AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KASAR AQUADES CACING LAUT Nereis sp. CACING TANAH...

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KASAR AQUADES CACING LAUT Nereis sp., CACING TANAH Lumbricus rubellus DAN Eisenia

foetida TERHADAP Escherichia coli

SKRIPSI

Oleh:

AHMAD HAPPY MU’AMAR SYAIFULLAH NIM. 135080301111062

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG 2017

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KASAR AQUADES CACING LAUT Nereis sp., CACING TANAH Lumbricus rubellus DAN Eisenia foetida

TERHADAP Escherichia coli

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Perikanan Pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Universitas Brawijaya

Oleh:

AHMAD HAPPY MU’AMAR SYAIFULLAH NIM. 135080301111062

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG November, 2017

iii

IDENTITAS TIM PENGUJI

Judul : AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KASAR AQUADES CACING

LAUT Nereis sp., CACING TANAH Lumbricus rubellus DAN Eisenia foetida TERHADAP Escherichia coli

Nama Mahasiswa : AHMAD HAPPY MU’AMAR SYAIFULLAH

NIM : 135080301111062

Program Studi : Teknologi Hasil Perikanan

PENGUJI PEMBIMBING:

Pembimbing 1 : Dr. Ir. HARTATI KARTIKANINGSIH, MS.

Pembimbing 2 : EKO WALUYO, S.Pi, M.Sc

PENGUJI BUKAN PEMBIMBING:

Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. BAMBANG BUDI SASMITO, MS

Dosen Penguji 2 : ABDUL AZIZ JAZIRI, S.Pi, M.Sc

Tanggal Ujian : 28 November 2017

iv

PERNYATAAN ORISINALITAS

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam laporan skripsi yang saya tulis

ini benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, dan sepanjang pengetahuan

saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan

oleh orang lain kecuali yang tertulis dalam naskah ini dan disebutkan dalam

daftar pustaka.

Apabila kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan skripsi ini hasil

penjiplakan (plagiasi), maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan

tersebut, sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.

Malang, November 2017 Mahasiswa

Ahmad Happy Mu’amar S. NIM. 135080301111062

v

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, Tuhan yang Maha Esa

karena berkat segala dari-Nya penulis dapat menyelesaikan laporan skripsi ini.

Penulis menyampaikan terimakasih kepada semua yang pihak berkontribusi

dalam penyelesaian laporan skripsi ini. Ucapan terimakasih penulis sampaikan

kepada:

1. Orang tua dan keluarga yang selalu memberikan doa, semangat dan

dukungan dalam bentuk apapun sehingga penulis dapat menyelesaikan

laporan skripsi ini.

2. Ibu Dr. Ir Hartati Kartikaningsih, MS dan Bapak Eko Waluyo, S.pi, M.Sc

selaku dosen pembimbing I dan II yang telah banyak memberikan waktu,

bimbingan, saran dan bantuan dalam penyelesaian laporan

3. Bapak Dr. Ir. Bambang Budi Sasmito dan Bapak Abdul Aziz Jaziri S.Pi, M.Sc

selaku dosen penguji I dan II yang telah memberikan saran perbaikan

terhadap penulisan laporan

4. Teman-teman seperjuangan dalam Tim Cacing : Afik, Valdi, Rani, Khun, Iis,

Dio, Panji, Udin, Amir, Firli, Wibi, Fanny, Silvi, Intan, Nadia, Iyan. Tim

Sargassum: Rifqi, Shella, Mita, Aufa dan Tim Gelatin: Fendy, Liza, Faisal

5. Mbak Megawati Kusuma, S.Gz. selaku laboran Laboratorium Keamanan

Hasil Perikanan yang telah mencukupi kebutuhan lab selama penelitian

6. Teman-teman Pertamax Petralite Premium Solar: Rifqi, Minwo, Miko, AW,

Lori, Afik, Riza, Dita, Firli, Rianda, Gesi, Ganis, Riza, Khun, Prilli, Daniar,

Yulia.

7. Teman-teman program studi Teknologi Hasil Perikanan, wabilkhusus

angkatan 2013.

8. Semua pihak yang berkontribusi dalam penyelesaian laporan ini.

vi

RINGKASAN

AHMAD HAPPY MU’AMAR SYAIFULLAH (135080301111062). Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut Nereis sp., Cacing Tanah Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida terhadap Eschericia coli. (di bawah bimbingan Dr. Ir. Hartati Kartikaningsih, MS dan Eko Waluyo, S.Pi, M.Sc).

Escherichia coli merupakan salah satu bakteri gram negatif yang sebagian besar merupakan bakteri patogen. Beberapa penyakit seperti diare, peradangan selaput lendir pada saluran kemih dan penyakit lain pada sistem pencernaan telah dilaporkan disebabkan oleh Escherichia coli. Penanggulangan dampak negatif bakteri ini biasa dilakukan dengan pemberian antibiotik sintetis, namun penggunaan antibiotik sintetis secara terus-menerus akan menimbulkan efek samping merugikan serta terbentuknya resistensi terhadap antibiotik yang digunakan. Oleh karena itu, diperlukan penelitian mengenai senyawa alami yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli. Berbagai penelitian terdahulu menunjukan bahwa cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan cacing tanah Eisenia foetida memiliki manfaat sebagai antibakteri.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri dari cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan cacing tanah Eisenia foetida yang diekstraksi menggunakan pelarut aquades dengan metode dekokta terhadap bakteri Escherichia coli. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan, Laboratorium Penanganan Hasil Perikanan, Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya Malang dan Laboratorium Sentral FMIPA Universitas Negeri Malang pada Bulan februari – Juni 2017.

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental dengan variabel bebas jenis cacing dan konsentrasi ekstrak, sedangkan variabel terikat adalah aktivitas antibakteri. Uji aktivitas antibakteri menggunakan uji daya hambat metode difusi cakram, dilanjutkan dengan uji Minimum Inhibition Concentration (MIC) dan Minimum Bactericidal Concentration (MBC). Pengamatan bakteri yang terpapar ekstrak dilakukan dengan pewarnaan sederhana dan Scanning Electron Microscope.

Hasil penelitian menunjukan bahwa terdapat aktivitas antibakeri yang bersifat bakteriostatik dari ketiga ekstrak cacing. Hasil terbaik ditunjukan ekstrak cacing tanah Lumbricus rubellus pada konsentrasi 100.000 ppm dengan daya hambat 3,07 mm, MIC 12.500 ppm dan MBC >100.000 ppm. Hasil pengamatan bakteri dengan pewarnaan yang dilakukan menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 100 kali dan Scanning Electron Microscope perbesaran 15.000 kali menunjukan adanya penurunan jumlah koloni dan perubahan morfologi berupa lipatan dan kerutan pada sel bakteri Escherichia coli yang terpapar ekstrak Nereis sp., Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida.

Disarankan untuk dilkukan uji lanjutan mengenai identifikasi dan karakterisasi dugaan senyawa antibakteri yang terdapat dalam ekstrak aquades cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida serta

dilakukan penelitian mengenai manfaat dari ekstrak ketiga jenis cacing tersebut selain sebagai antibakteri.

vii

KATA PENGANTAR

Penulis menyajikan laporan penelitian yang berjudul “Aktivitas Antibakteri

Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut Nereis sp., Cacing Tanah Lumbricus

rubellus dan Eisenia foetida terhadap Eschericia coli.” sebagai salah satu syarat

untuk meraih gelar sarjana perikanan di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,

Universitas Brawijaya, di bawah bimbingan:

1. Dr. Ir. Hartati Kartikaningsih, MS

2. Eko Waluyo, S.Pi, M.Sc

Laporan skripsi ini berisikan tentang penelitian yang memanfaatkan tiga

jenis cacing (cacing laut Nereis sp. serta cacing tanah Lumbricus rubellus dan

Eisenia foetida) sebagai bahan antibakteri terhadap Eschericia coli. Oleh karena

Eschericia coli merupakan bakteri patogen yang dapat menyebabkan gangguan

kesehatan khususnya pada sistem pencernaan, maka diharapkan ekstrak kasar

aquades dari ketiga cacing tersebut dapat menjadi alternatif pengobatanya.

Malang, November 2017

Penulis

viii

DAFTAR ISI

Halaman

IDENTITAS TIM PENGUJI ....................................................................... iii PERNYATAAN ORISINALITAS ................................................................ iv UCAPAN TERIMA KASIH......................................................................... iv RINGKASAN ............................................................................................. vii KATA PENGANTAR ................................................................................. viii DAFTAR ISI............................................................................................... viiii DAFTER TABEL ....................................................................................... x DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xiii

1. PENDAHULUAN ................................................................................... Error! Bookmark not defined.

1.1 Latar Belakang ................................................................................ Error! Bookmark not defined. 1.2 Rumusan Masalah .......................................................................... Error! Bookmark not defined. 1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................. Error! Bookmark not defined. 1.4 Hipotesis .......................................................................................... Error! Bookmark not defined. 1.5 Kegunaan Penelitian ....................................................................... Error! Bookmark not defined. 1.6 Waktu dan Tempat Penelitian ......................................................... Error! Bookmark not defined.

2. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... Error! Bookmark not defined.

2.1 Cacing.............................................................................................. Error! Bookmark not defined. 2.2 Cacing Laut Nereis sp. ................................................................... Error! Bookmark not defined. 2.3 Cacing Tanah Lumbricus rubellus .................................................. Error! Bookmark not defined. 2.4 Cacing Tanah Eisenia foetida ......................................................... Error! Bookmark not defined. 2.5 Ekstraksi Metode Dekokta .............................................................. Error! Bookmark not defined. 2.6 Pelarut Aquades .............................................................................. Error! Bookmark not defined. 2.7 Uji Akivitas Antibakteri ..................................................................... Error! Bookmark not defined.

2.7.1 Uji Daya Hambat Metode Cakram (Kirby-Bauer) ..................... Error! Bookmark not defined. 2.7.2 Uji MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dan MBC

(Minimum Bactericidal Concentration) ................................... Error! Bookmark not defined. 2.8 Escherichia coli ............................................................................... Error! Bookmark not defined. 2.9 Pengamatan Bakteri ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

2.9.1 Pengamatan dengan Pewarnaan Sederhana .......................... Error! Bookmark not defined. 2.9.2 Pengamatan dengan Scanning Electron Microscope (SEM) .. Error! Bookmark not defined.

3. MATERI DAN METODE PENELITIAN ................................................. Error! Bookmark not defined.

3.1 Materi Penelitian .............................................................................. Error! Bookmark not defined. 3.1.1 Alat Penelitian ........................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1.2 Bahan Penelitian....................................................................... Error! Bookmark not defined.

3.2 Metode Penelitian ............................................................................ Error! Bookmark not defined. 3.3 Analisis Data.................................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.4 Prosedur Penelitian ......................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.5 Penelitian Pendahuluan .................................................................. Error! Bookmark not defined.

3.5.1 Preparasi Sampel. .................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.5.2 Pembuatan Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut Nereis sp.,

Cacing Tanah Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida ......... Error! Bookmark not defined. 3.5.3 Pembuatan Kurva Standar Brown ............................................ Error! Bookmark not defined.

ix

3.6 Penelitian Utama ............................................................................. Error! Bookmark not defined. 3.6.1 Sterilisasi Alat ........................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.6.2 Peremajaan Bakteri .................................................................. Error! Bookmark not defined. 3.6.3 Pembuatan Suspensi Bakteri ................................................... Error! Bookmark not defined. 3.6.4 Uji Daya Hambat Metode Difusi Cakram ................................. Error! Bookmark not defined. 3.6.5 Penentuan Minimum Inhibition Concentration (MIC) dan

Minimum Bactericidal Concentration (MBC) .......................... Error! Bookmark not defined. 3.6.6 Pengamatan Bakteri dengan Pewarnaan ................................ Error! Bookmark not defined. 3.6.7 Pengamatan Bakteri dengan Scanning Electron Microscope . Error! Bookmark not defined.

4. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN .......................................... Error! Bookmark not defined.

