alimentele şi suplimentele nutritive - surse de vitamină a pentru ...
Transcript of alimentele şi suplimentele nutritive - surse de vitamină a pentru ...
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
,,Grigore T.Popa”, IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
ALIMENTELE ŞI SUPLIMENTELE
NUTRITIVE - SURSE DE VITAMINĂ A
PENTRU ORGANISM
OH
CH3
CH3CH3CH3 CH3
- REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT -
Coordonator ştiinţific,
Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu
Doctorand,
Lăcrămioara Elena Patriche (Lisă)
IAŞI
2014
Conform Deciziei Rectorului Universităţii de Medicină şi Farmacie
„Gr. T. Popa” Iaşi nr. 14060 din 08.07.2014 a fost numită comisia pentru
susţinerea publică a tezei de doctorat intitulată „Alimentele şi
suplimentele nutritive - surse de vitamină A pentru organism”
elaborată de Farm. Lăcrămioara Elena Patriche (Lisă), în vederea
conferirii titlului de doctor în ştiinţe Medicale, domeniul Farmacie.
Componenţa comisiei de doctorat:
PREŞEDINTE: Decan Prof. univ. dr. Monica Hânceanu
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ. dr. Rodica Cuciureanu
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi
REFERENŢI OFICIALI:
Prof. univ. dr. Daniela Lucia Muntean
Universitatea de Medicină şi Farmacie, Târgu Mureş
Prof. univ. dr. Doina Miere
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca
Conf. dr. Nela Bibire
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi
Susţinerea publică a tezei de doctorat va avea loc în data de
19.09.2014 ora 11.00 în Sala Societăţii de Medici şi Naturalişti, Iaşi.
Prezenta teză de doctorat cuprinde 143 pagini, este ilustrată
prin 86 figuri şi 45 tabele şi conţine 219 indicaţii bibliografice,
rezumatul cuprinde un număr limitat din totalul acestora.
În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru
cuprins, tabele şi figuri.
CUPRINS
INTRODUCERE ………………………………………………………………. 1
Motivaţia cercetării ……………………………………………………………... 3
Structura şi obiectivele tezei de doctorat ……………………………………….. 3
PARTEA GENERALĂ …………………………………………………………. 5
Capitolul I
Vitamina A şi organismul uman ………………………………………………... 6
I.1. Vitaminele – aspecte generale ……………………………………... 6
I.2. Vitamina A: structură şi proprietăţi fizico – chimice ………………. 8
I.2.1. Sinteza vitaminei A ………………………………………… 10
I.2.2. Biosinteza vitaminei A ……………………………………... 13
I.2.3. Farmacocinetica vitaminei A .................................................. 14
I.2.4. Rolul vitaminei A în organismul uman .................................. 17
I.2.5. Necesarul zilnic de vitamină A ............................................... 24
I.2.6. Deficitul de vitamină A–consecinţele şi populaţiile cu risc ... 31
I.2.7. Toxicitatea vitaminei A …………………………………….. 33
Capitolul II
Alimentele şi suplimentele nutritive – aspecte generale ....................................... 36
II.1. Surse alimentare de vitamină A ……………………………………. 36
II.1.1. Alimentele de origine animală - surse de vitamină A ……… 37
II.1.2. Alimentele de origine vegetală - surse de vitamină A ……… 37
II.2. Reglementări legislative privind suplimentele nutritive .................... 37
II.3. II.3.1. Suplimentele nutritive – surse de vitamină A .………………………. 38
Capitolul III
Detecţia şi cuantificarea vitaminei A …………………………………………… 40
III.1. Extracţia vitaminei A din probe ………………………………….. 40
III.2. Determinarea cantitativă a vitaminei A …………………………... 40
PARTEA PERSONALĂ ………………………………………………………... 46
Capitolul IV
Estimarea conţinutului în vitamină A din produse alimentare ………………….. 47
IV.1. Introducere .…………………………………………………............ 47
IV.2. Determinarea spectrofotometrică a vitaminei A din produsele
alimentare …………………………………………………………... 48
IV.2.1. Determinarea vitaminei A din probele de margarină prin
metoda spectrofotometrică Carr - Price ..................................... 49
IV.2.2. Reactivi ……………………………………………………... 49
IV.2.3. Protocol experimental ……………………………………..... 49
IV.2.3.1. Trasarea curbei de calibrare ……………………... 49
IV.2.3.2. Determinarea randamentului de recuperare ……... 50
IV.2.4. Evaluarea stabilităţii vitaminei A în probele de margarină … 50
IV.2.5. Determinarea vitaminei A din probele de margarină ………. 52
IV.2.6. Rezultate ……………………………………………………. 52
IV.2.7. Discuţii ……………………………………………………… 53
IV.2.8. Concluzii ……………………………………………………. 53
Capitolul V
Determinarea HPLC a vitaminei A din suplimente nutritive …………………… 54
V.1. Introducere …………………………………………………………. 54
V.2. Validarea unei metode HPLC de determinare a vitaminei A ………. 56
V.2.1. Protocol de validare a metodelor analitice ………………... 56
V.3. Raport de validare ………………………………………………….. 62
V.3.1. Reactivi …………………………………………………… 62
V.3.2. Condiţii cromatografice de analiză ……………………….. 62
V.3.3. Liniaritatea (curba de calibrare) …………………………... 62
V.3.4. Selectivitatea ……………………………………………… 63
V.3.5. Limita de cuantificare …………………………………….. 64
V.4. Determinarea vitaminei A din probe de suplimente nutritive ……… 65
V.4.1. Reactivi ……………………………………………………... 65
V.4.2. Probele de analizat ………………………………………….. 65
V.4.3. Prepararea soluţiei de bază de retinil acetat (SI)……………. 66
V.4.4. Analiza cromatografică ……………………………………... 66
V.4.5. Separarea vitaminei A din probe …………………………… 66
V.4.6. Rezultate ……………………………………………………. 66
V.4.7. Discuţii ……………………………………………………… 72
V.4.8. Concluzii ……………………………………………………. 72
Capitolul VI
Determinarea HPLC a vitaminei A din probe de ser uman …………………….. 74
VI.1. Introducere …………………………………………………………. 74
VI.2. Materiale şi metodă ............................................................................ 75
VI.2.1. Design-ul studiului clinic în vederea recoltării probelor
biologice ……………………………………………………. 75
VI.2.2. Protocolul studiului …………………………………………. 76
VI.2.2.1. Reactivi ………………………………………….. 76
VI.2.2.2. Soluţiile standard ………………………………... 76
VI.2.2.3. Prepararea probelor ……………………………… 76
VI.2.2.4. Echipamente şi condiţii cromatografice ................ 76
VI.2.3. Studiul liniarităţii …………………………………………… 77
VI.2.4. Limita de detecţie …………………………………………... 77
VI.2.5. Limita de cuantificare ………………………………………. 78
VI.3. Rezultate ………....………………………………………………… 78
VI.4. Discuţii ………....…………………………………………………... 83
VI.5. Concluzii …………………………………………………………… 85
Capitolul VII
Farmacocinetica retinolului administrat pe cale orală la femei ………………… 86
VII.1. Introducere …………………………………………………………. 86
VII.2. Studii clinice realizate ……………………………………………… 87
VII.3. Subiecți …………………………………………………………….. 87
VII.4. Design-ul studiului în vederea recoltării probelor biologice ………. 88
VII.5. Metoda analitică …………………………………………………. 88
VII.6. Concentraţiile plasmatice ale retinolului …………………………... 88
VII.7. Analiza farmacocinetică noncompartimentală …………………….. 92
VII.7.1. Parametrii farmacocinetici ai retinolului …………………. 94
VII.7.2. Analiza statistică a parametrilor farmacocinetici …………. 97
VII.8. Concluzii …………………………………………………………… 97
Capitolul VIII
Evoluţia unor parametri biochimici după administrarea orală de vitamină A ….. 98
VIII.1. Introducere ……………………………………………………….. 98
VIII.2. Materiale şi metode ………………………………………………. 98
VIII.3. Eşantionare ……………………………………………………….. 100
VIII.3.1. Repartiția lotului luat în studiu funcţie de sex ………... 100
VIII.3.2. Repartiţia lotului luat în studiu funcţie de vârstă ……… 100
VIII.3.3. Repartiţia lotului luat în studiu funcţie de înălțime …… 102
VIII.3.4. Repartiţia lotului luat în studiu funcţie de greutate …… 104
VIII.4. Evoluţia parametrilor biochimici diferenţiată pe sexe …………… 106
VIII.4.1. Determinarea activităţii transaminazelor ……………... 106
VII.4.1.1. Determinarea activităţii alanin-aminotransferazei ……. 106
VII.4.1.2. Determinarea activităţii aspartat-aminotransferazei …… 108
VIII.4.2. Determinarea activităţii γ-glutamil transpeptidazei …... 109
VIII.4.3. Determinarea fosfatazei alcaline (ALP) ………………. 110
VIII.4.4. Determinarea proteinelor totale ……………………….. 111
VIII.4.5. Determinarea bilirubinei ……………………………… 112
VIII.4.5.1. Determinarea bilirubinei totale ……………………….. 113
VIII.4.5.2. Determinarea bilirubinei directe şi indirect …………… 114
VIII.4.6. Determinarea colesterolului …………………………... 115
VIII.4.7. Determinarea trigliceridelor …………………………... 116
VIII.5. Discuţii …………………………………………………………… 117
VIII.6. Concluzii …………………………………………………………. 125
Concluzii generale ……………………………………………………………... 126
Bibliografie ……………………………………………………………………... 128
Index Tabele …………………………………………………………………… 145
Index Figuri ……………………………………………………………………. 147
Anexa 1. Aviz comisia de etică a cercetării …………………………………….. 151
Anexa 2. Formular de informare ……………………………………………….. 153
Anexa 3. Formular de consimţământ informat în cercetare ……………………. 155
Anexa 4. Lista de articole publicate din tematica tezei de doctorat ……………. 157
Motivaţia cercetării
Suplimentele alimentare care au vitamină A în compoziţia lor sunt
recomandate şi administrate pentru completarea necesarului de vitamină A
pentru organism. Deoarece, în general aceste suplimente nu se
administrează după evaluarea statusului nutriţional al organismului în
vitamină A, se impun precauţii pentru a se evita aportul excesiv al acestui
micronutrient. Înregistrarea şi punerea pe piaţă a suplimentelor alimentare
nu este supusă aceloraşi reglementări ca şi în cazul medicamentelor şi de
aceea, în cazul vitaminei A, micronutrient la care balanţa deficit/exces este
în limite foarte înguste este necesară respectarea concentraţiei
micronutrientului pe doza unitară administrată.
