Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs
description
Transcript of Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs
![Page 1: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/1.jpg)
Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs
Sous la tutelle de Laurence Casalot
Diagnostic Moléculaire
Audrey BLANCHARDNadège FOISELLE
Le 25 novembre 2008
![Page 2: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/2.jpg)
PCR-DGGE
Technique permettant l’analyse de la diversité bactérienne d’un échantillon après amplification d’un gène donné
Electrophorèse en gel dénaturant, contenant des concentrations variables de dénaturant, formant un gradient de dénaturation
![Page 3: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/3.jpg)
PCR-DGGE Fragments d’ADN double brin plus ou moins
dénaturés en fonction de sa séquence : GC% Enchaînement des acides nucléiques
Ajout d’un îlot GC contenant une succession de G et de C sur 40pb
Ilôt GC
0% dénaturation
Ilôt GC
30% dénaturation 70% dénaturation
Ilôt GC
![Page 4: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/4.jpg)
PCR-DGGE
Comparaison des résultats d’analyses par PCR-Electrophorèse non dénaturante et PCR-DGGE
![Page 5: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/5.jpg)
PCR-DGGE
Comparaison des résultats d’analyses par PCR-Electrophorèse non dénaturante et PCR-DGGE
Gradient dénaturant
30%
70%
DGGEElectrophorèse non dénaturante
![Page 6: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/6.jpg)
PCR-DGGE
Avantages Théoriquement, une bande par
microorganisme présent dans l’échantillon Détection de mutation ponctuelle Séquençage possible des fragments
Inconvénients Fragments de faible taille Parfois difficilement interprétable Temps de migration long
![Page 7: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/7.jpg)
Anciennes techniques d’analyse de la diversité des SRP
PCR-DGGE à partir du gène codant pour l’ARNr 16S
PCR-DGGE à partir du gène dsrB
![Page 8: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/8.jpg)
Limites de la PCR-DGGE sur ARNr 16S
Absence d’amplification pour certaines espèces car les amorces utilisées ne sont pas spécifiques de toutes les espèces bactériennes de SRP
Résultats obtenus non représentatifs de la réelle diversité des SRP dans les prélèvements
Nécessité d’étudier un autre gène plus spécifique des SRP
![Page 9: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/9.jpg)
Gène dsrB Le gène dsrB code pour la sous unité B de la
sulfite réductase (dissimilatory (bi)sulfite reductase) Enzyme clé qui permet la libération d’énergie
pendant la réduction des sulfates Enzyme uniquement présente chez les SRP Séquence du gène très conservée à travers les
différentes espèces Topologie proche pour les arbres phylogénétiques
construits à partir du gène dsrAB et du gène codant pour l’ARNr16S
![Page 10: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/10.jpg)
Limites de la PCR-DGGE sur dsrB
Migration de différents fragments à une même distance Nécessité de cloner les fragments d’ADN extrait
des différentes bandes du gel avant de pouvoir les séquencer
Long et fastidieux lorsqu’un grand nombre d’échantillons est concerné
![Page 11: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/11.jpg)
Limites de la PCR-DGGE sur dsrB
Migration de différents fragments à une même distance
Absence d’amplification pour certains SRP Souches naturellement peu abondantes Mauvaise hybridation de l’amorce sens : jusqu’à 3
nucléotides différents Diminution de la sensibilité due à la présence de
l’îlot GC sur l’amorce sens lors de la PCR
![Page 12: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/12.jpg)
Amélioration de la PCR-DGGE sur dsrB
But de l’équipe de Miletto : Mettre au point une technique permettant l’identification de l’ensemble des SRP d’un échantillon Amplification du gène dsrB de l’ensemble des
SRP présent dans l’échantillon Séparation totale de l’ensemble des différents
fragments d’ADN afin de réaliser un séquençage direct
![Page 13: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/13.jpg)
- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens
Référence
DémarcheEchantillon de sol
Extraction de l’ADNADN environnemental
PCR dsrAB
Mélange d’amorces : - 3 amorces sens - 4 amorces antisensSélection des amplicons de 1,9kb
Banque de clonesdsrAB
SéquencesdsrB
Clonage
Séquençage
AmpliconsdsrB
PCR dsrB
- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens
PCR dsrBAmplicons
dsrB
Nested PCR
![Page 14: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/14.jpg)
Nested PCR Principe
Amplification par PCR avec un premier couple d’amorces
Amplification par PCR avec un second couple d’amorces
![Page 15: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/15.jpg)
DémarcheEchantillon de sol
Extraction de l’ADNADN environnemental
PCR dsrABSélection des amplicons de 1,9kb
Banque de clonesdsrAB
SéquencesdsrB
Clonage
Séquençage
AmpliconsdsrB
PCR dsrB
PCR dsrBAmplicons
dsrB
DGGE
PCR dsrB
- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens
SéquencesdsrBSéquençag
e
PCR dsrBAmpliconsdsrB
![Page 16: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/16.jpg)
Résultats PCR-DGGE sur dsrB
Approche directe
Nested PCR
Banque de clones (référence)
![Page 17: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/17.jpg)
Résultats PCR-DGGE sur dsrB
Approche directe
Nested PCR
Banque de clones (référence)
Résultats obtenus en nested PCR ne semblent pas présenter d’artefact dû à l’approche utilisée
Augmentation du nombre de bandes détectables avec les stratégies de nested PCR et de clonage (90% de bandes communes)
Diminution du biais introduit par la PCR : détection des souches peu abondantes
Meilleure sensibilité
![Page 18: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/18.jpg)
Conditions de migration PCR-DGGE
La qualité des résultats obtenus en PCR-DGGE ne dépend pas uniquement de la stratégie d’amplification Temps de migration élevé Voltage adapté Gradient de dénaturant adapté
Migration 30h à 75V Gradient de dénaturant compris entre 35 et 80%
![Page 19: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/19.jpg)
Analyse phylogénétique de dsrB
Construction de l’arbre phylogénétique 97 séquences protéiques de dsrAB extraites de
GenBank Méthode des distances
Ajout manuel des séquences protéiques partielles déduites de dsrB méthode de parcimonie
Mise en évidence d’une grande diversité des SRP dans l’échantillon Confirme les résultats obtenus en DGGE
![Page 20: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/20.jpg)
Analyse phylogénétique de dsrB
Abondance relative des différentes familles de SRP
FamilleAbondance relative
(%)
Clones DGGE
Desulbobacteraceae 53 59
Desulfovibrionales 0 0
Desulfomonile tiedjei gr. 8 7
Desulfobacterium anilini gr. 6 7
Firmicutes xénologues 0 0
Desulfobulbaceae 6 24
Syntrophobacteraceae 8 3
Desulfobacca acetoxidans 11 0
Firmicutes orthologues 6 0
Autes 3 0
Résultats comparables d’une technique d’étude à l’autre
![Page 21: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/21.jpg)
Analyse phylogénétique de dsrB
Abondance relative des différentes familles de SRP
FamilleAbondance relative
(%)
Clones DGGE
Desulbobacteraceae 53 59
Desulfovibrionales 0 0
Desulfomonile tiedjei gr. 8 7
Desulfobacterium anilini gr. 6 7
Firmicutes xénologues 0 0
Desulfobulbaceae 6 24
Syntrophobacteraceae 8 3
Desulfobacca acetoxidans 11 0
Firmicutes orthologues 6 0
Autes 3 0 Souches peu abondantes dans l’échantillon traité
![Page 22: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/22.jpg)
Validation de cette technique
Etude des variations de compositions de microcosmes Echantillon de vase prélevé en zone intertidale en
Belgique Traité avec un régime de marée Utilisation d’une eau a une salinité différente Traitement de 4 semaines
![Page 23: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/23.jpg)
Validation de cette technique
Résultats
Mise en évidence de l’enrichissement sélectif en SRP de l’espèce Desulfosarcina
Confirme le résultat obtenu par une autre technique
![Page 24: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/24.jpg)
![Page 25: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: Amélioration de la technique DGGE en vue d’identifier des microorganismes sulfato-réducteurs](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062301/56814093550346895dac25a2/html5/thumbnails/28.jpg)
Référence
DémarcheEchantillon de sol
Extraction de l’ADNADN environnemental
PCR dsrAB
Mélange d’amorces : - 3 amorces sens - 4 amorces antisensSélection des amplicons de 1,9kb
Banque de clonesdsrAB
SéquencesdsrB1
Clonage
Séquençage
AmpliconsdsrB
PCR dsrB
- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens
PCR dsrBAmplicons
dsrB
DGGE
PCR dsrB - amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens
- amorce sens avec ilôt GC - une amorce antisens
SéquencesdsrB2Séquençag
e
Nested PCR