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Unidad 4. Mutagénesis, carcinogénesis y teratogénesis Departamento de Farmacia, Facultad de Química, UNAM.
1 Profesor: Francisco Hernández Luis
Unidad 4. Mutagénesis, carcinogénesis y
teratogénesis
4.1 Mutagénesis
Mutación es todo cambio transmisible en el material genético de un
organismo. Algunos de los agentes físicos y químicos que producen dichos
cambios son: la radiación ionizante, mostazas nitrogenadas, epóxidos,
sulfonatos de metilo.
De las alteraciones que se producen en el ácido desoxiribonucléico
(ADN), no todas son necesariamente dañinas, ya que muchas mutaciones
han ocasionado mejores adaptaciones de los individuos en los procesos
evolutivos. El peligro se presenta con aquellas mutaciones cuyos efectos
provocan reacciones adversas para el organismo. Las consecuencias
nocivas de las mutaciones incluyen desordenes en la fertilidad, muerte
embrionaria y perinatal, malformaciones, enfermedades hereditarias, y
cáncer. Los propósitos de la toxicología en este campo son:
a) Identificar aquellas sustancias que presenten potencialidad
mutagénica
b) Tratar de establecer el mecanismo de acción y las consecuencias
fenotípicas de los agentes que provocan mutaciones
c) Establecer los parámetros o condiciones necesarias para minimizar
la exposición humana a los mutágenos, con el propósito de evitar
alteraciones en la información hereditaria que ya posee el individuo
La probabilidad de que un xenobiótico pueda causar daño genético
es afectado por su concentración en el medio ambiente; su ingreso y
distribución corporal; el sistema metabólico del tejido en el cual el
compuesto es distribuido; la reactividad del xenobióticos o sus metabolitos
con las macromoléculas, especialmente con el ADN; la capacidad de la
célula para rectificar o amplificar el daño; la oportunidad de que el daño
causado se exprese; y la capacidad del tejido para reconocer y suprimir la
multiplicación de las células con propiedades aberrrantes. Por todos estos
factores, es importante tener en cuenta que para que un compuesto
presente en el medio ambiente, afecte al material genético no es un evento
simple y fácil de llevar a cabo.
Figura 4-1. Paradigma toxicológico
Niveles de acción de mutágenos
Las consecuencias de la mutagénesis se pueden esquematizar en
la siguiente forma según sea afectada una célula somática o una célula
germinal.
excreción
aproximación al ADNtraslado por la membrana
del núcleo
riesgo de exposición
ruta de ingreso y
distribución fisiológica
biotransformación
reacción con el ADN
(mutación)
procesos de
reparación
expresión
trastorno biológico
(reacción adversa)
traslado por membranas
celulares
etapa
toxocinética etapa
toxodinámica
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Figura 4-2. Consecuencias de mutaciones en células somáticas y germinales
Es importante señalar la diferencia entre dos términos que con
frecuencia suelen utilizarse como sinónimos: mutagenicidad y
genotoxicidad. La mutagenicidad es la capacidad de un xenobiótico para
causar alteraciones en el material genético que lleguen a ser transmisible a
la progenie celular. La genotoxicidad implica un término más amplio, ya que
incluye alteraciones al material genético, tales como intercambio de
cromátidas hermanas o rupturas de hebras de ADN, que no
necesariamente son transmitidas a la decendencia Klaassen C.D., 2001)
Interacción de xenobióticos con el DNA
Cambio de grupo funcional
Un ejemplo de transformación química de bases es provocada por
el ácido nitroso, HNO2, el cual provoca la transformación de citosina a
uracilo o de la adenina a hipoxantina. El ácido nitroso puede ser formado,
en el cuerpo humano, por la reacción de nitritos con compuestos orgánicos
(aminas secundarias) en las condiciones ácidas del estómago.