Asigurarea aportului optim de vitamine liposolubile este o
necesitate în asigurarea unei alimentaţii echilibrate. Sursele alimentare de
vitamine liposolubile nu sunt întotdeauna suficiente pentru a asigura acest
aport. Suplimentele nutritive cu vitamine pot completa acest aport.
Avantajul recurgerii la suplimente este acela al estimării aportului zilnic,
dar este contracarat de insuficienta cunoaştere a biodisponibilităţii fiecărui
component a produsului administrat, în condiţiile în care standardizarea
diferitelor principii nutritive sub formă de „supliment nutritiv” nu este strict
controlată.
Vitamina A se găseşte în mod natural în multe produse alimentare,
de origine vegetală şi animală. Unele alimente (margarina) sunt îmbogăţite
în vitamină A pentru a li se îmbunătăţi calitatea. Margarina este un aliment,
de origine vegetală, mult utilizat în alimentaţie datorită aportului crescut în
grăsimi vegetale, vitamină A şi vitamină D. Legislaţia sanitară în vigoare,
prevede pentru vitamină A şi esterii săi în margarină, un minimum de
25.000 U.I./kg, în funcţie de sortul acesteia. Complexitatea chimică a
produsului alimentar studiat, dar mai ales stabilitatea chimică extrem de
redusă a vitaminei A fac destul de dificilă determinarea acesteia în
margarină.
Studiile de farmacocinetică a vitaminelor liposolubile din
suplimentele nutritive autorizate în România pot contribui la optimizarea
formulării (concentraţii, asocieri posibile, incompatibilităţi), administrării şi
biodisponibilităţii principiilor nutritive.
Structura şi obiectivele tezei de doctorat
Memoriul tezei de doctorat este structurat în două părţi: Partea
Generală şi Partea Experimentală.
Partea Generală cuprinde trei capitole în care sunt prezentate
informaţii privind: principalele proprietăţi fizico-chimice ale vitaminei A,
metodele de sinteză şi de biosinteză, farmacocinetica şi rolul vitaminei A în
organsim, necesarul zilnic de vitamină A, precum şi consecinţele
deficitului/excesului de vitamină. De asemenea, tot în cadrul acestei părţi
sunt prezentate aspecte generale privind alimentele şi suplimentele
alimentare ca surse de vitamină A, alături de extracţia şi determinarea
cantitativă a acesteia.
Partea Experimentală alcătuită din cinci capitole, prezintă
urmatoarele obiective principale:
determinarea conţinutului în vitamină A din diferite sorturi de
margarină şi evaluarea stabilităţii chimice a acesteia (Cap. IV);
validarea unei metode lichid cromatografice (HPLC) cuplată cu
detecţie UV adaptată dozării vitaminei A, precum şi aplicarea
metodei validate în vederea determinării conţinutului de vitamină
A din unele suplimente alimentare de pe piaţa românească (Cap.
V);
determinarea concentraţiei plasmatice de vitamină A din sânge prin
metoda HPLC (Cap. VI);
studierea din punct de vedere farmacocinetic a retinolului după
administrarea orală a unei doze unice de vitamină A la femei
sănătoase, unele dintre ele gravide (Cap.VII);
studierea diferenţiată pe criterii de sex, vârstă, înălţime, greutate, a
evoluţiei unor parametri biochimici, după administrarea orală în
doză unică a 100.000 U.I. vitamină A (Cap.VIII).
PARTEA EXPERIMENTALĂ
Capitolul IV. Estimarea conţinutului în vitamină A
din produse alimentare
Vitamina A se găseşte ca atare în produsele alimentare de origine
animală sau sub formă de caroteni, provitamine în produsele alimentare de
origine vegetală. Unele alimente (margarina) sunt îmbogăţite în vitamină A
pentru a li se îmbunătăţi calitatea. Margarina este un aliment, de origine
vegetală, mult utilizat în alimentaţie datorită aportului crescut în grăsimi
vegetale, vitamină A şi vitamină D.
Legislaţia sanitară în vigoare, prevede pentru vitamina A şi esterii săi
în margarină, un minimum de 25.000 U.I./kg, în funcţie de sortul acesteia
(Norma din 22.11.2001). Complexitatea chimică a produsului alimentar
studiat, dar mai ales stabilitatea chimică extrem de redusă a vitaminei A fac
dificilă determinarea acesteia în margarină. Cercetările experimentale
incluse în acest capitol au avut ca obiective:
Determinarea conţinutului în vitamină A din diferite sorturi
de margarină prin metoda spectrofotometrică Carr-Price;
Evaluarea stabilităţii vitaminei A în probele de margarină.
IV.2.1. Determinarea vitaminei A din probele de margarină prin
metoda spectrofotometrică Carr-Price
Vitamina A formează cu triclorura de stibiu (reactivul Carr-Price) în
soluţie cloroformică, o coloraţie albastră, cu maximum de absorbţie la 620
nm. Reacţia este dată şi de β-caroten, şi de aceea se dozează în prealabil
carotenii.
IV.2.3.1. Trasarea curbei de calibrare Metoda este liniară pentru domeniul de concentraţii 10 - 150 μg
retinol. Ecuaţia de regresie liniară obţinută este y = 0,0042x – 0,0053,
valoarea coeficientului de corelaţie R2 este 0,9966.
Fig. IV.1. Curba de calibrare pentru acetat de retinol la concentraţii
cuprinse între 10 şi 150 g/ml.
IV.2.4. Evaluarea stabilităţii vitaminei A în probele de margarină
Cunoscută fiind fotostabilitatea redusă a vitaminei A, am realizat un
studiu al dinamicii conţinutului în vitamină A pe o durată de 60 de zile. S-a
lucrat pe probe de margarină „Unirea” şi margarină „vrac”, achiziţionate de
la producători, imediat după condiţionare. Determinarea vitaminei A s-a
efectuat imediat după achiziţionarea probelor şi la 7, 15, 30 şi 60 de zile.
Rezultatele sunt consemnate în figurile IV.2. şi IV.3. din care se constată
după 60 de zile, scăderi puţin semnificative ale conţinutului iniţial de
vitamină A Abaterile procentuale medii rezultate din evaluarea stabilităţii
vitaminei A din probele de margarină luate în studiu faţă de concentraţiile
declarate sunt 6,45% pentru margarina „Unirea”, respectiv 8,85% pentru
margarina „vrac”.
Fig. IV.2. Dinamica valorilor vitaminei A în probele de margarină
„Unirea” pe o perioadă de 60 de zile.
Fig. IV.3. Dinamica valorilor vitaminei A în probele de margarină „vrac”
pe o perioadă de 60 de zile.
IV.2.5. Determinarea vitaminei A din probele de margarină
S-au analizat 9 probe de margarină; probele au fost achiziţionate
din reţeaua comercială a oraşului Galaţi.