4.1 Karakteristik Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut Nereis sp., Cacing Tanah Lumbricus rubellus dan Cacing Tanah Eisenia foetida ............................................................................................ Error! Bookmark not defined.

4.2 Kepadatan Suspensi Bakteri Uji ..................................................... Error! Bookmark not defined. 4.3 Uji Daya Hambat ............................................................................. Error! Bookmark not defined. 4.4 Minimum Inhibition Concentration (MIC) ........................................ Error! Bookmark not defined. 4.5 Minimum Bacterisidal Consentration (MBC) ................................... Error! Bookmark not defined. 4.6 Pengamatan Bakteri ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

4.6.1 Pengamatan Bakteri dengan Pewarnaan ................................ Error! Bookmark not defined. 4.6.2 Pengamatan Bakteri dengan Scanning Electron Microscope . Error! Bookmark not defined.

5. PENUTUP ............................................................................................. Error! Bookmark not defined.

5.1 Kesimpulan ...................................................................................... Error! Bookmark not defined. 5.2 Saran ............................................................................................... Error! Bookmark not defined.

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. Error! Bookmark not defined.

LAMPIRAN ................................................................................................ Error! Bookmark not defined.

x

DAFTER TABEL

Tabel Halaman

1. Kriteria Daya Hambat Antibiotik ............................................................ Error!

Bookmark not defined.

2. Desain Rancangan Acak Lengkap Faktorial Uji Daya Hambat ........... Error!


3. Kriteria Zona Hambat ............................................................................ Error!


4. Desain Percobaan Uji MIC ................................................................... Error!


5. Larutan Brown dan Jumlah Kepadatan Escherichia coli ...................... Error!


6. Desain Penanaman Uji Daya Hambat .................................................. Error!


7. Hasil Pembuatan Ekstrak Aquades ...................................................... Error!


8. Kepadatan Suspensi Bakteri Escherichia coli ...................................... Error!


9. Diameter Zona Bening .......................................................................... Error!


10. Hasil Absorbansi MIC (λ 686 nm) ....................................................... Error!


11. Hasil Uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration) ........................ Error!


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Cacing Laut Nereis sp........................................................................... Error!


2. Cacing Tanah Lumbricus rubellus ........................................................ Error!


3. Cacing Tanah Eisenia foetida ............................................................... Error!


4. Bakteri Escherichia coli ......................................................................... Error!


5. Mekanisme Kerja SEM ......................................................................... Error!


6. Alur Prosedur Penelitian ....................................................................... Error!


7. Daya Hambat Ekstrak Nereis sp. (a), Lumbricus rubellus (b), dan

Eisenia foetida (c) ................................................................................ Error! Bookmark not defined.

8. Mekanisme dari Peptida Antimikroba ................................................... Error!


9. Mekanisme Resistensi Bakteri Gram-Negatif terhadap Peptida

Antimikroba ........................................................................................... Error! Bookmark not defined.

10. Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Nereis sp. ...................... Error!


11. Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Lumbricus rubellus ........ Error!


12. Escherichia coli terpapar Ekstrak aquades Eisenia Foetida .............. Error!


13. Pengamatan Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Nereis sp.

menggunakan Scanning Electron Microscope .................................. Error! Bookmark not defined.

14. Pengamatan Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Lumbricus

rubellus menggunakan Scanning Electron Microscope .................... Error! Bookmark not defined.

15. Pengamatan Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Eisenia

foetida menggunakan Scanning Electron Microscope ...................... Error! Bookmark not defined.

xii

16. Ecsherichia coli Normal dan Setelah Pemberian Peptida

Antimikroba.. ................................................................................. … 70

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Prosedur Preparasi Sampel .................................................................. Error!


2. Pembuatan Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut dan Caing Tanah ... Error!


3. Pembuatan Larutan Standar Brown ..................................................... Error!


4. Penentuan Panjang Gelombang .......................................................... Error!


5. Pembuatan Kurva Standar Brown ........................................................ Error!


6. Prosedur Peremajaan Isolat ................................................................. Error!


7. Pembuatan Suspensi Bakteri ............................................................... Error!


8. Uji Daya Hambat Metode Difusi Cakram .............................................. Error!


9. Uji MIC (Minimum Inhibition Concentration) ......................................... Error!


10. Uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration) ................................. Error!


11. Pengamatan Bakteri dengan Pewarnaan ........................................... Error!


12. Preparasi Pengamatan Bakteri dengan SEM .................................... Error!


13. Dokumentasi Penepungan dan Ekstraksi Sampel ............................. Error!


14. Dokumentasi Pembuatan Suspensi ................................................... Error!


15. Dokumentasi Uji Daya Hambat .......................................................... Error!


xiv

16. Dokumentasi Uji MIC (Minimum Inhibition Concentration) ................ Error!


17. Dokumentasi Uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration) ........... Error!


18. Dokumentasi Pengamatan Bakteri dengan Pewarnaan .................... Error!


19. Dokumentasi Pengamatan Bakteri menggunakan SEM .................... Error!


20. Perhitungan Rendemen Ekstrak ......................................................... Error!


21. Perhitungan Regresi untuk Penentuan Kepadatan Bakteri ............... Error!


22. Pembuatan Larutan ............................................................................ Error!


23. Hasil Uji Daya Hambat ........................................................................ Error!


24. Hasil Absorbansi Uji MIC .................................................................... Error!


25. Hasil Pengamatan Uji MBC ................................................................ Error!


26. Komposisi Media ................................................................................. Error!


1

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Escherichia coli merupakan salah satu bakteri yang menyebabkan

berbagai penyakit terutama pada sistem pencernaan. Escherichia coli termasuk

bekteri gram negatif yang bersifat patogen sehingga keberadaanya merugikan

bagi kesehatan. Menurut Wistreich (1999), sakit perut dapat disebabkan oleh

adanya bakteri-bakteri merugikan yang ada dalam saluran pencernaan. Bakteri

penyebab penyakit saluran pencernaan salah satunya adalah Eschericia coli.

Lestari, et al (2013) menyatakan bahwa Escherichia coli merupakan bakteri yang

menyebabkan penyakit diare. Wabah infeksi bakteri Escherichia coli yang meluas

sangat meresahkan tak terkecuali di Indonesia. Escherichia coli digambarkan

sebagai komunitas bakteri coli dengan membangun segala perlengkapan

patogenitasnya di infeksi saluran pencernaan. Escherichia coli adalah salah satu

baketri gram negatif termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang memperoleh

makanan berupa zat organik di lingkunganya.

Menurut Polapa (2015), Eschericia coli adalah bakteri gram negatif

berbentuk batang yang secara normal hidup di saluran pencernaan manusia dan

hewan. Meskipun secara normal hidup di saluran pencernaan, banyak kasus

diare yang disebabkan oleh bakteri ini. Ditambahkan oleh Indriati, et al (2012),

Escherichia coli yang merupakan bakteri normal didalam usus manusia akan

menimbulkan penyakit bila masuk ke dalam organ atau jaringan lain. Sifatnya

unik karena dapat menyebabkan infeksi primer pada usus, misalnya diare pada

anak seperti juga kemampuannya menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh lain

di luar usus. Menurut Elfidasari, et al (2011), Escherichia coli tersebar di banyak

tempat dan kondisi dengan rentang suhu pertumbuhan 80C – 460C, tetapi suhu

2

optimum pertumbuhanya 370C. Oleh karena itu, bakteri ini dapat hidup dalam

tubuh manusia dan vertebrata lain. Bakteri ini juga berbahaya apabila hidup di

luar usus seperti pada saluran kemih, yang dapat mengakibatkan peradangan

selaput lendir (sistitis).

Pertumbuhan bakteri Escherichia coli biasa dihambat dengan memberikan

antibiotik, namun penggunaan antibiotik secara terus-menerus akan

menimbulkan sifat resisten bakteri target terhadap antibiotik yang diberikan.

Pengobatan pada pentakit diare juga biasanya menggunakan antibiotik, namun

obat sintetik ini dapat menyebabkan resisten pada saluran pencernaan (Indriati,

et al. 2012). Salah satu upaya untuk mengurangi resistensi, pemberian antibiotik

harus berdasarkan pola bakteri penyebab infeksi dan kepekaan bakteri terhadap

antibiotik (Nurmala, et al. 2015). Saat ini telah banyak terjadi resistensi bakteri

Escherichia coli sebagai penyebab infeksi saluran kemih terhadap antibitotik

sehingga angka kesakitan semakin tinggi. Escherichia coli memiliki resistensi

yang tinggi terhadap clindamycin, pipemidic acid, penicillin G, streptomycin

masing-masing sebesar 100% (Endriani, et al. 2010). Pemberian antibiotik

sintetis secara terus menerus dapat menimbulkan resistensi bakteri patogen

terhadap antibiotik sintetik yang dapat meningkatkan prevalensi penyakit infeksi

(Hayati, et al. 2011). Oleh karena itu, diperlukan penelitian untuk memperoleh

bahan alami yang berpotensi sebagai antibakteri Escherichia coli.

Potensi senyawa antibakteri alami salah satunya dapat diperoleh dari

golongan hewan annelida termasuk cacing, baik cacing laut maupun cacing

tanah. Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa cacing laut Nereis sp.

cacing tanah Lumbricus rubellus dan cacing tanah Eisenia foetida memiliki

senyawa yang bersifat antibakteri. Jekti, et al. (2008) melaporkan adanya

senyawa antibakteri dari cacing laut kelas polychaeta yang mampu menghambat

3

pertumbuhan bakteri Pseudomonas auroginosa, Escherichia coli, Klebsiella sp.,

Streptococcus pyogenes, Staphylococcus auerus, dan Streptococcus

pneumoniae. Cacing laut ini memiliki kandungan bromophyrrole yang mampu

menghambat respirasi mikroba. Menurut Aninda (2016), cacing laut

Siphonosoma australe selain bermanfaat sebagai antihiperglikemik, juga memiliki

kandungan steroid yang bersifat antibakteri. Deloffre, et al (2003) menyatakan

bahwa cacing laut Nereis diversicolor memiliki senyawa metalloprotein tipe II

(MPII) yang bersifat antibakteri dan berperan dalam sistem pertahanan diri

terhadap lingkungan. Ditambahkan oleh Tasiemski, et al (2006), cacing laut

Nereis diversicolor memiliki peptida hedistin yang bersifat antibakteri terhadap

Staphylococcus aureus dan Vibrio alginolyticus.

Cacing tanah Lumbricus sp. memiliki senyawa aktif yang telah

dimanfaatkan sebagai bahan obat, pelembut kulit dan antiinfeksi. Ekstrak cacing

tanah lumbricus sp. juga memiliki senyawa antibakteri yang bersifat bakterisidal

pada Staphylococus aureus dan Shigella flexneri dan bersifat bakteristatik

terhadap Streptococcus beta hemoliticus dan Vibrio cholerae (Suryani, 2010).

Air rebusan cacing tanah Lumbricus rubellus dapat menghambat pertumbuhan

bakteri Escherichia coli pada konsentrasi 20%. Kemampuan antibakteri dari air

rebusan cacing tanah Lumbricus rebellus ini karena memiliki senyawa

antimikroba yaitu lumbricin (Indriati, et al. 2012). Istiqomah, et al (2014)

menambahkan bahwa ekstrak kering cacing tanah Lumbricus rubellus juga dapat

menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella pullorum dan Staphylococcus

aureus.

Cacing tanah Eisenia foetida dalam mekanisme pertahan diri pada

lingkungan melibatkan senyawa antibakteri. Senyawa antibakteri ini terdiri dari

beberapa protein seperti lisozim dan fetidin (Grdisa, et al. 2013). Popovic, et al

4

(2005) melaporkan bahwa Eisenia foetida mengandung glikolipoprotein G-90

yang berguna sebagai antibakteri. Liu, et al (2004) menemukan adanya peptida

antibakteri OEP3121 pada cacing tanah Eisenia foetida yang berguna dalam

melawan mikroba yang resisten terhadap beberapa obat-obatan. Govindarajan

dan Prabakaran (2012) menambahkan bahwa Eisenia foetida mampu

menghambat pertumbuhan beberapa bakteri patogen yaitu Pseudomonas

aeruginosa dan Escherichia coli.