Figura 4-3. Deaminación de la citidina para dar uridina por acción del HNO2
Alquilaciones
Alquilación intracatenaria Alquilación intercatenaria
Figura 4-4. Tipos de alquilaciones en las hebras de ADN
Características de los agentes alquilantes
- Son de naturaleza electrofílica
- Altamente reactivos
- Formación de enlaces covalentes
- Reemplazan H por un grupo alquilo
- Interrupción de la función del ADN y muerte celular
- Escasa selectividad (antineoplásicos (antiproloferativos) y
carcinógenos)
transmisible a
la progenie
recesivodominante viablemuerte fetal
cáncer
cambio recesivo
muerte celular
célula germinalcélula somática
evento mutagénico
odominante
mutágeno
N
N
NH2
O
ribosa
N
N
ribosa
O
O
HNO2
Citidina Uridina
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- En general todos son depresores de la médula ósea
Figura 4-5. Alquilacion del ADN, monofuncional y bifuncional
Intercalaciones al ADN
A continuación se ilustra el fenómeno de la intercalación en el ADN.
Figura 4-6. Alquilación del ADN
Figura 4-7. Diagrama que muestra dos moléculas de doxorrubicina
intercalándose en el ADN
Los agentes intercalantes son un importante grupo de mutágenos
utilizados en los laboratorios de investigación. La intercalación fué primero
descrita por Lerman en 1961 como una interacción no covalente en la cual
el agente intercalante se coloca de forma perpendicular al eje de la doble
hélice. Algunos ejemplos de agentes intercalantes se presentan en la figura
4-8.
Los compuestos intercalantes se caracterizan por su dimensión,
que corresponde a 3 anillos aromáticos condensados (o heterocíclicos), la
cual es semejante al diámetro de la doble hélice del ADN. La intercalación
provoca una separación vertical de los pares de bases, distorsionando la
conformación del enlace azucar-fosfato y una distorsión de la hélice tal que
la longitud de la misma se incrementará. La intercalación ocurre
agente alquilante bifuncional
+
ADN
proteína
OH
alquilantehidrolizado
alquilacióndos hebras
alquilaciónuna hebra
alquilaciónADN-proteína
alquilacióndos ADN
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preferentemente en la secuencia pirimidina-3´-5´-purina que dentro de la
secuencia purina-3´-5´-pirimidina.
Figura 4-8. Agentes intercalantes del DNA
Las investigaciones señalan que los agentes intercalantes
interfieren con la topoisomerasa II. Esta enzima cataliza la ruptura
pasajera de la doble hélice de ADN para propósitos tales como replicación
o transcripción. Aunque la separación ocurre en presencia de los
intercaladores, la topoisomerasa II permanece firmemente unida en el punto
dañado y entonces previene el acoplamiento de las hebras nuevamente.
Actualmente, se piensa que la intercalación es la primera etapa en una
serie de eventos que provocarán daño al ADN por otros mecanismos.
Figura 4-9. Afectación de la topoisomerasa
Tabla 4-1. Mutágenos y sus mecanismos de acción
Tipo de mutágeno
Mecanismo Ejemplo Mutación
Agentes alquilantes
Forman enlaces covalentes con las purinas y pirimidinas provocando los sitios apúricos
Sulfato de alquilo, mostazas nitrogenadas, nitrosourea
Transición, transversión
Agentes desaminantes
Desaminan adenina y la transforman en hipoxantina; y a la citosina en uracilo
Ácido nitroso Transición
Análogos de base
Sustituyen a las bases púricas y pirimidínicas normales durante la replicación del ADN
2-aminopurina Transición
Agentes intercalantes
Se intercalan en las hebras de ADN.
Acridinas, antraciclinas
Corrimiento que altera la lectura en el ADN
Tabla 4-2. Ejemplos de acción mutagénica y aberración cromosómica
Xenobiótico Actividad de microlesión relativa
Actividad de macrolesión relativa
Sulfato de dimetilo 100 100 Metilnitrosoguanidina 27 710 Cafeína 0 340 Hidroxilamina 0 88
quinacrina
N
OCH3
Cl
NHN
C2H5
C2H5
P = pépt ido
actinomicina
PP
O
N
O
CH3 CH3
C CO O
bromuro de etidium
+ -Br N
NH2H2N
C2H5
acriflavina
NH2N NH2
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4.2 Evaluación de la actividad mutagénica de
xenobióticos
Muchas sustancias químicas y agentes físicos pueden provocar
citotoxicidad por diferentes mecanismos, uno de los cuales involucra la
interacción con los ácidos nucléicos con la alteración en la información
genética, con la consecuente producción, ya sea, de un efecto letal para la
célula o daños débiles o severos a una o más de las funciones celulares a
nivel de ARN, membranas, proteínas y enzimas. Los experimentos para
poder evaluar estos efectos llegan a ser complejos y prolongados ya que
implican animales completos, y estudios a través de varias generaciones.
