldehyde/ethanethiol/fluorenylmethyl chloroformate derivatives by high-performance liquid chromatography: A deproteinization study. J Chromatogr A, 1149: 46-55.

2. Hanczkó R, Jámbor A, Perl A, Molnár-Perl I. (2007) Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations: Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. J Chromatogr A, 1163: 25-42.

3. Jámbor A, Molnár-Perl I. (2009) Amino acid analysis by high-performance

liquid chromatography after derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride: Literature overview and further study. J Chromatogr A, 1216: 3064-3077.

4. Jámbor A, Molnár-Perl I. (2009) Quantitation of amino acids in plasma by high

performance liquid chromatography: Simultaneous deproteinization and derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride. J Chromatogr A, 1216: 6218-6223.

110

10. Köszönetnyilvánítás

Hálás köszönetemet szeretném ezúton is kifejezni témavezetőmnek, Perlné Dr. Molnár

Ibolyának, aki nemzetközileg elismert szakmai tudásával segített. Munka iránti szeretete

és szorgalma példaképet jelent számomra.

Köszönöm a Gyógyszertudományok Doktori Iskola elnökének, Dr. Szőke Évának a

lehetőséget, hogy a Ph.D. tanulmányaimat elvégezhettem, továbbá a Semmelweis

Egyetem Doktori Iskolának a nekem ítélt utazási támogatást és predoktori ösztöndíjat.

Köszönöm Dr. Záray Gyulának, hogy az ELTE TTK, Kémiai Intézet Analitikai Kémiai

Tanszéken, vezetőként, fogadott.

Szeretném megköszönni Dr. Noszál Bélának a lehetőséget, hogy a Magyar Tudományos

Akadémia Szerves és Gyógyszeranalitikai Munkabizottság ülésén bemutathattam

doktori munkámat.

Köszönetemet nyilvánítom az Országos Onkológia Intézetnek a plazma mintákért,

valamint a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítványnak a számomra ítélt utazási

támogatásért és ösztöndíjért.

Köszönet illeti Dr. Kursinszki Lászlót, Dr. Hanczkó Róbertet, Dr. Kőrös Ágnest, akik a

HPLC rejtelmeibe bevezettek, továbbá Varga Zsolt okleveles vegyészt.

Köszönöm a biztatást a tanszék dolgozóinak és doktorandusztársaimnak.

Végül, de kiemelten szeretném köszönetemet kifejezni Férjemnek, Szüleimnek,

Barbinak és barátaimnak, hogy szeretetteli hátteret biztosítanak számomra.