1

TÜRKİYE CUMHURİYETİ

A�KARA Ü�İVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

AKUT GASTROE�TERİTİ OLA� 5 YAŞ ALTI ÇOCUKLARDA

ROTAVİRÜS SUŞLARI�I� PCR İLE TİPLE�DİRİLMESİ VE

BELİRLE�E� TİPLERİ� KLİ�İK AĞIRLIK DERECESİ İLE

İLİŞKİSİ

Dr. Anıl AKTAŞ TAPISIZ

ÇOCUK E�FEKSİYO� HASTALIKLARI BİLİM DALI

YA�DAL UZMA�LIK TEZİ

Tez Danışmanı

Prof Dr. Ülker DOĞRU

A�KARA 2010

2

TÜRKİYE CUMHURİYETİ

A�KARA Ü�İVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

AKUT GASTROE�TERİTİ OLA� 5 YAŞ ALTI ÇOCUKLARDA

ROTAVİRÜS SUŞLARI�I� PCR İLE TİPLE�DİRİLMESİ VE

BELİRLE�E� TİPLERİ� KLİ�İK AĞIRLIK DERECESİ İLE

İLİŞKİSİ

Dr. Anıl AKTAŞ TAPISIZ

ÇOCUK E�FEKSİYO� HASTALIKLARI BİLİM DALI

YA�DAL UZMA�LIK TEZİ

Tez Danışmanı

Prof Dr. Ülker DOĞRU

Bu tez Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından

2008 08 09 264 proje numarası ile desteklenmiştir

A�KARA 2010

ii

Ö�SÖZ

Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları yandal eğitimim süresince bilgi ve tecrübeleri

ile bana yol gösteren, tüm hayatım boyunca daima örnek alacağım, tez danışmanım

ve çok değerli hocam Sayın Prof. Dr. Ülker Doğru başta olmak üzere, bu yolda

ilerlememde bana çok büyük emek veren, yardımlarını esirgemeyen ve birlikte

çalışmaktan mutluluk duyduğum değerli hocalarım Prof Dr. Erdal İnce ve

Doç Dr. Ergin Çiftçi’ye bütün kalbimle teşekkürlerimi sunarım.

Sadece yan dal arkadaşım değil aynı zamanda ‘ablam’ olan Doç. Dr. Nurşen

Belet’e, sevgili arkadaşım Uzm Dr. Halil Özdemir’e, Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları

Kliniği tüm hemşire ve personeline bütün desteklerinden dolayı teşekkür ederim.

Tezimin yürütülmesinde, yeterli örnek toplanması ve saklanmasında destek

sağlayan Prof. Dr. Ahmet Derya Aysev ve Uzm. Dr. Haluk Güriz’e ve Ankara

Üniversitesi Tıp Fakültesi Cebeci Hastanesi Merkez Laboratuvarı Mikrobiyoloji

birimi personeline teşekkürlerimi sunarım.

Tezimin en zor aşamasında, örneklerin çalışılmasında bütün donanımı,

sıcaklığı ve içtenliği ile yanımda olan Doç Dr. Zeynep Ceren Karahan’a, Ankara

Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

doktor ve personeline ve ayrıca istatistik aşamasındaki değerli desteklerinden dolayı

Doç Dr. Atilla Halil Elhan’a emeklerinden dolayı teşekkürlerimi sunarım.

Hayatım boyunca verdikleri emek ve sevgi ile beni bu günlere getiren ve

fedakarlıklarını hiçbir zaman esirgemeyen değerli aileme ve son olarak bana

varlıkları ile destek ve güç veren sevgili eşim ve ‘CAN’ım oğluma sonsuz

teşekkürlerimi sunarım.

Dr. Anıl AKTAŞ TAPISIZ

iii

İÇİ�DEKİLER

KABUL VE ONAY .................................................................................................... i

ÖNSÖZ ...................................................................................................................... ii

İÇİNDEKİLER ......................................................................................................... iii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................. iv

ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................... v

TABLOLAR DİZİNİ ................................................................................................ vi

1. GİRİŞ VE AMAÇ ............................................................................................. 1

2. GENEL BİLGİLER .......................................................................................... 3

2.1. Patojenin tanımı ...................................................................................... 3

2.2. Virüsün yapısı ........................................................................................ 3

2.3. Sınıflandırma .......................................................................................... 7

2.4. Patogenez ............................................................................................... 9

2.5. İmmünoloji ........................................................................................... 10

2.6. Bulaşma ................................................................................................ 12

2.7. Klinik bulgular ..................................................................................... 13

2.8. Epidemiyoloji ....................................................................................... 14

2.9. Tanı ....................................................................................................... 15

2.10. Tedavi ................................................................................................... 18

2.11. Korunma ............................................................................................... 20

3. GEREÇ VE YÖNTEM .................................................................................. 25

4. BULGULAR ................................................................................................. 33

5. TARTIŞMA ................................................................................................... 41

6. SONUÇLAR .................................................................................................. 49

7. ÖZET .............................................................................................................. 52

8. SUMMARY ................................................................................................... 54

9. KAYNAKLAR ............................................................................................... 55

iv

SİMGELER VE KISALTMALAR

ELISA : Enzyme-Linked İmmunsorbent Assay

ELISPOT : Enzyme-Linked İmmunosorbent Spot

EM : Elektron mikroskobi

IF : İmmünofloresan

IFN : İnterferon

IL : İnterlökin

KF : Kompleman fiksasyon

LA : Lateks aglutinasyon

NSP : Non-strüktürel protein

ORS : Oral Rehidrasyon Solüsyonu

PAGE : Poliakrilamid jel elektroforezi

RFLP : Restriction fragment length polymorphism

RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction

SG I : Subgrup I

SG II : Subgrup II

SGI : Genogroup I

SGII : Genogroup II

VP : Viral protein

v

ŞEKİLLER

Şekil 1. Rotavirusun 11 genomik segmentinin poliakrilamid jel

elektroforezindeki görünümü ................................................................... 4

Şekil 2. Rotavirusun yapısı .................................................................................... 6

Şekil 3. Rotavirusun VP7 bölgesine ait 1062 bp uzunluğundaki

genom bölgesi ......................................................................................... 28

Şekil 4. Rotavirusun VP4 bölgesine ait 876 bp uzunluğundaki genom

bölgesi .................................................................................................... 30

Şekil 5. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların yaşlara

göre dağılımı .......................................................................................... 33

Şekil 6. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların aylara

göre dağılımı ........................................................................................... 34

Şekil 7. VP4 multiplex PCR ürünleri .................................................................. 35

Şekil 8. VP7 multiplex PCR ürünleri .................................................................. 36

vi

TABLOLAR

Tablo 1. Rotavirüs gastroenteriti sayısal skorlama sistemi ................................. 26

Tablo 2. Ayaktan ve Yatan Hastaların Yaş ve Skor Puanı Açısından

Karşılaştırılması ..................................................................................... 35

Tablo 3. RT-PCR ile belirlenen G genotiplerinin dağılımı .................................. 37

Tablo 4. RT-PCR ile belirlenen P genotiplerinin dağılımı ................................... 38

Tablo 5. RT-PCR ile belirlenen her iki G ve P tiplerinin dağılımı ....................... 39

Tablo 6. G genotiplerine göre klinik skor puanları .............................................. 40

Tablo 7. G genotiplerine göre yatan ya da ayaktan hasta sayıları ........................ 40

1

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Rotavirüsler tüm dünyada 5 yaş altı çocuklarda görülen ishallerin, özellikle de

hastaneye yatışlara ve ölümlere neden olan ağır ishallerin en sık nedenidir. Dünyada

her yıl milyonlarca çocuk rotavirüs ishali nedeni ile polikliniklere başvurmakta,

yaklaşık 2 milyonu hastaneye yatırılmakta ve 600.000 kadarı rotavirüs

gastroenteritine bağlı hayatını kaybetmektedir. Rotavirüsler 5 yaş altı çocuklarda aşı

ile korunabilir hastalık ölümleri arasında, pnömokoklardan sonra ikinci sırayı

almaktadır (1).

İnsanda sadece grup A, B ve C rotavirüsler hastalığa neden olur. En yaygın

görülen ve bebeklerdeki ağır gastroenteritlerin %21-65’inin sebebi grup A rotavirüs

enfeksiyonlarıdır. İnsan grup A rotavirüs suşları arasında 27 P tipi ve 19 G tipi

tanımlanmıştır. Dünyadaki epidemiyolojik çalışmalarda VP7 serotipleri G1, G2, G3,

G4 ile G9 ve VP4 serotipleri P4, P6 ile P8 bütün rotavirüs enfeksiyonlarının

%96’sından sorumlu tutulmaktadır (2).

Beş yaş altı çocuklardaki akut viral gastroenteritlerin ilk sıradaki nedeni olan

rotavirüsler, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerdeki morbiditeleri ve gelişmekte olan

ülkelerdeki mortaliteleri nedeni ile çok önem taşırlar. Gelişmiş ülkelerde mortalite

düşük olmasına rağmen morbidite oranı yüksektir ve hospitalizasyon oranları da

%20-60 gibi oldukça yüksek olup gelişmekte olan ülkelerdekine benzer bulunmuştur

(3). Rotavirüs enfeksiyonu asemptomatik olabileceği gibi ağır dehidratasyon

sonucunda ölüme de neden olabilir. Rotavirüs enfeksiyonunun klinik seyrinde

hastalığın ağırlık derecesini tanımlayan skorlama sistemleri kullanılmaktadır (4).

Ancak tam olarak hiçbir G ya da P tipinin klinik ağırlık derecesi ile ilişkisi net olarak

ortaya konamamıştır (5).

Kişisel ve toplumsal hijyenin iyileştirilmesi ve temizlik uygulamalarına

rağmen rotavirüs enfeksiyonuna bağlı morbidite ve mortalitede azalma

sağlanamamıştır. Hastalığın sıklığı ve ağır seyri nedeni ile rotavirüse karşı aşı

geliştirilmiş ve birçok ülkede lisans almıştır. Günümüzde G1P[8] tipinden oluşan

2

monovalan ve G1, G2, G3, G4,WC3 ve P[8]’den oluşan pentavalan 2 tip oral canlı

zayıflatılmış rotavirüs aşısının kullanımı ülkemiz dahil çok sayıda ülkede

onaylanmıştır. Her iki aşının koruyucu etkinliği ciddi ishale karşı %85-98

arasındadır. Rotavirüs aşısı ABD, Venezuella, Brezilya, Meksika ve Avusturya gibi

ülkelerde çocukluk çağı aşı takvimine girmiştir. Buna karşılık Avrupa ve birçok

ülkede rotavirüs aşıları lisans almasına rağmen ulusal aşılama programına henüz

konulmamıştır ve rotavirüs aşısının aşılama programına konulmasından önce

çocuklarda görülen gastroenteritlerde rotavirüs enfeksiyonlarının önemini ortaya

koyan epidemiyolojik çalışmalar devam etmektedir. Rotavirüs aşısından beklenen

ciddi rotavirüs hastalığından koruması, hastaneye yatışları ve ekonomik kayıpları

azaltması ve ölümleri en aza indirmesidir (6).

Grup A rotavirüslerinin G ve P genotiplemesi, rotavirüs aşısı yapımından

önce prevalan suşların tespiti ve aşılama programları sonrası aktif sürveyans

çalışmaları ile genotipik değişimlerin izlenmesinde önem taşır. Buna ilaveten

rotavirüs aşısının rutin uygulamaya girişinden önce her ülke için rotavirüs morbidite

ve mortalite oranları, rotavirüs gastroenterit prevalansı, yaşa özgü insidans ve

hospitalizasyon oranlarının analiz edilmesi gerekir (7,8).

Bu çalışmanın amacı;

1. Akut gastroenteritli çocuklarda rotavirüs enfeksiyonlarının moleküler

epidemiyolojisini araştırmak,

2. Rotavirüs tiplerinin klinik ağırlık derecesine etkisini belirlemek,

3. Ülkemiz açısından sürveyans ve aşılama çalışmalarına ışık tutmaktır.

3

2. GE�EL BİLGİLER

2.1. PATOJE�� TA�IMI

Rotavirüsler, ilk olarak 1972 yılında, Avustralya’da Ruth Bishop adlı

mikrobiyolog ve arkadaşları tarafından non-bakteriyel ishali olan bir çocuğun

duodenal aspiratında ‘tekerlek benzeri’ partiküller olarak elektron mikroskobisi (EM)

yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir (9). Flewett ve arkadaşları 1974 yılında

tekerlek gibi görünüşünden dolayı virüse “rotavirüs” ismini vermiştir (10). İlerleyen

yıllarda daha kolay ve uygun tanısal tekniklerin gelişmesi ile çocukluk çağı ishalinin

en yaygın sebebi olarak bilinen rotavirüs hakkında önemli bilgiler kaydedilmiştir.

2.2. VİRÜSÜ� YAPISI

Rotavirüs, oldukça geniş bir aile olan Reoviridae ailesinini bir üyesidir. Bu

ailenin genel özelliği olarak zarfsız, ikozahedral yapıda, protein kapsidlidir. Yaklaşık

100 nm çapında, 11 segmentli, çift sarmallı bir RNA virüsüdür. Dış kapsid, iç kapsid

ve çekirdek olmak üzere 3 katmandan oluşur. Viral genom, viral protein (VP)1 ve

VP3 ile birlikte merkezde bulunur, bunu hemen çevreleyen iç tabaka VP2’denoluşur.

Dış kapsid VP7 (G proteini) ve VP4 (P protein) olmak üzere 2 proteinden oluşur. Her

bir rotavirüs genom segmenti yapısal olan veya yapısal olmayan bir viral protein

(VP) kodlar. Genom segmentinin altısı virüs partiküllerinde bulunan yapısal

proteinleri (Viral proteinler; VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 ve VP7) diğer altı segment

ise yapısal olmayan proteinleri (Non-strüktürel protein; NSP1-6) kodlar. Yalnızca 11.

segment 2 protein kodlar (11).

4

Şekil 1. Rotavirüsün 11 genomik segmentinin poliakrilamid jel elektroforezindeki

görünümü

VP4 yapısal proteini 775 amino asit uzunluktadır ve 4. segment tarafından

kodlanır. VP4 rotavirüsün yüzeyinde bulunan çıkıntı “spike” proteinidir ve dış kapsid

yüzeyinden yaklaşık 80Å içeri uzanır. VP4 hücreye bağlanma, penetrasyon,

hemaglutinasyon, nötralizasyon ve virulans gibi pek çok önemli fonksiyona sahiptir

(12).

VP7 yapısal proteini 9. segment tarafından kodlanır. Viral kapsidin dış

katmanını ve toplam virion kütlesinin %30’unu oluşturur. VP7 hücreye bağlanma ve

girme sürecinde VP4’ü modüle eder ve VP4’ün bağlanmasından sonra hücrenin

yüzey molekülleri ile etkileşime girer. Dış kapsidin içerdiği VP4 (P proteini) ve VP7

(G proteini) proteinleri nötralizan antikorların ve tip spesifik antikorların hedefidir ve

rotavirüs serotiplerinin belirlenmesinde kullanılır (2).

Minor çekirdek proteini olan VP1 proteini 1. segment tarafından kodlanır.

Merkezi çekirdeğin küçük bir bileşeni olup toplam virion kütlesinin %2’sini

oluşturur. Farklı rotavirüsların karşılaştırılması ile VP1’in amino asit ve protein

seviyelerinin yüksek derecede korunmuş olduğu görülmüştür. VP1 en büyük

5

polipeptiddir. VP2 yapısal proteini 2. segment tarafından kodlanır ve iki minör

protein olan VP1 ve VP3 ile birlikte rotavirüsün iç çekirdeğini oluşturur. VP2 iç

çekirdekte en bol bulunan proteindir ve dsRNA ile etkileşim halindedir. VP2 proteini

rotavirüs çekirdek yapısının oluşumunda ve fonksiyonunda önemli bir rol oynar.

Viral RNA’ya bağlanarak çift zincirli RNA’nın kapsidle kaplanmasında ve

replikasyonun gerçekleşmesinde görevi vardır (13).

VP3 yapısal proteini 3. segment tarafından kodlanır. Çekirdeğin minor

bileşenidir. Diğer viral polimerazlar ile dizi homolojisine sahiptir ve guaniltransferaz

ve metiltransferaz aktivitesine sahiptir. VP5 rotavirüsün korunmuş hidrofobik bir

bölgesine yerleşmiş ve virüsün hücreye girişinde önemli bir rol oynayan proteindir.

VP6 proteini 6. segment tarafından kodlanır. VP6 genomun transkripsiyonu için

önemlidir. VP6 yapısal ve immünolojik role sahip olup virüs kapsid bütünlüğünün

sağlanmasında ve korunmasında önemli bir rol oynar. VP6’nın doğrudan enzimatik

aktivite göstermemesine rağmen transkripsiyon için kesinlikle gerekli bir major iç

kapsid polipeptidi olduğu belirlenmiştir. VP6 grup spesifik antijenik determinanttır

(14).

Rotavirüsün yapısal olmayan proteinlerinden NSP1 proteini 5. segment

tarafından kodlanır. Şimdilik rolü tam olarak bilinmemekle birlikte doğal immün

cevabın modülasyonunda bir role sahip olduğu düşünülmektedir. NSP2 proteini 8.

segment tarafından kodlanır. RNA replikasyonunda ve paketlenmesinde bir role

sahip olduğu ileri sürülmüştür. Yapılan çalışmalar nükleozid trifosfataz aktivitesine

de sahip olduğunu göstermiştir (14).

NSP3 proteini 7. segment tarafından kodlanır. Protein sentezinin

translasyonunu artırıcı, viral replikasyonda ve virüsün barsak ve diğer dokulara

yayılımında bir role sahiptir. Dizi analiz sonuçlarına göre NSP3’ün memelilere ait

rotavirüs şuşlarında %75 oranında korunmuş olduğu görülmüştür (14).

NSP4 proteini 10. segment tarafından kodlanır ve 175 amino asitten oluşan

bir glikoproteindir. Pek çok çalışmada NSP4’ün viral enterotoksin olduğu

kanıtlanmıştır. Viral partikülün olgunlaşmasında önemli bir adım olan endoplazmik

retikulumdan subviral çift katmanlı partikülün tomurcuklanması için intraselüler

6

reseptör olarak görev yapar. NSP4 membran destabilizasyonuna sebep olarak plazma

membranının permeabilitesini değiştirir ve epitelyum hücrelerin yüzeyleri arasındaki

sıkı bağlantıları “tight junction” bozarak intraselüler kalsiyum seviyesini artırır.

NSP4’ün VP4 ve VP6 ile etkileşimde bulunduğu gösterilmiştir. Rotavirüsün

virulansı ve toksijenik aktivitesindeki modifikasyonlar bu bölgedeki amino asit

değişiklikleri ile ilişkilendirilmiştir (14).

İnsan ve hayvan rotavirüslerinin NSP4 genlerinin dizileri belirlenmiş ve

kıyaslanmıştır. Dizi analizleri, birbirinden farklı 5 NSP4 genotipinin [A (KUN), B

(Wa), C (AU-1), D (EW) ve E (avian-like)] olduğunu göstermektedir. Genotip A, B,

C ve D memelilerden elde edilirken genotip E avian rotavirüs suşundan identifiye

edilmiştir. Genotip A, B ve C insanlarda tespit edilmiştir. NSP4 geninin A ve B

genotiplerin immün cevaptaki rolü henüz tam tanımlanamamıştır ve rotavirüs

aşısının stratejisinde bu genin önemli olup olmadığı halen bilinmemektedir (15).

NSP5 proteini 11. segment tarafından kodlanır. NSP5’in fosforilasyon ve

glikolizasyon olmak üzere iki post-translasyonal modifikasyonu tanımlanmıştır.