Separarea vitaminei A din probele de margarină s-a realizat prin
hidroliză alcalină. Calculul conţinutului de vitamină A din probe s-a
realizat cu ajutorul relaţiei: y = 0,0042x – 0,0053.
IV.2.6. Rezultate
Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A din probele de
margarină sunt inserate în tabelul IV.5.
Tabel IV.5.
Conţinutul de vitamină A în probelor de margarină analizate.
Nr.
crt. Denumirea probei
Concentraţia vitaminei A
(µg/g) Diferența
Declarată Determinată
1 Margarina „Unirea” 7,50 7,24 0,26
2 Margarina „Linco” 7,50 6,18 1,32
3 Margarina „Delma” 8,00 7,25 0,75
4 Margarina „Holland” 7,50 6,93 0,57
5 Margarina „Wiesana Omega 3 + 6” 8,00 7,69 0,31
6 Margarina „Wiesana Light” 8,00 7,53 0,47
7 Margarina „Fruhstuck” 7,50 7,05 0,45
8 Margarina „Rama Clasic” 8,00 7,82 0,18
9 Margarina „vrac” 5,00 4,12 0,88
IV.2.7. Discuţii
Determinarea vitaminei A din probele de margarină prin metoda
spectrofotometrică Carr-Price a condus la rezultate bune.
Metoda este liniară pentru domeniul de concentraţii 10-150 μg
retinol; valoarea coeficientului de corelaţie R2 este 0,9966. Conţinutul în
vitamină A s-a calculat după formula: y = 0,0042x – 0,0053.
Randamentul de recuperare pentru vitamina A a fost determinat
după îmbogăţirea probelor de margarină „Unirea” şi margarină „vrac” cu
acetat de retinil.
Procentele de regăsire variază între 88,42% - 93,14% pentru probele
de margarină „Unirea” şi, respectiv 85,34% - 89,13% pentru probele de
margarină „vrac”. Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu
cele existente în literatura de specialitate. Astfel, Egbuonu (1986) a raportat,
pentru probe de ficat de porc, procente de recuperare de vitamină A de 93 -
94%, utilizând metoda spectrofotometrică Carr-Price, în cazul în care s-au
adăugat 5μg acetat de retinol la fiecare 1 mL de extract. Media de
recuperare a fost 93,89 cu amestec de solvenţi clorură de metilen și
cloroform.
Evaluarea stabilităţii vitaminei A în margarină pe o perioadă de 60
zile a evidenţiat scăderi cu 6,5% pentru margarina „Unirea” și cu 8,86%
pentru margarina vrac. Se observă o stabilitate mai bună a margarinei
„Unirea” ambalată comparativ cu margarina „vrac” care este supusă acțiunii
factorilor fizico-chimici din mediul înconjurător.
Metoda spectrofotometrică Carr-Price a fost aplicată la determinarea
vitaminei A din probe de margarină. Pentru toate probele analizate valorile
obţinute au fost mai mici comparativ cu conţinutul declarat pe etichetă de
producator.
IV.2.8. Concluzii Metoda spectrofotometrică Carr-Price este liniară pentru domeniul
de concentraţii 10-150 μg retinol.
Valorile obţinute pentru probele de margarină analizate au fost mai
mici comparativ cu conţinutul declarat pe etichetă de producator, ceea ce
confirmă încă o dată instabilitatea vitaminei A în prezenţa luminii şi a
oxigenului din produsele alimentare. Dezavantajul metodei constă în timpul
extrem de scurt în care trebuie realizată citirea, ceea ce necesită viteză mare
de lucru.
Capitolul V. Determinarea HPLC a vitaminei A
din suplimente nutritive
Metodele cromatografice de lichide de înaltă performanţă (HPLC)
utilizate pentru separarea vitaminelor liposolubile sunt folosite încă din
1973. În majoritatea cazurilor, aceste metode folosesc cromatografia de
lichide cu fază inversă pentru determinarea trans-retinolului (Zaman et al.,
1993; Abahusain et al., 1998). Alte lucrări, deasemenea, confirmă precizia
cuantificării carotenoidelor şi retinoizilor prin această metodă (Talwar et
al., 1998; Gueguen et al., 2002; Nikolin et al., 2004; Moren et al., 2005).
Suplimentele alimentare pe bază de vitamină A sunt recomandate şi
administrate în vederea completării necesarului de vitamină A pentru
organism. Înregistrarea şi punerea pe piaţă a suplimentelor alimentare nu
este supusă aceloraşi reglementări ca şi medicamentele. De aceea, în cazul
vitaminei A - micronutrient la care balanţa deficit/exces prezintă limite
foarte înguste, este necesară respectarea concentraţiei pe doza unitară
administrată.
Cercetările experimentale au urmărit două obiective:
Validarea unei metode HPLC de determinare a vitaminei A;
Aplicarea metodei validate pentru determinarea conţinutului în
vitamină A al unor suplimente alimentare de pe piaţa
românească.
V.3. Raport de validare
În cercetările realizate am adaptat metoda HPLC aplicată de către
Bui-Nguyen şi Blanc în determinarea vitaminei A din lapte şi din brânză pe
probe de suplimente alimentare (Bui-Nguyen şi Blanc, 1979).
V.3.3. Liniaritatea (curba de calibrare)
Curba de calibrare a fost liniară în intervalul de concentraţii 0,05 -
10 g/ml. Ecuaţia de regresie liniară obţinută este y = 5368x + 346, cu un
coeficient de corelaţie: r2= 0,9995.
Fig. V.1. Curba de calibrare obţinută pentru soluţii de trans-retinol în amestec
metanol/apă 95:5 (v/v), pentru concentraţii cuprinse între 0,05 şi 10 g/ml.
V.3.4. Selectivitatea
Selectivitatea metodei a fost determinată prin modificări în
compoziţia fazei mobile. Pentru obţinerea unor timpi de retenţie diferiţi (o
bună rezoluţie) au fost testate mai multe amestecuri de solvenţi pentru faza
mobilă. Timpii de retenţie obţinuţi (în minute), pentru mai multe
amestecuri de fază mobilă studiate, sunt prezentaţi în tabelul V.1.
Tabel V.1.Timpii de retenţie obţinuţi (în minute) pentru amestecuri de faza mobilă.
Faza mobilă trans-retinol Retinil acetat
Metanol 2,34 2,52
Metanol/apă (99:1) 3,81 4,19
Metanol/apă (95:5) 4,15 4,70
Metanol/apă (90:10) 4,52 5,22
Metanol/acetonitril/apă (75:20:5) 2,49 2,85
Rezoluţia separării
Folosind ca fază mobilă amestecul metanol/apă (95:5) a fost
determinată rezoluţia separării cromatografice, valoarea obţinută Rs = 1,82
indică o bună separare a celor doi compuşi, fapt ce reiese şi din
cromatograma prezentată în Figura V.3.
Fig. V.3. Cromatograma amestecului de trans-retinol şi retinol acetat (S.I.) pentru
concentraţii de 10 g/ml retinol şi 4 g/ml retinol acetat.
Retenţia relativă s ca o măsură a selectivităţii metodei, are
valoarea medie 1,4 ± 0,2 determinată pentru un număr de trei analize pe trei
concentraţii diferite: 0,5; 2 respectiv 5 g/ml.
V.3.5. Limita de cuantificare Limita de cuantificare a fost determinată prin diluţii repetate ale
soluţiilor etalon, pentru un raport semnal/zgomot (S/N) egal cu trei, a fost
de 20 ng/ml pentru trans-retinol şi de 50 ng/ml pentru retinol acetat (S.I.),
metoda de analiză putând fi folosită pentru determinarea vitaminei A din
probe în care se găseşte în concentraţii foarte mici.
V.4. Determinarea vitaminei A din probe de suplimente nutritive
Dozarea vitaminei A din suplimente nutritive se realizează prin
simpla extracţie a retinolului din produs.
V.4.2. Probele de analizat În cercetările noastre au fost analizate
cinci suplimente alimentare conţinând vitamină A achiziţionate din reţeaua
farmaceutică a oraşului Galaţi:
V.4.5. Separarea vitaminei A din probe Pentru analiza vitaminei A prezentă sub formă de retinil esteri în
suplimente nutritive separarea vitaminei A s-a realizat în două variante:
extracţie în n-hexan şi extracţie în amestec apă - n-hexan (5 : 1) cu 0,05%
2,6-diterţbutil-4-metilfenol.
V.4.6. Rezultate
În Figura V.5. este prezentată cromatograma obţinută pentru retinil
acetat (standard intern) în concentraţie de 5 g/ml (reprezentare plană şi
tridimensională), în condiţiile cromatografice menţionate.
Timpii de retenție pentru determinarea retinolului din produsele
studiate prezintă valoarea medie 4,5082 ± 0,033, determinarea acestuia
bazându-se pe analiza statistică elementară aplicată pe seriile de date
experimentale obținute (Tabel V.2.).
a. b.