Senyawa antibakteri yang terdapat pada cacing laut Nereis sp., cacing

tanah Lumbricus rubellus, dan cacing tanah Eisenia foetida dapat diperoleh

melalui ekstraksi pelarut. Pelarut yang biasa digunakan untuk mengekstraksi

senyawa aktif alami adalah aquades. Ekstraksi menggunakan pelarut aquades

dilakukan dengan ekstraksi dekokta. Ekstraksi menggunakan metode dekokta

dengan pelarut aquades merupakan salah satu metode yang cukup baik karena

kebnyakan masyarakat menggunakan metode yang hampir mirip dengan

dekokta yaitu perebusan simplisia mencapai suhu 90° C selama 30 menit untuk

memperoleh cairan rebusan yang digunakan sebagai obat tradisional (Rohmah,

2016). Pemilihan pelarut yang akan digunakan dalam proses ekstraksi harus

memperhatikan sifat kandungan senyawa yang akan diisolasi. Sifat yang penting

adalah polaritas suatu senyawa (Septiana, et al. 2012). Menurut sudarmadji, et al

(1996), pada prinsipnya suatu bahan akan mudah larut dalam pelarut yang sama

polaritasnya.

Keberadaan Escherichia coli akan menimbulkan efek merugikan terutama

jika berada dalam tubuh manusia, beberapa penyakit akan ditimbulkan oleh

adanya bakteri ini. Sifat resistensi Escherichia coli terhadap beberapa antibiotik

sintetis yang biasa digunakan menjadi salah satu kendala dalam mengatasi

pertumbuhan bakteri ini, oleh karena itu diperlukan penelitian mengenai bahan

5

alami yang berpotensi memiliki sifat antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli.

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui manfaat dari ekstrak aquades cacing

laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus, dan cacing tanah Eisenia

foetida sebagai antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari penelitian ini yaitu ada atau tidaknya aktivitas

antibakteri ekstrak cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus, dan

cacing tanah Eisenia foetida terhadap Escherichia coli serta ada atau tidaknya

perubahan morfologi dan koloni Escherichia coli yang terpapar ekstrak dengan

pengamatan menggunakan mikroskop cahaya dan Scanning Electron

Microscope.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keberadaan aktivitas

antibakteri ekstrak cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus, dan

cacing tanah Eisenia foetida terhadap Escherichia coli berdasarkan hasil uji daya

hambat, uji MIC (Minimum Inhibition Concentration), uji MBC (Minimum

Bactericidal Concentration) dan pengaruh paparan ekstrak ketiga cacing

terhadap perubahan morfologi dan koloni bakteri yang diamati dengan mikroskop

cahaya dan Scanning Electron Microscope.

1.4 Hipotesis

Hipotesis dari penelitian ini adalah:

H0 : diduga tidak terdapat pengaruh aktivitas antibakteri dari interaksi jenis

spesies cacing dan konsentrasi ekstrak yang berbeda terhadap Escherichia

coli dan tidak terdapat perubahan morfologi dan koloni bakteri terpapar

6

ekstrak yang diamati dengan mikroskop cahaya dan Scanning Electron

Microscope.

H1 : diduga terdapat pengaruh aktivitas antibakteri dari interaksi jenis spesies

cacing dan konsentrasi ekstrak yang berbeda terhadap Escherichia coli

dan terdapat perubahan morfologi dan koloni bakteri terpapar ekstrak yang

diamati dengan mikroskop cahaya dan Scanning Electron Microscope.

1.5 Kegunaan Penelitian

Kegunaan penelitian ini adalah diharapkan peneliti mendapatkan adanya

aktivitas antibakteri ekstrak cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus

rubellus, dan cacing tanah Eisenia foetida terhadap bakteri Escherichia coli.

1.6 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2017 - Juni 2017. Proses

preparasi sampel, pembuatan ekstrak kasar, uji aktivitas antibakteri, dan

pengamatan mikroorgansime dengan pewarnaan dilaksanakan di Laboratorium

Keamanan Hasil Perikanan, Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan, dan

Laboratorium Perekayasa Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan, Universitas Brawijaya, Malang. Pengamatan Scanning Electron

Microscope

7

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Cacing

Cacing dalam pandangan sebagian orang hanya dihubungkan dengan

cacing tanah, atau paling tidak cacing parasit intestinal. Cacing (annelida) adalah

salah satu cabang terbesar dari hewan yang mencakup ribuan spesies. Annelida

berarti cincin atau segmen, karakteristik yang memisahkan cacing dari filum

hewan lain. Tubuh annelida terdiri dari beberapa segmen dimana pencernaan

dan aliran darah utamanya mengalir melewati segemen-segmen tersebut (Russel

dan Denning, 2000). Secara tradisional annelida dibagi menjadi polichaeta dan

clitellata, termasuk organisme purba dan secara ekologis penting yang termasuk

didalamnya 16.500 spesies yang berhabitat di lautan, perairan tawar dan daratan

(Purschke, et al. 2014). Filum Annelida antara lain dibagi menjadi kelas

Oligochaeta, Hirudinea dan Polychaeta. Rambut yang keras dan pendek pada

cacing dinamakan seta. Apabila pada tiap segmen ada banyak seta maka cacing

dimasukkan dalam kelas Polychaeta, apabila seta sedikit masuk ke dalam kelas

Oligochaeta, dan bila tidak memiliki seta maka termasuk kelas Hirudinea. Kelas

Polycaheta umumnya hidup di lautan dan banyak dimanfaatkan sebagai bahan

pangan. Kelas Oligochaeta misalnya adalah cacing tanah Lumbricus sp. dan

cacing tanah Eisenia foetida (Simandjutak dan Waluyo,1982).

Suhardi (1982), menyatakan bahwa tubuh annelida adalah perkembangan

dari coelomata tidak bersegmen seperti priapulida, sipuncula atau echiurida.

Semua bagian tubuh pada tiap segmen merupakan pengulangan dari bagian-

bagian tubuhnya. Saluran pencernaan filum annelida telah lengkap dan

berbentuk tubuller disepanjang anterior hingga posterior. Wijarni (1984)

menambahkan bahwa tubuh annelida telah mempunyai koelom dan kitin yang

8

terbagi menjadi ruas-ruas segmen yang sama, baik dibagian luar ataupun dalam,

kecuali saluran pencernaan yang tersusun melewati anterior hingga posterior.

Annelida memiliki mulut pada ujung anterior yang disebut prostomium.

Makanan masuk melalui prostomium kemudian masuk ke dalam faring. Makanan

melewati esofagus dan disimpan sementara di tembolok, selanjutnya dicerna di

lambung dan usus halus dan sisa pencernaan dikeluarkan melalui anus. Cacing

memiliki alat pembantu yaitu seta, yang berfungsi sebagai jangkar supaya lebih

kokoh pada tempat geraknya. Alat pembantu gerak lainnya adalah lendir yang

diproduksi oleh kelenjar lendir pada epidermis. Pada bagian anterior cacing

terdapat kileteum yang berguna dalam perkembang biakan (Simandjutak dan

Waluyo,1982).

Cacing bernafas melalui kulit, sehingga kulit cacing harus tetap lembap

untuk menjamin difusi O2 dan CO2 tetap berjalan baik. Lapisan tipis pada kulit

yang disebut kutikula menjadi tempat pertukaran udara. Di bawah kutikula

terdapat pembuluh darah untuk diedarkan ke seluruh tubuh. Sistem syaraf terdiri

dari simpul syaraf (ganglion) yang terdapat pada anterior dan simpul syaraf di

ventral serta serabut-serabut syaraf. Sistem peredaran darah cacing diatur oleh 5

pasang jantung. Darah cacing mengandung hemoglobin sebagai pembawa O2.

Cacing memiliki ginjal yang berfungsi mengeluarkan sisa nitrogen (Oemarjati dan

Wardhana, 1990). Suhardi (1982), menyatakan bahwa annelida memiliki sistem

peredaran darah yang berlangsung di dalam pembuluh darah. Sistem syaraf

terdiri atas pusat syaraf yang terletak di bagian punggung yang dilanjutkan oleh

tali syaraf ke arah belakang di daerah perut tubuh yaitu 1 ganglion dan 1 pasang

syaraf untuk tiap segmen.

9

2.2 Cacing Laut Nereis sp.

Cacing laut Nereis sp. termasuk dalam kelas polychaeta keluarga nereidae.

Morfologi badan luarnya tersusun atas segmen-segmen, memiliki sepasang

parapodia dan berseta pada setiap segmen badanya (Rasidi, 2012). Polychaeta

memiliki segmentasi yang jelas dengan banyak somit, banyak seta. Pada bagian

kepala dapat dikenal dengan adanya tentakel dan tidak mempunyai klitelium

(Suhardi, 1982). Cacing laut Nereis sp. dapat hidup pada berbagai sedimen dari

lumpur berpasir hingga pasir saja. Cacing laut keluarga nereidae memiliki saluran

transportasi berupa darah yang mengandung hemoglobin sebagai sarana

transportasi oksigen (Wilson dan Ruff, 1988).

Morfologi anterior cacing laut Nereis sp. dapat dilihat pada gambar 1.

Klasifikasi cacing laut Nereis sp. menurut Wilson dan Ruff (1988) sebagai berikut:

Kingdom : Animalia Filum : Annelida Kelas : Polychaeta Ordo : Phyllodocida Famili : Nereidae Genus : Nereis Spesies : Nereis sp.

Gambar 1. Cacing Laut Nereis sp.

Cacing laut polychaeta banyak ditemukan di perairan pantai mangrove.

Habitat cacing laut umumnya berpasir dan berlumpur yang mengandung bahan

dekomposit. Polychaeta secara ekologi berperan penting sebagai makanan

hewan dasar seperti ikan dan udang (Junardi dan wardoyo, 2008). Habitat cacing

laut yang ekstrim memungkinkan cacing laut memiliki senyawa tertentu sebagai

10

pertahanan diri terhadap lingkungan. Deloffre, et al (2003) menyatakan bahwa

cacing laut Nereis diversicolor memiliki senyawa metalloprotein tipe II (MPII)

yang bersifat antibakteri dan berperan dalam sistem pertahanan diri terhadap

lingkungan. Aninda (2016) menambahkan, cacing laut selain bermanfaat sebagai

antihiperglikemik, juga memiliki kandungan senyawa yang bersifat antibakteri.

2.3 Cacing Tanah Lumbricus rubellus

Cacing tanah Lumbricus rubellus termasuk dalam kelompok epigaesis,

merupakan jenis cacing yang aktif di permukaan tanah. Warna tubuh cacing

tanah Lumbricus rubellus gelap dan memiliki kemampuan penyamaran yang

efektif. Cacing tanah Lumbricus rubellus memiliki kemampuan mendekomposisi

limbah organik (Maulida, 2015). Bentuk tubuh cacing tanah Lumbricus rubellus

silindris dengan tubuh bagian belakang klitelium memipih dorsal lateral dan

bagian

depan atau kepala lebih memipih dari pada bagian belakang atau ekor.

Lumbricus rubellus berwarna merah tua gelap, perut kuning dan memiliki panjang

2,5-10,5 cm. Bagian ekor Lumbricus rubellus berwarna kuning dengan segmen

tubuh berjumlah 95-120 segmen (Dika, 2006).

Cacing tanah Lumbricus sp. memiliki senyawa aktif yang telah

dimanfaatkan sebagai bahan obat, pelembut kulit dan antiinfeksi (Suryani, 2010).

Kandungan asam amino cacing tanah Lumbricus rubellus lengkap serta terdapat

juga lemak, karbohidrat, kalsium, fosfor dan sulfur, asam suksinat dan asam

hialuronat (Sasmito, 2000). Air rebusan cacing Lumbricus rubellus dipercaya

mengobati penyakit infeksi pencernaan (Deni, 2015). Lumbricus rubellus memiliki

senyawa yang bersifat antibakteri. Kemampuan antibakteri dari air rebusan

cacing tanah Lumbricus rebellus ini karena memiliki senyawa antimikroba yaitu

lumbricin (Indriati, et al. 2012).