NSP6’nın rolü tam olarak açık değildir, fakat rotavirüs replikasyonunda anahtar bir

rol oynadığı düşünülmektedir (16).

Şekil 2. Rotavirusun yapısı

7

2.3. SI�IFLA�DIRMA

Rotavirüsler kapsid proteinin antijenik özelliğine göre serolojik olarak grup,

subgrup ve serotiplere sınıflandırılır. VP6 proteininindeki farklılıklara göre A’dan

G’ye (A, B, C, D, E, F, G) kadar adlandırılan 7 gruba ayrılır (17). Rotavirüs grup A,

B ve C hem insanlarda hem de hayvanlarda bulunurken rotavirüs grup D, E, F ve G

yalnızca hayvanlarda bulunur. Grup A, B ve C rotavirüsları %20-60 arasında

değişiklik gösteren amino asit homolojisine sahiptir. Grup A rotavirüsleri yine

VP6’da bulunan farklı epitoplar ile subgruplara ayrılabilir. İnsan rotavirüs suşlarının

çoğu subgrup I ve II’ye aittir. Grup A subgrup II, subgrup I’e göre daha sık görülür

(18).

Rotavirüs genomunun segmentleri tek bir hücrede 2 farklı rotavirüs suşunun

koenfeksiyonu ile “yeniden eşleşme” oluşmasına izin verir. Bu özelliği G ve P

proteinlerinin pek çok kombinasyonlarının oluşmasına aracılık eder. Böylece genotip

çeşitliliği meydana gelir. Her bir rotavirüs grubu genetik olarak "yeniden eşleşme"

yeteneğine sahiptir, fakat yeniden eşleşme farklı gruplar arasında ortaya çıkmaz (16).

Grup A rotavirüsları jel elektroforezisinde 11 RNA segmentinin mobilitesine

göre iki farklı elektroferotip paterni gösterir. Hızlı göç edenler uzun (long)

elektroferotip ve yavaş göç edenler kısa (short) elektroferotip olarak adlandırılır.

Grup A rotavirüs G1, G3 ve G4 serotipleri genellikle tipik olarak subgrup II ve uzun

elektroferotip, G2 ise subgrup I ve kısa elektroferotip profili gösterir (19).

Monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan nötralizasyon testi ile rotavirüsler

her bir grup içinde serotiplere sınıflandırılır. Serotip spesifik antijenler iki dış kapsid

proteini olan VP4 ve VP7 dir. VP7, bir glikoproteindir ve VP7 ile G serotipleri (G;

glikoprotein) belirlenir. Virüsün yüzeyindeki “spike” proteini olan VP4 P tip

antijenini belirleyen bir proteindir. Hem VP4 hem de VP7 tip spesifik koruyucu

nötralizan antikor oluşumunu uyarır. Rotavirüslerin sınıflandırılmasında VP4 ve VP7

tipleri ikili sistem olarak kullanılır. Grup A rotavirüslerin şimdiye kadar 19 G genotip

(G1-G19) ve 14 G (G1-G14) serotipi tespit edilmiş olup en az 11 G serotipinin (G1–

G6, G8–G12) insanları enfekte ettiği belirlenmiştir (17).

8

Rotavirüsün VP4 segmentine göre en azından 27 farklı P genotipi

bulunmaktadır. İnsanlardan izole edilen 12 P tipi (P1A[8], P1B[4], P2A[6], P2C[6],

P3[9], P4[10], P5A[3], P6[1], P8[11], P11[14], P12[19] ve P[25]) vardır. P

serotiplerinin tanısı için baculovirüs’ta eksprese edilen VP4 antijenine karşı

geliştirilen tip spesifik antikorlar kullanılarak Grup A rotavirüslarının şimdiye kadar

en az 17 P serotipi tanınmıştır, bunlardan 3 tanesi subtiptir (14 P serotip, 1A, 1B ve

2-14). İnsanları enfekte ettiği bulunan P serotipleri ise şimdilik sekiz tane olup P1A,

P1B, P2A, P3, P3B, P4, P5 ve P8’dir. İnsanlarda en yaygın P genotipleri, P[8] ve

P[4]’dür, sırasıyla P1A ve P1B serotiplerine karşılık gelir. P serotipleri ve P

genotipleri arasında korelasyon tam kurulmamış olduğundan P serotipleri sadece

numara ile yazılırken P genotiplerinin numarası parentez içinde belirtilir. P tiplerinin

isimlendirilmesinde alternatif olarak P1A[8] gibi hem serotip hem de genotip

numarası yazılabilir. G serotipleri ve genotipleri arasında korelasyon olduğundan

dolayı her ikisinde de sadece numarası yazılır (16).

Rotavirüs suşlarının dizilerinin direkt karşılaştırılmaları ile bütün homolog

genom segmentleri arasındaki genetik akrabalık RNA-RNA arasındaki hibridizasyon

ile tespit edilmektedir (20). RNA-RNA hibridizasyon insan ve hayvan suşları

arasında yakın tür içi ilişkileri göstermede veya doğal olarak ortaya çıkan rotavirüs

reassortant suşları doğrulamada kullanılır. Referans suşlar olarak üç insan A

genogrubu rotavirüs suşu olan [Wa (P1A[4], G1), DS-1 (P1B[4], G2) ve AU-1

(P3[9], G3)] kullanılmaktadır. Genetik olarak yeniden eşleşme sırasında virüsün

genomik segmentleri kısmen veya tamamen ayrılabilir ve prototip virüstan oldukça

farklı olabilir. Farklı genogruplar arasındaki yeniden eşleşmeler ile şimerik virüsler

oluşturabilir ve kolayca bir genogruba yerleştirilemez. Buna ilaveten genom

segmentlerinin takımı prototip virüslerden kısmen veya tamamen farklı olabilir ve

kolayca tanısı yapılamaz. Pek çok hayvan genogrupları identifiye edilmiştir, fakat

bunların birbirleri ve insan suşları ile ilişkileri tamamen açıklanmamıştır. İnsan ve

hayvan rotavirüs suşlarının dizi analizinde olağan dışı rotavirüs suşlarının sayısının

nadir olduğu açığa çıkarılmıştır ve bazı suşların nükleik asit hibridizasyon yöntemleri

kullanılarak etkili bir şekilde taranamayan reassortant olaylardan türemiş şaşırtıcı

genom kompozisyonuna sahip olduğu gösterilmiştir (21).

9

Son zamanlarda filogenetik analiz çalışmaları gerçekleştirilmiş ve grup A

rotavirüslerinin 11 genom segmentinin her birinin dizisi tanımlanmıştır. Bu analiz

temeline dayanarak VP4, VP7 ve NSP4 için önerilen sınıflandırma sistemi

değiştirilmiş ve VP1, VP2, VP3, VP6, NSP1, NSP2, NSP3 ve NSP5/6 için yeni

sınıflandırma sistemi uluslararası standartizasyonda gerçekleştirilmiştir (22).

2.4. PATOGE�EZ

Rotavirüs enfeksiyonunda patolojik değişiklikler hemen daima ince barsağa

sınırlıdır. Rotavirüs enfeksiyonu, enterosit vakuolizasyonu ve kaybı gibi hafif

lezyonlardan ince bağırsak epitelinde villöz atrofiye neden olan yaygın hücresel

nekroz ve kript hiperplazisine kadar değişen daha belirgin değişikliklere neden

olabilir. İnce barsak epitel fonksiyonundaki değişiklik, su ve iyon kaybına yol

açarak sulu ishale sebep olur (14). Virüs partikülleri hücre sitoplazmasında replike

olarak kansız bol miktarda inflamatuvar olmayan ishale yol açar. Hastalığın

semptomları ile histolojik lezyonlar arasında korelasyon gözükmemektedir.

Rotavirüs ishalinin önceleri sadece enterosit hasarı sonucu gelişen malabsorbsiyona

bağlı ozmotik ishal olduğu kabul edilirken günümüzde rotavirüs ishalinin birçok

mekanizmalarla geliştiği bilinmektedir ve hem viral hem de konak faktörleri

hastalığın oluşmasında etkilidir (14).

Rotavirüsün patojenitesini belirleyen viral faktörler birçok hayvan deneyinde

araştırılmıştır (23). NSP4, rotavirüs patogenezinde en ilgi çekici faktörlerden biri

olan bir viral enterotoksindir. Yenidoğan farelerde NSP4’ün barsakta histolojik

değişikler oluşmadan önce ishali enterotoksin olarak artırdığı gösterilmiştir. NSP4,

Ca2+’u endoplazmik retikulumdan mobilize ederek intrasellüler Ca2+

konsantrasyonunu artırır ve hücresel elektrolit dengesini bozar. Artan hücre içi

kalsiyum, hücre iskelet yapısında değişikliğe, disakkaridazların sentezlerinin

azalmasına, sodyum ve solüt transferinin inhibisyonuna neden olmaktadır. Bu sırada

NSP4’ün ortama salınımı gerçekleşmekte ve diğer hücrelerde de toksin etkisi ortaya

çıkmaktadır. Enterik sinir sisteminin uyarılması da rotavirüs patogenezinde rol

oynayabilir (24).

10

2.5. İMMÜ�OLOJİ

Rotavirüse karşı immün cevap, hem doğal hem de hücresel ve humoral

bağışıklığı kapsayan kazanılmış immün cevabı içermektedir. Hayatın ilk birkaç

yılında rotavirüs ile birçok enfeksiyonlar oluşabilir. İlk enfeksiyon genellikle daha

şiddetli geçmekte ve enfeksiyonun sayısı arttıkça şiddeti de azalmaktadır. İlk

enfeksiyon, özellikle ciddi rotavirüs ishaline karşı yüksek oranda korur. Semptomatik

veya asemptomatik geçirilen ilk rotavirüs enfeksiyonu sonraki rotavirüs ile ilişkili

ishale karşı %73-87 arasında korur. İkinci bir rotavirüs enfeksiyonundan sonra gerek

asemptomatik gerekse semptomatik olsun hafif veya şiddetli enfeksiyona karşı

tamamen (%100) koruma sağlanır (25,26).

Rotavirüs enfeksiyonuna karşı başlıca serotip spesifik homotipik nötralizan

antikorlar enfeksiyonunun ilk iki haftası içinde gelişir. Bu immüniteye rotavirüsün 2

dış kapsid proteini olan VP4 ve VP7 antikorları aracılık eder. Her iki protein de dış

kapsidin bileşenleri olup nötralize edici antikorların üretimini harekete geçirmede

birbirlerinden bağımsızdır. Farklı serotiplere karşı da düşük düzeyde heterotipik

antikor cevabı oluşur. Fakat çoğunlukla enfekte eden suşa göre değişir. Örneğin: G2

serotipleri başlıca homotipik antikor cevabı oluştururken G1, G3 ve G4 homotipik ve

heterotipik antikor cevabı oluşturur. Homotipik antikor cevabı muhtemelen

heterotipik antikorlara göre daha uzun sürelidir. Buna karşılık aynı serotiple

reenfeksiyonların ortaya çıktığı gösterilmiştir, ancak primer enfeksiyona göre daha

az ciddidir. Heterotipik koruma için muhtemel birkaç açıklama vardır. Birincisi,

lokal IgA antikorları VP4 ve VP7'deki çapraz reaksiyon gösteren epitopları tanımlar

ve diğeri ise, iç kapsid proteini olan VP6'daki antikorların korumayı sağlamasıdır ve

üçüncü bir ihtimal ise, çapraz reaksiyon veren virüs-spesifik sitotoksik T

lenfositlerinin korumada yer almasıdır, ancak rotavirüs enfeksiyonunda sitotoksik T

lenfositlerinin rolü henüz tam olarak bilinmemektedir (27).

Nötralizan antikorlar yaş ve virüs ile karşılaşma ile artar. Çocukların 3 yaşına

kadar %90’ında bir veya daha fazla rotavirüs tipine karşı antikorlar bulunmaktadır ve

4 yaşına kadar bu oran %100’ü bulur. Rotavirüs antikor düzeyleri doğumda

yüksektir, 3-6 aya kadar azalır, 2-3 yaşında pik yapar. Rotavirüs antikorlarının

11

erişkinlerde de yüksek prevalansta seyretmesi virüs ile subklinik enfeksiyonların

oluştuğunu gösterir. Yaşlılar ise muhtemelen immünitenin azalmasına bağlı olarak

ciddi hastalığa karşı duyarlıdırlar (28).

Rotavirüs ile enfeksiyon yaşam boyu süren güçlü bir humoral IgG immün

yanıtı harekete geçirir. IgG yanıtı kolayca oluşurken, genellikle rotavirüs

enfeksiyonundan korunma lokal IgA antikorları tarafından sağlanır. Rotavirüs

spesifik total serum IgG titreleri değil, fakat total serum rotavirüs IgA’nın özellikle

ciddi ishale karşı koruyuculuğu ile ilgili olarak total rotavirüs serum IgA varlığının

sekretuvar komponente bağlı serum immünglobulinlerin (Ig) varlığı ile korele olduğu

bulunmuştur. Bu antikorlar büyük ihtimalle bağırsak kaynaklı polimerik IgA’dır ve

barsakta fazla olan IgA seruma ulaşır. Spesifik olarak sekretuvar komponente bağlı

olan rotavirüs IgA antikorları enfeksiyondan sonra 4 aydan kısa bir süre içinde

serumdan kaybolur. Üstelik enfeksiyondan yaklaşık 1 hafta sonra serumda bulunan

immünglobuline bağlı rotavirüs sekretuvar komponentinin miktarı duedonal sıvıdaki

miktar ile koreledir. Böylece enfeksiyondan sonraki 4 ay içinde bulunan total

rotavirüs spesifik serum IgA varlığının intestinal IgA ile iyi korele olduğu

gözükmektedir (29,30).

Rotavirüs tarafından enfeksiyona karşı korunmadan sorumlu immün

mekanizmalar hala iyi bilinmemektedir. İntrasellüler sitokin flow-sitometri assay ve

ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) kullanılarak yapılan insan rotavirüs

spesifik T-hücre yanıtı çalışmalarına göre; hem sağlıklı hem de rotavirüs ile enfekte

erişkinlerde interferon (IFN)-gama salgılayan CD4+ ve CD8+ rotavirüs-spesifik T

hücreleri bulunur. Rotavirüs gastroenteritli çocuklarda bu hücrelerin sayısı düşüktür

veya tespit edilemez. Sonuçta, rotavirüs spesifik CD4+ T hücreleri tarafından

salgılanan sitokin paterni açık değildir, fakat hem T-helper 1 (TH1) hem de TH2

paterni olabilir (31).

12

2.6. BULAŞMA

Rotavirüs insandan insana en sık fekal oral yolla bulaşır. Bulaşma kontamine

eşyalarla da olabilir. Çocuklar rotavirüs enfeksiyonu ve hastalığı için büyük risk

grubunu oluşturmasına rağmen rotavirüs enfeksiyonu yetişkinlerde de ortaya

çıkabilir. Bu kişiler özellikle küçük çocuklar ile yakından ilişkide bulunan, kişisel

hijyenin zayıf olduğu çocuk yuvaları ve yaşlıların bulunduğu bakım evlerinde olan,

sık seyahat eden veya hastanede yatan erişkinlerdir (32).

Virüs oldukça bulaşıcı olmasından dolayı rotavirüsün yayılmasını kontrol

altına almak çok zordur. Enfekte insanların dışkısında 1010- 1012/mL kadar enfeksiyon

partikülü bulunur ve enfeksiyonun olabilmesi için yaklaşık 1-10 kadar partikülün

olması yeterlidir. Virüsün yayılmasında kusma da önemli bir rol oynamaktadır. Hem

semptomatik hem de asemptomatik hastalar genellikle 7-10 gün boyunca rotavirüs

partiküllerini etrafa yayarlar. Bu süre özellikle immün yetmezliği olan kişilerde

bazen birkaç haftayı bulabilir. Virüs oda ısısında dışkıda aylarca, çevresel yüzeylerde

ise günlerce canlı kalabilir. Rotavirüs ile enfekte olmuş metal ve plastik gibi

yüzeylerde virüs canlılığını uzun süre koruyabilir. Rotavirüsün transmisyonunda en

etkili yüzeyler tuvalet ve lavabodur. Rotavirüs çevrede uzun süre stabil kaldığından

kontamine yüzeylere temas veya kontamine su ve yiyeceklerle de rotavirüs

bulaşabilir. Rotavirüs partikülleri insan eli üzerinde saatlerce canlılığını koruyabilir.

Musluk suyu zayıf bir dezenfektandır. Bu yüzden eller kesinlikle sabunla

yıkanmalıdır. Temiz su kullanımı ve dikkatli el yıkama virüsün bulaşmasını

azaltmada önemlidir. Kontamine yüzeylerin hemen dezenfekte edilmesi gerekir.

Rotavirüs dezenfektanlara oldukça dirençlidir. Fenol, %2 formalin, %5 lysol, %6

H2O2 ve %80-95 etanol etkili dezenfektanlardır. Ayrıca %1 sodyum hipoklorid

etkilidir, ancak fekal materyal aktivitesini azaltabilir, bu sebeple dezenfeksiyondan

önce yüzeyler deterjanla temizlenmelidir. Klorheksidin, kloroform, eter ve pH 4-9’a

dirençlidir (33).

13

2.7. KLİ�İK BULGULAR

Hemen her çocuk 5 yaşından önce rotavirüs ile enfekte olmakta, enfeksiyonu

semptomatik veya asemptomatik olarak geçirebilmektedir. Rotavirüs enfeksiyonların

%20-40 kadarı asemptomatiktir. Asemptomatik enfeksiyonlar sıklıkla 3 aylıktan

küçük bebeklerde görülür. Hastalığın ciddiyetini hem viral hem de konağa ait

faktörler etkileyebilir. Viral faktörler arasında VP4’ün bazı alellerinin asemptomatik

hastalıkla ilişkili olduğu düşünülmektedir. Malnutrisyon ve yaş gibi konak faktörleri

de rotavirüs enfeksiyonunun ciddiyetini etkilemektedir. Malnutrisyon ince bağırsağın

düzelmesini geciktirir. Semptomatik rotavirüs enfeksiyonu genellikle yaşa bağlıdır.

Yaş ilerledikçe rotavirüs enfeksiyonlarının ciddiyeti ve sayısı azalır. Villus epitel

hücreleri üzerindeki rotavirüs bağlayan reseptörlerin miktarının yaşla birlikte

azaldığı hayvan çalışmalarında gösterilmiştir. Buna karşılık erişkinlerde

enfeksiyonun asemptomatik veya az belirtilerle seyretmesi daha çok immünitenin

kazanılmasıyla ilişkilidir. Rotavirüs ile sekonder enfeksiyonlar klinik olarak daha

hafif veya asemptomatik şekildedir (25).

Hastalığının inkübasyon süresi 1-4 gündür. Rotavirüs enfeksiyonu çocuklarda

hafif ateş (%60-65) ve kusma (%60-70) ile başlar. Ateş genellikle 38.5-39.5oC’de 1-

2 gün sürer. Önemli dehidratasyon varsa ateş daha yüksek olabilir. Genellikle 1-3

gün süren kusmayı ani başlayan sulu ishal izler. Günde 10-20 kez olan sulu ishal

genellikle 5-8 gün sürer ve ağır sıvı kayıplarına yol açabilir. Karın ağrısı görülebilir.

Bazı vakalarda hızlı ve ciddi dehidratasyon özellikle 2 yaşından küçük çocuklarda

ölümlere sebep olmaktadır. Gelişmiş ülkelerde hastanede yatan premature bebeklerin

büyük risk altında olduğu gösterilmiştir. Maternal antikorun koruyucu etkisinden

dolayı 4-6 aydan küçük yeni doğanlarda enfeksiyonlar sıklıkla asemptomatik olup

vakaların sadece %10-20’sinde semptomatiktir ve genellikle hafiftir. Ancak

prematüre bebeklerde ciddi enfeksiyonlar görülebilir. Anne sütü ile beslenen

çocuklarda hastalığın ciddiyeti ve süresi azalır (34,35).