Ante tal situación, se han desarrollado una serie de pruebas in vitro de corta
duración (short-term) utilizando microorganismos, plantas, insectos y
cultivos celulares de mamíferos. Estas pruebas sirven para monitorear
(screening) posibles agentes con actividad mutagénica, teratogénica y/o
carcinogénica.
Pruebas para la evaluación de actividad mutagénica en procariotes
Basados en la hipótesis de que los carcinógenos son inicialmente
mutágenos, Ames y colaboradores en la década de los 70´s, realizaron
experimentos con varios microorganismos para encontrar sustancias con
actividad mutagénica. La cepa bacteriana que mejores resultados
proporcionó fué la Salmonella typhimurium. (En la actualidad también se
utiliza Escherichia coli WP2 uvr A-). Las cepas originales fueron
genéticamente incapaces de sintetizar histidina (his-). En este ensayo, se
incuban cepas de esta bacteria con algún xenobiótico y en medio de cultivo
sin histidina. En estas circunstancias, un crecimiento de colonias es
indicativo de acción mutagénica del compuesto estudiado, al convertir un
organismo auxotrófico que requiere de un nutriente específico para subsistir
(histidina) hacia un organismo prototrófico, que puede sintetizar el nutriente
requerido desde un precursor más simple presente el medio de cultivo.
Figura 4-10. Prueba de Ames
www.bioreliance.com/AMES_assay.html
Dos variantes de esta técnica, se utilizan al verter las mezclas de
microorganismos y xenobióticos, a las cajas de petri para posterior
incubación. Estas variantes son: la incorporación inmediata y la
preincubación.
En la incorporación inmediata, el control, el microorganismo y el
xenobiótico, una vez que han sido mezclados, se vierten inmediatamente a
las cajas de Petri, para enseguida incubarlas a 37 °C durante 48 h. Ésta
variante se presenta esquemáticamente en la figura 4-11.
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Figura 4-11. Pruebas para la actividad mutagénica en bacterias
Un aspecto adicional a considerar es la adición de la fracción S9.
Esta fracción se obtiene del hígado de mamíferos (usualmente ratas), a las
cuales se les administra previamente Aroclor 1254 (en la actualidad se
prefiere una mezcla de fenobarbital y 5,6-benzoflavona) para inducir las
enzimas que metabolizan xenobióticos.
Figura 4-12. Obtención de la fracción S9
Para mejores resultados, se prepara la mezcla S9 que consiste en
fracción S9 (0.1-0.3 mL), MgCl2 (0.4 M, 0.02 mL), KCl (1.65 M, 0.02 mL),
glucosa 6-fosfato(1M, 0.005 mL), NADPH (0.1 M, 0.04 mL), NADH (0.1M,
0.04 mL), amortiguador de fosfato de sodio (0.2M, 0.5 mL). Todo esto se
afora a 1 mL.
La variante de preincubación se describe a continuación.