11

Gambar 2 menunjukan spesies cacing tanah Lumbricus rubellus. Klasifikasi

cacing tanah Lumbricus rubellus menurut Maulida (2015) sebagai berikut:

Kingdom : Animalia Filum : Annelida Kelas : Clitellata Ordo : Oligochaeta Famili : Lumbricidae Genus : Lumbricus Spesies : Lumbricus rubellus

Gambar 2. Cacing Tanah Lumbricus rubellus

2.4 Cacing Tanah Eisenia foetida

Cacing tanah Eisenia foetida merupakan salah satu jenis cacing tanah

yang dibudidayakan secara komersial. Cacing ini memiliki perkembangbiakan

yang cepat serta produktivitas tinggi. Eisenia foetida termasuk hewan tingkat

rendah yang tidak bertulang belakang, sering disebut red wiggler, brandling dan

manure worm. Eisenia foetida mempunyai cincin-cincin kuning dan merah hati

sepanjang tubuhnya, ujung ekor pipih, bagian dorsal berwarna merah muda,

bagian ventral berwarna putih kemerahan dan ekor berwarna orange. Panjang

tubuh Eisenia foetida sekitar 7 cm dengan diameter tiga mm (Permata, 2006).

Menurut Fadaee (2012), nama lokal cacing Eisenia foetida antara lain cacing

macan, cacing bawang, cacing pipih, cacing cadillac dan cacing untuk umpan

pancing.

Cacing Eisenia foetida memiliki warna tubuh coklat tua dengan belang

kuning antar segmen tubuhnya, bentuk bulat dengan panjang sekitar 32-130 mm

12

dan segmen tubuh berjumlah sekitar 80-110 segmen. Lubang jantan (male pore)

umumnya terdapat pada segmen ke-15, sedangkan lubang betina (female pore)

terdapat pada segmen ke-14. Lambung sederhana terdapat di depan usus.

Esofagus mengandung kelenjar kalsiferus yang berfungsi untuk menetralisir

media jika dalam kondisi asam. Klitelium berbentuk saddle, terdapat dibagian

posterior dari lubang jantan (Afriyansyah, 2010).

Gambar 3 menunjukan foto dokumentasi cacing tanah Eisenia foetida.

Klasifikasi cacing tanah Eisenia Foetida menurut Permata (2006) sebagai berikut:

Kingdom : Animalia Filum : Annelida Kelas : Clitellata Sub Kelas : Oligochaeta Ordo : Haplotaciada Famili : Lumbricidae Genus : Eisenia Spesies : Eisenia foetida

Gambar 3. Cacing Tanah Eisenia foetida

Eisenia foetida memiliki manfaat dalam perbaikan ekosistem tanah,

menyuburkan lahan pertanian, meningkatkan manfaat limbah organik,

meningkatkan daya serap air permukaan tanah, mengurai pencemaran

lingkungan, umpan ikan, kosmetik, dan bahan obat (Permata, 2006). Cacing

tanah Eisenia foetida dalam mekanisme pertahan diri pada lingkungan

melibatkan senyawa antibakteri. Senyawa antibakteri ini terdiri dari beberapa

protein seperti lisozim dan fetidin (Grdisa, et al. 2013). Popovic, et al (2005)

13

menambahkan bahwa Eisenia foetida mengandung glikolipoprotein G-90 yang

berguna sebagai antibakteri.

2.5 Ekstraksi Metode Dekokta

Ekstraksi dalam penelitian saintifikasi menurut Mukhriani (2014) bertujuan

untuk mengetahui adanya suatu senyawa yang dapat berfungsi sebagai obat.

Pemilihan metode ekstraksi tergantung pada sifat bahan dan senyawa yang akan

diisolasi. Menurut Yuliani dan Satuhu (2012), ekstraksi adalah proses penarikan

komponen aktif yang terkandung dalam suatu bahan menggunakan pelarut yang

sesuai dengan kelarutan komponen aktifnya. Deri, et al (2015) menambahkan

bahwa Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan senyawa kimia yang

dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Dalam proses

ekstrasi ini, bahan aktif akan terlarut oleh zat penyari yang sesuai sifat

kepolaranya. Hayati, et al (2011) menyatakan bahwa dalam bidang pengobatan,

bahan-bahan hasil proses ekstraksi yang berbentuk ekstrak banyak digunakan

karena lebih spesifik mengandung zat-zat hasil ekstraksi. Proses ekstraksi pada

simplisia nabati berupa cacing Lumbricus rubellus juga dapat meningkatkan

keseimbangan asam amino bahan. Beberapa metode ekstraksi menurut

Istiqomah (2013) antara lain maserasi, perkolasi, refluks, sokletasi, digesti, infusa

dan dekokta.

Metode dekokta merupakan metode ekstraksi yang mudah dilakukan tanpa

menggunakan peralatan laboratorium maupun industri dan lebih aplikatif

diterapkan langsung oleh masyarakat umum (Lestari, 2016). Berdasarkan Badan

Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia (2008), metode dekokta

dilakukan dengn cara menyiapkan sediaan cair yang dibuat dengan

mengekstraksi sediaan herbal dengan air pada suhu 90o C selama 30 menit.

Cara pembuatan ekstrak dengan metode ini adalah dengan mencampur simplisia

14

halus dengan air destilasi sepuluh kali jumlah simplisia dan dipanaskan mulai

suhu 90o C selama 30 menit. Ekstrak disaring dengen kain flanel selagi panas.

Proses ekstraksi dalam penelitian ini juga melibatkan proses evaporasi.

Warbung, et al (2013) mengemukakan bahwa proses penguapan atau evaporasi

dapat memengaruhi kemampuan senyawa aktif dalam menghambat

pertumbuhan bakteri. Evaporasi menurut Mukhriani (2014) dilakukan dengan

cara sampel dimasukkan bersama pelarut ke dalam labu yang dihubungkan

dengan kondensor. Pelarut dipanaskan hingga mencapai titik didih. Uap

terkondensasi dan kembali ke dalam labu. Destilasi uap memiliki proses yang

sama dan biasanya digunakan untuk mengekstraksi minyak esensial (campuran

berbagai senyawa menguap). Selama pemanasan, uap terkondensasi dan

destilat (terpisah sebagai 2 bagian yang tidak saling bercampur) ditampung

dalam wadah yang terhubung dengan kondensor.

2.6 Pelarut Aquades

Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquades. Pemilihan

pelarut aquades didasarkan pada sifat senyawa target yang akan diekstraksi dari

bahan. Menurut Septiana, et al (2012), pemilihan pelarut yang akan digunakan

dalam proses ekstraksi harus memperhatikan sifat kandungan senyawa yang

akan diisolasi. Sifat yang penting adalah polaritas suatu senyawa. Sudarmadji, et

al (1996) menyatakan bahwa pada prinsipnya suatu bahan akan mudah larut

dalam pelarut yang sama polaritasnya. Irvan (2015) menambahkan bahwa

alasan pemilihan pelarut dalam proses ekstraksi diantaranya pelrut mampu

melarutkan senyawa yang akan diekstrak, mudah dipisahkan dan dimurnikan

kembali. Besarnya konsentrasi pelarut merupakan slah satu faktor yang sangat

berpengaruh pada kecepatan perpindahan massa dari solute ke solvent.

15

Aquades merupakan air murni hasil destilasi. Aquades adalah pelarut yang

paling mudah didapat dan murah, bersifat netral dan tidak berbahaya sehingga

aman bila digunakan dalam bahan pangan. Aquades atau air isuling memiliki

kadar mineral sangat minim sehingga baik digunakan. Kelemahan pelarut

aquades terletak pada proses evaporasi yang lebih lama karena titik didihnya

lebih tinggi dibandingkan dengan pelarut lainnya (Sibuea, 2015). Berdasarkan

Badan Pengawas Obat dan Makanan (2008), Aquades memiliki kemampuan

yang baik untuk mengekstraksi sejumlah bahan simplisia. Penggunaan pelarut

aquades dinilai lebih aman karena sediaan ditujukan penggunaannya pada

rongga mulut, tetapi penyarian dengan metode ini menghasilkan filtrat yang tidak

stabil dan mudah tercemar oleh bakteri dan kapang karena bakteri dan kapang

mudah tumbuh pada media berair.

2.7 Uji Akivitas Antibakteri

Antibakteri menurut (Maharani, et al. 2016) adalah zat yang dapat

menghambat pertumbuhan bakteri dan digunakan secara khusus untuk

mengobati infeksi. Aktivitas suatu zat yang bersifat antibakteri dipengaruhi oleh

beberapa faktor seperti konsentrasi bahan, pH, komposisi medium, suhu, jenis

bakteri uji dan kemampuan antibakteri dalam medium. Nugraha (2014)

menambahkan bahwa antibakteri merupakan senyawa yang mampu

menghambat pertumbuhan dan mencegah reproduksi bakteri. Senyawa

antibakteri yang terkandung dalam beberapa jenis ekstrak diketahui mampu

menghambat pertumbuhan bakteri patogen.

Mekanisme penghambatan bakteri patogen oleh antibakteri dapat melalui

beberapa cara antara lain menghambat sintesis dinding sel, merusak

permeabilitas membran sel, menghambat sintesis RNA (proses transkripsi) dan

menghambat sintesis protein (proses translasi) dan replikasi DNA (Nugraha,

16

2014). Senyawa antibakteri mampu menghambat atau membunuh

mikroorganisme melalui beberapa mekanisme antara lain mengambat

pembentukan dinding sel; merusak membran sel; mengganggu sintesis protein;

dan mengambat metabolisme asam nukleat. Potensi biologis suatu senyawa

sebagai antibakteri dinyatakan dalam bentuk mikrogram dengan membandingkan

jumlah penghambatan pertumbuhan bakteri yang disebabkan senyawa selama

pengujian dalam kondisi terkontrol (Pelczar, et al. 1977).

Pengujian aktivitas antibakteri menurut Kusmiyati dan Agustini (2006)

dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode pengenceran. Metode difusi

dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu metode silinder, lubang dan cakram

(Kirby-Bauer). Metode pengenceran dapat dilaukan dengan mengencerkan zat

antibakteri dan dimasukkan ke dalam tabung - tabung reaksi steril. Ke dalam

masing - masing tabung itu ditambahkan sejumlah bakteri uji yang telah diketahui

jumlahnya pada interval waktu tertentu. Pengujian aktivitas antibakteri dalam

penelitian ini menggunakan metode difusi cakram (kirby-Bauer) dan metode

dilusi (pengenceran) dengan pengujian MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

dilanjutkan dengan pengujian MBC (Minimum Bactericidal Concentration).

2.7.1 Uji Daya Hambat Metode Cakram (Kirby-Bauer)

Uji daya hambat metode cakram (Kirby-Bauer) merupakan cara yang

paling sering digunakan untuk menentukan kepekaan bakteri terhadap berbagai

macam antibakteri. Pada cara ini, digunakan cakram kertas (paper disc) yang

berfungsi sebagai tempat menampung zat antibakteri. Kertas cakaram tersebut

diletakkan pada lempeng agar yang telah diinokulasi mikroba uji, kemudian

diinkubasi pada waktu dan suhu tertentu, sesuai dengan kondisi optimum dari

mikroba uji (Prayoga, 2013). Kepekaan suatu antibakteri ditentukan oleh

diameter zona hambat yang terbentuk. Penghambatan pertumbuhan bakteri oleh

17

zat antibakteri terlihat sebagai wilayah yang jernih sekitar pertumbuhan

mikroorganisme. Lebar daerah hambatan ini tergantung pada konsentrasi obat

yang digunakan (Wigati, 2016).