Akut gastroenteritlerin yaygın görülen özellikleri arasında dehidratasyon,

elektrolit kaybı, metabolik asidoz, beslenme yetersizliği ve bez bölgesi dermatiti gibi

belirtiler rotavirüs enfeksiyonunda görülebilir. İmmun yetmezliği olan çocuklarda

14

barsak dışı yayılım oldukça yaygın olup hastalık daha ağır seyreder (14). Rotavirüs

enfeksiyonları sadece gastrointestinal yolla sınırlı olmayıp hem immün kompetan

kişiler hem de immün eksikliği olan enfekte çocuklarda rotavirüs antijen veya viral

RNA’nın kan, beyin omurilik sıvısı, karaciğer, safra kanalı, mezenterik lenf

nodülleri, dalak, böbrek, boğaz ve akciğer gibi birçok ekstraintestinal yerlerde tespit

edildiği bildirilmiştir (36). Rotavirüs gastroenteritine sahip çocuklardan alınan serum

örneklerinin %43-66’sında viremi görülür (37). Birçok çalışmada rotavirüs

gasroenteriti olan çocuklarda santral sinir sistemi enfeksiyon sıklığı %2-5.7 arasında

değişmektedir (38). Ağır rotavirüs gastroenteriti olan çocuklarda sekonder

bakteriyemi ve candidemi komplikasyonu da gelişebileceği unutulmamalıdır (39).

2.8. EPİDEMİYOLOJİ

Rotavirüsler tüm dünyada bebek ve küçük çocuklardaki gastroenteritlerin en

önemli nedenidir. Gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde benzer sıklıkta görülür (40).

Dünyada her yıl 5 yaş altı 140 milyon çocuk rotavirüs ile enfekte olmakta, yaklaşık

25 milyonu kliniklere başvurmakta 2 milyonu hastaneye yatırılmakta ve ortalama

600.000 çocuk rotavirüse bağlı hayatını kaybetmektedir. Bir başka deyişle 5 yaşına

altında rotavirüs gastroenteriti olan her 5 çocuktan 1’i kliniklere başvurmakta, her 65

çocuktan 1’i de hastaneye yatırılmakta ve yaklaşık olarak her 293 çocuktan 1’i de

rotavirüs gastroenteriti sebebiyle ölmektedir. Bu oran tüm 5 yaş altı çocuklarda

görülen ölümlerinin %20’sini oluşturmaktadır (1). Rotavirüs ölümlerinin %80’den

fazlası Güney Asya ve Afrika gibi az gelişmiş bölgelerde görülmektedir (3).

Gelişmiş ülkelerde ise mortalite düşük ancak morbidite yüksektir. Rotavirüsler tüm

dünyada ishale bağlı hospitalizasyonun da en önde gelen sebebidir. Hastaneye

yatırılması gereken gastroenterit vakalarının %20-60’ından rotavirüsün sorumlu

olduğu gösterilmiştir. Rotavirüs ishaline bağlı hospitalizasyonların oranı gelir

seviyesininin artması ile artan bir eğilim göstermektedir (41,42).

İnsanlarda hastalık yapan grup A, B ve C rotavirüsleridir. Çocuklarda

rotavirüs enfeksiyonlarının çoğuna grup A rotavirüsler sebep olur. Grup A rotavirüs

enfeksiyonlarının çoğu endemik olmasına rağmen özellikle hastane ve kreşlerde

15

salgınlara sebep olabilir. Grup B rotavirüsü en çok erişkinlerde hastalık yapar, yeni

doğan ve çocuklarda semptomatik enfeksiyonlarda nadiren tespit edilir. Grup C

rotavirüs, sporadik ishal vakaları ile ilişkilidir, salgınlara nadiren sebep olur. Başlıca

besin kaynaklı çocukluk çağı ishali ile ilişkilidir. Grup C rotavirüsleri tüm dünyada

bulunmaktadır. İngiltere, Japonya, Asya, Brezilya ve Avrupa’da Grup C rotavirüs

ishal salgınları bildirilmekle birlikte grup A rotavirüslerinden daha az yaygındır.

Brezilya’da yapılan bir çalışmada akut gastroenteriti olan hastaneye başvuran 5 yaşın

altındaki çocukların %1’inde tespit edilmiştir. Grup D, E, F ve G rotavirüs

enfeksiyonları insanlarda gastroenterit ile ilişkili değildir. Rotavirüsün geniş konak

dağılımı vardır. İzolatların çoğu yeni doğan hayvanlarda ishale sebep olmaktadır.

Grup A rotavirüsları hemen hemen bütün hayvanları enfekte eder. Sığır ve domuz

grup B ve C rotavirüsları tespit edilmiştir (41).

Rotavirüs enfeksiyonu ılıman iklimlerde tipik olarak kış mevsiminde

görülürken tropikal bölgelerde rotavirüs ishali bütün yıl boyunca gözlenir. Global

olarak en çok görülen epidemiyolojik önemi olan 5 rotavirüs tipi G1P[8], G3P[8],

G4P[8] ve G2P[4] ve G9P[8] bütün suşların %90’dan fazlasını oluşturur. Baskın

serotipler, yıldan yıla ve bölgeden bölgeye değişmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar

bir bölgede de her yıl baskın rotavirüs tiplerinin değişebildiğini göstermiştir.

Dünyanın farklı yerlerinde yeni ve nadir serotipler belirli zaman dilimlerinde artıp

azalabileceğinden sürekli epidemiyolojik izlem gereklidir (8).

2.9. TA�I

Dışkıda rotavirüsün tespiti için pek çok yöntem geliştirilmiştir.

Konvansiyonel yöntemler ile virüsün belirlenmesi için dışkı örneklerinin hastalığın

ilk 4 günü içinde alınması uygundur. Semptomların başlangıcından 8 gün sonra

toplanan örnekler nadiren virüs içerir. Ancak virüs atılımı semptomların süresine

bağlı olarak 3 haftaya kadar da sürebilir ve bu süre içinde daha yüksek sensitiviteye

sahip moleküler yöntemlerle (RT-PCR; reverse transcription polymerase chain

reaction) virüs tespit edilebilir (14)..

16

Elektron mikroskobi (EM) rotavirüsün dışkı materyalinde direk olarak

görüntülenmesi ve patognomonik iki ve üç tabakalı rotavirüs partiküllerinin hızlı

idendifikasyonu için uygundur. Rotavirüs partikülleri akut gastroenterite sebep olan

enterik adenovirüslar, norovirüs, sapovirüs ve astrovirüslardan farklı bir morfolojik

görünüme sahip olduklarından bu yöntem yüksek bir avantaja sahiptir (43).

Rotavirüsün tespiti için yalnızca birkaç örnek araştırılmak istenildiğinde EM en hızlı

tanı metodudur, çünkü dışkı örnekleri direkt olarak fosfotungistik asit ile boyanarak

birkaç dakika içinde incelenebilir, ancak bu yöntem genellikle rutinde kullanılmaz.

Grup A rotavirüsü önceden proteolitik enzim olan tripsin ile muamele edilirse veya

besiyerine düşük düzeyde tripsin ilave edilirse hücre kültüründe üretilebilir, ancak

daha çok araştırma amacıyla bazı merkezlerde yapılmaktadır. Hücre kültüründe

rotavirüsün üretilmesi nötralizasyon yöntemiyle rotavirüs serotiplerinin

belirlenmesine izin verir (14).

Çeşitli otomatize yöntemler dışkı örneklerinde rotavirüsün belirlenmesi için

uygundur. Pek çok laboratuvarda Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ve

lateks aglutinasyon (LA) testleri oldukça yüksek sensitiviteye sahip olması, özel

ekipmanlara gereksinim duyulmadan kolay uygulanabilir olması, hızlı sonuç vermesi

ve spesifik olmayan reaksiyonlar için bir kontrol grubuna sahip olması sebebiyle

rotavirüs tanısında yaygın olarak kullanılan testlerdir (43,44). Dışkı örneklerinde

rotavirüs antijenlerinin tespiti için ELISA ve LA kitleri ticari olarak mevcuttur.

Rotavirüs LA testinin ELISA testine göre sensitivitesi daha düşük olup ELISA

testinin sensitivitesi %98-100, spesifitesi %100’ü bulurken LA testinin sensitivitesi

%85-90, spesifitesi %100’dür. Ticari ELISA ve LA testleriyle gastroenteritlerin en

yaygın sebebi olan sadece rotavirüs Grup A tespit edilir. Serolojik testlerden

özellikle ELISA testi rotavirüs spesifik IgM, IgA ve IgG antikor cevabının tespiti

için kullanılabilir (14).

Grup A rotavirüsleri G serotiplerinin tespiti için G1-G4 tip spesifik

monoklonal antikorlara dayanan ticari ELISA testleri epidemiyolojik çalışmalarda

yaygın olarak kullanılmaktadır. G5, G8, G9 ve G10 gibi diğer tiplerinin belirlenmesi

için genotipleme testleri kullanılır (45). Grup A rotavirüs subgrup I ve II tespiti için

VP6 üzerindeki iki farklı epitop için spesifik monoklonal antikorların kullanıldığı

17

ELISA testi geliştirilmiştir. Akut gastroenteritli hastalardan en çok izole edilen grup

A rotavirüs P1A ve P1B serotiplerinin araştırılması için de ELISA testleri vardır.

Ancak VP4 antijeninde çapraz reaktif epitoplar bulunduğundan ELISA ile serotip

ayırımı tam olmayabilir. Bu sebeple daha çok genotipleme metodları tercih edilir

(45).

Hücre kültürü, poliakrilamid jel elektroforezi ve polimeraz zincir reaksiyonu

gibi testler tanıda nadiren kullanılır. Serolojik tanı için kompleman fiksasyon,

nötralizasyon, immünfloresan testleri tanı için tavsiye edilmemesine rağmen

araştırma amaçlı kullanılabilir. Önceleri rotavirüs serotiplendirilmesi için

hiperimmün serum ile yapılan nötralizasyon testleri kullanılmış, ancak nötralizan

antikorlar daha çok dış kapsidin majör proteini olan VP7’ye yönelik olduğundan VP4

serotiplerinin ayırımı etkin bir şekilde yapılamamıştır. Rotavirüsün tespiti için dot

hibridizasyon yöntemi membran üzerinde ısı ile denatüre olmuş ve işaretlenmiş tek

zincirli rotavirüs traskriptlerinin insitu hibridizasyonu temel alınarak geliştirilmiştir.

Yöntem oldukça yüksek spesifiteye sahiptir ve elde edilen sonuçlar EM, ELISA ve

RNA analizi gibi diğer testler ile elde edilen sonuçlar ile uygundur. Dışkı

örneklerinin çeşitli dilüsyonlarında rotavirüsün tespiti için ELISA ve dot

hibridizasyonun karşılaştırıldığı çalışmalarda dot hibridizasyon yönteminin

doğrulayıcı ELISA yöntemine göre 10-100 kez daha fazla sensitif olduğu

görülmüştür (46).

Rotavirüs grup A’nın tespit edildiği tanı testleri arasında gerçek zamanlı

polimeraz zincir rekasiyonu (RT-PCR) en önemlisidir ve antijen tespit metodlarına

göre çok daha duyarlıdır. Bu yöntem standart elektroferotip yöntemlerinden 100.000

kez, hibridizasyon yönteminden ise 5000 kez daha duyarlıdır. Bu yöntemle ishalin

başlangıcından 4-57 gün sonrasına kadar virüsün atılımı belirlenebilir (45). Rotavirüs

tespiti için RT-PCR testinin kullanımı ELISA yöntemi ile tiplendirilemeyen rotavirüs

pozitif örneklerin genotiplendirilmesi için uygundur. Rotavirüs aşısı yapımından

önce prevalan suşların tespiti ve sonra yeni rotavirüs tiplerinin ortaya çıkışının

izlenmesinde grup A rotavirüslarının G ve P genotiplemesi önem taşır. Grup A

rotavirüslarının G ve P genotiplemesi için spesifik cDNA probları ile nükleik asit

hibridizasyon testi, RFLP (restriction fragment length polymorphism), tip spesifik

18

primerler ile yapılan RT-PCR, nested RT-PCR, multiplex RT-PCR ve oligonükleotid

mikroarray hibridizasyon testleri kullanılır. Genotipleme testlerinden en çok RT-PCR

kullanılmaktadır. Grup B ve C rotavirüsların tanısı için RT-PCR testi birçok

çalışmada kullanılmıştır. Rotavirüs genomunun poliakrilamid jel elektroforezi

(polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE) ile nongrup A rota virüsları, grup A

rotavirüslarından ayırt edilebilir. Sensitivitesi %90’dan fazla ve spesifitesi %100’dür.

Grup A rotavirüsün kısa elektroferotipleri genellikle subgrup I ve uzun

elektroferotipleri ise subgrup II ile ilişkili bulunmuştur. Epidemiyolojik çalışmalarda

elektroferotipleme viral bulaşmayı izlemede faydalıdır (46).

Rotavirüs enfeksiyonunun serolojik cevabının ölçümünde kompleman

fiksasyon (KF) testi, immünfloresan (IF) testi, ELISA, nötralizasyon,

hemaglutinasyon inhibisyon ve immünositokimyasal boyama testleri de uygundur.

KF testi 6-24 aylık hasta çocuklar arasında antikor cevabını belirlemede diğer testler

kadar etkili iken 6 aydan küçük yeni doğanlarda ve yetişkinlerde etkili bir test

değildir. Bu yaş grubunda IF, ELISA IgG, ELISA IgM ve ELISA IgA daha etkilidir.

Çünkü IgA plasentaya geçemez. Rotavirüs ELISA IgA özellikle pasif olarak elde

edilmiş anneye ait IgG antikorlarına sahip olan yenidoğanlarda serolojik cevabın

gösterilmesinde oldukça etkilidir (47).

2.10. TEDAVİ

Rotavirüs gastroenteritinin tedavisinde amaç ishal ve kusma sonucu oluşan

sıvı ve elektrolit kaybını yerine koymaktır. Sıvı tedavisi yaşa ve sıvı kaybının

derecesine göre yapılır. Dehidrate olmayan ve kusması devam etmeyen çocuklara

yaşlarına uygun oral beslenmeye devam etmeleri önerilir. Dehidrate olmayan ve

kusması devam eden çocuklara evde sıvı alımını veya oral rehidrasyon sıvılarını

(ORS) önermede fayda vardır. Evde alınması tavsiye edilen sıvılar; su, anne sütü,

çorba ve taze sıkılmış meyve sularıdır. Buna ek olarak her bir sulu dışkıda 10 mL/kg

ve her bir kusmada 2 mL/kg kaybedilen gastrointestinal kaybı yerine koymak için

oral rehidrasyon sıvısı verilmesi dehidratasyonun önlenmesinde büyük önem taşır

(48). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) standartlarına göre oral rehidrasyon sıvısı

19

formülü: sodyum 90 mmol/L; klorür 80 mmol/L; potasyum 20 mmol/L, sitrat 10

mmol/L ve glikoz 110 mmol/L olmak üzere toplam ozmolaritesi 310 mOsm/L’dir.

Son yıllarda sodyum konsantrasyonu düşük oral rehidrasyon sıvılarının da etkili

olduğu bulunmuştur (49).

Eğer oral rehidrasyon, sıvı ve elektrolit kaybını yerine koymaz veya hastada

ciddi dehidratasyon var ve şokta ise derhal intravenöz sıvı verilmelidir. Bazı çocuklar

şiddetli dehidrate olduğunda eğer abdominal distasyon, barsak tıkanması, aşırı kusma

veya letarjiden dolayı oral rehidrasyon solüsyonları alamıyorsa intravenöz

rehidrasyona ihtiyaç duyabilir. Genellikle hemodinamik stabilite sağlanıncaya kadar

serum fizyolojik veya laktatlı ringer solüsyonu 20-30 mL/kg verilir. Daha önceden

klinik denemeler sonucu pek çok çocuğun başlangıçta 30 mL/kg intravenöz sıvının

alınımından sonra oral rehidrasyon sıvılarını tolere etmeye başlayabildiği

belirlenmiştir. Şiddetli dehidrate olan çocuklar intravenöz sıvı alınımına kadar oral

sıvı alınımını sürdürebilirler. Sıvı kaybı devam ettiği sürece kaybın derecesine göre

sıvı desteği sürdürülmelidir.

Ağır ishal ile ilişkili ölümler, oral rehidrasyon tedavisi ile başarılı bir şekilde

azalmasına rağmen bazı çocuklar için problem olmaya devam etmektedir. Çünkü oral

rehidrasyon tedavisi düşük kalorilidir ve rehidrasyon ortaya çıktıktan mümkün

olduğu kadar kısa bir süre sonra beslenmeye başlanması tavsiye edilir. Klasik diyet

olarak akut gastroenterit tedavisi için muz, pirinç ve elma püresi alınması bazı

uzmanlar tarafından eleştirilmiş ve bu besinlerin düşük enerjili, az yağlı ve düşük

proteinli olduğu belirtilmiştir. Çocukların yaşlarına uygun olarak kompleks

karbonhidrat, et, yoğurt ve meyveleri içeren diyetleri tüketmeleri tavsiye

edilmektedir (50).

Anne sütü sağlıklı infantların beslenmesi için en iyi kaynak olmasına rağmen

oral rehidrasyon solüsyonlarından daha fazla ozmolariteye ve daha az sodyuma

sahiptir. Ayrıca anne sütünün karbonhidrat kaynağı olan laktoz, akut gastroenterite

eşlik eden ciddi disakkaridaz eksikliğinin olduğu vakalarda uygun olmayabilir. Yine

de anti-rotaviral özellikleri olan laktoferrin ve laktadherin ve anti-rotaviral IgA anne

sütünde bulunduğundan rotavirüs akut gastroenteritine sahip bebeklerin anne sütü ile

20

beslenmesinin tedavide yararı vardır. Bütün akut gastroenteriti olan yenidoğan

bebeklerin anne sütü ile beslenmeye devam etmesi tavsiye edilmektedir. Yenidoğan

bebek dehidrate ise oral rehidrasyon solüsyonları veya intravenöz sıvı tedavisi

gereklidir (48).

Antiemetiklerin sedasyon, akatizi ve distoni gibi yan etkileri nedeni ile akut

gastroenteritlerin tedavisinde rutin kullanılmaları önerilmemektedir. Antimotilite ve

antisekretuvar ilaçların da ishale karşı kullanılması tavsiye edilmemektedir. Opiat ve

antikolinerjik bazlı ilaçların çocuklar üzerindeki toksisitesi, letarji, invajinasyon

koma ve hatta ölüm gibi yan etkileri belirlenmiştir (48).

Pek çok geniş spektrumlu antiviral ilaçların etkinliği in vivo şartlarda

rotavirüs replikasyonunun inhibitörü olarak araştırılmıştır. Anti-rotavirüs aktivitesine

sahip çeşitli adenozin analogları bulunmuştur. Bu anologların viral mRNA’nın

olgunlaşması için gerekli metilasyonu düzenlemede görevli olan S-adenozin

homosisteinin hidroliz enziminin aktivitesini engelleyerek işlev gördüğü ileri

sürülmüştür. Yapılan çalışmalarda raceadotril’in (enkephalinaz inhibitörü) rotavirüs

gastroenteritinin de içinde bulunduğu sulu ishali nedeniyle hastaneye yatan çocuk

hastaların tedavisinde etkili olduğu gösterilmiştir, ancak bu konu ile ilgili daha fazla

çalışmalara ihtiyaç vardır (51).