Fig. V.5. Cromatograma soluţiei de retinol acetat-standard intern (5 g/ml):
a) reprezentare plană; b) reprezentare tridimensională.
Tabel V.2. Valorile medii ale timpilor de retenție a retinolului și
retinil acetatului în produsele farmaceutice studiate.
Sursa de Vitamină A Valorile medii
tR retinol tR retinol acetat
A 4,413 4,980
B 4,607 5,208
C 4,478 5,070
D 4,490 5,072
E 4,553 5,152
Imaginea cromatografică obţinută pentru Proba A din cele 5
suplimente alimentare analizate este prezentată în figura V.6..
Fig. V.6. Profilul cromatografic HPLC al retinolului și acetatului de retinol din
produsul A: Retinol (tR = 4,413) Acetat de retinol (tR = 4,980).
Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A prin metoda
HPLC din probele de analizat sunt inserate în figura V.11.. S-a constatat că
pentru cele 5 probe de suplimente nutritive nu există diferenţe
semnificative între conţinutul declarat şi valoarea determinată a retinolului
total din suplimentele alimentare studiate.
V.4.7. Discuţii
În urma evaluării experimentale a parametrilor de validare au fost
stabilite condiţiile de lucru care au confirmat validitatea metodei propuse.
Validarea metodei a fost realizată urmărind parametrii: de liniaritate,
selectivitate, rezoluţia separării, retenţia relativă, limita de detecţie.
Curbele de calibrare atât pentru trans-retinol, cât şi pentru retinil
acetat (standardul intern) au fost lineare în intervalul de concentraţii 0,05-
10 μg/ml. Ecuaţia de regresie liniară obţinută este y = 5368x + 346, cu un
coeficient de corelaţie r2 = 0,9995.
Limita de cuantificare găsită pentru un raport semnal/zgomot (S/N)
egal cu trei, a fost de 20 ng/ml pentru trans-retinol şi de 50 ng/ml pentru
retinil acetat. Timpii de retenţie: 4,413 min. pentru trans-retinol şi 5,080
min. pentru retinil acetat au fost obţinuţi după folosirea mai multor
amestecuri de fază mobilă.
1
2
Fig. V.11. Conţinutul în retinol al probelor analizate.
Folosirea metodei HPLC permite măsurarea retinolului liber şi a
esterilor săi, chiar în prezenţa altor componente care pot interfera în
cuantificare. Această metodă poate fi complementară metodei
spectrofotometrice, mai ales prin evitarea metodelor laborioase de
saponificare. Din analiza rezultatelor obţinute la determinarea vitaminei A
din probele de suplimente alimentare luate în studiu nu se constată variaţii
semnificative faţă de concentraţiile declarate. Abaterile procentuale faţă de
concentraţiile declarate variază între 1,25% şi 14,35%. S-a constatat că
pentru două probe (A şi C) există diferenţe semnificative între conţinutul
declarat şi valoarea determinată.
V.4.8. Concluzii Pe baza parametrilor de validare analizaţi se poate concluziona ca
metoda HPLC validată corespunde cerinţelor metodelor HPLC pentru
determinarea principiilor active medicamentoase din medii complexe.
Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A din probele de
suplimente alimentare luate în studiu nu evidenţiază variaţii semnificative
faţă de concentraţiile declarate. Abaterile procentuale variază faţă de
concentraţiile declarate între 1,25% şi 14,35%, valori care se încadrează în
limitele impuse de legislaţia în vigoare
Capitolul VI. Determinarea HPLC a vitaminei A
din probe de ser uman
Vitamina A aparţine grupului de vitamine liposolubile. La om
vitamina A (all-trans-retinolul) este esenţială pentru procesul vederii, în
reproducere, în reglarea sistemului imunitar, pentru dezvoltarea osoasă, în
timpul embriogenezei precum, şi pentru troficitatea mucoaselor și
tegumentelor (Binkley şi Krueger, 2000). Deasemenea s-a publicat ca
aceasta ar avea un rol preventiv în bolile cardiovasculare şi în mai multe
tipuri de cancer (Wolf, 1984; Uni et al., 2000; Fields et al., 2007).
Cercetările experimentale incluse în acest capitol au urmărit:
Validarea unei metode lichid cromatografice (HPLC) cuplată
cu detecţie UV pentru dozarea vitaminei A din sângele uman;
Determinarea concentraţiei plasmatice de vitamină A.
VI.2.1. Design-ul studiului clinic în vederea recoltării probelor
biologice
În derularea cercetării au fost respectate normele generale de
conduită privind necesitățile etice în cercetare la nivel național (Codul
Deontologiei Medicale din 06.06.1997) cât și a Declarației de la Helsinki
(Sommerset West Amendment, 1996) actualizate de Asociația Medicală
Mondială în 1996 și a Convenției asupra drepturilor omului și biomedicină
a Consiliului Europei adoptată în 1996. Pentru fiecare studiu clinic în parte,
protocolul clinic şi analitic al studiului a fost aprobat de către Comitetul de
Etică al Spitalului „Buna Vestire” din Galaţi (Anexa 1). În studiu au fost
incluși 24 voluntari sanătoși (12 femei și 12 bărbați cu vârste cuprinse între
20 și 64 de ani). Cu 48 h înaintea recoltării, voluntarilor nu li s-a permis, să
consume alimente şi băuturi cu conţinut bogat în vitamină A.
VI.2.2.4. Echipamente şi condiţii cromatografice
Analiza cromatografică a fost efectuată cu un cromatograf de
lichide „Thermo Finnigan Surveyor” cu pompă cuaternară şi degazor de
fază mobilă, echipat cu un detector cu reţea de fotodiode (DAD) şi un
sistem de operare Chrom Quest versiunea 4.1.
Separarea a fost realizată folosind o coloană cromatografică cu faze
inverse de tip C18 (Thermo Scientific Hypersil GOLD) cu lungimea de 250
mm, diametrul interior 4,6 mm şi cu grosimea particulelor de fază
staţionară de 5m.
Compuşii au fost eluaţi izocratic la un debit de 1,5 mL/min
folosind ca fază mobilă amestec metanol/apă 95:5 (v/v).
Monitorizarea s-a făcut cu ajutorul detectorului cu reţea de
fotodiode (DAD) atât prin monitorizarea întregului spectru UV, cât și
la lungimea de undă de 325 nm, toate analizele desfăşurându-se la
temperatura camerei.
VI.2.3. Studiul liniarității
Pentru determinarea liniarităţii, au fost preparate 7 soluţii standard
de lucru prin diluţia soluţiei stoc de all-trans-retinol în metanol, la
următoarele concentraţii: 1,88; 1,13; 0,94; 0,565; 0,18; 0,14 ; 0,07 g/mL.
Probele au fost preparate şi analizate cromatografic de trei ori. Pentru
analiza retinolului a fost folosită metoda regresiei liniare.
Curba de calibrare
RETINOL
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
0 0.5 1 1.5 2
conc. microg/ml
S r
eti
no
l
Fig. VI.1. Curba de calibrare obţinută pentru soluţii de all-trans-
retinol în metanol pentru concentraţii cuprinse între 0,07 şi 1,88 g/mL.
Concentrația retinolului din probele necunoscute a fost determinată
prin aplicarea ecuației curbei de regresie liniară la raportul suprafețelor: y =
255,4 + 33967,61x, cu un coeficient de corelare: r2 = 0,9989.
VI.3. Rezultate
În figurile VI.2. - VI.4. sunt prezentate cromatogramele rezultate în
urma analizei unor probe de ser, şi indică peak-urile obţinute pentru retinol
(peak-ul 1) cu tR = 4,200 min, 4,245 min, 4,193 min şi pentru standardul
intern (peak-ul 2) cu tR = 5,328 min, 5,380 min, 5,313 min, în condițiile
cromatografice utilizate în acest studiu.
Fig. VI.3. Cromatograma unei probei după injecţia a 20 μg de extract ser
şi standard intern (Pacientul nr. 2).
Metoda a fost aplicată pentru analiza cantitativă a retinolului
din sângele uman.
VI.4. Discuţii
Limita de detecție și limita de cuantificare, sunt suficient de mici
pentru a evidenția cele mai mici concentraţii de retinol prezente în sânge.
Datele prezentate sunt din analiza a 24 de subiecţi, 12 femei şi 12
bărbaţi, cu vârste cuprinse între 20 de ani şi 64 de ani. Concentraţiile pentru
all-trans-retinol au fost cuprinse între 0,509 μg/mL şi 1,580 μg/mL.
Intervalele pentru all-trans-retinol sunt în acord cu valorile de referinţă
recomandate pentru populaţia din România (0,600 – 1600 μg/mL).