Cantidades disponibles (108 microorganismos/ mL) de microorganismo
mutante, son incubados en tubos de ensayo por 30 o 60 min, con medios
pocos nutritivos, una capa de agar y en presencia o ausencia del
xenobiótico a evaluar. Transcurrido el tiempo, el contenido de los tubos se
vierte sobre cajas de petri que contiene una cantidad mínima de medio de
cultivo y son incubadas a 37 °C por 48 h.
rataadministración
del inductor
sacrificar y
extraer el
hígado
homogeneizar
en frío con
solución salina
centrifugar
a 10, 000 g
el sobrenanante
se centrifuga a
102 000 g
al precipitado
se le denomina
fracción micro-
somal S9
al sobrenadante
se le llama fración
citosólica S100
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Los tubos de ensayo deben presentar 10
8 organismos por mL. En el tubo (A) se presenta
medio de cultivo más agar, en el tubo (B) se presenta el medio de cultivo más la fracción S-9 del hígado de rata inducido por Aroclor 1254; el tubo (C) presenta el medio de cultivo, la fracción S-9 y el compuesto químico que se va a evaluar. Los tubos se incuban a 37 °C por 48 Hr. Sobre un rango de concentraciones del compuesto de prueba, el número de colonias debe incrementarse al aumentar la cantidad de sustancia.
Figura 4-13. Pasos generales de la prueba de Ames
Un aspecto importante a considerar es la concentración del
xenobiótico que se va a estudiar. Por esta razón, primero se lleva a cabo un
estudio de sensibilidad de la cepa a diferentes concentraciones del
xenobiótico. Las concentraciones tóxicas (pendientes negativas, Figura
siguiente) de entrada se rechazan.
Para cada estudio se recomienda de 5 a 6 concentraciones diluidas
a una relación del doble o triple. Cada estudio por duplicado. En la gráfica
siguiente, la recta de pendiente positiva es la de utilidad. De esta parte se
determina el valor de dicha pendiente (m) que se interpreta como la
actividad mutagénica específica, parámetro que nos sirve para evaluar la
actividad mutagénica del xenobiótico estudiado.
m = actividad mutagénica específica (n.c./mg) n.c. : número de colonias
Figura 4-14. Consideraciones para la prueba de Ames
En la actualidad se disponen de varias cepas de Salmonella
typhimurium para realizar las evaluaciones de actividad mutagénica.
Algunas de ellas se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 4-3. Algunas cepas de salmonella utilizadas para la prueba de Ames
Cepas de Salmonella typhimurium
Tipos de mutaciones detectadas
TA 1535 Detecta mutaciones por sustitución de pares de bases
TA 100 Es derivada de la TA 1535, pero contiene el plásmido pKM101, el cual incrementa la sensibilidad al provocar fallas en los procesos de reparación del ADN.
TA 102, TA 104 Detectan mutaciones por sustitución de pares de bases que no detectan las cepas TA 1535 y TA 100.
TA 1537 Detecta mutaciones por adición de bases. Presenta una mutación en el gen hisC3076
n.c./caja
mg/caja
0
0 | | | |
efecto tóxico
sobre el
microorganismom
10 20 30 40
_
_
_
_
_
100
200
300
400
500
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TA 1538 Detecta mutaciones por adición de bases. Presenta la mutación en el gen hisD3052
TA 98 Es derivada de la TA 1538, presenta el plásmido pKM101
TA 1535 Detecta mutaciones por deleción de bases
YG 1024 Cepa sensible a aminas aromáticas heterocíclicas Claxton, L.D.; Allen, J.; Autetta, A.; Mortelmans, K.; Nestmann, E.; Zeiger, E. Guide for the Salmonella thyphimurium/mammalian microsome tests for bacterial mutagenicity. Muatation Research 1987, 189, 83-91.
Para ilustrar la aplicación de la prueba de Ames, se presenta a
continuación los resultados obtenidos al evaluar al café soluble (Nescafé)
con este procedimiento.