2.11. KORU�MA

Rotavirüs gastroenteritlerinin görülme sıklığı ve ağır hastalık yükü nedeni ile

hastalıktan korunma çok önem taşır. Korunmada anne sütü, el yıkama ve

dezenfeksiyon gibi önlemlerin yeri olsa da, bakteriyel gastroenteritlerden korunmada

önemli olan kişisel ve toplumsal hijyen kuralları rotavirüs enfeksiyonlarının

önlenmesinde çok etkili değildir. Rotavirüsların sebep olduğu gastroenteritler, hijyen

koşullarından bağımsız olarak, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde benzer sıklıkta

görülür. Bu sebeple rotavirüs ishalinin önlenmesinde tek etkili yöntem aşılamadır.

Rotavirüs aşısından beklenen doğal rotavirüs enfeksiyonuna benzer immünite

oluşturarak, orta ve ciddi enfeksiyona karşı koruması, hastane yatışları, ölümleri

21

önlemesi, morbidite ve ekonomik kayıpları azaltması ve hastalığın süre ve ciddiyetini

hafifletmesidir (52, 53).

İlk rotavirüs aşı çalışmalarında değişik hayvan rotavirüsları attenüe edilmiş

daha sonra ise insan çalışmaları başlatılmıştır. Hayvan orjinli aşılarla ilgili başarısız

deneyimlerin ardından reassortant aşı çalışmaları başlatılmıştır. İlk rutine sokulan

insan-maymun reassortant rotavirüs aşısı (RotaShield) 1990'larda geliştirilmiş olup

Amerika Birleşik Devletleri (ABD) ve Venezuella'da küçük çocuklarda şiddetli

rotavirüs ishalini önlemede güvenli ve etkili olduğu gösterilmiş ancak ABD’de 1.2

milyon doz aşı uygulamasından sonra 15 olguda invajinasyon gelişmesi nedeni ile

piyasaya verildikten 1 yıl sonra, Ekim 1999’da, ruhsatı devam etmesine rağmen

kullanımdan çekilmiştir (54).

Rotashield aşısının geri çekilmesi yeni aşı geliştirme çabalarını artırmıştır. İki

yeni rotavirüs aşısı monovalan Human Rotavirüs Aşısı (HRV) olan Rotarix

(GlaxoSmithKline) ve Pentavalan Human-Bovine Reassortant Rotavirüs Aşısı (PRV)

olan RotaTeq (Merck) ile ilgili etkinlik ve güvenilirlik çalışmaları tamamlanmış ve

2006 yılından itibaren bu 2 aşı 100’den fazla ülkede ruhsat alarak kullanıma

girmiştir. Her iki aşının da güvenilir olduğu ve invajinasyonle ilişkili olmadığı

gösterilmiştir. Herhangi bir rotavirüs ishaline karşı %70, şiddetli rotavirüs ishaline

karşı ise %90 koruma sağladığı gösterilmiştir (54). Rotavirüs aşılarının, hastane

yatışlarını (%96), acil servis başvurularını (%93), iş gücü kayıplarını (%87) azalttığı

gösterilmiştir (54,55).

Monovalan Human Rotavirüs Aşısı (HRV, RIX4414 suşu, Rotarix), insan

rotavirüs suşu G1P1A[8] tipinden oluşan canlı attenüe monovalan bir aşı olup virulan

rotavirüs suşu G1P1A[8] tipi doku kültürlerinde birçok pasaj yapılarak attenüe

edilmiştir. Barsakta iyi replike olur ve dışkı ile atılır. Rotarix korunmada homotipik

antikor yanıtı kadar heterotipik antikor yanıtını uyarır. Monovalan human rotavirüs

aşısı (HRV) ile G1’in yanısıra G2, G3, G4 ve G9 gibi diğer serotiplere karşı da

nötralizan antikor yanıtı oluşmaktadır (56-60). Rotarix aşısının 6 haftalıktan itibaren

oral yolla 2 doz (minimum 4 hafta arayla) uygulanması önerilir. HRV, 2-8oC’de

depolanmalı ve saklanmalıdır. Diğer çocukluk aşıları ile birlikte uygulanabilir.

22

Monovalan human rotavirüs aşısının immünojenisitesi ve güvenilirliği ilk kez

Belçika’da erişkinlerde ve Almanya’da 1 yaş üstü çocuklarda denenmiştir. Daha

sonra, Finlandiya’da bebeklerde bir pilot çalışma başlatılmıştır. Bu çalışmada; 2 ve 4.

ay şemasıyla 2 doz uygulandığında, HRV’nin etkinliğinin %73, ağır rotavirüs

gastroenteritine karşı koruyuculuğunun ise %90’dan fazla olduğu olduğu

gösterilmiştir (57). Güney Amerika’da yapılan daha geniş, çift kör, plasebo-kontrollü

çalışmada ise HRV aşısının etkinliği ve barsak tıkanması riski değerlendirilmiştir. On

bir Güney Amerika ülkesinin katıldığı ve 63.225 bebeğe aşı (31.673 bebek aşı grubu)

ve plasebo (31.552 bebek plasebo grubu) verilen çalışmada HRV, 2 ve 4. ayda

bebeklere 2 doz uygulanmıştır. Her hangi bir aşı dozundan sonraki 31 gün içinde

plasebo grubunda 9, aşı grubunda 3 barsak tıkanması vakası saptanmıştır. HRV’nin

ilk dozundan sonra 100 günlük izlem periyodunda (bebekler 6 aylık olduğunda) aşı

grubunda 9, plasebo grubunda ise 16 barsak tıkanması vakası görülmüştür. Çalışma

grubundaki 20.000 infantın 1 yıllık izleminde, aşının ağır rotavirüs gastroenteritine

karşı koruyuculuğunun %85, ağır dehidratasyonla seyreden rotavirüs gastroenteritine

karşı koruyuculuğunun ise %100 olduğu saptanmıştır. Monovalan human rotavirüs

aşısı, G1 serotipine karşı (%92) etkili olduğu gibi G3 (%88), G4 ve G9 (%91)

serotiplerine karşı da yüksek oranda koruyuculuk sağlamaktadır. G2 tipine karşı ise

%41-67 koruyuculuk sağladığı gösterilmiştir (59).

Pentavalan Human-Bovine Reassortant Rotavirüs Aşısı (PRV, RotaTeq), 5

insan-sığır reassortant rotavirüs suşundan oluşan pentavalan, canlı attenüe bir aşıdır.

Ensık görülen insan rotavirüs gerotiplerini (G1, G2, G3, G4 ve P1A[8]) içerir. İnsan

barsağında Rotarix suşlarına göre daha az replike olur. RotaTeq aşısı beş insan-sığır

reassortant rotavirüs suşundan oluşmakta olup sığır rotavirüs suşu WC3 (P7[5]G6)

kullanılmıştır. Bu aşının fazla sayıda serotip içerecek şekilde formüle edilmesindeki

amaç yüksek koruyucuk sağlamaktır. RotaTeq 2 mL sıvı formdadır ve oral yolla 3

doz (2, 4 ve 6 aylık) halinde uygulanır. İki doz arasında en az 4 hafta olması önerilir.

Aşılamaya 6-12 haftada başlanmalıdır. İlk dozun 12 haftadan büyük bebeklere

uygulanmasının güvenilirliği yoktur. Aşılama 32. haftaya kadar tamamlanmalıdır

(60).

23

PRV aşısının barsak tıkanması riskini değerlendirmek amacıyla, 2001 yılında

Finlandiya ve ABD’ de plasebo kontrollü bir çalışma uygulanmıştır. Bu çalışmada,

6- 12 haftalık bebeklere 4-10 hafta arayla 3 doz (en son aşı dozu 32 haftayı

geçmeyecek sekilde) PRV veya plasebo uygulanmıştır. Daha sonra, Orta Amerika

ülkeleri, İsveç, Almanya, Belçika, İtalya ve Tayvan’ın da katılımıyla çalışmaya

alınan bebek sayısı 70.301’e ulaşmıştır. Bu geniş çalışma grubunda, her hangi bir aşı

dozundan sonraki 42 gün içinde plasebo grubunda 5, aşı grubunda 6 barsak tıkanması

vakası saptanmıştır. PRV’nin ilk dozundan sonra 1 yıllık izlem periyodunda aşı

grubunda 12, plasebo grubunda ise 15 barsak tıkanması vakası bildirilmiştir. Barsak

tıkanması için relatif risk 42 gün içinde 1.6 (%95 CI, 0.4-6.4) ve 1 yılda 0.9 (%95 CI,

0.4-1.9) dur (59). RotaTeq Avrupa ve Amerika’da lisans almış olup yapılan ilk

çalışmalarda rotavirüs ile ilişkili ishale karşı yaklaşık %75 koruyucu ve ciddi ishale

karşı %90’dan fazla etkili olduğu bulunmuştur. Hospitalizasyonu %96 ve kliniklere

başvuruları %86 oranında azaltmaktadır (60).

Sonuç olarak, yaklaşık 130.000 bebek üzerinde yapılan çalışmalar her iki yeni

rotavirüs aşısının da (monovalan HRV ve PRV) ishal, özellikle ciddi ishale karşı

etkin ve güvenli bir korunma sağladığını göstermektedir. İki yeni rotavirüs aşısı

Rotarix ve Rotateq 2008 yılı itibariyle 100’den fazla ülkenin bulunduğu Avrupa,

Amerika, Meksika, Latin Amerika ülkeleri, Orta Doğu, Asya ve Afrika ülkelerinde

lisans alarak kullanıma girmiştir. Ülkemizde de bu iki yeni rotavirüs aşısı lisans

almış ve kullanıma girmiştir.

Bu iki aşı dışında, dünyanın birçok bölgesinde (Çin, Kore, Endonezya,

Almanya ve Brezilya) rotavirüs aşı geliştirme çalışmaları sürdürülmektedir. Lanzhou

lamb rotavirüs (LLR) aşısı 2000 yılında Çin’de Lanzhou Enstitüsü tarafından üretilen

monovalan canlı attenüe oral aşıdır. LLR aşısında kullanılan kuzu rotavirüsu

P[12]G10 tipinde olup ilk kez 1985’de izole edilmiştir ve hücre kültüründe pasajlar

yapılarak attenüe edilmiştir. Çin’de lisans alan bir aşıdır, Aşı tek doz oral yolla 2-24

aylık çocuklara verilir. Tek doz aşının etkinliği %73.3 bulunmuştur ve 12-23 aylık

çocuklarda etkiniğin %80.9 oranla 2-11 aylık çocuklara göre (%60) daha yüksektir

(60).

24

Aşı gelişimine başka bir yaklaşım yeni doğanlarda asemptomatik enfeksiyona

sebep olan bazı rotavirüs suşlarının kullanılmasıdır. İnsan neonatal rotavirüs

P2A[6]G3 suşu faz II çalışmasında 3, 5 ve 7 aylık bebeklere üç doz oral olarak

verilmiş ve koruyuculuğu %54 bulunmuştur. Aşının etkinliğinin artırılması için

çalışmalar sürmektedir. Diğer neonatal suşlardan ikisi Hindistan’da yeni doğanlardan

izole edilen 116E suşu P8[11]G9 ve I321 suşu P8[11]G10 canlı aşı adayları olup

preklinik çalışmaları yapılmaktadır. Bu neonatal aşı suşları (Bharat BioTech, Ltd)

116E ve I321 doğal olarak oluşan insan-sığır reassortant rotavirüsleridir (61).

Rotavirüs enfeksiyonlarına karşı inaktif rotavirüs suşları veya baculovirüs’ta

eksprese edilen virüs benzeri partiküllerin kullanılarak oral aşıların geliştirilmesi için

çalışmalar da vardır ve hayvan modellerinde test edilmektedir. Ayrıca rotavirüsün

bakterilerde eksprese edilen birçok yapısal proteinlerinden oluşan subünit aşıların

üretimi ve DNA aşıları için de çalışılmaktadır (62).

25

3. GEREÇ VE YÖ�TEM

Bu çalışmaya, Ocak 2008 ile Ocak 2009 tarihleri arasında Ankara

Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları Bölümüne başvuran, 0-5

yaş arası akut gastroenteriti olan ve dışkı örneklerinde immünokromatografik test ile

rotavirüs antijeni pozitif saptanan hastalar dahil edildi. Taze dışkıda grup A rotavirüs

antijeni varlığı saptanan hastalara rotavirüs gastroenteriti tanısı konuldu. Hastalardan

elde edilen dışkı örnekleri Revers Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-

PCR) ile tiplendirme yapılıncaya kadar -70°C’de saklandı.

3.1. Rotavirüs Antijen Tayini

Taze dışkı örneklerinde rotavirüs antijen varlığı Certest, Biotec marka

kalitatif immünokoromatografik test ile gösterildi. Dışkı örneği 1 mL tampon çözelti

ile süspanse edildikten sonra yaklaşık 150 mikroL karışım kit içerisinde bulunan strip

üzerine damlatıldı ve sıvının reaksiyon alanına doğru ilerlemesi beklenerek 10

dakika sonra değerlendirildi. Yeşil renkli kontrol bandına ek olarak T harfi ile

belirlenen bölgede kırmızı bandın ortaya çıkması durumunda rotavirüs antijeni

pozitif kabul edildi. Testler Ankara Üniversitesi Cebeci Hastanesi Merkez

Mikrobiyoloji Laboratuvarı’nda bir teknisyen tarafından uygulandı ve sonuçlar

laboratuvar kayıt defterine kaydedildi.

Çalışmaya dahil edilen tüm hastaların demografik özellikleri (yaş ve

cinsiyet), başvurdukları ay, ölçülen en yüksek vücut sıcaklıkları, ishal ve kusma

süreleri, günlük ishal ve kusma sayıları, dehidratasyon dereceleri, yatarak ya da

ayaktan izlem gerekliliği, oral ya da parenteral hidrasyon gereksinimleri kaydedildi.

Olguların hepsi Ruuska ve Vesikari (4) tarafından tanımlanan rotavirüs gastroenteriti

sayısal skorlama sistemine göre değerlendirilerek 0-20 puan arası olacak şekilde

skorlandı (Tablo 1). Bu skorlama sistemine göre ≤5 puan alanlar hafif, 6-10 arası

puan alanlar orta, ≥11 puan alanlar ağır hastalık olarak kabul edildi.

26

Tablo 1. Rotavirüs gastroenteriti sayısal skorlama sistemi (4).

Bulgular Puan

İshalin süresi (gün)

1-4

5

> 6

1

2

3

Maksimum dışkılama sayısı/24 saat

1-3

4-5

> 6

1

2

3

Kusmanın süresi (gün)

1

3

> 3

1

2

3

Maksimum kusma sayısı/24 saat

1

2-4

> 5

1

2

3

Ateş

< 37.0o C

37.1-38.4o C

38.5-38-9o C

> 39o C

0

1

2

3

Dehidratasyon

Yok

%1-5

> %6

0

2

3

Tedavi

Yok

Rehidratasyon

Hastaneye yatış

0

1

2

Örnek toplama tamamlandıktan sonra saklanan dışkı örneklerinden sırası ile

aşağıda belirtilen yöntemler doğrultusunda rotavirüs tipleri çalışıldı.

27

3.2. Gaita Örneklerinden Rna Ekstraksiyonu

RNA ekstraksiyonunda asit guanidin tiyosiyanat/fenol-kloroform

ekstraksiyon yöntemi kullanıldı. Total RNA izolasyon ajanı Trizol (Gibco BRL,

Katalog no: 15596-026) kullanılarak, üreticinin önerileri doğrultusunda yapıldı. Tüm

işlemler eldiven, maske ve gözlük kullanılarak gerçekleştirildi. Toplanan gaita

örnekleri, fosfat ile tamponlanmış salin (PBS) solüsyonu içerisinde santrifüjlenek

%20 oranında sulandırılarak süspanse edildikten sonra, bu süspansiyondan alınan

500 µL örnek, 1.5 mL’lik mikrosantrifüj tüpü içerisinde eşit hacimde Trizol ile

pipetaj yapılarak homojenize edildi. Homojenize edilen örnekler, oda ısısında 15-30

dakika inkübe edilerek nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışması sağlandı.

Üzerlerine 0,2 mL kloroform eklenerek 15 saniye süreyle elde hızla çalkalandı ve

oda ısısında 2-3 dakika inkübe edildi. Daha sonra örnekler 12000 x g’de, +4 °C’de,

15 dakika santrifüjlendi. Santrifüj işlemi sonrasında en altta kırmızımsı renkli fenol-

kloroform fazı, ortada bir ara faz ve en üstte renksiz bir sıvı fazı olmak üzere üç faz

elde edildi. RNA’yı içeren en üstteki faz yeni bir tüpe alınarak 0,5 mL izopropil alkol

içerisinde çöktürüldü. Örnekler oda ısısında 10 dakika inkübe edildikten sonra 12000

x g’de, +4 °C’de, 10 dakika santrifüjlendi. Bu aşamada tüpün altı ve yanlarında RNA

çöküntüsü gözlendi. Süpernatan atıldıktan sonra pellet 1 mL %75 etanol ile yıkandı.

Örnek vortekslenerek karıştırıldı ve 7500 x g’de, +4 °C’de, 5 dakika santrifüjlendi.

Etanol uzaklaştırıldıktan sonra pellet 5-10 dakika oda ısısında kurumaya bırakıldı ve

elde edilen RNA, RNase içermeyen su içerisinde birkaç kere pipetaj yapılarak ve 55

°C’de 10 dakika inkübe edilerek çözündürüldü.

3.3. cD�A Eldesi

cDNA sentez kiti (Roche diagnostik, Almanya) ile A grubu rotavirüslerin

VP7 ve VP4 gen bölgelerine spesifik primerler (Beg9, End9 ve con2, con3)

kullanılarak, üreticinin önerileri doğrultusunda her örnek için iki ayrı cDNA sentezi

gerçekleştirildi. Bunun için, 5 µl RNA örneği toplam hacim 12,5 µL olacak şekilde,

her bir primerden 1,5 µL (15 pmol) içerecek şekilde karıştırıldı. Hazırlanan karışım

65 °C’de 5 dakika inkübe edildikten sonra üzerine, kit içerisinde sunulan 5X

28

reaksiyon tamponu (4 µL), dNTP karışımı (2 µL), revers transkriptaz enzimi (1 µL)

ve Ribolock (0,5 µL) eklendi. Karışım, 42 ºC’de 60 dakika, 72 ºC’de 10 dakika

bekletildikten sonra PCR yapılana kadar +4 ºC’de muhafaza edildi.

3.4. VP7 (G) Genotiplerinin Belirlenmesi

Bu amaçla, A grubuna ait olarak belirlenen örneklerden, literatürde belirtilen

yöntem üzerinde minör değişiklikler yapılarak, iki aşamalı PCR reaksiyonu

gerçekleştirildi (63). İlk aşamada Beg9 (5’ GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC

3’) ve End9 (5’ GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA TCT AAG 3’) primerleri

kullanılarak elde edilen cDNA’lardan, yine aynı primerler kullanılarak gen9

bölgesinin tamamı (1062 bç) amplifiye edildi (Şekil 3).

Şekil 3. beg9 ve end9 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen Rotavirüsün VP7 bölgesine

ait 1062 bç uzunluğundaki genom bölgesi, M: 50 bç’lik moleküler büyüklük

belirleyici (Fermantas, Litvanya), 1-5: Hastalara ait PCR ürünleri, NK: negatif

kontrol

Bu amaçla, 50 µL toplam hacim içerisinde, 5 µL cDNA, 2,5 mM MgCl2, 0,2

mM dNTP karışımı, 30 pmol Beg9 ve End9 primerleri, 2,5 U Taq DNA polimeraz

enzimi ve %7 BSA olacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı. PCR şartları şu

M 1 2 3 4 5 NK

29

şekilde gerçekleştirildi: 94 °C’de 2 dakika ilk denatürasyonu takiben, 30 siklus

olacak şekilde 94 °C’de 1 dakika, 40 °C’de 2 dakika, 72 °C’de 2 dakika, son olarak

72 °C’de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen ürünler %2’lik agaroz jel

elektroforezinde 100V altında 2 saat yürütüldükten sonra etidyum bromid ile

boyanarak UV altında görüntülendi. Bu aşama sonunda gözle görülebilir bir

amplifikasyon ürünü olmasa bile tüm PCR ürünleri 2. amplifikasyona tabi tutuldu.