Există mici diferențe între rezultatele obținute noi şi rezultatele
publicate de diverși autori și. Astfel, intervalele de concentraţii raportate
într-un studiu cu 221 de participanţi: 0,34 – 1,18 μg/mL (Siluk et al., 2007).
Deasemenea, intervalele de concentraţii raportate (0,24 – 1,28 μg/mL) în
studiul NHANES III pe populaţie din Statele Unite (NHANES, 2006), sunt
nesemnificativ diferite de rezultatele obţinute în acest studiu.
Distribuţia concentraţiilor de all-trans-retinol în ser a voluntarilor
participanţi la studiu sunt prezentate în Fig. VI.8.
Valorile statistice descriptive relevă o distribuție normală a
valorilor retinolului seric la subiecții de sex feminin și masculin luați în
1
2
studiu. Aceasta se evidențiază prin valorile indicilor Skewness și Kurtosis
mai mici de ±1,39, avand o valoare medie de 0,79 µg/mL pentru sexul
feminin și de 1 pentru sexul masculin.
Fig. VI.8. Distribuţia frecvențelor concentraţiilor de retinol în ser a lotului
luat în studiu.
VI.5. Concluzii
Curba de calibrare demonstrează o foarte bună liniaritate exprimată
prin coeficientul de corelare pentru întreg domeniul de concentrații de
interes clinic.
Utilizarea detectorului cu rețea de fotodiode permite obținerea unei
purități a peak-ului cromatografic necesară analizei. Selectivitatea obținută
prin modificarea lungimii de undă către maximul de absorbție al analitului
este esențială pentru o corectă determinare cantitativă a analitului.
Limita de detecție obținută a fost de 30 ng/ml, iar limita de
cuantificare a fost de 100 ng/ml. Aceste limite sunt suficient de mici pentru
determinarea cantitativă a celor mai mici concentraţii de retinol prezente în
sânge.
Metoda HPLC prezentată pentru determinarea retinolului în sânge
este precisă, exactă, selectivă, sensibilă şi reproductibilă. Metoda poate fi
aplicată în studiile clinice pentru investigarea retinolului în sânge.
Concentrația sanguină a retinolului nu s-a apropiat de nivelurile
toxice (1800 μg/mL). Nivelurile mai mari de retinol se datorează probabil
consumului excesiv de suplimente alimentare pe bază de retinol.
Capitolul VII. Farmacocinetica retinolului administrat
pe cale orală la femei
VII.1. Introducere
Farmacocinetica studiază viteza proceselor de absorbţie, distribuţie,
metabolizare şi excreţie a substanţelor medicamentoase şi a metaboliţilor
lor, precum şi a răspunsului farmacologic, terapeutic sau toxic, la animale
sau om.Pentru a descrie procesele cinetice pe care le suferă substanţa
medicamentoasă în organism, farmacocinetica utilizează noţiunile de model
farmacocinetic şi compartiment. Acestea sunt alese astfel încât să existe o
bună concordanţă între datele experimentale şi ecuaţiile matematice care
descriu modelul ales.
O condiţie esenţială pentru realizarea unei analize farmacocinetice
o constituie posibilitatea dozării substanţei medicamentoase în lichidele
biologice. Dificultăţile care apar la dozare constau în faptul ca în general
concentraţiile terapeutice ale celor mai multe substanţe active sunt mici, de
ordinul nanogramelor sau zecilor de nanograme şi în faptul că lichidele
biologice reprezintă matrici complexe de compuşi endogeni de care trebuie
separat compusul activ. Tehnicile analitice actuale (cromatografia de
lichide de înalta performanţă, cromatografia de gaze, electroforeza capilară)
permit dozarea cu mare acurateţe a substanţelor medicamentoase utilizate
în terapie.
În cadrul acestui capitol va fi studiată farmacocinetica retinolului
după administrarea pe cale orală a unei doze unice la femei sănătoase, unele
dintre ele gravide.
VII.2. Studiu clinic realizat
Pentru studiul farmacocineticii retinolului administrat în doză unică
pe cale orală la femei a fost realizat un studiu clinic „Studiul farmacocinetic
al vitaminei A administrată individual sau în asocieri similare celor din
suplimentele nutritive”, aprobat de către Comitetul de Etică al Spitalului
„Buna Vestire” din Galaţi (Anexa 1). Studiul farmacocinetic a fost realizat
prin injectarea unor voluntari sănătoși, conform protocolului de desfăşurare
a studiului, a unei doze unice de vitamină A și colectarea probelor de
sânge la intervale de timp bine stabilite.
VII.3. Subiecţi
În studiu au fost incluşi 12 voluntari sănătoşi, femei cu vârste
cuprinse între 22 şi 63 ani. S-au constituit doua loturi de voluntari: lotul
martor, femei la care s-a administrat vitamina A în doză unică de 100.000
U.I. (Vitamina A forte, capsule 50.000 U.I., S.C. Biofarm S.A., Bucureşti)
şi lotul cu femei gravide la care s-a administrat vitamina A în doză unică de
3.600 U.I. (Elevit Pronatal, comprimate filmate, Bayer S.R.L.). Subiecţii au
primit şi semnat câte un formular de consimţământ informat (Anexa 3) cu
privire la scopul studiului şi eventualele riscuri care pot apărea. După
semnarea formularului de consimţămât, subiecţilor li s-au prelevat probele
de sânge conform protocolului.
VII.5. Metoda analitică
Metoda analitică utilizată pentru determinarea concentraţiilor
plasmatice ale retinolului este metoda HPLC, validată în Capitolul VI.
VII.7. Analiza farmacocinetică noncompartimentală
Aceasta metodă de analiză îşi propune estimarea unor parametri
farmacocinetici ai substanţei medicamentoase pe baza datelor
experimentale, fără a face însă nici o presupunere referitoare la existenta
unui model matematic care să descrie cinetica substanţei respective în
organism. Valorile medii ale parametrilor farmacocinetici ai retinolului in
functie de starea de graviditate sunt prezentate în Tabelele VII.7 - VII.8.
Tabel VII.7. Valorile medii ale parametrilor farmacocinetici ai retinolului
administrat la femei non-gravide.
Parametru Media
aritmetică DS Min. Mediana Max. CV%
Media
geometrică
ASCall
(h·g/mL) 158,8 89,11 49,16 169,4 267,2 56,11 133,3
ASClast
(h·μg/mL) 158,8 89,11 49,16 169,4 267,2 56,11 133,3
Cl_F_obs
(mL/h) 26,08 10,77 16,03 21,63 46,13 41,31 24,56
Cmax
(μg/mL) 1,449 0,3661 0,9070 1,591 1,882 25,26 1,406
HL_Lambda
_z (h) 304,5 109,9 133,3 319,0 428,9 36,07 284,3
Lambda_z
(1/h) 0,002657 0,001343 0,001616 0,002183 0,005202 50,52 0,002438
Tmax (h) 38,00 22,02 12,00 36,00 72,00 57,94 32,35
Vz_F_obs
(L) 10390 2885 7063 9305 14670 27,77 10070
Tabel VII.8. Valorile medii ale parametrilor farmacocinetici ai retinolului
administrat la femei gravide.
Parametru Media
aritmetică DS Min. Mediana Max. CV%
Media
geometrică
ASCall
(h·μg/ml) 139,3 57,08 77,46 123,8 210,4 40,98 129,9
ASClast
(h·μg/ml) 139,3 57,08 77,46 123,8 210,4 40,98 129,9
Cl_F_obs
(mL/h) 48,07 34,32 13,55 36,16 104,2 71,39 38,58
Cmax
(μg/ml) 1,129 0,3138 0,7140 1,168 1,444 27,79 1,090
HL_Lambda
_z (h) 259,3 140,1 72,69 246,4 493,9 54,04 223,9
Lambda_z
(1/h) 0,003754 0,002933 0,001403 0,002821 0,009536 78,14 0,003096
Tmax (h) 42,00 33,51 6,000 48,00 72,00 79,80 26,19
Vz_F_obs
(L) 13020 4403 9008 11330 20070 33,81 12460
VII.8. Concluzii
A fost realizată analiza farmacocinetică a concentraţiilor plasmatice
ale retinolului obţinute în urma unui studiu clinic în care s-a administrat
3.600 U.I. palmitat de retinol la femei gravide şi 100.000 U.I. palmitat de
retinol la femei non-gravide.
În prima parte a analizei datelor obţinute a fost aplicată analiza
farmacocinetică noncompartimentală. Au fost calculate valorile
parametrilor farmacocinetici Cmax, Tmax, ASClast, ASCall, Lambda_z
(constanta de viteza a eliminarii), t½, Cl aparent şi Vd aparent. Valorile
parametrilor farmacocinetici au fost comparate în funcţie de factorul
fiziologic graviditate, negăsindu-se diferenţe statistic semnificative între
parametri.