Dasar percobaan uji daya hambat bakteri adalah dengan membiarkan

senyawa berdifusi kedalam perbenihan padat. Kadar senyawa tertinggi tercapai

pada daerah di dekat tempat pemberian obat dan makin jauh makin berkurang.

Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang tidak menunjukan adanya

pertumbuhan bakteri di sekitar cakram. Lebar daerah hambatan tergantung pada

daya resap senyawa kedalam agar dan kepekaan bakteri uji terhadap senyawa

(Soleha, 2015). Kelebihan metode cakram (Kirby-Bauer) ini diantaranya mudah

dilakukan, tidak memerlukan peralatan khusus, dan relatif murah (Prayoga,

2013).

Lebar diameter zona bening dijadikan sebagai parameter melihat kekuatan

senyawa antibakteri yang terkandung dalam ekstrak. Semakin besar diameter

zona bening yang terbentuk mengindikasikan semakin kuat senyawa antibakteri

dalam menghambat pertumbuhan bakteri. Tabel 1 menunjukan kriteria kekuatan

daya hambat berbagai antibiotik dengan metode difusi cakram.

Tabel 1. Kriteria Daya Hambat Antibiotik

Antibiotik Konsentrasi pada cakram tiap

ml

Wilayah penghambatan (mm)

Resisten Intermediate Peka

Ampicilin 0,01 mg <11 12 >14 Kloramfenikol 0,03 mg <12 13-17 >18 Erythromycin 0,015 mg <13 14-17 >18 Gentamycin 0,01 mg <13 14-17 >18 Streptomycin 0,01 mg <11 12-14 >15 Tetracyclin 0,03 mg <14 15-19 >19

Sumber: Lay (1994)

Jawetz, et al (1996) menyatakan bahwa semakin besar diameter zona

bening maka semakin terhambat pertumbuhan bakteri uji, sehingga diperlukan

standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap

18

suatu antibiotik. Faktor yang memengaruhi metode Kirby-Bauer antara lain: (1)

konsentrasi mikroba uji, (2) konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram,

(3) jenis antibiotik, (4) pH medium.

2.7.2 Uji MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration)

Beberapa bahan antimikroba tidak membunuh, tetapi hanya menghambat

pertumbuhan mikroorganisme. Bahan antimikroba bersifat bakteriostatik bila

digunakan dalam konsentrasi kecil, namun bila digunakan dalam konsentrasi

tinggi akan mematikan mikroorganisme (Lay, 1994). Prayoga (2013) menyatakan

bahwa obat yang digunakan untuk membasmi mikroba memiliki ketentuan yaitu

harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya, obat tersebut

haruslah bersifat sangat toksik untuk mikroba tetapi tidak toksik untuk hospes.

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, antibakteri dibagi menjadi 2, yaitu:

1. Antibakteri yang mempunyai sifat menghambat pertumbuhan bakteri

(Aktivitas bakteriostatik)

2. Antibakteri yang mempunyai sifat membunuh bakteri (aktivitas bakterisidal)

Menurut Soleha (2015), minimum inhibitory concentration (MIC) merupakan

konsentrasi terendah zat antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan

bakteri dengan hasil yang dilihat dari pertumbuhan koloni pada agar atau

kekeruhan pada biakan cair, sedangkan minimum bactericidal concentration

(MBC) merupakan konsentrasi terendah zat antibakteri yang dapat membunuh

99,9% bakteri pada biakan selama waktu yang ditentukan. Prayoga (2013)

menambahkan bahwa dalam menghambat pertumbuhan bakteri ataupun

membunuhnya, terdapat kadar minimal. Kadar minimal tersebut masing-masing

dikenal sebagai kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM).

Antibakteri tertentu dapat meningkat aktivitasnya dari bakteriostatik menjadi

19

bakterisisal apabila kadar antibakterinya ditingkatkan melebihi kadar hambat

minimal (KHM).

MIC merupakan petunjuk konsentrasi antibiotik yang mampu menghambat

pertumbuhan mikroorganisme dan juga memberikan petunjuk mengenai dosis

yang diperlukan dalam pengobatan penyakit. MIC didefinisikan sebagai

konsentrasi terendah bahan antimikroba yang menghambat pertumbuhan,

sedangkan MBC adalah konsentrasi terendah bahan antimikroba yang

mematikan. Konsentrasi terendah ini dapat ditentukan menggunakan

pengenceran tabung. Inokulum isolat bakteri yang ditambahkan pada deret

pengenceran tabung yang berisi antibiotik dan pertumbuhan mikroorganisme

dilihat dari kekeruhan di dalam tabung. MIC dapat pula ditentukan dengan

penggunaan berbagai konsentrasi antibiotik dan dibandingkan dengan tabung

kontrol negatif dan positif (Lay, 1994). Penentuan konsentrasi minimum antibiotik

yang dapat membunuh bakteri atau MBC dilakukan dengan menanam bakteri

pada pembenihan cair yang digunakan untuk MIC ke dalam media baru

kemudian di inkubasi semalam pada suhu 370 C (Soleha, 2015). Berdasarkan hal

ini, maka perlu dilakukan pengujian MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dan

MBC (Minimum Bactericidal Concentration).

2.8 Escherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri fakultatif anaerob, berbentuk batang,

bersifat gam negatif dan merupakan flora normal intestinal (Noviana, 2004).

Bakteri ini termasuk bakteri gram negatif berbentuk batang yang secara normal

hidup di saluran pencernaan manusia dan hewan. Meskipun secara normal hidup

di saluran pencernaan, banyak kasus diare yang disebabkan oleh bakteri ini

(Polapa, 2015). Escherichia coli yang merupakan bakteri normal didalam usus

manusia akan menimbulkan penyakit bila masuk ke dalam organ atau jaringan

20

lain. Sifatnya unik karena dapat menyebabkan infeksi primer pada usus,

misalnya diare pada anak seperti juga kemampuannya menimbulkan infeksi pada

jaringan tubuh lain di luar usus (Indriati, et al. 2012),

Menurut Elfidasari, et al (2011), Escherichia coli tersebar di banyak tempat

dan kondisi dengan rentang suhu pertumbuhan 80C – 460C, tetapi suhu optimum

pertumbuhanya 370C. Oleh karena itu, bakteri ini dapat hidup dalam tubuh

manusia dan vertebrata lain. Bakteri ini juga berbahaya apabila hidup di luar usus

seperti pada saluran kemih, yang dapat mengakibatkan peradangan selaput

lendir (sistitis). Menurut Anshari (2011), dalam suatu biakan, Escherichia coli

membentuk koloni bulat konveks, halus dengan pinggir-pinggir yang nyata,

bersifat aerob, meragikan karbohidrat dan mempunyai struktur antigenik yang

kompleks. Bakteri ini juga paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi

karena air maupun makanan yang terdeteksi adanya Escherichia coli yang

bersifat patogen, jika termakan atau terminum dapat menyebabkan keracunan.

Pada umumnya Escherichia coli berwarna putih, kadang-kadang berwarna putih

kekuningan, coklat keemasan, jingga kemerahan atau merah dengan karakter

berombak-ombak, basah dan homogen. Escherichia coli memiliki sistem

membran ganda dimana membran luarnya diselimuti oleh membran luar

permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal dengan peptidoglikan, yang

terletak diantara membran dalam dan membran luarnya. Gambar 4. menunjukan

gambar bakteri Eschericia coli.

Escherichia coli merupakan bagian famili Enterobacteiciae, berbentuk

batang pendek (coccobasil), gram negatif, ukuran 0,4-0,7 µm x 1,4 µm, sebagian

bergerak dan beberapa strain memiliki kapsul dan tidak membentuk spora serta

bersifat anaerob fakultatif, kebanyakan bersifat motil dengan menggunakan

flagella (Sari, 2015). Organisme ini tersebar luas di alam, biasanya lazim terdapat

21

dalam sel pencernaan manusia dan hewan. Escherichia coli tersebar diseluruh

dunia dan ditularkan bersama air atau makanan yang terkontaminasi oleh fases.

Escherichia coli tidak dapat mengurangi asam sitrat dan garam sitrat sebagai

sumber karbon tunggal dan tidak menghasilkan pigmen, tetapi kadang-kadang

menghasilkan pigmen berwarna kuning. Escherichia coli bersifat aerob atau

fakultatif anaerob, dapat tumbuh pada media buatan. Koloni terlihat basah,

mengkilat, tidak bening, bulat dengan tepi yang terlihat halus dan rata. Koloni

muda terlihat granuler halus dan makin tua menjadi granuler kasar

(Wasitaningrum, 2009). Klasifikasi taksonomi Escherichia coli menurut Tantri

(2016) sebagai berikut:

Kingdom : Bacteria Divisi : Protobacteria Kelas : Gamma Protobacteria Bangsa (Ordo) : Enterobacteriales Suku (Familia) : Enterobactericeae Marga (Genus) : Escherichia Spesies : Escherichia coli

Gambar 4. Bakteri Escherichia coli (Anshari, 2011)

Escherichia coli memiliki potensi untuk menyebabkan penyakit. Escherichia

coli yang bersifat patogen dapat dibagi menjadi tiga sub kelompok utama

tergantung pada sifat patogen mereka, yaitu commensal atau nonpathogenic,

infeksi usus yang menyebabkan patogen dan ekstraintestinal patogen E. coli

(ExPEC). Escherichia coli pada usus yang bersifat phatogen mencakup banyak

22

pathotype seperti enterotoxigenic (ETEC), enteropathogenic (EPEC),

enterohemorrhagic (EHEC), semua jenis strain ini menyebabkan infesi pada usus

manusia (Iswara, 2015). Escherichia coli termasuk salah satu bakteri Coliform

yang dapat menularkan penyakit pada manusia atau hewan lingkungan perairan

yang tercemar (Kusumawardani, 2016). Keberadaanya dalam air mempunyai

korelasi yang tinggi terhadap ditemukanya patogen di makanan. Makanan yang

sering terkontaminasi adalah susu, air minum, sayuran, buah-buahan, ikan dan

makanan laut lainya. Kontaminasi Escherichia coli juga bisa melalui alat

pengolahan makanan yang dicuci dengan air yang terkontaminasi bakteri ini

(Sari, 2015).

Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif bagian famili

Enterobactericeae, dinding sel pada bakteri gram negatif menurut Hendrayati

(2012), terdiri dari peptidoglikan dan membran luar. Dinding sel berperan penting

sebagai proteksi terhadap tekanan osmotik internal dan juga berperan dalam

pembelahan sel. Pada umumnya dinding sel bersifat permeabel non selektif,

namun membran luar ekstrasitopalsmik bekteri gram negatif dapat menghambat

perpindahan molekul-molekul berukuran besar. Membran luar ini merupakan

suatu lipid bilayer dengan protein, lipoprotein dan polisakarida. Variasi pada

membran luar inilah yang menyebabkan terdapatnya sifat patogenitas dan

resistensi mikroba. Noviana (2004) melaporkan bahwa Escherichia coli telah

mengalami resistensi terhadap berbagai antibiotik diantaranya streptomisin dan

tetrasiklin.

Istiqomah (2014) menyatakan bahwa bakteri gram negatif memiliki struktur

yang lebih kompleks, yaitu kompleks molekul liposakarida yang melindungi

senyawa toksik dan antibiotik, serta membuat lapisan tipis peptidoglikan dan

plasma membran. Struktur dinding sel yang lebih kompleks dan stabil

23

menyebabkan resistensi bakteri gram negatif lebih tinggi dibandingkan golongan

bakteri gram positif yang hanya mempunyai lapisan tunggal peptidoglikan.

Campbell, et al (2002) menambahkan bahwa Bakteri gram negatif umumnya

lebih resisten terhadap antibiotik dibandingkan dengan bakteri gram positif

karena membran bagian luar menghalangi masuknya obat-obatan. Bakteri gram

negatif memiliki dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan dengan bakteri

gram positif.