İkinci amplifikasyonda, VP7 tiplerini belirlemek üzere, 7,5 µL PCR ürünü, 15

pmol tiplendirme primerleri aAT8 (5’GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG 3’),

aBT1 (5’ CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 3’), aCT2 (5’ CAA TGA TAT

TAA CAC ATT TTC TGT G 3’), aDT4 (5’ CGT TTC TGG TGA GGA GTT G 3’),

aET3 (5’ CGT TTG AAG AAG TTG CAA CAG 3’), aFT9 (5’ CTA GAT GTA

ACT ACA ACT AC 3’) ve RVG9 (5’ GGT CAC ATC ATA CAA TTC T 3’), 2,5 U

Taq polimeraz, 2,5 mM MgCl2, ve 0,2mM dNTP karışımı içerecek şekilde 100

µL’lik reaksiyon karışımı hazırlandı. PCR şartları şu şekilde ayarlandı: 94 °C’de

1dakika, 42 °C’de 2 dakika, 72 °C’de 1 dakika olacak şekilde 30 siklusu takiben 72

°C’de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen PCR ürünleri %2’lik agaroz jel

elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında

görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre G1 (749 bç), G2 (652 bç), G3

(374 bç), G4 (583 bç), G8 (885 bç) ve G9 (306 bç) tipleri tespit edildi (63).

3.5. VP4 (P) Genotiplerinin Belirlenmesi

Bu amaçla, A grubuna ait olarak belirlenen örneklerden, literatürde belirtilen

yöntem üzerinde minör değişiklikler yapılarak, iki aşamalı PCR reaksiyonu

gerçekleştirildi (64). İlk aşamada con2 (5’ ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC 3’)

ve con3 (5’ TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A 3’) primerleri kullanılarak elde

edilen cDNA’lardan, yine aynı primerler kullanılarak gen4 bölgesinin tamamı (876

bç) amplifiye edildi. Bu amaçla, 50 µL toplam hacim içerisinde, 5 µL cDNA, 2,5

mM MgCl2, 0,2 mM dNTP karışımı, 30 pmol con2 ve con3 primerleri, 2,5 U Taq

DNA polimeraz enzimi ve %7 BSA olacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı.

30

PCR şartları şu şekilde gerçekleştirildi: 94 °C’de 2 dakika ilk denatürasyonu takiben,

30 siklus olacak şekilde 94 °C’de 1 dakika, 50 °C’de 2 dakika, 72 °C’de 2 dakika,

son olarak 72 °C’de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen ürünler %2’lik

agaroz jel elektroforezinde 100V altında 2 saat yürütüldükten sonra etidyum bromid

ile boyanarak UV altında görüntülendi (Şekil 4). Bu aşama sonunda gözle görülebilir

bir amplifikasyon ürünü olmasa bile tüm PCR ürünleri 2. amplifikasyona tabi

tutuldu.

Şekil 4. con 2 ve con 3 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen Rotavirüsün VP4 bölgesine

ait 876 bç uzunluğundaki genom bölgesi, M: 50 bç’lik moleküler büyüklük

belirleyici (Fermantas, Litvanya), 1-5: Hastalara ait PCR ürünleri, NK: negatif

kontrol

İkinci amplifikasyonda, VP4 tiplerini belirelemek üzere, 7,5 µL PCR ürünü,

15 pmol tiplendirme primerleri 1T-1 (5’ TCT ACT TGG ATA ACG TGC 3’), 2T-1

(5’ CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 3’), 3T-1 (5’ TGT TGA TTA GTT GGA

TTC AA 3’), 4T-1 (5’ TGA GAC ATC GCA ATT GGA C 3’), 5T-1 (5’ ATC ATA

GTT AGT AGT CGC 3’), HCR3 (5’ TGA TTG AGC TTT TAA TGA TAT CAC 3’)

ve con3, 2,5 U Taq polimeraz, 2,5 mM MgCl2, ve 0,2 mM dNTP karışımı içerecek

şekilde 100 µL’lik reaksiyon karışımı hazırlandı. PCR şartları şu şekilde ayarlandı:

94 °C’de 1dakika, 50 °C’de 2 dakika, °72 C’de 2 dakika olacak şekilde 30 siklusu

31

takiben 72 °C’de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen PCR ürünleri %2’lik

agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV

altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre P4 (345 bç), P6 (483 bç),

P8 (267 bç), P9 (391 bç), P10 (583 bç) ve HCR3 (749 bç) tipleri tespit edildi (63,65).

3.6. Az rastlanan (sığır/domuz kökenli) A grubu rotavirüslerin VP7 (G)

Tiplendirmesi

G tiplendirmesi yapılamayan örnekler, sıklıkla sığır/domuz kökenli olmakla

beraber insanlarda da enfeksiyon yapabilen G tiplerini belirlemek üzere ilk gen4

amplifikasyonunu takiben elde edilen PCR ürünlerinin 5 µL’si şablon olarak

kullanılarak, Beg9, FT5 (5’CAT GTA CTC GTT GTT ACG TG 3’), DT6 (5’ CTA

GTT CCT GTG TAG AAT C 3’), HT8 (5’ CGG TTC CGG ATT AGA CAC 3’),

ET10 (5’ TTC AGC CGT TGC GAC TTC 3’) ve BT11 (5’ GTC ATC AGC AAT

CTG AGT TGC 3’) primerleri ile ikinci bir amplifikasyona tabi tutuldu. Reaksiyon

karışımı, 25 µL toplam hacim içerisinde 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 10 pmol

primer ve %8 BSA içerecek şekilde hazırlandı. PCR şartları 30 siklus olmak üzere şu

şekilde uygulandı: 94 °C’de 1 dakika, 55 °C’de 2 dakika, 72 °C’de 1 dakika. Elde

edilen ürünler, %2’lik agaroz jel elektroforezine tabi tutularak etidyum bromid ile

boyandıktan sonra UV altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre

G5 (780 bç), G6 (500 bç), G8 (274 bç), G10 (715 bç) ve G11 (337 bç) genotipleri

belirlenmiş oldu (66).

3.7. Az rastlanan (sığır/domuz kökenli) A grubu rotavirüslerin VP4 (P)

Tiplendirmesi

P tiplendirmesi yapılamayan ancak A grubu olduğu belirlenen örnekler,

sıklıkla sığır/domuz kökenli olmakla beraber insanlarda da enfeksiyon yapan P

tiplerini belirlemek üzere ilk gen4 amplifikasyonunu takiben, elde edilen PCR

ürünlerinin 5 µL’si şablon olarak kullanılarak, con2, PNCDV (5’ CGA ACG CGG

GGG TGG TAG TTG 3’), pUK (5’ GCC AGG TGT CGC ATC AGA G 3’), pOSU

(5’ CTT TAT CGG TGG AGA ATA CGT CAC 3’), pGott (5’ GCT TCA ACG TCC

TTT AAC ATC AG 3’) ve pB223 (5’ GGA ACG TAT TCT AAT CCG GTC 3’)

32

primerleri kullanılarak ikinci amplifikasyona tabi tutuldu. Reaksiyon karışımı, 25 µL

toplam hacim içerisinde 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 10 pmol primer ve %8 BSA

içerecek şekilde hazırlandı. PCR şartları 30 siklus olmak üzere şu şekilde uygulandı:

94 °C’de 1 dakika, 55 °C’de 2 dakika, 72 °C’de 1 dakika. Elde edilen ürünler, %2’lik

agaroz jel elektroforezine tabi tutularak etidyum bromid ile boyandıktan sonra UV

altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre az rastlanan P genotipleri

olan PNCDV (sığır kaynaklı-620 bç), pUK (sığır kaynaklı-552 bç), pOSU (domuz

kaynaklı-500 bç), pGott (domuz kaynaklı-423 bç) ve pB223 (sığır kaynaklı-314 bç)

belirlenmiş oldu (67).

RT-PCR ile G ya da P tipleri belirlenemeyen hastalar çalışma dışı bırakıldı.

Belirlenen rotavirüs G genotipleri ile klinik skor puanları arasındaki ilişki araştırıldı.

3.8. İstatistik

İstatistiksel analizler SPSS programı kullanılarak Ankara Üniversitesi Tıp

Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı’nda yapıldı.

Olguların istatistiksel değerlendirmeleri non parametrik testler ile yapıldı.

Verilerin analizi için Mann Whitney-U, ki-kare ve medyan testleri kullanıldı.

Belirlenen rotavirüs genotipleri arasında klinik skor puanı ve yatarak ya da ayaktan

izlem açısından fark olup olmadığı Kruskal Wallis Testi (ANOVA) ile

değerlendirildi. p<0.05 bulunan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Çalışmamız Helsinki deklarasyonu prensiplerine göre ve hastanemiz etik

kurulundan alınan onay ile yürütüldü. Hasta aileleri çalışma ile ilgili olarak detaylı

bir şekilde bilgilendirilerek ve onamları alınarak bu çalışmaya dahil edildi.

Bu çalışma Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi

tarafından 2008 08 09 264 proje numarası ile desteklendi.

33

4. BULGULAR

Çalışma süresince Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Enfeksiyon

Hastalıkları Bölümüne başvuran 5 yaş altı akut gastroenteriti olan 494 hastadan

dışkıda immünokoromatografik yöntem ile rotavirüs antijen tayini istendi. Grup A

rotavirüs antijeni pozitif saptanan toplam 137 (%28.1) hastanın dışkı örnekleri

saklanarak demografik ve klinik verileri kayıt edildi. Bu gruptaki çocukların

hiçbirine rotavirüs aşısı uygulanmamıştı. Saklanan 137 dışkı örneği daha sonra RT-

PCR ile incelendiğinde 100 (%72.9) hastanın G ya da P genotipi belirlenebilirken tip

tayini yapılamayan 37 hasta çalışma dışı bırakıldı.

RT-PCR ile rotavirüs tipi belirlenen 100 hastadan 57’si (%57) erkek, 43’ü

(%43) kız hasta idi. Hastaların ortanca yaşı 16 ay (5 gün-59 ay) olarak saptandı.

Hastaların yaşlara göre dağılımı; <3 ay 13 hasta (%13), 3-5 ay arası 7 hasta (%7), 6-

11 ay arası 14 hasta (%14), 12-23 ay arası 34 hasta (%34), 24-35 ay arası 12 hasta

(%12), 36-47 ay arası 6 hasta (%6), 48-59 ay arası 14 hasta (%14) arasında idi.

Olguların büyük çoğunluğu 24 ayın altındaki (n=68, %68) çocuklardan oluşuyordu.

RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların yaşlara göre dağılımı Şekil 5 ile

gösterildi.

0

5

10

15

20

25

30

35

hast

a sa

yısı

< 3ay 3-5 ay 6-11 ay 12-23 ay 24-35 ay 36-47 ay 48-59 ay

Şekil 5. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların yaşlara göre dağılımı

Yaş (ay)

34

Olguların 38’i (%38) kış, 24’ü (%24) sonbahar, 25’i (%25) ilkbahar, 11’i

(%11) yaz mevsiminde başvurdu. On dört hasta (%14) Ocak ayında, 10 hasta (%10)

Şubat, 6 hasta (%6) Mart, 10 hasta (%10) Nisan, 9 hasta (%9) Mayıs, 4 hasta (%4)

Haziran, 3 hasta (%3) Temmuz, 4 hasta (%4) Ağustos, 2 hasta (%2) Eylül, 8 hasta

(%8) Ekim, 14 hasta (%14) Kasım, 14 hasta (%14) da Aralık aylarında başvurdu.

Rotavirüs enfeksiyonu tüm yıl boyunca görülmekle birlikte sonbahar ve kış aylarında

pik yaptığı görüldü. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların aylara göre

dağılımı Şekil 6 ile gösterildi.

0

2

4

6

8

10

12

14

Ocak

Şubat

Mar

t

Nisan

May

ıs

Hazira

n

Temm

uz

Ağusto

sEylü

l

Ekim

Kasım

Aralık

hast

a sa

yısı

Şekil 6. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların aylara göre dağılımı

Hastaların 58’i (%58) ayaktan izlenirken 42’si (%42) yatırılarak izlendi.

Ayaktan izlenen 58 hastanın 15 (%25.9)’inde rehidrasyon desteğine ihtiyaç

duyulmaz iken 43 (%74.1) hastaya oral rehidrasyon önerildi. Yatırılarak izlenen 42

hastanın hepsine parenteral sıvı desteği verildi. Yatırılarak izlenen hastaların ortanca

yaşı 11 ay (5 gün-59 ay), ayaktan izlenen hastaların ortanca yaşı ise 22 ay (3,5-59 ay)

olarak bulundu. Her iki grup arasında ortanca yaş açısından istatistiksel olarak

anlamlı fark vardı (p=0.002).

Hastalar Vesikari tarafından tanımlanan rotavirüs ishali sayısal skorlama

sistemine göre değerlendirildiğinde ortanca klinik skor puanı 10 (3-18) olarak

bulundu. Beş puan ve altında alan 7 hasta (%7) hafif, 6-10 puan arasında alan 51

hasta (%51) orta, ≥11 puan alan 42 hasta (%42) ise ağır rotavirüs gastroenteriti

35

olarak kabul edildi. Ayaktan izlenen hastaların ortanca skor puanı 9 (3-14),

yatırılarak izlenenlerin ortanca skor puanı ise 12 (4-18) olarak bulundu. Ayaktan ve

yatırılarak izlenen hastaların ortanca skor puanları karşılaştırıldığında istatistiksel

olarak anlamlı fark vardı (p<0.001). Ayaktan ve yatan hastaların yaş ve klinik skor

puanları açısından karşılaştırılması Tablo 2’de gösterildi. Olguların klinik skor

puanları ile yaşları arasındaki ilişkiye bakıldığında anlamlı bir ilişki saptanamadı

(p=0.649 r= -0.047).

Tablo 2. Ayaktan ve Yatan Hastaların Yaş ve Skor Puanı Açısından Karşılaştırılması

Ayaktan Yatan P

Yaş 22 ay (3-59 ay) 11 ay (5 gün-59ay) P=0.002

Klinik Skor Puanı 9 (3-14) 12 (4-18) P<0.001

Dışkı örneklerinden önce RT-PCR testi ile VP4 (P) ve VP7 (G) rotavirüs

genomları ve ardından multipleks PCR testi ile P (VP4) ve G (VP7) genotipleri tespit

edildi (Şekil 7 ve Şekil 8).

Şekil 7. VP4 multiplex PCR ürünleri: M: 50 bç moleküler büyüklük belirteci (Fermentas,

Litvanya), 1-3: P[6] (483 bç), 4: P[8] (267 bç), 5: P[6] (483 bç) + P[8] (267 bç),

6:P[4] (345 bç), 7: P[10] (583 bç), 8: HCR3 (749 bç), 9: P[8] (267 bç) + HCR3

(749 bç), NK: negatif kontrol.

36

Şekil 8. VP7 multiplex PCR ürünleri: M1: 50 bç moleküler büyüklük belirteci, (Fermantas,

Litvanya), M2: 50 bç moleküler büyüklük belirteci (GM 345Bio Basic, Kanada), 1:

G4 + G9 (583 bç + 306 bç), 3: G2 (652 bç), 4: G3 (374 bç), 5: G1 (749 bç).

İmmünokromatografik yöntem ile rotavirüs antijeni pozitif saptanan 137

örnekten 100’ünde RT-PCR yöntemi ile VP7 (G genotip) ya da VP4 (P genotip)

varlığı pozitif bulundu. Hastalardan 90’ında (%90) hem G (VP7) hem de P (VP4)

genotipi belirlenebilirken, 6 hastada (%6) G (VP7), 4 hastada (%4) P (VP4) genotipi

belirlenemedi.

Rotavirüsün VP7 bölgesine ait G genotiplerinden G1 %11 oranla tek başına

11 örnekte, G2 %13 oranla tek başına 13 örnekte, G3 %9 oranla tek başına 9 örnekte,

G4 %12 oranla tek başına 12 örnekte, G5 %2 oranla tek başına 2 örnekte, G8 %3

oranla tek başına 3 örnekte ve G9 %30 oranla tek başına 30 örnekte tespit edildi. G

genotiplerinden G1+G2 %1 oranla 1 örnekte, G1+G9 %2 oranla 2 örnekte, G2+G3

%1 oranla 1 örnekte, G2+G4 %3 oranla 3 örnekte, G4+G9 %4 oranla 4 örnekte,

G1+G4+G9 %1 oranla 1 örnekte, G2+G4+G9 %2 oranla 2 örnekte bulundu. Geriye

37

kalan 6 örnekte (%6) G genotipi belirlenemedi. G genotiplerinden 14 örnekte (%14)

miks enfeksiyon bulundu. Rotavirüs G genotiplerinin dağılımı Tablo 3’de gösterildi.

Tablo 3. RT-PCR ile belirlenen G genotiplerinin dağılımı

G genotipleri Sayı (n) %

G1 11 11

G2 13 13

G3 9 9

G4 12 12

G5 2 2

G8 3 3

G9 30 30

G1+G2 1 1

G1+G9 2 2

G2+G4 3 3

G2+G3 1 1

G4+G9 4 4

G1+G4+G9 1 1

G2+G4+G9 2 2

Tiplendirilemeyen 6 6

Toplam 100 100

Rotavirüsün VP4 bölgesine ait P genotiplerinden P[4] %3 oranla tek başına 3

örnekte, P[6] %12 oranla tek başına 12 örnekte, P[8] %55 oranla tek başına 55

örnekte, P[10] %7 oranla tek başına 7 örnekte, HCR3 %1 oranla tek başına 1 örnekte,

PGott %1 oranla tek başına 1 örnekte, P[4]+P[8] %2 oranla 2 örnekte, P[6]+P[8] %8

38

oranla 8 örnekte, P[4]+P[10] %1 oranla 1 örnekte, P[4]+P[6]+P[8] %1 oranla 1

örnekte, P[8]+P[10] %3 oranla 3 örnekte, P[8]+HCR3 %1 oranla 1 örnekte ve

PGott+PUK %1 oranla 1 örnekte bulundu. Geriye kalan 4 örnekte (%4) P genotipi

belirlenemedi. P genotiplerinden 17 (%17) örnekte miks enfeksiyon bulundu.

Rotavirüs P genotiplerinin dağılımı Tablo 4’de gösterildi.