Capitolul VIII. Evoluţia unor parametri biochimici după
administrarea orală de vitamină A
VIII.1. Introducere
Efectele toxicitaăţii acute și cronice a vitaminei A sunt bine
documentate în literatura de specialitate. Dovezi emergente sugerează că
subtoxicitatea fără semne clinice de toxicitate, poate fi o preocupare tot mai
mare, pentru că aportul din surse de vitamina A preformată depășește de
multe ori doza zilnică recomandată (DZR) pentru adulți, în special în țările
dezvoltate (Fletcher şi Fairfield, 2002). Osteoporoza şi fractura de şold sunt
asociate cu aportul de vitamina A preformată, care sunt doar de două ori
mai mari decât DZR. Evaluarea statusului vitaminei A la persoane cu
subtoxicitate sau toxicitate este complicată, deoarece concentrațiile serice
de retinol sunt indicatori nonspecifici, în acest interval interferând rezervele
de vitamina A din ficat.
În acest capitol cercetările experimentale au urmărit:
Evoluţia unor parametri biochimici la om, după administrarea
orală în doză unică a 100.000 U.I. de vitamină A;
Corelarea statistică a dinamicii parametrilor biochimici cu
concentraţiile serice de vitamină A dupa adminsitrarea orală a
unei doze unice de 100.000 U.I. de vitamină A.
VIII.2. Materiale şi metode
Protocol experimental
Recoltarea probelor de sânge s-a efectuat cu consimțământul
informat al pacienților conform Convenției Internaționale a Națiunilor
Unite. Studiul efectuat a ținut cont de prevederile Conferinței Internaționale
de Armonizare susținută de autoritățile competente în domeniul
medicamentului precum și de ghidurile etice internaționale pentru
cercetarea biomedicală pe subiecți umani revizuită în 1993, 2001 și 2002.
Toți subiecții și-au dat consimțământul pentru participare după ce au fost
informați cu privire la scopul și posibilele riscuri ale acestui studiu. Probele
de sânge (3 mL, puncţie venoasă) au fost recoltate dimineaţa pe nemâncate
(8.00 - 9.00) la Spitalul de Obstetrică şi Ginecologie „Buna Vestire” din
Galaţi, în vacutainere fără anticoagulant şi prelucrate în laboratorul de
analize medicale din cadrul spitalului.
Subiecţi
În studiu au fost incluşi 19 voluntari sănătoşi, 11 femei şi 8 bărbaţi,
cu vârste cuprinse între 22 şi 63 ani. Înainte cu 48 h de începerea studiului
şi pe toată perioada studiului, voluntarilor nu li s-a permis, să consume
alimente şi băuturi cu conţinut bogat în vitamină A. Imediat după
prelevarea primei probe de sânge (proba blank) subiecţilor li s-a administrat
pe cale orală, 100.000 U.I. palmitat de retinol în doză unică (Vitamina A
forte, cps. 50.000 U.I., S.C. Biofarm S.A., Bucureşti). În continuare au fost
prelevate probe la 24h, 72h şi 168h după administrarea vitaminei A.
Investigaţii biochimice
După recoltare, probele de sânge destinate determinărilor
biochimice au fost centrifugate timp de 10 minute la 4.000 rot./min cu o
centrifugă EBA 20 Hettich Zentrifugen.
Serul obţinut a fost supus imediat determinărilor biochimice care s-
au realizat prin metode spectrofotometrice standardizate folosind
microslide-uri VITROS, şi au urmărit evoluţia activităţii următorilor
parametri biochimici: ALAT/TGP; ASAT/TGO; GGT; fosfataza alcalină;
proteine totale; bilirubină totală, direct şi indirectă; cholesterol şi
triglyceride. Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi de
experimentul realizat s-au efectuat la analizorul automat VITROS 250 -
biochimie uscată.Toate rezultatele prezentate reprezintă media a 3
determinări.
VIII.5. Discuţii
Pe baza rezultatelor obţinute a fost evaluată dinamica valorilor
parametrilor biochimici determinaţi (Fig. VIII.23-27.).
Dinamica valorilor transaminazelor serice (TGP, TGO) relevă o
creștere marcantă după 24 de ore în cazul TGO și după 72 h pentru TGP.
Aproape de 168 h valorile transaminazelor încep să scadă.
Dacă valorile GGT și Proteinele totale rămân constante, valorile fosfatazei
alcaline marchează o creștere după 24 de ore de la administrarea a 100.000
U.I. de vitamină A.
Dacă bilirubina totală și cea indirectă creșterea este remarcată ușor
în intervalul 24 - 72 h urmată de scăderea valorilor, pentru bilirubina
directă se constată o creștere cu 66 % după 24 de ore de la administrare
atingând un maxim la 168 h. Retinolul este conjugat cu acidul glucuronic
după care compusul conjugat intră în circuitul enterohepatic și este oxidat
la acid retinoic.
Valorile serice ale trigliceridelor înregistrează o reducere de
aproximativ 13% și o creștere cu 13% a valorilor colesterolului după 72 h
de la administrarea vitaminei A pe cale orală. În prezența vitaminei A,
concentrația serică a celor doi parametri sunt în relație de inversă
proporționalitate.
Fig. VIII.23-27. Dinamica valorilor medii a parametrilor biochimici timp de 168 h
după administrarea a 100.000U.I. vitamină A: (a) ALAT/TGP și ASAT/TGO; (b)
trigliceride și colesterol; (c) bilirubina totala, directă și indirectă; (d) GGT, proteine
totale și fosfataza alcalină.
Studiul statistic corelațional al dependenței dintre valorile serice
ale retinolului și unii parametri biochimici
Cu reazultatele obținute s-a realizat o corelație statistică între
dinamica concentrației serice de retinol după administrarea de vitamină A
și dinamica parametrilor biochimici serici, determinând modul în care
retinolul influențează procesele biochimice de la nivel celular. Valorile
b
d
a
.
b
.
c
. d
.
numerice ale acestor parametri pe baza cărora s-a realizat studiul
corelațional sunt prezentate în tabelul VIII.11.
Tabel VIII. 11.Valorile parametrilor biochimici și concentraţiile retinolului seric
determinate prin analiza HPLC.
Valorile medii Control 24 h 3 zile 7 zile
Nivelul retinolului seric determinat prin HPLC
Concentrația retiolului serc, μg/mL 0,861 1,169 1,177 0,964
Parametri biochimici
ALAT, U/L 27,00 29,20 34,40 26,60
ASAT, U/L 23,00 32,60 27,80 24,40
Colesterol, mg/dL 176,80 171,60 194,20 191,20
Trigliceride, mg/dL 172,20 113,60 102,20 86,00
Bilirubină totală, mg/dL 0,800 0,994 0,814 0,670
Bilirubină directă, mg/dL 0,184 0,304 0,144 0,202
Bilirubină indirectă, mg/dL 0,618 0,654 0,666 0,466
GGT, U/L 27,20 28,.80 24,40 23,00
Fosfatază alcalină, U/L 79,80 91,80 72,20 76,00
Proteine totale, g/100 mL 7,66 7,48 7,40 7,46
Fig. VIII.38. Repartiţia coeficienţilor de corelaţie Pearson a parametrilor
biochimici studiaţi.
Conform interpretării coeficientului Pearson am obţinut, corelații
puternice avem pentru transaminaze (TGP, TGO) și proteine totale,
moderate pentru trigliceride, bilirubină totală și indirectă și slabă pentru
bilirubină directă. Pentru restul parametrilor biochimici analizați nu avem
nici o corelație cu valorile concentrațiilor serice de retinol (Fig. VIII.38.).
VIII.6. Concluzii
Pe baza studiului diferenţiat pe criterii de sex, vârstă, înălţime şi
greutate, a evoluţiei parametrilor biochimici TGP, TGO, GGT, fosfatază
alcalină, proteine totale, bilirubină totală (directă şi indirectă), colesterol si
trigliceride, după administrarea orală în doză unică a 100.000 U.I. vitamină
A, a fost evaluată dinamica valorilor obţinute pentru aceşti parametri. În
aceste condiţii experimentale, s-a constatat faptul că dinamica valorile
transaminazelor serice (TGP, TGO) relevă o creștere marcantă, atât după
24 de ore în cazul TGO (27,60 U/L), cât și după 72 h pentru TGP (27,24
U/L). Dupa 168 h valorile transaminazelor încep să scadă. Dacă valorile
GGT și Proteinele Totale rămân constante, valorile fosfatazei alcaline
marchează o creștere după 24 de ore de la administrarea a 100.000 U.I. de
vitamină A. În ceea ce priveste bilirubina totală și cea indirectă, se remarcă
o uşoară creștere în intervalul 24-72 h, urmată de scăderea valorilor acestor
parametri, în timp ce pentru bilirubina directă se constată o creștere cu 66
% după 24 de ore de la administrare, valoarea acestui parametru atingând
un maxim la 168 h. Valorile serice ale trigliceridelor înregistrează o
reducere de aproximativ 13% și o creștere cu 13% a valorilor
colesterolului după 72 h de la administrarea vitaminei A pe cale orală. În
prezența vitaminei A, concentrația serică a celor doi parametri sunt în
relație de inversă proporționalitate.