2.9 Pengamatan Bakteri

2.9.1 Pengamatan dengan Pewarnaan Sederhana

Pengamatan bakteri menggunakan pewarnaan sederhana dapa dilakukan

dengan bantuan mikroskop cahaya. Menurut Lay (1994), mikroskop merupakan

alat bantu yang memungkinkan obyek yang sangat kecil (mikroskopis) dapat

diamati. Mikroskop cahaya memiliki tiga sistem lensa, yaitu lensa obyektif, lensa

okuler, dan kondensor. Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya,

karena tidak menadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang

menyebabakan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau latar

belakangnya. Zat warna mengadsorbsi atau membiaskan cahaya sehingga

kontras mikroorganisme dan sekelilingnya ditingkatkan. Waluyo (2008)

menambahkan bahwa pada umumnya bekteri tidak memiliki zat warna sehingga

bersifat tembus cahaya. Sitoplasma sel bakteri memiliki indeks bias yang hampir

sama dengan indeks bias lingkunganya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan

latar belakangnya dapat diperjelas dengan pemberian zat warna. Penelitian ini

menggunakan teknik pewarnaan sederhana untuk mengamati bakteri uji dibawah

mikroskop cahaya.

Pewarnaan sederhana merupakan salah satu teknik pewarnaan positif,

yaitu prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme.

24

Pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu macam zat warna untuk

meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya,

prosedur pewarnaan sederhana menggunakan zat warna bermuatan basa

seperti kristal violet, biru metilen, karbol fuksin basa, safranin atau hijau malakit.

Pewarnaa sederhana sering digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan

penataan mikroorganisme. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat

penataan bakteri, pada kokus dapat terlihat penataan seperti rantai

(streptokokus), buah anggur (stafilokokus), pasangan (diplokokus), bentuk kubus

yang terdiri dari 4 atau 8 kokus (sarcinae) (Lay, 1994).

Pada pengamatan morfologi sel mikroorganisme, seringkali dilakukan

fiksasi diikuti dengan pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara

melewatkan pada api atau merendam pada methanol. Tujuan dilakukan fiksasi

adalah untuk melekatkan bakteri pada gelas objek dan mematikan bakteri (Lay,

1994).

2.9.2 Pengamatan dengan Scanning Electron Microscope (SEM)

SEM merupakan mikroskop elektron yang dapat digunakan untuk

mengamati morfologi permukaan dalam skala mikro dan nano. Teknik analisis

SEM menggunakan elektron sebagai sumber pencitraan dan medan

elektromagnetik sebagai lensanya (Rianita, et al. 2014). Scanning Electron

Microscope (SEM) bekerja berdasarkan prinsip scan sinar elektron pada

permukaan sampel, yang selanjutnya informasi yang didapatkan diubah menjadi

gambar. Pada SEM gambar dibuat berdasarkan deteksi elektron baru atau

elektron pantul yang muncul dari permukaan sampel ketika permukaan sampel

tersebut discan dengan sinar elektron. Elektron sekunder atau elektron pantul

yang terdeteksi selanjutnya diperkuat sinyalnya, kemudian besar amplitudonya

25

ditampilkan dalam gradasi gelap-terang pada layar monitor CRT (cathode ray

tube) (Oktaviana, 2009). Gambar 5. menunjukan mekanisme kerja SEM.

Sujatno, et al (2015) menyatakan bahwa meskipun sinyal data yang

dihasilkan cukup kuat dibanding mikroskop optik atau XRD, tetapi karena

seringkali obyek pengamatan yang terbilang kecil dan mengandung komponen

non konduktif, seperti lapisan pasivasi oksida pada permukaan, SEM dapat

memberikan kontras yang relatif rendah terlebih pada perbesaran tinggi. Oleh

karena itu SEM harus dioperasikan dengan pengaturan parameter elektron

seperti high voltage, spot size, bias dan beam current juga parameter optik

seperti kontras, fokus dan astigmatismus yang tepat sehingga diperoleh hasil

gambar yang optimal secara ilmiah dan tidak memberikan interpretasi ganda.

Selain itu, proses pengambilan gambar dan analisis kimia dengan SEM

sangatlah dipengaruhi oleh jenis sampel berikut cara penangannya serta teknik

preparasinya di samping kemampuan operasional dari operatornya.

Gambar 5. Mekanisme Kerja SEM (Hafner, 2007)

26

3. MATERI DAN METODE PENELITIAN

3.1 Materi Penelitian

Materi penelitian ini meliputi alat penelitian dan bahan penelitian.

Penjelasan mengenai alat dan bahan penelitian dijelaskan pada sub bab berikut.

3.1.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat untuk

pembuatan ekstrak kasar cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus

dan cacing tanah Eisenia foetida, alat-alat untuk uji aktivitas antibakteri dengan

metode difusi cakram serta MIC dan MBC, pengamatan morfologi bakteri dengan

pewarnaan sederhana, dan pengamatan morfologi bakteri uji menggunakan

perangkat scanning electron microscope.

Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan ekstrak kasar cacing laut

Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan cacing tanah Eisenia foetida

adalah loyang, saringan, baskom, blender, mortal, alu, sendok bahan, hot plate,

termometer, spatula, gelas beker 1000 ml, magnetic stirrer IKA produksi Jerman

tahun 2010, rotary evaporator IKA RV-10 produksi Malaysia tahun 2014, kulkas

merk Daichi produksi Jepang tahun 2005, oven Memmert UN 55 produksi

Jerman tahun 2015, gelas ukur 100 ml, labu ukur 100 ml, timbangan digital merk

A&D produksi Jepang tahun 2010, timbangan analitik Mettler Toledo AL-204

produksi Italia tahun 2010 dan botol vial 10 ml. Alat-alat yang digunakan untuk uji

aktivitas antibakteri adalah autoklav merk Hirayama produksi Jepang tahun 2004,

timbangan digital merk A&D produksi Jepang tahun 2010, cawan petri, tabung

reaksi merk Pyrex Iwaki beserta raknya, botol semprot, sprayer, bunsen, laminar

air flow Biobase produksi China tahun 2015, spektofotometer Spectroquant

Pharo 300 produksi Jerman tahun 2011, inkubator Memmert UN 55 produksi

27

Jerman tahun 2015, freezer merk Sansio produksi Jepang tahun 2005,

mikropipet blue tip merk eppendorf produksi Jerman tahun 2016, jarum lop, jarum

ose, vortex mixer merk IKA produksi tahun 2008, dan jangka sorong Sellery 54-

808 produksi China tahun 2017. Alat-alat untuk pengamatan morfologi bakteri

adalah kaca objek, pipet tetes, cuvet, bunsen, mikroskop Olympus CX22

produksi Jepang tahun 2014 dan Scanning Electron Microscopy TM 3000

Hitachi with SwiftED 3000 X-Ray Microanalysis produksi Jepang tahun 2016.

3.1.2 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan-bahan

untuk pembuatan ekstrak kasar cacing laut laut Nereis sp., cacing tanah

Lumbricus rubellus dan cacing tanah Eisenia foetida, bahan-bahan untuk uji

aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram serta MIC dan MBC,

pengamatan morfologi bakteri dengan pewarnaan sederhana, dan pengamatan

morfologi bakteri uji menggunakan perangkat scanning electron microscope.

Sampel cacing tanah Eisenia foetida dan Lumbricus rubellus dalam kondisi

hidup yang diperoleh dari CV. Alam Organik di Kelurahan Sukun, Kota Malang,

Provinsi Jawa Timur. Sampel cacing laut Nereis sp. diperoleh dari pesisir

Kabupaten Tuban, Provinsi Jawa Timur (LS 6,894o, BT 112,147o). Bahan-bahan

untuk proses ekstraksi adalah aquades, alumunium foil, kertas label, kertas

saring whatmann no 41, plastic wrap dan air. Bahan-bahan uji aktivitas

antibakteri adalah biakan murni Escherichia coli yang diperoleh dari Laboratorium

Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, aquades, cotton swab,

media Muller Hilton Agar merk Himmedia produksi India tahun 2017, media

Nutrient Agar merk Oxoid produksi Inggris tahun 2016, media Trypton Soy Broth

merk Oxoid produksi Inggris tahun 2016 , NaCl pa merk Oxoid produksi Inggris

tahun 2016, alkohol, kertas cakram steril merk Oxoid (diameter 6 mm) produksi di

28

Inggris tahun 2017, kertas cakram chloramphenikol 30 ppm oxoid (diameter 6

mm) produksi di Inggris tahun 2017, dan ampicillin komersil produksi Kimia

Farma tahun 2017. Bahan-bahan untuk pengamatan morfologi bakteri dengan

pewarnaan adalah kristal violet merck, aquades, dan cover glass dan object

glass. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji SEM adalah cover slide, Phosphat

Buffer Solid, etanol dan glutaraldehyde.

3.2 Metode Penelitian

Metode penelitian atau metode ilmiah adalah prosedur atau langkah-

langkah dalam mendapatkan pengetahuan ilmiah dan menyusun ilmu

pengetahuan (Suryana, 2010). Metode penelitian merupakan usaha untuk

menemukan, mengembangkan dan melakukan verifikasi terhadap kebenaran

suatu peristiwa atau pengetahuan. Metode penelitian membicarakan berturut-

turut megenai suatu penelitian dilakukan, yaitu dengan alat apa dan prosedur

bagaimana suatu penelitian dilakukan (Hamdi, 2014).

Penelitian ini menggunakan metode eksperimen, tujuan penelitian

eksperimental menurut Dahlan (2013) adalah untuk mengetahui hubungan antar

variabel. Suryana (2010) menyatakan bahwa metode eksperimen adalah metode

penelitian untuk menguji apakah variabel-variabel eksperimen efektif atau tidak.

Untuk menguji efektif tidaknya harus digunakan variabel kontrol. Penelian ini

menggunakan metode eksperimen untuk mengetahui ada atau tidaknya

pengaruh ekstrak kasar aquades cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus

rubellus dan cacing tanah Eisenia foetida terhadap bakteri Escherichia coli.

Eksperimen yang dilaksanakan adalah mengetahui pengaruh konsentrasi

berbeda dari ekstrak kasar aquades ketiga cacing terhadap kriteria zona hambat,

serta mengetahui sifat bakteriostatik atau bakterisidal dari Escherichia coli yang

terpapar ekstrak kasar aquades ketiga cacing melalui pengujian MIC dan MBC.

29

Eksperimen untuk uji daya hambat metode difusi cakram (Kirby-Bauer)

adalah dengan rancangan acak lengkap faktorial dengan enam perlakuan

dengan tiga kali pengulangan pada masing masing variabel. Variabel bebas yang

digunakan adalah konsentrasi ekstrak (0, 10, 100, 1.000, 10.000 dan 100.000

ppm) dan kontrol positif (kloramfenikol 30 ppm). Variabel terikat adalah diameter

zona bening dengan satuan mm pada ekstrak dan kontrol positif. Tabel 2.

menunjukan desain percobaan uji daya hambat metode difusi cakram dalam

penelitian ini.

Tabel 1. Desain Rancangan Acak Lengkap Faktorial Uji Daya Hambat

No Eksperimen

Faktor 1 Faktor 2 Escherichia coli (X)

R1 R2 R3

1 Ekstrak aquades Nereis sp. (A)

0 ppm (a) AaX1 AaX2 AaX3 10 ppm (b) AbX1 AbX2 AbX3 100 ppm (c) AcX1 AcX2 AcX3 1.000 ppm (d) AdX1 AdX2 AdX3 10.000 ppm (e) AeX1 AeX2 AeX3 100.000 ppm (f) AfX1 AfX2 AfX3

2

Ekstrak aquades Lumbricus rubellus (B)


3

Ekstrak aquades Eisenia foetida(C)


4 Kontrol positif (D)

Kloramfenikol (D) 30 ppm (g)

DgX1 DgX2 DgX3

Variabel kontrol digunakan untuk menguji efektif atau tidaknya variabel-

variabel eksperimen. Kontrol positif dan negatif untuk mengetahui kebenaran

bahwa penghambatan memang disebabkan oleh senyawa antibakteri. Kontrol

positif yang digunakan adalah kloramfenikol. Nilai diameter zona hambat ekstrak

dibandingkan dengan penelitian Permadani, et al (2015) dan nilai diameter

30

kontrol positif berdasarkan metode Bonang dan Koeswardono (1982). Tabel 3.

menunjukkan kriteria zona hambat.