Tablo 4. RT-PCR ile belirlenen P genotiplerinin dağılımı

P genotipleri Sayı (n) %

P[4] 3 3

P[6] 12 12

P[8] 55 55

P[10] 7 7

HCR3 1 1

PGott 1 1

P[4]+P[8] 2 2

P[6]+P[8] 8 8

P[4]+P[10] 1 1

P[8]+P[10] 3 3

P[8]+HCR3 1 1

PGott+PUK 1 1

P[4]+P[6]+P[8] 1 1

Tiplendirilemeyen 4 4

Toplam 100 100

RT-PCR ile 100 örneğin 90’ında (%90) her iki G ve P tipleri belirlendi ve 34

farklı rotavirüs G/P kombinasyonu elde edildi. Çalışmamızda en baskın rotavirüs

genotipi 19 hastada (%19) G9P[8] olup bunu 7 hastada %7 oranla G1P[8] ve 7

hastada (%7) G4P[6] izledi. G3P[8] 6 hastada (%6), G2P[8] 5 hastada (%5),

39

G9P[10] 4 hastada (%4), G8P[8] 3 hastada (%3), G1P[4], G2P[10], G3P[6] ve

G5P[8] 2’şer hastada (%2’şer), G2HCR3, G2P[6], G4P[10], G4P[8] ve G9PGott 1’er

hastada (%1’er) saptandı. Tek bir G/P genotip enfeksiyonu toplam 64 (%64) vakada

bulundu. Geri kalan 26 hastada (%26) ise miks enfeksiyon vardı. G1+G9 P[8],

G2+G4+G9 P[8], G2+G4 P[8], G2 P[6]+P[8], G4+G9 P[6]+P[8], G9 P[4]+P[8], G9

P[6]+P[8], G9 P[8]+P[10] 2’şer hastada, G2 P[8]+P[10], G4+G9 P[6], G2+G3 P[8],

G1+G2 P[6]+P[8], G2+G4 P[4]+P[6]+P[8], G1+G4+G9 P[8], G4+G9 PGott+PUK,

G4 P[6]+P[8], G4 P[4]+P[10], G4 P[8]+HCR3 1’er hastada saptandı. Her iki G ve P

tipi belirlenen hastalar Tablo 5’te gösterildi.

Tablo 5. RT-PCR ile belirlenen her iki G ve P tiplerinin dağılımı

G tipi P tipi

P[4] P[6] P[8] P[10] HCR3

P

Gott

P[4]+

P[8]

P[6]+P[8]

P[4]+P[10]

P[8]+P[10]

P[8]+HCR3

PGott

+

PUK

P[4]+

P[6]+P[8]

P Tiplendirile

meyen

Toplam

G1 2 7 2 11

G2 1 5 2 1 2 1 1 13

G3 2 6 1 9

G4 7 1 1 1 1 1 12

G5 2 2

G8 3 3

G9 19 4 1 2 2 2 30

G1+G2 1 1

G1+G9 2 2

G2+G4 2 1 3

G2+G3 1 1

G4+G9 1 2 1 4

G1+G4

+G9

1 1

G2+G4

+G9

2 2

G Tiplendirilemeyen 1 1 4 6

Toplam 3 12 55 7 1 1 2 8 1 3 1 1 1 4 100

40

Rotavirüs tipleri belirlenen hastalarda belirlenen G genotipleri arasında klinik

skor puanları açısından fark olup olmadığı araştırıldı. Ortanca klinik skor puanları

tek başına G1 genotipi pozitif olan 11 hastanın 11 (9-18), G2 genotipi pozitif olan 13

hastanın 9 (7-15), G3 genotipi pozitif olan 9 hastanın 10 (4-13), G4 genotipi pozitif

olan 12 hastanın 10.5 (3-14 ), G9 genotipi pozitif olan 30 hastanın 9.5 (4-17), G9 ile

miks enfeksiyonu olan 9 hastanın 12 (6-15) olarak bulundu. En sık görülen bu 6 grup

G genotipleri arasında klinik skor puanları açısından anlamlı bir fark saptanmadı

(p=0,53). Yine bu 6 grup hasta arasında yatarak ya da ayaktan izlem açısından da

fark saptanmadı (p=0,95) (Tablo 6).

Tablo 6. G genotiplerine göre klinik skor puanları

VP7 (G) Klinik Skor Puanı

G1 11 (9-18)

G2 9 (7-15)

G3 10 (4-13)

G4 10.5 (3-14)

G9 9.5 (4-17)

G9 miks 12 (6-15)

(klinik skor puanları için p=0,53)

Tablo 7. G genotiplerine göre yatan ya da ayaktan hasta sayıları

VP7 (G) Yatan Ayaktan

G1 6 5

G2 6 7

G3 4 5

G4 6 6

G9 13 17

G9 miks 3 6

(ayaktan ya da yatarak izlem için p=0,98)

41

5. TARTIŞMA

Rotavirüsler tüm dünyada çocukluk çağı ishallerin en sık nedenidir. Dünyanın

pek çok ülkesinde yapılan çalışmalarda akut gastroenteritlerde rotavirüs insidansı

belirlenmiştir. Coğrafi bölgelere göre insidans farklılıkları görülebilmektedir (1).

Ülkemizden farklı bölgelerden yapılan çalışmalarda rotavirüs sıklığı değişiklik

göstermekte %21-39 arasında değişmektedir. Yıldırmak ve ark 1989-1990 (68),

Şıklar ve ark 1998-1999 (69), Karadağ ve ark 1999-2002 (70), Bozdayı ve ark.’nın

(71) 2004-2005 yılları arasında Ankara bölgesinde yaptıkları çalışmalarında rotavirüs

sıklığını sırası ile %29, %22.7, %36.8 ve %39.7 olarak bulmuşlardır. Kurugöl ve ark.

(72) İzmir’de %39.8, Bulut ve ark. (73) Malatya’da %21, Gül ve ark. (74)

Kahramanmaraş’ta %25.7, Türkoğlu ve ark. (75) İstanbul’da %25.4, Çataloluk ve

ark. (76) Gaziantep’te %23.4, Ceyhan ve ark. (77) 4 farklı ilde (Ankara, Adana,

İstanbul, İzmir) %53 sıklıkta rotavirüs pozitifliği saptamışlardır. Bizim çalışmamızda

da 5 yaş altı çocuklarda rotavirüs sıklığı %28.1 olarak saptanmış ve literatürle

uyumlu olduğu görülmüştür. Dünyanın bazı ülkelerinde rotavirüs pozitiflik oranı

ABD’de %17-69, Almanya’da %16, Hindistan’da %20-28, Pakistan’da %20’dir (1).

Bu verilerin ışığında hastalığın görülme sıklığının hem gelişmiş hem de gelişmekte

olan ülkelerde benzer olduğu görülmektedir.

Rotavirüse bağlı gastroenteritlerin mevsimsel özelliği olduğu bilinmektedir.

Rotavirüs enfeksiyonu ılıman iklimlerde genellikle endemik olup özellikle kış ayları

boyunca görülür (2). Amerika’da ve Avrupa’da benzer özellikler sergileyerek Aralık-

Mart döneminde pik yapmaktadır. Hindistan ve Suudi Arabistan’da aynı şekilde kışın

pik yapmasına karşılık İran’da yapılan bir çalışma’da kış mevsiminde %7 gibi düşük

oranda gözlendiği pik zamanının ise ilkbahar olduğu bildirilmiştir. Afrika’da ise

sıklıkla kurak mevsimlerde pik yaptığı izlenmiştir (3). Oysa tropikal bölgelerde

rotavirüs ishali bütün yıl boyunca görülür. Nadiren salgınlardan sorumlu olabilir.

Ülkemizde yapılan çalışmalarda rotavirüs ishalleri yıl boyunca görülmektedir.

Karadağ ve ark (70) Ankara’da yaptıkları çalışmada hastalığın pik döneminin Kasım-

Nisan döneminde, Kurugöl ve ark. (72) İzmir’de yaptıkları çalışmada Ocak-Mart

arasında, Bozdayı ve ark. (71) Ankara’da yaptıkları çalışmada kış ve sonbahar

42

aylarında olduğunu saptamışlardır. Çalışmamızda da daha önceki çalışmalara paralel

olarak rotavirüs pozitifliği bütün yıl boyunca görülmekle birlikte en çok kış ve

sonbahar aylarında en az da yaz aylarında saptanmıştır.

Rotavirüs ishallerinin ve dolaşan suşların populasyonda yıl boyunca

görülmesi gen değişimine olanak sağlayarak suşların çeşitlilik olasılığını artırabilir.

Bu durum Hindistan gibi tropikal ve subtropikal iklime sahip ülkelerde

görülebilmektedir (71).

Tüm dünyada hemen hemen çocukların hepsi 5 yaşına kadar rotavirüs ile

enfekte olur. Rotavirüse bağlı gastroenterit sıklığı yaşla birlikte azalmaktadır.

Gelişmekte olan ülkelerde primer rotavirüs enfeksiyonu daha erken yaşlarda

görülürken gelişmiş ülkelerde primer hastalık yaşı daha geç yaşlara kayar. Örneğin

Irak’ta rotavirüs ishallerinin %75’i, İran’da da %90’ı 1 yaş altında görülmektedir

(71). Çalışmamızda rotavirüs enfeksiyonu en sık 12-24 ay arasındaki çocuklarda

saptanırken olguların %68’i 2 yaş ve altında, %45.3’ü 1 yaş ve altında idi. Kurugöl

ve ark. (72) olguların %80.6’sının, Karadağ ve ark. (70) %43.7’sinin, Gül ve ark

(74) %71’inin, Bozdayı ve ark.(71) %70’inin, Ceyhan ve ark (77) %83.8’inin 2 yaş

altında olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmamızda da olgularımızın %68’i 2 yaş ve

altında idi. Hastalığın 12-24 aylar arasında pik yaptığı görüldü. Rotavirüse bağlı ilk

enfeksiyonun sıklıkla 2 yaşından önce görülmesi, dehidratasyon ve malnutrisyonla

seyretmesi hastalığın mortalitesini artırmaktadır (1). Çalışmamızda ayaktan (n=58

%58) ve yatan (n=42 %42) hastaların ortanca yaşları sırası ile 22 ay (3-59 ay) ve 11

ay (5 gün-59 ay) olup, her iki grup arasında ortanca yaş açısından anlamlı fark vardı.

Bu da, hastalığın erken yaşlarda geçirilmesinin hastaneye yatış gerekliliğini

artırdığını ortaya koyuyordu.

Rotavirüs gastroenteritlerinde, klinik ağırlık derecesi ile rotavirüs tipinin

ilişkisi olduğuna dair literatür verileri çelişkilidir. Geçmişte G9 serotipinin hızlı

yayılma özelliğine karşın klinik seyrin derecesi üzerine etkisi olup olmadığı kesin

olarak ortaya konamamıştır. Yapılan çalışmalardan bazılarında G9’un klinik ağırlık

derecesi ile ilişkisi gösterilirken (78) bazılarında ise ilişkisiz bulunmuştur (71,79-81).

Biz de çalışmamızda belirlenen G genotipleri arasında klinik ağırlık derecesi

43

açısından fark olup olmadığını araştırdık fakat herhangi bir G genotipi için klinik

skor puanı açısından bir fark olmadığını gördük. Aynı şekilde ayaktan ya da yatan

hastalar arasında da tip dağılımı açısından fark yoktu. En sık görülen G9 serotipi

pozitif saptanan 30 hastadan 17’si ayaktan 13’ü yatırılarak izlenen hastalardan

oluşuyordu. Bozdayı ve ark’nın Türkiye’de saptadığı G9 suşlarındaki VP7

proteinlerinin yüksek oranda benzerlik göstermesi nedeni ile ilk enfeksiyon sırasında

oluşan antikorların aynı serotiple oluşan ardışık enfeksiyonlara karşı da koruma

sağlayacağı ileri sürülmüştür çünkü rotavirüs enfeksiyonuna karşı koruma VP7

proteinine karşı oluşan nötralizan antikorlar ile sağlanmaktadır. Ancak ülkemizde G9

yayılım hızının yüksekliği ve görülme sıklığındaki artışın hastalığın ağırlık

derecesini nasıl etkileyeceği ve tekrarlayan enfeksiyonların daha hafif geçip

geçmeyeceğini ortaya koyacak daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Tüm dünyada bebek ve küçük çocuklardaki akut gastroenteritlerin en önemli

nedeni olan rotavirüsler dış kapsidde bulunan VP7 ve VP4 antijenlerine göre G ve P

tiplerine ayrılırlar. Son yıllarda tanı tetkikleri arasında RT-PCR’ın kullanıma girmesi,

daha fazla sayıda rotavirüs tipinin belirlenmesine olanak sağlamıştır. Şimdiye kadar

tespit edilen G tipleri içerisinde G1, G2, G3, G4 ve G9 tüm dünyada insanlardaki

enfeksiyonların büyük bir kısmından sorumludur (2). Ancak dolaşan rotavirüs

tiplerinin çok çeşitlilik göstermesi nedeni ile genotipik değişimlerin devamlı olarak

izlenmesi gereklidir. Bir ülkede rotavirüs aşısının kullanıma girmesinden önce hangi

serotiplerin dolaşmakta olduğunu bilmek önemlidir (3).

Ülkemizde RT-PCR ile yapılan tiplendirme çalışmalarında; Kurugöl ve

ark’nın 2000-2001 yılları arasında İzmir bölgesinde yaptıkları çalışmada; 3

merkezden toplanan 324 dışkı örneği RT-PCR ile tiplendirilmiş; G1 serotipi %75.1,

G2 %0.8, G3 %3 ve G4 %6.3 sıklıkta tespit edilmiştir. Miks enfeksiyon oranı %5.9

bulunmuştur (72). Çataloluk ve ark.’nın 2000-2002 yıllarında Gaziantep’te yaptıkları

çalışmada; hastalıktan sorumlu en sık genotip G4P[8] (%42.2) olarak saptanmıştır.

G1P[8] % 26.6, G2P[8] %7.8, G4P[6] %6.3, G2P[4] %3.1, G3P[8] %3.2, G1P[6]

%3.1, G3P[8] %1.5, G2P[6] %1.5; miks enfeksiyonlar ise %7.3 oranında

bulunmuştur (76). 2004-2005’te Bozdayı ve ark.’nın çalışmalarında en sık G1P[8]

(%55.5) suşu saptanırken, bunu 2. sıklıkta G9P[8] (%10.1) izlemiştir. Miks

44

enfeksiyon oranı %2.4 bulunmuştur (71). Bu çalışmada daha önceki çalışmalara göre

G9 (%17.2) artışı dikkat çekmiştir. 2005-2006 yılları arasında 4 merkezden ishal

nedeni ile hastaneye yatırılan 5 yaş altı 411 çocuk hastanın dahil edildiği bir diğer

çalışmada G1P[8] yine 76% oranında en sık izole edilen suş olup, bunu % 12.8

oranla G2P[4] izlemiştir. G9P[8] ise % 3.9 hastada saptanmıştır (77).

Ülkemizde bugüne kadar yapılan çalışmaların birçoğunda G1 serotipi baskın

bulunmuş (71, 72,77) ancak bizim çalışmamızda RT-PCR ile tiplendirme sonuçlarına

göre en baskın serotip toplam 30 hastada olmak üzere G9 (%30), en sık kombinasyon

da yine G9P[8] (%19) olarak saptanmıştır. Bazı çalışmalarda çok sık rastlanan

G2P[4] kombinasyonuna ise bizim çalışmamızda hiç rastlanmamıştır (77).

G9 serotipi, Çataloluk ve ark’nın 2000-2002 yılları arasında ülkemizin 9

farklı bölgesinden topladıkları örneklerle yaptıkları çalışmalarında 119 rotavirüs

pozitif dışkı örneğinden sadece 4’ünde (%3.2) sporadik olarak saptanırken (76);

Bozdayı ve ark’nın 2004-2005 yılları arasında yaptıkları çalışmada %19 oranında

saptanmış, bu durum aslında diğer ülkelere göre gecikmeli bir artış olarak

yorumlanmıştır (71). G9 serotipi aslında 1990’lı yıllardan itibaren tüm dünyada

giderek artan sıklıkta görülmeye başlamış (2) ancak ülkemizden ilk olgu Aralık

2004’te Ankara’da saptanmış, bizim çalışmamızın sonuçlarına göre de en sık görülen

serotip haline gelmiştir. Dünyada da G9 serotipi için durum böyledir. İngiltere ve

Gana’da G9 suşlarının ardışık yayılım gösterdiği, ilk önce bir merkezde görülüp daha

sonra diğerlerine hızla yayıldığı görülmüştür (82).

Bugüne kadar G9 serotipinin P4, P6, P8, P11 ve P19 ile birlikteliği

gösterilmiştir (83). Farklı coğrafi bölgelerden toplanan G9 virüslerinin gen yapıları

incelendiğinde neredeyse hepsinin aynı olduğu, ancak aynı ülkedeki suşların ise VP7

gen yapıları büyük oranda korunurken diğer genler ile çeşitli karışımlarının olduğu

gösterilmiştir (84). Her ülkeden izole edilen G9 rotavirüsleri çok çeşitli genomik

varyasyonlar göstermekte, çeşitli P tipleri ile birlikteliğinde kısa ya da uzun

elektroforetipik özellik gösterebilmektedir. Örneğin Bozdayı ve ark’nın

çalışmalarında G9P[8] kısa elektroforetip dünyada ilk kez ülkemizde tespit edilmiştir

(71).

45

Gelişmiş ülkelerdeki G9 suşlarının P[8] özgünlüğünün olması ve nadiren

"yeniden eşleşme" göstermesi nedeni ile genetik yapısının stabil olduğu

düşünülürken, Hindistan, Bangladeş ve Afrika gibi gelişmekte olan bölgelerde farklı

suşlar arasında gen değişiminin sık olması nedeni ile G9P[8] ve G9P[6] suşlarının

birlikteliği daha sık görülmekte ve bu da miks enfeksiyon sıklığını artırmaktadır (82).

Daha önceden Çataloluk ve ark’nın yaptıkları çalışmada saptanmayan G9’un P[4],

P[6] ve miks P tipleri ile kombinasyonları Bozdayı ve ark’nın yaptıkları çalışmada

görülmekle birlikte miks enfeksiyon oranı gelişmiş ülkelerdekine benzer şekilde

düşük oranda (%2.4) bulunmuştur (71). Ancak aradan geçen 3 yıl sonunda bizim

çalışmamızda saptanan miks enfeksiyon oranı %26’dır. Çalışmamızda G9 artışına

paralel olarak miks enfeksiyon oranının da artması ülkemizdeki G9 suşlarının

gelişmekte olan ülkelerdekine benzer şekilde gelişigüzel reassortmanlar oluşturma

eğiliminde olduğunu düşündürmektedir. G9’un P[8] ile kombinasyonu çalışmamızda

en sık (%55) görülmekle birlikte ülkemizde daha önceden yapılan çalışmalarda

tanımlanmayan P[10] ve hayvan kökenli suşlar ile (P Gott ve P-UK)

kombinasyonlarının da görülmesi dikkat çekicidir. G9’un P Gott ve P-UK

kombinasyonlarına literatür taramalarında rastlanmamıştır. P Gott sığır kökenli, P-

UK ise domuz kökenli olduğu bilinen rotavirüsün VP4 (P) tipleridir (67).

Çalışmamızda P[10] 11 hastada (%11) görülmüştür (4 hastada G9P[10], 2 hastada

G2P[10], 2 hastada G9P[8]+P[10], 1 hastada G4P[10], 1 hastada G2P[8]+P[10], 1

hastada G4P[4]+P[10] olarak). Aslında P[10] literatürde son derece nadir rastlanan

bir tip olup sadece insanlarda hastalık yaptığı gösterilmiştir. Bugüne kadar P[10]’un

G3,G4 ve G8 ile 1’er ve G9 ile 2 hastada kombinasyonları saptanmıştır (85).

Çalışmamızda 2 hastada izole edilen HCR3 suşunun geçmişte sadece

kedi/köpekgillerde hastalık yaptığı bilinirken, insanda ilk olarak 1984’te Amerika’da

aşı çalışmaları sırasında asemptomatik olarak enfekte olan sağlıklı bir bebekten izole

edilmiş daha sonra patojenitesi gösterilmiştir. Bugüne kadar dünyada literatürde

bildirilen sadece 3 HCR3 suşu izole edilmiş olup hepsi de G3HCR3 şeklindedir. Bu

HCR3 suşlarının kedi/köpekgillerden tam bir virion olarak insanlara geçtiği

gösterilmiştir (86). Bu çalışmada ise HCR3’ün G2 ve G4 genotipleri ile birlikte

görülmesi de şaşırtıcıdır.