Pe baza rezultatelor obţinute a fost realizat şi un studiu statistic
corelaţional între concentraţiile serice de retinol, după administrarea dozei
unice de vitamină A, şi parametrii biochimici menţionaţi (TGP, TGO,
GGT, fosfataza alcalină, proteine totale, bilirubina totală directă şi
indirectă, colesterol şi trigliceride). Conform interpretărilor coeficientului
Pearson, s-au observat corelații puternice pentru transaminazele (TGP,
TGO) și proteinele totale, în timp ce pentru trigliceride, bilirubină totală și
indirectă corelaţiile sunt moderate. În ceea ce priveşte bilirubina directă,
corelaţia conform interpretărilor coeficientului Pearson este slabă. Pentru
restul parametrilor biochimici analizați (GGT, fosfatază alcalină, colesterol)
nu avem nici o corelație cu concentrația de retinol seric.
CONCLUZII GENERALE
Cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat au permis atingerea
obiectivelor fixate corespunzătoare fiecărui capitol din Partea
Experimentală şi formularea unor concluzii generale, care au condus la
finalizarea tezei de doctorat conform obiectivelor propuse, după cum
urmează:
A fost efectuat un studiu experimental privind determinarea
conţinutului în vitamină A prin metoda spectrofotometrică Carr-
Price din diferite sorturi de margarină şi evaluarea stabilităţii
chimice a acesteia (Cap. IV). Valorile obţinute pentru probele de
margarină analizate au fost mai mici comparativ cu conţinutul
declarat pe etichetă de producător, ceea ce confirmă încă o dată
instabilitatea vitaminei A în prezenţa luminii şi a oxigenului din
produsele alimentare.
Studiul privind validarea unei metode cromatografice (HPLC)
cuplată cu detecţie UV adaptatată dozării vitaminei A (Cap. V), a
permis dezvoltarea unei metode rapide şi exacte de determinare a
vitaminei A din suplimentele nutritive.
Validarea metodei a fost realizată pe un cromatograf de lichide de
tip Thermo Finnigan Surveyor cu pompă cuaternară şi degazor de
fază mobilă cu detector cu reţea de fotodiode (DAD), prevăzut cu
un sistem de operare Chrom Quest versiunea 4.1. şi o coloană
Hypersil GOLD (Thermo Scientific) cu lungimea de 250 mm,
diametrul 4,6 mm şi mărimea particulelor 5m (250 mm x 4,6 mm
I.D. particle size 5 m). Au fost urmăriţi parametrii de liniaritate,
selectivitate, rezoluţia separării, retenţia relativă, limita de
cuantificare şi au fost stabilite urmatoarele condiţii de lucru pentru
determinarea HPLC a vitaminei A: faza mobilă utilizată
corespunde unui amestec metanol-apă (95 : 5, v/v), cu un debit de
1,5 mL/min, detecţia fiind de 325 nm, volumul de probă de injectat
corespunde valorii de 20 l, iar timpul de analiză este 10
min/probă. În condiţiile cromatografice descrise mai sus, curbele de
calibrare atât pentru trans-retinol, cât şi pentru retinil acetat
(standardul intern) au fost lineare în intervalul de concentraţii 0,05
- 10 μg/ml. De asemenea, limita de cuantificare determinată pentru
un raport semnal/zgomot (S/N) egal cu trei, a fost de 20 ng/ml
pentru trans-retinol şi de 50 ng/ml pentru retinil acetat. Timpii de
retenţie obţinuţi după testarea mai multor amestecuri de fază
mobilă, au fost de 4 min. pentru retinol şi de 5 min. pentru retinil
acetat.
Metoda de lucru astfel validată a putut fi aplicată în vederea
determinării conţinutului de vitamină A din unele suplimente
alimentare de pe piaţa românească, după extracţia lichid - lichid a
probelor în amestec apa : n-hexan (5:1) (utilizat ca solvent), in
prezenţă de 0,05% 2,6-diterţbutil-4-metilfenol, ca antioxidant.
Analiza parametrilor de validare arată că metoda validată
corespunde cerinţelor metodelor HPLC pentru determinarea
principiilor active medicamentoase din mediile complexe.
Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A din probele de
suplimente alimentare luate în studiu nu evidenţiază variaţii
semnificative faţă de concentraţiile declarate. Abaterile procentuale
variază faţă de concentraţiile declarate între 1,25% şi 14,35%.
Determinarea concentraţiei plasmatice de vitamină A din sânge
prin metoda HPLC (Cap. VI) a permis determinarea cantitativă a
retinolului seric. Curba de calibrare a fost obţinută pentru domeniul
de concentrații 0,07 şi 1,88 g/mL. Ecuația de regresie liniară
(y=255,4+33967,61x) și coeficientul de corelare (r2=0,9989)
demonstrează o liniaritate bună. Concentraţiile serice pentru all-
trans-retinol se situează între 0,509 μg/mL şi 1,580 μg/mL, fiind în
acord cu valorile de referinţă recomandate pentru populaţia din
România. Valorile statistice descriptive relevă o distribuție normală
a valorilor retinolului seric la subiecții de sex feminin și masculin
luați în studiu.
Studierea din punct de vedere farmacocinetic a retinolului după
administrarea orală a unei doze unice de vitamină A pe doua loturi
de femei sănătoase: gravide şi non-gravide (Cap. VII) a permis
determinarea valorilor parametrilor farmacocinetici Cmax, Tmax,
ASClast, ASCall, Lambda_z (constanta de viteza a eliminarii), t½, Cl
aparent şi Vd aparent. Valorile parametrilor farmacocinetici au fost
comparate în funcţie de factorul fiziologic graviditate, negăsindu-se
diferenţe statistic semnificative între parametri.
Pe baza studiului diferentiat pe criterii de sex, vârstă, înălţime şi
greutate, a evoluţiei parametrilor biochimici TGP, TGO, GGT,
fosfatază alcalină, proteine totale, bilirubină totală (directă şi
indirectă), colesterol şi trigliceride, după administrarea orală în
doză unică a 100.000 U.I. vitamină A (Cap. VIII), a fost evaluată
dinamica valorilor obţinute pentru aceşti parametri. În aceste
condiţii experimentale, s-a constatat faptul că dinamica valorile
transaminazelor serice (TGP, TGO) relevă o creștere marcantă, atât
după 24 de ore în cazul TGO (27,60 U/L), cât și după 72 h pentru
TGP (27,24 U/L). După 168 h valorile transaminazelor încep să
scadă. Dacă valorile GGT și Proteinele Totale rămân constante,
valorile fosfatazei alcaline marchează o creștere după 24 de ore de
la administrarea a 100.000 U.I. de vitamină A. În ceea ce priveşte
bilirubina totală și cea indirectă, se remarcă o uşoară creștere în
intervalul 24 - 72 h, urmată de scăderea valorilor acestor parametri,
în timp ce pentru bilirubina directă se constată o creștere cu 66 %
după 24 de ore de la administrare, valoarea acestui parametru
atingând un maxim la 168 h. Valorile serice ale trigliceridelor
înregistrează o reducere de aproximativ 13% și o creștere cu 13% a
valorilor colesterolului după 72 h de la administrarea vitaminei A
pe cale orală. În prezența vitaminei A, concentrația serică a celor
doi parametri sunt în relație de inversă proporționalitate.
Pe baza rezultatelor obţinute a fost realizat şi un studiu statistic
corelaţional între concentraţiile serice de retinol, după
administrarea dozei unice de vitamină A, şi parametrii biochimici
menţionaţi (TGP, TGO, GGT, fosfatază alcalină, proteine totale,
bilirubină totală directă şi indirectă, colesterol şi trigliceride).
Conform interpretărilor coeficientului Pearson, s-au observat
corelații puternice pentru transaminazele (TGP, TGO) și proteinele
totale, în timp ce pentru trigliceride, bilirubină totală și indirectă
corelaţiile sunt moderate. În ceea ce priveşte bilirubina directă,
corelaţia conform interpretărilor coeficientului Pearson este slabă.
Pentru restul parametrilor biochimici analizați (GGT, fosfatază
alcalină, colesterol) nu avem nici o corelație cu concentrația de
retinol seric.
Originalitatea tezei constă în abordarea complexă a posibilităţilor
de determinare a vitaminei A din produse alimentare, suplimente
alimentare şi lichide biologice (sânge uman), de prelucrare
statistică şi de corelare a parametrilor analizaţi. Tehnicile de
cercetare sunt moderne şi performante, în concordanţă cu
dezvoltările ştiinţifice contemporane. Rezultatele cercetărilor
prezintă un interes deosebit pentru domeniul alimentaţiei şi pentru
sănătatea populaţiei în România.