Tabla 4-4. Actividad mutagénica específica (n.c./mg) del café soluble
Incorporación inmediata Preincubación
Cepa Sin S9 Con S9 Sin S9 Con S9
TA 98 1.92 ± 0.91 negativo 9.15 ± 0.90 2.43 ± 0.24 TA 100 5.02 ± 0.70 negativo 28.11 ± 2.85 6.66 ± 0.94 TA 102 15.05 ± 0.61 9.83 ± 0.57 30.38 ± 2.87 26.70 ± 2.87 TA 104 negativo negativo 34.10 ± 2.28 negativo YG 1024
negativo negativo 14.47 ± 3.77 negativo
Duarte, M.P.; Laires, A.; Gaspar, J.; Le o, D.; Oliveira, J.S.; Rueff, J. Genotoxicity of instand cofee: possible involvement og phenolic compounds. Mutation Research 1999, 442, 43-51
Los resultados obtenidos con cepas de distintas sensibilidades a
compuestos genotóxicos, sugieren que los componentes del café soluble
lesionaron al ADN por mecanismos diferentes. En este estudio, el procedimiento
de preincubación previa fue más eficiente en detectar la actividad mutagénica
que el de incorporación inmediata. En ambos casos, la adición de la fracción
S9, disminuyó la actividad mutagénica del café, lo que indica que los
compuestos responsables, al metabolizarse perdieron sus características
genotóxicas.
Pruebas de mutagenicidad con células eucariotas in vitro
Intercambio de cromátides hermanas (SCE)
Esta prueba ha sido utilizada para detectar rupturas cromosómicas
por xenobióticos
CélulaXenobiótico
Fracción S-9
.
lavar BrdU Colchicina
Replicaciones
No 1 No 2
ausencia de luz
Cromosomas en metafase
Preparación de cortes
Teñir
Observación de
cromosomas
"arlequines"
Figura 4-15. Pasos generales para la prueba de intercambio de cromátidas
Del cultivo celular de ovario de hamster (CHO) o pulmonares (V79)
se toman muestras que se incuban con el xenobiótico en presencia y en
ausencia de alícuotas de la fracción S-9 durante 2 h. En seguida, se lava
para remover el compuesto que no haya sido absorbido; las células son
transferidas a un medio que contiene 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) y se
permite que ocurran dos replicaciones de ADN (24 o 30 Hr). Transcurrido el
tiempo, se adiciona colchicina para detener el proceso de reproducción en
la etapa de metafase. Cortes son preparados y teñidos con colorantes
fluorescentes, expuestos a la luz ultravioleta, y fijados con Giemsa. Los
daños causados por la exposición al xenobiótico (rupturas,
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fragmentaciones, etc.) se verán reflejados en el intercambio de piezas entre
cromosomas. Este efecto se observará en el microscopio por la presencia
de una variedad de patrones luminosos y obscuros en los cromosomas,
quienes reciben el nombre de arlequines.
Pruebas de mutagenicidad con células eucariotas in vivo
Pruebas con Drosophila melanogaster
La mayor ventaja de la mosca de la fruta (Drosophila
melanogaster) como un organismo de prueba en estudios toxicológicos se
enlistan a continuación:
- Una especie eucariota de reproducción sexual
- Paralelismo entre sus células germinales con las del ser humano
- Genéticamente bien conocido
- Presenta tres cromosomas grandes
- Muchas mutaciones con efectos visibles son marcadores útiles
- Presenta cromosomas especiales combinados con marcadores y
rearreglos
- Tiempo de generación corto y gran número de progenie
- Es capaz de metabolizar una gran cantidad de xenobióticos, lo que
resulta conveniente en la transformación de promutágenos a
mutágenos.
Uno de los sistemas de prueba se basa en que los machos de una
especie tienen un gen ligado al cromosoma X, que le da un color amarillo a
su cuerpo. Los machos de 2 días de edad son expuestos al xenobiótico a
probar, disuelto a diferentes concentraciones en agua con azúcar. Los
machos sobrevivientes son apareados con hembras. Si no hay machos de
cuerpo amarillo en la progenie, se asume que ha ocurrido una mutación
letal. Con cantidades menores a la concentración letal, se podrán observar
algunos machos de cuerpo amarillo, cuyo número guardará una relación
inversa con la concentración de xenobiótico a la que los progenitores han
sido expuestos.