46

Çalışmamızdaki hayvan kaynaklı olduğu düşünülen suşların tespit edildiği

hastaların hayvanlar ile temaslarının olup olmadığı bilinmemektedir. Bu suşlar insan-

hayvan rotavirüslerinin gen değişimi ile ortaya çıkmış olabileceği gibi daha önceden

gen değişiminin gerçekleştiği bir insandan da direkt olarak geçmiş olabilir. Hayvan

kaynaklı rotavirüslerin tür bariyerini aşarak insanlara geçişini tetikleyen faktörler tam

olarak ortaya konamamıştır. Geçmişte hayvan rotavirüslerinin normal koşullarda

insanları enfekte etmediğine inanılırken özellikle miks enfeksiyonların daha sık

görüldüğü, insan ve hayvan türlerinin yakın fiziksel temasta olduğu gelişmekte olan

ülkelerde, rotavirüslerin türden türe geçişinin doğada kısmen yüksek oranda

görülebileceği, bunun tam bir virion geçişi olarak veya gen segmentinin reassortmanı

ile gerçekleşebileceği yapılan çalışmalarda gösterilmiştir (87). Rotavirüs genomunun

segmentli yapısı dolaşan suşlar arasında gen değişimini kolaylaştırmaktadır.

Günümüzde kullanılan standart tiplendirme metodları ile bu suşların hayvan

rotavirüsleri ile ne derece genetik benzerlik gösterdiği ortaya konamamaktadır. Bunu

ortaya koymak için sekans analizleri veya RNA-RNA hibridizasyon metodları

gereklidir. Bu ileri incelmeler yapılmadığı taktirde bu suşların hayvan kökenli ya da

insan-hayvan reassotmanı sonucu ortaya çıkıp çıkmadığı anlaşılamayacaktır. İleride

bu genotiplerin rotavirüs aşıları içinde yer alması gerekliliği; rotavirüs evrimini daha

iyi anlamamızı sağlayacak, eş zamanlı yürütülen insan ve hayvan sürveyans

çalışmaları ile ortaya konabilir.

Çalışmamızda ayrıca Türkiye’de daha önceden yapılan çalışmalarda tespit

edilemeyen ve eskiden hayvan kökenli olduğu düşünülen G5 ve G8 genotipleri de

tespit edilmiştir. Son yıllarda rotavirüs tiplerini belirlemede kullanılan tanı

tekniklerindeki gelişmelere paralel olarak eskiden sadece hayvanlarda hastalık

yaptığı düşünülen rotavirüs tiplerinin insanlarda da hastalık yaptıkları gösterilmiştir.

G5 serotipi genellikle domuzlardan izole edilirken; G8 genelde büyük baş

hayvanlarda patojen olarak gösterilmiştir (88). G5 rotavirüslerinin eskiden sadece

domuzlarda hastalık yaptığı bilinirken son yıllarda insanlarda önemli bir ishal nedeni

olarak görülmektedir (89-91). Sığır kaynaklı olan G8 serotipi insanlarda ilk olarak

Endonezyalı çocuklardan izole edilmiş sonrasında dünyanın birçok ülkesinden farklı

oranlarda bildirilmiştir (92). G8’in genellikle P[4] ve P[6] kombinasyonları

bildirilirken çalışmamızda her 3 hastada da 2008’de ilk olarak Güney Kore’den

47

ardından Avustralya’dan da bildirilen G8P[8] kombinasyonu tespit edilmiştir (92).

Bu rotavirüs tiplerinin tespiti de yine G9 artışı ve ona ikincil miks enfeksiyon artışı

ile de ilişkilendirilebilir.

Çalışmamızda miks enfeksiyon oranı ülkemizde daha önceden bildirilenlere

göre çok yüksek olup, G9 serotipinin gerek G, gerek de P tipleri ile çeşitli

kombinasyonlarına rastlanmıştır. Saptadığımız G9 suşları ile Bozdayı ve ark.

tarafından genetik olarak farklı olduğu gösterilen "Türk G9" serotipinin ne derece

benzer olduğunu ortaya koyacak daha ileri elektroforetipleme çalışmalarına ihtiyaç

vardır. Bu sonuçlara göre G9 artışı Türkiye’de rotavirüs epidemiyolojisi büyük

ölçüde etkilemiş gibi görünmektedir. Kaldı ki ülkemizde enfeksiyonun yıl boyunca

görülmesi de bu gen değişimlerine olanak sağlamakta ve kolaylaştırmaktadır.

Tüm dünyada çocukluk çağı ishallerinin en yaygın sebebi olan rotavirüsler

gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde benzer sıklıkta görülürken hastalığın sonuçları

farklı olabilir (1). Gelir dağılımının düşük olması mortalite ile direkt ilişkilidir.

Dünya’da her yıl rotavirüs enfeksiyonuna bağlı yaklaşık 600.000 ölümden %80’den

fazlası gelir dağılımının düşük ve tıbbi bakımın zayıf olduğu Güney Asya ve Güney

Afrika gibi ülkelerde görülür (1).

Avrupa’da 5 yaş altı çocuklarda rotavirüs hastalık yükü ve mortalite oranını

literatür taramasına dayanarak araştıran bir çalışmada; Türkiye ortanın üstünde gelir

düzeyi (3596-11115 dolar) olan bir ülke olmasına rağmen, rotavirüse bağlı

mortalitenin en yüksek oranda (>10/100000 yılda) görüldüğü ülkeler arasında yer

almıştır. Bu durum yüksek bebek ölüm hızına, yetersiz aşılamaya, eğitim eksikliği ve

malnutrisyona bağlanmıştır. Türkiye’de yılda rotavirüse bağlı tahmini 1700 ölüm

(toplam ishale bağlı ölümlerin %26'sı) olduğu bildirilmiştir. Avrupa’da ölümlerin

%93’ü Türkiye’nin de içinde bulunduğu 7 ülkede (Azerbeycan, Kazakistan,

Kırgızistan, Tacikistan, Türkmenistan ve Özbekistan) gerçekleşmekte, hastalık yükü

gelir düzeyine göre dramatik olarak değişmektedir (93). Bu verilere dayanarak; bizim

de içinde bulunduğumuz bu ülkelerde genel aşılama yapılmasının mevcut rotavirüse

bağlı ölümleri %80 oranında önleyebileceği ileri sürülmektedir. Ancak ülkemizden

48

yapılan çalışmalarda hastalıkla ilgili veriler oldukça kısıtlıdır ve ulusal aşı

politikamızı belirlemeden önce daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır.

Biz de tüm dünyada olduğu gibi ülkemiz açısından da büyük önem taşıyan 5

yaş altı çocukluk çağı rotavirüs gastroenteritlerinde rotavirüs tiplerini belirlemek,

belirlenen tiplerin klinik ağırlık derecesi ile ilişkisini ortaya koymak ve ülkemiz

açısından surveyans ve aşı çalışmalarına ışık tutmak amacı ile Ankara Üniversitesi

Çocuk Enfeksiyon Bölümü’nde planladığımız bu çalışmada, dolaşan rotavirüs

suşlarında daha önceki yıllara göre belirgin değişiklikler olduğunu gördük. Daha

önceden yapılan çalışmalarda sıklıkla görülen tipler daha nadir görülürken yeni

ortaya çıkan tipler olduğunu saptadık. Çalışmamızda ülkemizde son yıllarda giderek

artan oranda saptanan G9 serotiplerindeki artışa paralel olarak, miks enfeksiyon

sıklığının arttığı görülürken, ülkemizde yapılan çalışmalarda daha önceden

saptanmayan bazı hayvan kökenli suşlara da rastlandı.

Günümüzde mevcut rotavirüs aşıları G9 veya P6 epitoplarının her ikisini de

içermemektedir (56). Yapılan çalışmalarda çapraz koruma olabileceği gösterilmiş

olsa da mevcut rotavirüs aşılarının seçilmiş G9 suşlarını artırıp artırmayacağı

bilinmemektedir (57). G9 serotipi tüm dünyada G1’den sonra en sık izole edilen,

çalışmamızda ise en sık izole edilen suş haline gelmiştir. Rotavirüs aşı geliştirme

çalışmalarında bu durum mutlaka göz önünde bulundurulmalıdır. Canlı atenue

rotavirüs aşıları ulusal aşı takviminde yer almamakla birlikte Türkiye’de 2007

yılından itibaren isteyen hastalara uygulanabilmektedir. Aşının kitlesel aşılama

olarak yapılmayıp sadece kısıtlı sayıda hastaya yapılıyor olmasının bu çalışmadaki

epidemiyolojik değişiklikler üzerine etkisi belirsizdir ve bunu ortaya koyacak daha

ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Rotavirüslerin sürekli değişen epidemiyolojisi göz önüne alındığında

rotavirüs aşılarının Avrupa’da rotavirüse bağlı mortalitenin en yüksek olduğu

ülkelerden biri olan Türkiye’de rutin aşı şemasına konulmasından önce

epidemiyolojik çalışmaların devamlılığı çok önem taşımaktadır.

49

6. SO�UÇLAR

1. Çalışmaya RT-PCR ile G ya da P genotipi belirlenebilen 100 hasta dahil

edildi.

2. Hastaların 57’si (%57) erkek, 43’ü (%43) kızdı ve ortanca yaşları 16 ay (5

gün-59 ay) olarak belirlendi.

3. 13 hasta (%13) <3 ay, 7 hasta (%7) 3-5 ay arası, 14 hasta (%14) 6-11 ay arası,

34 hasta (%34) 12-23 ay arası, 12 hasta (%12) 24-35 ay arası, 6 hasta (%6)

36-47 ay arası, 14 hasta (%14) 48-59 ay arasında idi.

4. Olguların büyük çoğunluğu 24 ayın altındaki (n=68, %68) bebeklerden

oluşuyordu.

5. Olguların 38’i (%38) kış, 24’ü (%24) sonbahar, 25’i (%25) ilkbahar, 11’i

(%11) yaz mevsiminde başvurdu.

6. On dört hasta (%14) Ocak ayında, 10 hasta (%10) Şubat, 6 hasta (%6) Mart,

10 hasta (%10) Nisan, 9 hasta (%9) Mayıs, 4 hasta (%4) Haziran, 3 hasta

(%3) Temmuz, 4 hasta (%4) Ağustos, 2 hasta (%2) Eylül, 8 hasta (%8) Ekim,

14 hasta (%14) Kasım, 14 hasta (%14) da Aralık aylarında başvurdu.

7. Rotavirüs enfeksiyonu tüm yıl boyunca görülmekle birlikte sonbahar ve kış

aylarında pik yaptığı görüldü.

8. Hastaların 58’i (%58) ayaktan izlenirken 42’si (%42) yatırılarak izlendi.

9. Yatırılarak izlenen hastaların ortanca yaşı 11 ay (5 gün-59 ay), ayaktan

izlenen hastaların ortanca yaşı ise 22 ay (3,5-59 ay) olarak bulundu.

10. Ayaktan ve yatan hastalar arasında ortanca yaş açısından istatistiksel olarak

anlamlı fark vardı (p=0.002).

11. 7 hasta (%7) hafif, 51 hasta (%51) orta, 42 hasta (%42) ise ağır rotavirüs

gastroenteriti olarak kabul edildi.

12. Ayaktan izlenen hastaların ortanca skor puanı 9 (3-14), yatırılarak

izlenenlerin ortanca skor puanı ise 12 (4-18) olarak bulundu.

50

13. Ayaktan ve yatan hastalar arasında ortanca skor puanları açısından

istatistiksel olarak anlamlı fark vardı (p<0.001).

14. Klinik skor puanları ile yaş arasında anlamlı bir ilişki saptanamadı (p=0.649

r= -0.047).

15. Doksan (%90) hastada hem G (VP7) hem de P (VP4) genotipi

belirlenebilirken, 6 hastada (%6) G (VP7), 4 hastada (%4) P (VP4) genotipi

belirlenemedi.

16. G genotipleri içinde G9 tek başına 30 örnekte (%30) pozitif olmak üzere en

sık izole edilen G genotipi oldu.

17. Ardından sıklık sırasına göre G2 %13 oranla tek başına 13 örnekte, G4 %12

oranla tek başına 12 örnekte, G1 %11 oranla tek başına 11 örnekte, G3 %9

oranla tek başına 9 örnekte tespit edildi.

18. RT-PCR ile 100 örneğin 90’ında (%90) her iki G ve P tipleri belirlendi ve 34

farklı rotavirüs G/P kombinasyonu elde edildi.

19. En baskın rotavirüs kombinasyonu 19 hastada (%19) G9P[8] olarak saptandı.

20. G2P[4] genotipine hiçbir hastada rastlanmadı.

21. Ülkemizde yapılan çalışmalarda daha önceden tespit edilmeyen G5 ve G8

genotipleri sırası ile 2 (%2) ve 3 (%3) örnekte pozitif saptandı.

22. P genotipleri içinde P[8] tek başına 55 örnekte (%55) pozitif olmak üzere en

sık izole edilen P genotipi oldu.

23. Ülkemizde yapılan çalışmalarda daha önceden tespit edilmeyen P[10], HCR3,

PGott ve PUK gibi P genotipleri tespit edildi.

24. Çalışmamızda %26 oranında miks enfeksiyon saptandı.

25. G9 genotipi ile %15 oranında miks enfeksiyon görüldü.

26. G9’un P[10], PGott ve PUK ile kombinasyonları tespit edildi.

27. En sık görülen G genotipleri arasında klinik skor puanları ve yatarak ya da

ayaktan izlem açısından anlamlı bir fark saptanmadı (sırası ile p=0,53,

p=0,95).

51

Çalışmamızda G9 serotiplerinde ve buna paralel olarak miks enfeksiyon

sıklığında artış saptandı. Ülkemizde yapılan çalışmalarda daha önceden saptanmayan

bazı hayvan kökenli suşlara da rastlandı.

Mevcut rotavirüs aşısı G9 serotipini içermemektedir. Rotavirüslerin sürekli

değişen epidemiyolojisi göz önüne alındığında rotavirüs aşılarının ülkemizde rutin

aşı şemasına konulmasından önce epidemiyolojik çalışmaların devamlılığı çok önem

taşımaktadır.

52

7. ÖZET

Amaç

Bu çalışmanın amacı 5 yaş altı akut gastroenteriti olan çocuklarda rotavirüs

enfeksiyonlarının moleküler epidemiyolojisini araştırmak, belirlenen rotavirüs

tiplerinin klinik ağırlık derecesine etkisini belirlemek ve ülkemiz açısından sürveyans

ve aşılama çalışmalarına ışık tutmaktır

Gereç ve Yöntem

Ocak 2008-Ocak 2009 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi

Çocuk Enfeksiyon bölümüne akut gastroenterit nedeni ile başvuran ve taze dışkı

örneklerinde rotavirüs antijeni pozitif saptanan 5 yaş altı hastaların demografik

verileri kaydedildi. Vesikari tarafından tanımlanan sayısal skorlama sistemine göre

klinik skor puanları belirlendi. Rotavirüs suşları PCR yöntemi ile tiplendirildi.

Bulgular

Çalışmaya RT-PCR ile G ya da P genotipi belirlenebilen 100 hasta dahil

edildi. Rotavirüs gastroenteriti sıklığı %28.1 olup, olguların büyük çoğunluğu 24

ayın altındaki (n=68 %68) bebeklerden oluşuyordu. Rotavirüs enfeksiyonu tüm yıl

boyunca görülmekle birlikte sonbahar ve kış aylarında pik yaptığı görüldü. G

genotipleri içinde G9 tek başına 30 hastada, P genotipleri içinde de P[8] tek başına

55 örnekte (%55) pozitif olmak üzere en sık izole edilen genotipler oldu. G

genotipleri arasında klinik skor puanları açısından anlamlı bir fark saptanmadı. Yüz

örneğin 90’ında (%90) her iki G ve P tipleri belirlendi ve 34 farklı rotavirüs G/P

kombinasyonu elde edildi. Çalışmamızda en baskın rotavirüs genotipi 19 hastada

(%19) G9P[8] olup bunu 7’şer hastada (%7) G1P[8] ve G4P[6] izledi. G2P[4]

genotipine hiçbir hastada rastlanmadı. Miks enfeksiyon oranı %26 olarak bulundu.

Ülkemizde yapılan çalışmalarda daha önceden tespit edilmeyen G5, G8, P[10],

HCR3, PGott ve PUK gibi genotipler tespit edildi.

53

Sonuç

Bu çalışma ile ülkemizde son yıllarda rotavirüslerin genotipik dağılımında

belirgin değişiklikler olduğu ortaya kondu. Rotavirüslerin sürekli değişen

epidemiyolojisi göz önüne alındığında rotavirüs aşılarının Avrupa’da rotavirüse bağlı

mortalitenin en yüksek olduğu ülkelerden biri olan Türkiye’de rutin aşı şemasına

konulmasından önce epidemiyolojik çalışmaların devamlılığı çok önem taşımaktadır.

Anahtar sözcükler: çocuklar, gastroenterit, genotip, rotavirüs, Türkiye

54

8. SUMMARY

Aim

This study was carried out to determine the molecular epidemiology of

rotavirus infections in children with acute gastroenteritis under 5 years old, the effect

of rotavirus type on clinical severity scores and highlight the surveillance and

rotavirus vaccination strategies for our country,

Material and Methods

100 patients were included who could be G or P typed by RT-PCR. The

incidence of rotavirus gastroenteritis was 28.1%, most of the patients (n=68 %68)

were consisted of children under 24 months old. Rotavirus infection was prevalent

throughout the year with a peak incidence in autumn and winter. G9 among G

genotypes and P[8] among P genotypes were the most frequent types which were

positive in 30 patients (30%) and 55 patients (55%), respectively. There were no

difference among G genotypes in terms of clinical score points. Both G and P types

were detected in 90 of the 100 samples and 34 different combinations were found.

G9P[8] was the most dominant rotavirus genotype detected in 19 patients (19%),

followed by G1P[8] and G4P[6] each detected in 7 (7%) patients. No G2P[4]

genotype was found. Level of mix infections were found to be 26%. G5, G8, P[10],

HCR3, PGott ve PUK genotypes were also detected which were not detected in

previous studies from our country.

Results

Distribution of rotavirus genotypes exhibited distinctive changes in this study.

When the everchanging epidemiology of rotaviruses are taken into account, ongoing

surveillance studies are important before the rotavirus vaccines become a part of

national vaccination programme in Turkey, one of the countries where the highest

mortality rates are seen due to rotavirus in Europe.

Key words: children, gastroenteritis, genotype, rotavirus, Turkey

55

9. KAY�AKLAR

1. Parashar UD, Hummelman EG, Bresee JS, Miller MA, Glass RI. Global

illness and deaths caused by rotavirus disease in children. Emerg Infect Dis

2003; 9: 565-72.

2. Ellen S, Dante A, Sharon, Humiston, Dante A, Sharon G. Rotavirus. Pediatr

Rev 2007; 8.

3. Parashar UM, Gibson CJ, Bresee JS, Glass RI. Rotavirus and severe childhood

diarrhea. Emerg Infect Dis 2006; 12: 304-6

4. Ruuska T, Vesikari T. Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical

scores for clinical severity of diarrhoeal episodes. Scand J Infect Dis 1990; 22:

259-67.

5. Aupiais C, de Rougemont A, Menager C, Vallet C, Brasme JF, Kaplon J,

Pothier P, Gendrel D. Severity of acute gastroenteritis in infants infected by

G1 or G9 rotaviruses. J Clin Virol 2009; 46: 282-5.

6. Franco MA, Angel J, Greenberg HB. Immunity and correlates of protection for

rotavirus vaccines. Vaccine 2006; 24: 2718-31.