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Consumul excesiv şi neavizat de către specialişti de suplimente
alimentare pe bază de vitamină A reprezintă un subiect sensibil de sănătate
publică. Rezultatele evaluarii acestui micronutrient, la care balanţa
deficit/exces se afla în limite foarte înguste, arată necesitatea reevaluării
periodice a aportului nutriţional al populaţiei.
Astfel, se justifică necesitatea continuării studiilor în următoarele
direcţii:
- Identificarea nutrienţilor critici pentru populaţie;
- Cartografierea deficitului datorat neacoperirii nevoilor zilnice
de vitamină A, şi respectiv depăşirii limitelor maxime tolerate;
- Stabilirea unor strategii de combatere pe termen lung, atât a
deficitului de vitamină A, cât şi a excesului acesteia;
- Metodele validate pot fi aplicate pentru extinderea studiilor
clinice de farmacocinetică a retinolului şi a derivaţilor acestuia;
- Continuarea studiilor de farmacocinetică a vitaminei A din
suplimentele nutritive autorizate în România, fapt ce contribuie
la optimizarea standardizării formelor farmaceutice
(concentraţii, asocieri posibile, incompatibilităţi), administrării
şi biodisponibilităţii principiilor nutritive.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
Álvarez R, Vaz B, Gronemeyer H, de Lera AR. Functions. Therapeutic
Applications, and Synthesis of Retinoids and Carotenoids. Chem Rev
2014; 114(1): 1-125.
Amoussa Hounkpatin WBA. Evaluation du potentiel de couverture des
besoins en vitamine A des jeunes enfants à partir des sauces
accompagnant les aliments de base consommés au Bénin. Université
Montpellier 2 (FRA), 2011.
Binkley N, Krueger D. Hypervitaminosis A and bone. Nutr Rev 2000; 58:
138-144.
Carr FH şi Price EA. Colour Reactions Attributed to Vitamin A. J Biochem
1926; 20(3): 497-501.
Carrière I, Delcourt C, Lacroux A, Gerber M. Nutrient intake in an elderly
population in southern France (POLANUT): deficiency in some
vitamins, minerals and omega-3 PUFA. Int J Vitam Nutr Res 2007;
77(1): 57-65.
Chaimongkol L, Pinkaew S, Furr HC et al. Performance of the CRAFTi
portable fluorometer comparing with the HPLC method for
determining serum retinol. Clinical Biochemistry 2011; 44: 1030-
1032.
Chen Y, Okano K, Maeda T et al. Mechanism of all-trans-retinal toxicity
with implications for stargardt disease and age-related macular
degeneration. J Biol Chem 2012; 287(7): 5059-5069.
Ching S, Ingram D, Hahnel R et al. Serum levels of micronutrients,
antioxidants and total antioxidant status predict risk of breast cancer
in a case control study. J Nutr 2002; 132(2): 303-306.
Dufour DR, Lott JA, Nolte FS et al. Diagnosis and Monitoring of Hepatic
Injury. I. Performance Characteristics of Laboratory Tests. Clin
Chem 2000; 46(12): 2027-2049.
Food and Nutrition Board. Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes
for Vitamin A, Vitamin K, Arsenic, Boron, Chromium, Copper,
Iodine, Iron, Manganese, Molybdenum, Nickel, Silicon, Vanadium,
and Zinc. Washington DC: National Academy Press, 2001.
Gamache PH, Freeto SM, Acworth IN. Coulometric array HPLC analysis
of lipid soluble vitamins and antioxidants. Am Clin Lab 1999; 6:18-
19.
Goodman AB. Retinoid receptors, transporters, and metabolizers as
therapeutic targets in late onset Alzheimer disease. J Cell Phys 2006;
209: 598-603.
Hao Z, Parker B, Knapp M, Yu L. Simultaneous quantification of alpha-
tocopherol and four major carotenoids in botanical materials by
normal phase liquid chromatography-atmospheric pressure chemical
ionization-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2005;
1094(1-2): 83-90.
Harrison EH. Mechanisms of digestion and absorption of dietary vitamin
A. Annu Rev Nutr 2005; 25: 87-103.
Kane MA, Folias AE, Napoli JL. HPLC/UV quantitation of retinal, retinol,
and retinyl esters in serum and tissues. Anal Biochem 2008; 378: 71-
79.
Khan A, Khan MI, Iqbala Z et al. An optimized and validated RP-
HPLC/UV detection method for simultaneous determination of all-
trans-Retinol (Vitamin A) and α-Tocopherol (Vitamin E) in human
serum: Comparison of different particulate reversed-phase HPLC
columns. J Chromatogr B 2010; 878: 2339-2347.
Lothar Thomas. Enzymes. In: Clinical laboratory diagnostics: use and
assessment of clinical laboratory results. 1ed. Frankfurt/Main,
Germany: TH-Books Verl., 1998, 80-85.
NHANES III Study - Centers for Disease Control and Prevention,
Inorganic Toxicology and Nutrition Branch, Division of Laboratory
Sciences, National Center for Environmental Health, Laboratory
Procedure Manual, Fat Soluble Micronutrients (Vitamins A, E, and
Carotenoids).
OMS - World Health Organization. Indicators for assessing Vitamin A
Deficiency and their application in monitoring and evaluating
intervention programs. Geneva: WHO, 1996.
Ordinul nr. 1069 din 19/06/2007 pentru aprobarea Normelor privind
suplimentele alimentare.
Siluk D, Oliveira RV, Esther-Rodriguez R M et al. A validated liquid
chromatography method for the simultaneous determination of
vitamins A and E in human plasma. J Pharm Biomed Anal 2007;
44(4): 1001-1007.
Wolf G. The enzymatic cleavage of β-carotene: still controversial. Nutr Rev
1995; 53: 134-137.
Zhang X, Chen K, Ping Q et al. Effect of biscuits fortifed with different
doses of vitamin A on indices of vitamin A status, haemoglobin and
physical growth levels of pre-school children in Chongqing. Public
Health Nutr 2010; 13(9): 1462-1471.
ANEXA 4. LISTA DE ARTICOLE PUBLICATE DIN TEMATICA
TEZEI DE DOCTORAT
Articole ştiinţifice publicate în reviste cotate ISI
1. Elena Lăcrămioara Patriche (Lisă), Octavian Croitoru, Gigi
Coman, Dana Tutunaru, Claudia Simona Ştefan, Rodica Cuciureanu;
Validation of HPLC method for determination of retinol in different dietary
supplements; lucrare acceptată pentru publicare în revista Romanian
Biotechnological Letter Factor de Impact 2012: 0,363.
Articole ştiinţifice publicate în reviste cotate B+ (BDI)
1. Elena Lăcrămioara Patriche (Lisă), Octavian Croitoru, Gigi
Coman, Dana Tutunaru, Claudia Simona Ştefan, Rodica Cuciureanu –
Pharmacokinetic evaluation of serum retinol concentrations correlated with
biochemical parameters on healthy subjects. Analele Universităţii
„Dunărea De Jos” Galaţi, Medicină, Fascicula XVII 2014; 1: 35-41.
Participări la Manifestări Ştiinţifice Naţionale:
1. Croitoru O., Buteică A.S., Lisă E.L.: Analiza vitaminei A prin
cromatografie de lichide şi detecţie cu reţea de diode. Poster. Simpozionul
Actualităţi şi perspective în cercetarea farmaceutică, Craiova, 26-28
septembrie 2012. Rezumat publicat în volumul de rezumate al
simpozionului, ISBN 978-606-11-2833-4, 62.
2. Patriche (Lisă) E.L., Cuciureanu R.: L’évaluation de la
stabilite de la vitamine a dans les aliments. Poster. Septième Colloque
Franco-Roumain de Chimie Appliquée – COFrRoCA 2012, 27-29 iunie
2012, Bacău, România. Rezumat publicat în volumul de rezumate al
simpozionului, ISSN 2068-6382, 107.
3. Lisă E.L.: Dietoterapia deficienţelor vitaminice – Hipo-
vitaminoza A. Comunicare orală. A XV -a reuniune naţională de istoria
farmaciei, Galaţi, 18-20 iunie 2009. Rezumat publicat în volumul de
rezumate al simpozionului, ISBN 978-973-8932-44-9, 37.
4. Lisă E. L., Cuciureanu R.: Suplimente alimentare - Surse de
vitamine liposolubile pentru organism. Poster. Conferinţa Naţională de
Fitoterapie, ed. a-IV-a, Iaşi, 14-16 mai 2008. Rezumat publicat în volumul
de rezumate al simpozionului.