Cuando se quiere monitorear un gran número de sustancias, para
evaluar los daños letales recesivos ligados al sexo (SLRL), la Drosophila
melanogaster es la mejor elección. En este ensayo se detectan efectos
letales asociados con mutaciones como microlesiones, deleciones, o
rearreglos cromosómicos. Los parámetros estudiados en células germinales
de las Drosophila son:
- Inducción de mutaciones relativas a citotoxicidad
- La proporción de aberraciones cromosómicas para las mutaciones
letales recesivas
- El papel de los procesos de reparación
- La influencia del tiempo de expresión en la formación de
aberraciones cromosómicas
- La inducción de mutaciones relativas a uniones cuantitativas al
ADN
Prueba de micronúcleos
Un micronúcleo (MN) se forma durante la transición
metafase/anafase del proceso mitótico. Surge de: a) un cromosoma entero
o b) de un pedazo del mismo. Éstos no se incorporan al núcleo de las
células hijas por carecer de un centrómero. El primer caso es ocasionado
por una sustancia aneugénica y el segundo, por una sustancia
clastogénica.
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Figura 4-16. Micronúcleos ocasionados por a) daño aneugénico y por b) daño
clastogénico
Figura 4-17. Micronúcleo
Los micronúcleos se pueden presentar en cualquier tipo de células
de tejidos proliferativos (tejido hepático, eritrocitos en médula ósea,
linfocitos). Estas células, recolectadas de animales expuestos a
xenobióticos, pueden ser utilizadas para este ensayo. El ratón es la especie
preferida para este tipo de estudios. Recientes reportes han señalado el
uso de peces, los cuales tienen eritrocitos nucleados, como especies
disponibles para el monitoreo de daño mutagénico por contaminantes de
cuerpos de aguas. Así mismo, se han utilizado algunas especies vegetales
como Tradescantia spp y Vicia faba, para evaluar la actividad mutagénica
de algunos contaminantes y fármacos.
El ensayo permite la detección de:
- Clastógenos (sustancia que rompe los cromosomas)
- Aneugenos (sustancias que afectan el huso mitótico)
- Apoptosis
- Retraso mitótico
- Ruptura de cromosomas
- Pérdida de cromosomas
- No disyunción de cromosomas
Ventajas del ensayo de micronúcleos
- El ensayo de MN es una alternativa al test de aberraciones
cromosómicas convencional.
- Se analizan las alteraciones presentes en metafases mitóticas
- Permite detectar aberraciones cromosómicas que responden a
alteraciones de tipo estructural (efecto clastogénico) o alteraciones
numéricas (efecto aneugénico) del agente en estudio.
El ensayo Cometa
Utilizado para evaluar el potencial genotóxico de diversas
sustancias químicas.
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Figura 4-18. Representación de ensayo cometa
Está basado en la migración de fragmentos rotos de ADN durante
un proceso electroforético, el cual es una técnica sensible que detecta:
- Rompimiento de cadenas sencillas
- Sitios álcali-lábiles
- Sitios de reparación por escisión de bases nitrogenadas
Las principales ventajas del ensayo cometa incluyen:
- La obtención de datos genéticos a nivel de células individuales, lo
que permite que el estudio estadístico sea robusto
- La necesidad de un pequeño número de células (<10000) por cada
compuesto a evaluar
- Uso de cualquier población de células eucariotas
De manera general se procede de la siguiente manera:
a) Se mezclan linfocitos, u otras células, con microgeles de agarosa
extendida sobre placas portaobjetos sumergidos en solución de
lisis y luego el ADN es desnaturalizado con NaOH.
b) Se realiza un corrido electroforético después de lisar las células en
el microgel de agarosa.
c) Se colorea el ADN con Bromuro de etidio y se estima el daño
mediante la visualización de la fluorescencia del ADN que migra.
Figura 4-19. Referencia para las mediciones en el ensayo cometa
La cola del cometa representa la migración del ADN. La longitud se
mide en micras desde el centro del núcleo hasta el último punto de
fluorescencia.
Bibliografía
1. Klaassen C.D. Cassarett and Doull´s Toxicolofy. The basic science
of poisons. Sexta edición. Mc Graw Hill. E.U.A. 2001, pp 31-32,
321.
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Press. USA 1987.
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system. Marcel Dekker Inc. USA. 1984.
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5. Watson, R.R. In vitro methods of toxicology. CRC Press, USA.
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