7. Hyser JM, Estes MK. Rotavirus vaccines and pathogenesis. Curr Opin

Gastroenterol 2009; 25: 36-43.

8. Parez N. Rotavirus gastroenteritis: why to back up the development of new

vaccines? Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2008; 31: 253-69.

9. Bishop RF, Davidson GP, Holmes IH. Dedection of a new virus by electron

microscopy of fecal extracts from children with acute gastroenteritis. Lancet

1974; 1: 149-151.

10. Flewett T, Bryden A, Davies H. Relation between viruses from acute

gastroenteritis of children and newborn calves. Lancet 1974; 2: 61-63.

11. Bishop RF. Natural history of human rotavirus infections. Arch Virol Suppl

1996; 12:119-128.

56

12. Crawford, S. E., S. K. Mukherjee, M. K. Estes, J. A. Lawton, A. L. Shaw, R.

F. Ramig, and B. V. Prasad. Trypsin cleavage stabilizes the rotavirus VP4

spike. J. Virol 2001; 75: 6052-6061.

13. Mansell EA, Patton JT. Rotavirus RNA replication: VP2, but not VP6, is

necessary for viral replicase activity. J. Virol 1990; 64: 4988-4996.

14. Kapikian AZ (2007) Rotaviruses. In Knipe DM, Howley PM et al. (eds) Fields

Virology, 5th ed. Philedelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams &

Wilkin, 1917-74.

15. Rodríguez-Díaz J, Rubilar-Abreu E, Spitzner M, Hedlund KO, Liprandi F,

Svensson L. Design of a multiplex nested PCR for genotyping of the NSP4

from group A rotavirus. J Virol Methods 2008; 149: 240-5.

16. Yarkın F. Gastroenterit virusları. Moleküler, klinik tanısal viroloji 2006; 233-

262.

17. Desselberger U, Wolleswinkel-van den Bosch J, Mrukowicz J. Rotavirus types

in Europe and their significance for vaccination. Pediatr Infect Dis J 2006; 25:

30-41.

18. Iturriza Gomara M, Wong C, Blome S, Desselberger U, Gray J. Molecular

characterization of VP6 genes of human rotavirus isolates: correlation of

genogroups with subgroups and evidence of independent segregation, J Virol

2002; 76: 6596-6601

19. Matthijnssens J, Ciarlet M, Rahman M, Attoui H, Bányai K, Estes MK,

Gentsch JR, Iturriza-Gómara M. Recommendations for the classification of

group A rotaviruses using all 11 genomic RNA segments. Arch Virol 2008;

153:1621-1629

20. Nakagomi O, Nakagomi T, Akatani K, Ikegami N. Identification of rotavirus

genogroups by RNA-RNA hybridization. Mol Cell Probes 1989; 3:251-261.

21. Prasad BV, Rothnagel R, Zeng CQ. Visualization of ordered genomic RNA

and localization of transcriptonal complexes in rotavirus. Nature 1996;

382:471-473.

57

22. Matthijnssens J, Ciarlet M, Heiman E, Arijs I, Delbeke T, McDonald SM,

Palombo AE, Iturriza7Go´mara M, Maes P, Patton JT, Rahman M, Van Ranst

M. Full genome-based classification of rotaviruses reveals common origin

between human Wa-like and porcine rotavirus strains and human DS-1-like

and bovine rotavirus strains. J Virol 2008; 82:3204-3219.

23. Burke B, Desselberger U. Rotavirus pathogenecity. Virology 1996; 218: 299-

305.

24. Rota S, Fidan I. Noninflamatuvar ishallerin patogenezi. Türk Mikrobiyol Cem

Derg 2007; 37 : 234-241.

25. Velazquez F. R. Protective Effects of Natural Rotavirus Infection. Pediatr

Infect Dis J 2009; 28: 54-56.

26. Velazquez FR, Matson DO, Calva JJ. Rotavirus infections in infants as

protection against subsequent infections. N Engl J Med 1996; 335:1022-8.

27. Chiba S, Yokoyama T, Nakata S, Morita Y, Urasawa T, Taniguchi K.

Protective effect of naturally acquired homotypic and heterotypic rotavirus

antibodies. Lancet 1986; 2:417-21.

28. Ball JM, Tian P, Zeng OQ. Age dependent diarrhea induced by a rotaviral non

structural glycoprotein. Science 1996; 272: 101-4.

29. Hjelt K, Grauballe PC, Schiotz PO, Andersen L, Krasilnikoff PA. Intestinal

and serum immune response to a naturally acquired rotavirus gastroenteritis in

children. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1985; 4:60-6.

30. Brown KA, Kriss JA, Moser CA, Wenner WJ, Offit PA. Circulating rotavirus-

specific antibodysecreting cells (ASCs) predict the presence of rotavirus-

specific ASCs in the human small intestinal lamina propria. J Infect Dis

2000;182 :1039-43.

31. Blutt, SE, Conner ME. Rotavirus: to the gut and beyond. Curr Opin

Gastroenterol 2007; 23: 39-43.

32. Anderson EJ,Weber SG. Rotavirus infection in adults. Lancet Infect Dis 2004;

4:91-9.

33. Fischer TK, Bresee JS, Glass RI. Rotavirus vaccine and the prevention of

hospital acquired diarrhea in children . Vaccine 2004;1: 49-54.

58

34. Dennehy PH, Cortese MM, Begue RE. A case-control study to determine risk

factors for hospitalization for rotavirus gastroenteritis in US children. Pediatr

Infect Dis J 2006; 25:1123-31.

35. Newman RD, Grupp-Phelan J, Shay DK, Davis RL. Perinatal risk factors for

infant hospitalization with viral gastroenteritis. Pediatrics, 1999; 103:E3.

36. Sugata K, Taniguchi K, Yui A, Miyake F, Suga S, Asano Y, Ohashi M, Suzuki

K, Nishimura N, Ozaki T, Yoshikawa T. Analysis of rotavirus antigenemia

and extraintestinal manifestations in children with rotavirus gastroenteritis.

Pediatrics 2008; 122: 392-7.

37. Chitambar SD, Tatte VS, Dhongde R, Kalrao V. High frequency of rotavirus

viremia in children with acute gastroenteritis: discordance of strains detected

in stool and sera. J Med Virol 2008; 80: 2169-76.

38. Iturriza-Gomara M, Auchterlonie IA, Zaw W. Rotavirus gastroenteritis and

central nervous system (CNS) infection: characterization of the VP7 and VP4

genes of rotavirus strains isolated from paired fecal and cerebrospinal fluid

samples from a child with CNS disease. J Clin Microbiol 2002; 40: 4797-9.

39. Ciftçi E, Tapisiz A, Ozdemir H, Güriz H, Kendirli T, Ince E, Doğru U.

Bacteraemia and candidaemia: a considerable and underestimated

complication of severe rotavirus gastroenteritis. Scand J Infect Dis 2009; 41:

857-61.

40. Lepage P. Rotavirus. Evidence for vaccination. Pediatr Infect Dis J 2008; 27:

1-2.

41. Grimwood K, Buttery JP. Clinical update: rotavirus gastroenteritis and its

prevention. Lancet 2007; 28; 370: 302-4.

42. Visser LE, Cano Portero R, Gay NJ, Martinez Navarro JF. Impact of rotavirus

disease in Spain: an estimate of hospital admissions due to rotavirus. Acta

Paediatr 1999; 88: 72-6.

43. Buser J, Risch L, Rutz T, Manang S, Munzinger J. Comparison of rota virus

latex agglutination test with two rapid immunochromatographic test devices

for detection of rotavirus in human feces. Eur J Clin Microbiol Infect Dis

2001; 20: 295-296.

59

44. Altindis M, Yavru S, Simsek A, Ozkul A, Ceri A, Koc H. Rotavirus Infection

in Children with Acute Diarrhea as Detected by Latex Agglutination, ELISA

and Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Indian Pediatr 2004; 41:590-4.

45. Gouvea V, Glass RI, Woods P. Polymerase chain reaction amplification and

typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J Clin Microbiol 1990;

28: 276-82.

46. Gentsch JR, Woods PA, Ramachandran M. Review of G and P typing results

from a global collection of rotavirus strains: implications for vaccine

development. J Infect Dis 1996; 174: 30-6.

47. Ray PG, Kelkar SD. Measurement of antirotavirus IgM/IgA/IgG responses in

the serum samples of Indian children following rotavirus diarrhoea and their

mothers. J Med Virol 2004; 72: 416-23.

48. King CK, Glass R, Bresee JS, Duggan C. Centers for Disease Control and

Prevention. Managing acute gastroenteritis among children: oral rehydration,

maintenance, and nutritional therapy. MMWR Recomm Rep 2003; 52: 1-16.

49. Choice Study Group. Multicenter, randomized, double-blind clinical trial to

evalute the efficacy and safety of a reduced osmolarity oral rehydration salts

solution in children with acute watery diarrhea. Pediatrics 2001; 107: 613-18.

50. Practice parameter: the management of acute gastroenteritis in young children.

American Academy of Pediatrics, Provisional Committee on Quality

Improvement, Subcommittee on Acute Gastroenteritis. Pediatrics 1996;

97:424-35.

51. Salazar-Lindo E, Santisteban Ponce J, Chea-Woo E. Racecadotril in the

treatment of acute watery diarrhea in children. N Engl J Med 2000; 343: 463-

67.

52. Greenberg HB, Estes MK. Rotaviruses: from pathogenesis to vaccination.

Gastroenterology 2009 May; 136: 1939-51.

53. Rotaviruses and rotavirus vaccines. Desselberger U, Manktelow E, Li W,

Cheung W, Iturriza-Gómara M, Gray J. Br Med Bull 2009; 90: 37-51.

54. Angel J, Franco MA, Greenberg HB. Rotavirus vaccines: recent developments

and future considerations. Nat Rev Microbiol 2007; 5: 529-39.

60

55. Clark A. The cost-effectiveness of rotavirus vaccine in Peru and Bengaldesh.

7th International Rotavirus Symposium Lisbon; 2006:12-3.

56. Buttery JP, Kirkwood C. Rotavirus vaccines in developed countries. Curr Opin

Infect Dis 2007; 20: 253-8.

57. Vesikari T, Karvonen A, Puustinen L. Efficacy of RIX4414 live attenuated

human rotavirus vaccine in Finnish infants. Pediatr Infect Dis J 2004; 23: 937-

43.

58. Ruiz Palacios G, Perez Schael I, Velazquez FR. Safety and efficacy of an

attenuated vaccine against severe rotavirus gastroenteritis. N Engl J Med 2006;

354:11-22.

59. Wood D. WHO informal consultation on quality, safety and efficacy

specifications for live attenuated rotavirus vaccines Mexico City, Mexico, 8-9

February 2005. Vaccine 2005; 23: 5478-87.

60. Dennehy PH, Rotavirus Vaccines: an Overview. Clin Microbiol Rev 2008;21:

198-208.

61. Bhandari N, Sharma P, Taneja S, Kumar T, Rongsen-Chandola T, Appaiahgari

MB, Mishra A, Singh S, Vrati S; Rotavirus Vaccine Development Group. A

dose-escalation safety and immunogenicity study of live attenuated oral

rotavirus vaccine 116E in infants: a randomized, double-blind, placebo-

controlled trial. J Infect Dis 2009; 200: 421-9.

62. Sealy R, Slobod KS, Flynn P, Branum K, Surman S, Jones B, Freiden P,

Lockey T, Howlett N, Hurwitz JL. Preclinical and clinical development of a

multi-envelope, DNA-virus-protein (D-V-P) HIV-1 vaccine. Int Rev Immunol

2009; 28: 49-68.

63. Gouvea V, Glass RI, Woods P, Taniguchi K, Clark HF, Forrester B, Fang Z-Y.

Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid

from stool specimens. J Clin Microbiol 1990; 28: 276-82.

64. Gentsch JR, Glass RI, Woods P, Gouvea V, Gorziglia M, Flores J, DAs BK,

Bhan MK. İdentification of Group A rotavirus gene 4 types by polymerase

chain reaction. J Clin Microbiol 1992; 30: 1365-73.

61

65. Clark HF, Gouvea V. Nucleotide sequence of the VP4 encoding gene of an

unusual human rotavirus (HCR3). Virology 1993; 196: 825-30.

66. Gouvea V, Santos N, Timenetsky MC. İdentification of bovine and porcine

rotavirus G types by PCR. J Clin Microbiol 1994; 32: 1338-40.

67. Gouvea V, Santos N, Timenetsky Mdo C. VP4 typing of bovine and porcine

group A rotaviruses by PCR. J Clin Microbiol 1994; 32: 1333-7.

68. Yıldırmak Y, Tanyer G, Dallar Y, Serdaroğlu A. Süt çocuklarının rotavirüs ve

diğer etyolojik ajanlara bağlı gastroenteritlerde klinik ve epidemiyolojik

özellikler. Türkiye Klinikleri J Pediatr 1992; 1:1-6.

69. Şıklar Z, Ünalacak M, Dallar Y, Tanyer G. Sıfır-2 yaş arası ishalli çocuklarda

rotavirüs sıklığı ve risk faktörleri. Turkiye Klinikleri J Pediatr 2000; 9: 219-24.

70. Karadağ A, Açıkgöz ZC, Avcı Z, et al. Childhood diarrhoea in Ankara,

Turkey: Epidemiological and clinical features of rotavirus-positive versus

rotavirus–negative cases. Scand J Infect Dis 2005; 37: 269-75.

71. Bozdayi G, Dogan B, Dalgic B, Bostanci I, Sari S, Battaloglu NO, Rota S,

Dallar Y, Nishizono A, Nakagomi O, Ahmed K. Diversity of human rotavirus

G9 among children in Turkey. J Med Virol 2008; 80:733-40.

72. Kurugöl Z, Geylani S, Karaca Y, Umay F, Erensoy S, Vardar F, Bak M,

Yaprak I, Ozkinay F, Ozkinay C. Rotavirus gastroenteritis among children

under five years of age in Izmir, Turkey. Turk J Pediatr 2003; 4: 290-4.

73. Bulut Y, İseri L, Ağel E, Durmaz B. Akut gastroenterit ön tanılı çocuklarda

rotavirüs pozitifliği. İnönü Üniv Tıp Fak Derg 2003; 10: 143-5.

74. Gül M, Garipardıç M, Çıragil P, Aral M, Karabiber H, Güler I. Sıfır-5 yas

arası gastroenteritli çocuklarda rotavirüs ve adenovirüs tip 40/41 arastırılması.

ANKEM Derg 2005; 19: 64-7.

75. Turkoglu S, Petit-Camurdan A, Akis N, Badur S. Epidemiology of rotavirus

infantile diarrhoea in Istanbul using virus genome RNA electrophoresis.

Mikrobiyol Bul 1993; 27: 93-9

62

76. Cataloluk O, Iturriza M, Gray J. Molecular characterization of rotaviruses

circulating in the population in Turkey. Epidemiol Infect 2005; 133: 673-8.

77. Ceyhan M, Alhan E, Salman N, Kurugol Z, Yildirim I, Celik U, Keser M,

Koturoglu G, Tezer H, Bulbul EK, Karabocuoglu M, Halicioglu O, Anis S,

Pawinski R.Multicenter prospective study on the burden of rotavirus

gastroenteritis in Turkey, 2005-2006: a hospital-based study. J Infect Dis

2009; 200: 234-8.

78. Linhares AC, Verstraeten T, Wolleswinkel-van den Bosch J, Clemens R,

Breuer T. Rotavirus serotype G9 is associated with more-severe disease in

Latin America. Clin Infect Dis 2006; 43: 312-4.

79. Aupiais C, de Rougemont A, Menager C, Vallet C, Brasme JF, Kaplon J,

Pothier P, Gendrel D. Severity of acute gastroenteritis in infants infected by

G1 or G9 rotaviruses. J Clin Virol 2009; 46: 282-5.

80. Clark HF, Lawley DA, Schaffer A, Patacsil JM, Marcello AE, Glass RI, Jain

V, Gentsch J. Assessment of the epidemic potential of a new strain of rotavirus

associated with the novel G9 serotype which caused an outbreak in the United

States for the first time in the 1995-1996 season. J Clin Microbiol 2004; 42:

1434-8.

81. Arista S, Vizzi E, Ferraro D, Cascio A, Di Stefano R. Distribution of VP7

serotypes and VP4 genotypes among rotavirus strains recovered from Italian

children with diarrhea. Arch Virol 1997; 142: 2065-71.

82. Armah GE, Steele AD, Binka FN, Esona MD, Asmah RH, Anto F, Brown D,

Green J, Cutts F, Hall A. Changing patterns of rotavirus genotypes in ghana:

emergence of human rotavirus G9 as a major cause of diarrhea in children. J

Clin Microbiol 2003; 41: 2317-22.

83. Martella V, Terio V, Del Gaudio G, Gentile M, Fiorente P, Barbuti S,

Buonavoglia C. Detection of the emerging rotavirus G9 serotype at high

frequency in Italy. J Clin Microbiol 2003; 41: 3960-3.

63

84. Ramachandran M, Kirkwood CD, Unicomb L, Cunliffe NA, Ward RL, Bhan

MK, Clark HF, Glass RI, Gentsch JR. Molecular characterization of serotype

G9 rotavirus strains from a global collection. Virology 2000; 278: 436-44.

85. Khamrin P, Maneekarn N, Peerakome S, Malasao R, Thongprachum A, Chan-

It W, Mizuguchi M, Okitsu S, Ushijima H. Molecular characterization of VP4,

VP6, VP7, NSP4, and NSP5/6 genes identifies an unusual G3P[10] human

rotavirus strain. J Med Virol 2009; 81: 176-82.

86. Khamrin P, Maneekarn N, Peerakome S, Yagyu F, Okitsu S, Ushijima H.

Molecular characterization of a rare G3P[3] human rotavirus reassortant strain

reveals evidence for multiple human-animal interspecies transmissions. J Med

Virol 2006; 78: 986-94.

87. Ibarra V, Ruiz-Palacios G, Guerrero ML, Glass RI, Gentsch JR. Unexpected

detection of animal VP7 genes among common rotavirus strains isolated from

children in Mexico. J Clin Microbiol 2003; 41: 4400-3.

88. Gentsch JR, Laird AR, Bielfelt B, Griffin DD, Banyai K, Ramachandran M,

Jain V, Cunliffe NA, Nakagomi O, Kirkwood CD, Fischer TK, Parashar UD,

Bresee JS, Jiang B, Glass RI. Serotype diversity and reassortment between

human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine

programs. J Infect Dis 2005; 192: 146-59.

89. Ha TP, Kim HJ, Saif LJ, Jeong YJ, Kim HH, Kwon HJ, Park SJ, Cho KO.

Sequence analysis of unusual P[7]G5 bovine rotavirus strains reveals evidence

of interspecies transmission. J Clin Microbiol 2009; 47: 3329-32.

90. Li DD, Duan ZJ, Zhang Q, Liu N, Xie ZP, Jiang B, Steele D, Jiang X, Wang

ZS, Fang ZY. Molecular characterization of unusual human G5P[6]

rotaviruses identified in China. J Clin Virol 2008; 42: 141-8.

91. Castello AA, Arvay ML, Glass RI, Gentsch J. Rotavirus strain surveillance in

Latin America: a review of the last nine years. Pediatr Infect Dis J 2004; 23:

168-72.

64

92. Swiatek DL, Palombo EA, Lee A, Coventry MJ, Britz ML, Kirkwood CD.

Characterisation of G8 human rotaviruses in Australian children with

gastroenteritis. Virus Res 2010;148: 1-7.

93. Williams CJ, Lobanov A, Pebody RG. Estimated mortality and hospital

admission due to rotavirus infection in the WHO European region. Epidemiol

Infect 2009; 137: 607-16.