Tabel 2. Kriteria Zona Hambat

Jenis antibiotik Diameteri daerah hambatan

Resisten Agak resisten Peka Sangat peka

Ekstrak ≤ 5 mm 6-10 mm 11-20 mm ≥ 21 mm Chloramfenikol 30 ppm <12 mm 13-17 mm >18 mm -

Uji MIC dilaksanakan menggunakan pengenceran tabung. Penentuan nilai

MIC menggunakan metode eksperimental dengan variabel bebas berupa

konsentrasi ekstrak dari ketiga jenis cacing dan kontrol positif. Konsentrasi

ekstrak yang diberikan adalah 0, 12.500, 25.000, 50.000, dan 100.000 ppm.

Konsentrasi kontrol positif adalah 10.000 ppm. Variabel terikat adalah nilai

serapan Optical Density (OD) sebelum dan sesudah inkubasi 8 jam pada

spektofotometer UV vis (λ 686 nm). Penurunan nilai OD pada konsentrasi

terendah dianggap menjadi nilai MIC. Penentuan nilai MBC dilakukan dengan

memindahkan suspensi uji MIC yang diisolasi pada media TSB steril yang tetap

berwarna jernih. Desain uji MIC ditunjukan oleh Tabel 4.

Tabel 3. Desain Percobaan Uji MIC

No Eksperimen

Faktor 1 Faktor 2 Escherichia coli (X)

R1 R2 R3

1 Ekstrak aquades Nereis sp. (A)

100.000 ppm (a) AaX1 AaX2 AaX3 50.000 ppm (b) AbX1 AbX2 AbX3 25.000 ppm (c) AcX1 AcX2 AcX3 12.500 ppm (d) AdX1 AdX2 AdX3 0 ppm (e) AeX1 AeX2 AeX3

2

Ekstrak aquades Lumbricus rubellus (B)


3

Ekstrak aquades Eisenia foetida(C)


4 Kontrol positif (D)

Ampicilin 100.000 ppm (f) DfX1 DfX2 DfX3

31

Suspensi hasil uji MIC diamati di bawah mikroskop cahaya perbesaran

100 x dengan zat warna safranin. Pengamatan dengan Scanning Electron

Microscope hanya dilakukan pada suspensi nilai MIC dari ketiga jenis sampel.

3.3 Analisis Data

Analisis data meliputi data suspensi isolat, data uji daya hambat dan data

uji minimum inhibition concentration. Pembuatan kurva standar brown untuk

penentuan jumlah suspensi menggunakan bantuan aplikasi MS Excell 2013.

Sumbu Y adalah nilai OD dan sumbu X adalah ketetapan suspensi. Setelah

diperoleh kurva dilanjutkan dengan analisis regresi sehingga diperoleh rumus

berikut:

Y= a+bX

Dengan : Y= nilai OD X= kepadatan suspensi a= koefisien b=koefisian

Nilai daya hambat dianalisis dengan ANOVA untuk mengetahui perbedaan

konsentrasi tiap ekstrak dan kontrol. Taraf nyata yang digunakan adalah 5%.

Apabila ditemukan perbedaan nyata pada tiap perlakuan, maka dilanjutkan

dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) pada taraf 5%. Analisis data menggunakan

aplikasi SPSS 16 for Windows.

Nilai MIC dianalisis dengan statistika deskriptif meliputi rerata dan standar

deviasi hasil pengujian. Analisis data menggunakan aplikasi MS. Excell 2013.

Penentuan MBC ditentukan dengan pengamatan visual.

3.4 Prosedur Penelitian

Prosedur penelitian yang dilaksanakan terdiri dari penelitian pendahuluan

dan penelitian utama. Alur penelitian diawali dengan preparasi sampel yaitu

proses pembuatan tepung cacing dari sampel cacing segar. Tepung yang

32

didapat diekstrak dengan metode dekokta menggunakan pelarut aquades. Hasil

ekstarksi kemudian dievaporasi dengan rotary evaporator sehingga diperoleh

ekstrak kental. Ekstrak kental dari hasil evaporasi digunakan untuk pengujian

aktivitas antibakteri melalui pengujian daya hambat metode cakram (Kirby-Bauer)

dan pengujian minimum inhibition concentration (MIC) dilanjutkan dengan

pengujian minimum inhibition concentration (MBC). Biakan bakteri pada tabung

isolat uji MIC diamati menggunakan pewarnaan sederhana dengan bantuan

mikroskop cahaya perbesaran 100 kali dan tabung yang menunjukan nilai MIC

diamati morfologinya menggunakan scanning electron microscope (SEM)

perbesaran 15.000 kali untuk membuktikan pengaruh paparan ekstrak terhadap

bakteri uji Escherichia coli. Gambar 6. menunjukan alur prosedur penelitian.

Gambar 1. Alur Prosedur Penelitian

33

Pengujian daya hambat beserta pengukuran zona bening yang dihasilkan,

pengujian MIC dan MBC masing-masing dilakukan pengulangan sebanyak tiga

kali untuk memperoleh data yang mendekati kebenaran. Sudarmadji, et al (1996)

menyatakan bahwa untuk memperoleh data yang mendekati kebenaran dapat

ditempuh dengan cara statistik, misalnya dengan pengulangan yang cukup

sehingga harga rata-rata secara teoritis lebih mendekati kebenaran dibandingkan

dengan satu angka yang diperoleh tiap satu kali pengukuran saja.

3.5 Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan meliputi tahapan preparasi sampel, pembuatan

ekstrak kasar aquades cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus

dan cacing tanah Eisenia foetida serta pembuatan kurva standar Brown untuk

penentuan kepadatan suspensi bakteri. Parameter yang diamati pada penelitian

pendahuluan ini adalah rendemen ekstrak cacing terhadap berat tepung cacing

sampel, panjang gelombang serapan maksimum larutan standar Brown pada

spektrofotometer UV-vis dan kurva standar Brown.

3.5.1 Preparasi Sampel (Sudarmi, et al. 2012).

Preparasi sampel yang dilaksanakan bertujuan untuk memperoleh tepung

cacing laut dan cacing tanah. Sampel cacing laut dan cacing tanah segar

dibersihkan dari kotoran dan tanah yang menempel dengan dicuci pada air

mengalir hingga bersih, dikeluarkan kotoran dan isi perut cacing, dicuci kembali

kemudian ditiriskan dan dikeringkan di lemari pengering oven merk Memmert UN

55 produksi Jerman tahun 2015 pada suhu 500C selama 8 jam atau hingga

benar-benar kering. Sampel kering selanjutnya ditepungkan menggunakan

blender dan tepung yang dihasilkan disimpan dalam wadah plastik zip lock.

Prosedur proses preparasi sampel ditunjukan pada Lampiran 1.

34

3.5.2 Pembuatan Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut Nereis sp., Cacing Tanah Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida (Hayati, et al. 2011)

Pembuatan ekstrak kasar dilaksanakan menggunakan metode dekokta

dengan pelarut aquades mengacu pada penelitian Hayati, et al (2011) dengan

modifikasi. Tepung cacing hasil preparasi sampel ditimbang sebanyak 50 gram

dan dilarutkan dalam 500 mL aquades. Larutan dipanaskan menggunakan hot

plate IKA produksi Jerman tahun 2015 selama 30 menit terhitung sejak larutah

bersuhu 900C.

Larutan kemudian dipisahkan dengan cara disaring sehingga didapatkan

filtrat. Filtrat dipekatkan dengan cara diuapkan menggunakan rotary evaporator

IKA-RV 10 produksi Malaysia tahun 2014 pada suhu 600C selama 30 menit

hingga konsistensinya kental. Ekstrak kental yang didapatkan dimasukan dalam

wadah tertutup dan disimpan pada suhu 40C sebelum siap digunakan dalam

pengujian aktivitas antibakteri. Diagram alir proses pembuatan ekstrak kasar

aquades cacing laut Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan cacing

tanah Eisenia foetida ditunjukan pada Lampiran 2.

3.5.3 Pembuatan Kurva Standar Brown (modifikasi Bonang dan Koeswardono, 1982 dan Zamani, et al. 2016)

Kurva standar Brown digunakan untuk mengetahui kepadatan suspensi

bakteri uji, kurva standar ini didapat dari hasil olah data larutan Brown. Prosedur

pembuatan larutan standar Brown mengacu pada metode Bonang dan

Koeswardono (1982). Sebanyak 7 mL barium sulfat (BaSO4) 1% dicampurkan

dalam 49 mL natrium sitrat 1%. Larutan tersebut dibagi dalam 10 tabung dengan

proporsi sesuai Tabel 5. Pada masing-masing tabung ditambahkan larutan

natrium sitrat 1% hingga volume 10 mL sesuai Tabel 5. Kepadatan suspensi

bakteri Escherichia coli berdasarkan standar Brown ditunjukan pada Tabel 5.

Pembuatan laruran standar Brown ditunjukan pada Lampiran 3.

35

Tabel 4. Larutan Brown dan Jumlah Kepadatan Escherichia coli

Nomor tabung

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Barium sulfat 1% + natrium sitrat 1% (ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Natrium sitrat 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -

Kepadatan Escherichia coli x 106

CFU/ ml

379 757 1.136 1.515 1.894 2.272 2.651 3.030 3.408 3.787

Larutan Brown 1-10 kemudian dicari absorbansi maksimal menggunakan

spektrofotometer UV-vis berdasarkan metode Zamani, et al (2016) pada panjang

gelombang (λ) 550 nm, 650 nm, dan 750 nm. Hasil pembacaan absorbansi

diulang tiga kali, rata-rata nilai absorbansi yang menunjukan korelasi positif

dengan kenaikan nomor tabung reaksi dan memperoleh nilai R2 yang paling

mendekati 1 berdasarkan analisis regresi linier digunakan sebagai panjang

gelombang yang digunakan untuk pembuatan kurva standar Brown dan

penentuan kepadatan suspensi bakteri. Prosedur penentuan panjang gelombang

ditunukan pada Lampiran 4.

Kurva dibuat menggunakan aplikasi Minitab 17 dan dianalisis regresi linier.

Sumbu Y adalah absorbansi dan sumbu X adalah panjang gelombang. Regresi

linier dibuat sehingga diperoleh rumus Y=a+bX. Rumus ini dijadikan untuk

penentuan kepadatan suspensi dengan spektrofotometer UV-vis Spectroquant

pharo 300 produksi Jerman tahun 2011. Pembuatan kurva standar ditunjukan

pada Lampiran 5.

3.6 Penelitian Utama

Penelitian utama yang dilaksanakan meliputi penentuan kepadatan

suspensi bakteri, uji daya hambat, uji MIC dan MBC, pengamatan bakteri uji

dengan pewarnaan sederhana dan pengamatan lanjutan menggunakan SEM

pada perbesaran 15.000 kali.

36

3.6.1 Sterilisasi Alat (Warbung, et al. 2013)

Sterilisasi peralatan sangat dibutuhkan dalam setiap pengujian mikrobiologi

untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Peralatan yang akan digunakan dalam

penelitian dicuci dengan sabun dan bibilas dengan air mengalir. Peralatan dan

bahan yang akan digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilsasi

menggunakan autokalv dengan suhu 1210C pada tekanan 1 atm selama 20

menit, sedangkan untuk peralatan berbahan plastik yang tidak tahan panas

disterilkan pada suhu dan tekanan yang sama selama 15 menit. Peralatan

berbahan logam disterilkan dengan cara dipanaskan langsung pada bunsen

hingga memijar.

3.6.2 Peremajaan Bakteri (Yusriana, et al. 2014)

Isolat bakteri Escherichia coli didapat dari Laboratorium Mikrobiologi

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Isolat bakteri tersebut disimpan pada

suhu 40C dan dilakukan peremajaan. Peremajaan bakteri dilakukan untuk

merawat isolat murni agar tetap tumbuh baik. Metode peremajaan bakteri

mengacu pada Yusriana, et al (2014). Isolat bakteri dari cawan petri diambil

menggunakan jarum ose steril dengan cara digores dan dipindahkan pada media

NA miring 5 ml dalam tabung reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 370C

selama 24-48 jam. Prosedur peremajaan isolat bakteri ditunjukan pada

Lampiran 6.

3.6.3 Pembuatan Suspensi Bakteri (Ngajow, et al. 2013)

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Escherichia coli

yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas

Brawijaya. Metode pembuatan suspensi bakteri mengacu pada Ngajow et al.,

(2013) dengan modifikasi. Bakteri uji diambil 4-10 ose dari media NA miring yang

tealah diinkubasi, kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi berisi NaCl

37

fisiologis 0,9%. Suspensi tersebut dihomogenkan menggunakan vortex mixer

hingga kekeruhanya setara dengan standar Brown. Pembuatan suspensi bakteri

ditunjukan pada Lampiran 7.

Kepadatan suspensi bakteri dtentukan berdsarkan tingkat kekeruhan yang

pengukuranya menggunakan spektrofotometer UV-vis dan dibandingkan dengan

kurva standar. Dasar teknik ini adalah banyaknya cahaya yang diabsorbsi

sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu (Lay, 1994).

Jumlah bakteri pada suspensi didapatkan dengan mengkalibrasi nilai kerapatan

optik (otical density / OD) ke dalam jumlah bakteri dalam satuan CFU/mL. kurva

kalibrasi dibuat dengan sumbu X sebagai jumlah hidup dan sumbu Y sebagai

nilai OD. Kurva pembanding untuk pengukuran OD menggunakan larutan

Standar Brown.

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur suspensi bakteri

menggunakan spektrofotometer UV-vis adalah 650 nm. Nilai OD suspensi bakteri

dibandingkan dengan kurva standar Brown. Kepadatan suspensi bakteri yang

digunakan untuk uji aktivitas antibakteri setara dengan larutan Brown 2 yaitu 757

x 106 CFU/mL. Jumlah kepadatan ini sudah memenuhi syarat untuk pengujian

aktivitas antibakteri. Menurut Mulyati (2009), pada pengujian antibakteri kisaran

jumlah kepadatan inokulum yang digunakan 107 CFU/mL, ditambahkan oleh

Hermawan, et al (2007), syarat jumlah bakteri uji untuk pengujian aktivitas

antibakteri dengan metode difusi adalah 105-108 CFU/mL.

3.6.4 Uji Daya Hambat Metode Difusi Cakram (Hasyim, et al. 2012)

Media yang digunakan dalam uji daya hambat metode difusi cakaram pada

penelitian ini adalah Muller-Hinton Agar (MHA). Pembuatan media mengacu

pada penelitian Hasyim, et al (2013). Media MHA ditimbang sebanyak 6,84 gram

38

kemudian dilarutkan ke dalam 180 ml aquades. Media distrelisasi menggunakan

autoklav pada suhu 1210C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit.

Bakteri uji Escherichia coli diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi,

Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya. Suspensi bakteri dibuat

menggunakan larutan NaCl fisiologis 0,9%, kepadatanya diukur menggunakan

spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 650 nm dan disetarakan

dengan standar Brown sehingga diperoleh jumlah kepadatan sebesar 784 x 106

CFU/mL. Penanaman bakteri pada media mengacu pada penelitian Halim dan

Zubaidah (2013) menggunakan cotton swab steril. Cotton swab steril dicelupkan

dalam suspensi dan diperas secara melingkar pada bagian dalam tabung reaksi,

kemudian digoreskan berkesinambungan pada media MHA secara merata.

Kontrol positif yang digunakan adalah antibiotik kloramfenikol, sedangkan

kontrol negatifnya adalah DMSO (dimetil sukfoksida) 10%. Kontrol positif dibuat

untuk mengetahui sifat bakteri uji terhadap antibiotik kloramfenikol. Rancangan

percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan

perlakuan masing-masing 6 konsentrasi pada ketiga cacing berbeda. Konsentrasi

ekstrak yang dibuat yaitu 0, 10, 100, 1000, 10.000, 100.000 ppm menggunakan

pelarut DMSO 10%. Desain penanaman uji daya hambat ditunjukan pada

Tabel 6.

Tabel 5. Desain Penanaman Uji Daya Hambat

Ulangan cawan

Konsentrasi ekstrak pada cakram pada DMSO 10% Kontrol positif kloramfenikol

1 0

ppm 10

ppm 100 ppm

1.000 ppm

10.000 ppm

100.000 ppm

30 ppm

2 0

ppm 10

ppm 100 ppm

1.000 ppm

10.000 ppm

100.000 ppm

30 ppm

3 0

ppm 10

ppm 100 ppm

1.000 ppm

10.000 ppm

100.000 ppm

30 ppm

Kertas cakram merk oxoid yang telah disterilkan dicelupkan ke dalam

masing-masing konsentrasi ekstrak sampai jenuh, kemudian diletakan diatas

39

media yang telah ditanami bakteri menggunakan pinset steril. Inkubasi dilakukan

selama 8 jam pada suhu 370 C menggunakan inkubator Memmert UN 55

produksi Jerman tahun 2015. Parameter yang diamati adalah zona hambat yang

dihasilkan tiap-tiap kertas cakram. Zona hambat ditandai dengan adanya zona

bening disekitar kertas cakram. Pengukuran zona hambat menggunakan jangka

sorong Sellery 54-808 produksi China tahun 2017 dengan cara hasil pengukuran

diameter zona bening dikurangi dengan diameter kertas cakram yang digunakan

(6mm), pengukuran dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Prosedur uji daya

hambat ditunjukan pada Lampiran 8.

DMSO (dimetil sulfoksida) 10% digunakan karea DMSO merupakan salah

satu pelarut yang dapat melarutkan hampir semua senyawa baik polar maupun

non polar. Selain itu DMSO tidak memberikan daya hambat pertumbuhan bakteri

sehingga tidak mengganggu hasil pengamatan pengujian aktivitas antibakteri

dengan metode difusi agar (Handayani, et al. 2009). Antibiotik kloramfenikol

digunakan sebagai kontrol positif untuk pengujian aktivitas antibakteri pada

pengujian dengan metode difusi agar. Kloramfenikol melancarkan efek

antimikrobial dengan cara mengganggu sintesis protein (Waluyo, 2008).

Diameter zona bening yang dihasilkan dianalisis dengan ANOVA pada

taraf nyata 5% menggunakan aplikasi SPSS 16. Apabila ditemukan perbedaan

nyata dilanjutkan dengan uji BNJ (Beda Nyata Jujur/ Tukey) pada taraf nyata 5%

untuk membedakan tiap perlakuan konsentrasi.

3.6.5 Penentuan Minimum Inhibition Concentration (MIC) dan Minimum

Bactericidal Concentration (MBC)

MIC merupakan konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan

mikroorganisme dalam kaldu yang dapat ditentukan dengan mengukur

kekeruhan setelah inkubasi (Lay, 1994). Uji MIC dilaksanakan menggunakan

40

metode pengenceran tabung dengan modifikasi metode uji MIC Bonang dan

Koeswardono (1982). Pengujian dilakukan dengan menyiapkan enam tabung

reaksi berisi 5 ml media TSB steril, kemudian ditambahkan ekstrak cacing

sehingga terbentuk larutan dengan berbagai konsentrasi. Konsentrasi yang

digunakan adalah 0, 12.500, 25.000, 50.000, dan 100.000 ppm. Pemilihan

rentang konsentrasi ekstrak berdasarkan uji hasil zona hambat yang menunjukan

adanya hambatan ekstrak.

Media TSB dibuat dengan melarutkan 8,1 gram media ke dalam 270 mL

aquades, kemudian media distrelisasi dengan autoklav pada suhu 1210 C

tekanan 1 atm selama 15 menit. Tahap selanjutnya menyiapkan 6 tabung reaksi

yang akan diisi masing-masing konsentrasi beserta tabung kontrol positif. Kontrol

positif (tabung 6) menggunakan 0,05 gram ampicilin dengan TSB 5 mL sebagi

pengencer sehingga konsentrasinya menjadi 10.000 ppm. Pembuatan

konsentrasi ekstrak diawali dengan membuat larutan stok ekstrak konsentrasi

200.000 ppm dengan melarutkan 4 gram ekstrak ke dalam 20 mL TSB steril

(b/v). Tabung 1,2,3,4,5 masing-masing diisi 5 mL TSB steril. Sebanyak 5 mL dari

larutan stok ekstrak 200.000 ppm diambil dan dimasukan ke dalam tabung 1

sehingga konsentrasi tabung 1 menjadi 100.000 ppm. Selanjutnya dari tabung 1

konsentrasi 100.000 ppm diambil sebanyak 5 mL dan dimasukan dalam tabung 2

sehingga konsentrasi tabung 2 menjadi 50.000 ppm. Langkah yang sama

dilanjutkan pada tabung 3 dan 4 sehingga konsentrasi tabung 3 dan 4 berturut-

turut adalah 25.000 dan 12.500 ppm. pengambilan 5 mL ekstrak dari tabung 5

dibuang (tidak dipakai), hal ini untuk menyetarakan volume setiap tabung,

sedangkan tabung 5 tetap berisi 5 mL TSB steril yang berfungsi sebagai kontrol

negatif. Volume akhir larutan pada tiap-tiap tabung reaksi sebanyak 5 mL.

Selanjutnya pada ke enam tabung reaksi (0, 12.500, 25.000, 50.000, 100.000

41

ppm dan kontrol positif) dimasukan masing-masing sebanyak 1 mL suspensi

bakteri Escherichia coli yang telah dikethui kepadatanya tiap mL.

Setiap selesai pencampuran, larutan dihomogenkan dengan vortex mixer

selama 1 menit. Sebelum diinkubasi keenam tabung tersebut diukur optical

density (OD) menggunakan spektrofotometer UV-vis (λ 686 nm). Seluruh tabung

selanjutnya diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370C selama 8 jam. Selesai

inkubasi selama 8 jam tiap-tiap tabung kembali dilakukan pengukuran optical

density (OD) menggunakan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang

yang sama, langkah ini dilakukan untuk membandingkan nilai OD sebelum dan

setelah inkubasi sehingga dapat ditentukan nilai MIC. Nilai MIC ditentukan

berdasarkan rata-rata nilai OD masing-masing konsentrasi yang menunjukan

adanya penurunan absorbansi setelah dilakukan inkubasi, konsentrasi terkecil

dimana terjadi penurunan absorbansi dianggap sebagai nilai MIC. Prosedur uji

MIC ditunjukan pada Lampiran 9.

Penentuan nilai MBC dilaksanakan berdasarkan metode Lay (1994).

Suspensi dalam tabung uji MIC setelah inkubasi selama 8 jam dipindahkan ke

dalam media TSB baru 5 mL. Suspensi MIC yang mengalami penurunan niali

absorbansi diambil menggunakan jarum ose kemudian dipindahkan ke dalam

media TSB baru. Tabung tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 240C.

Pengamatan hasil inkubasi dilakukan dengan melihat ada tidaknya kekeruhan,

kekeruhan ini mengindikasikan adanya pertumbuhan bakteri dalam media TSB.

Apabila dalam media TSB terdapat pertumbuhan koloni bakteri berarti ekstrak

cacing ersifat bakteriostatik, sedangkan apabila tidak ada pertumbuhan koloni

bakteri (warna media jernih) berarti ekstrak bersifat bekterisidal. Nilai MBC

ditentukan ketika tidak ditemukanya kekeruhan media uji pada konsentrasi

42

terendah. Pengulangan pengujian MIC dan MBC dilakukan sebanyak tiga kali.

Prosedur uji MBC ditunjukan pada Lampiran 10.

3.6.6 Pengamatan Bakteri dengan Pewarnaan (Lay, 1994)

Pewarnaan dilakukan dalam pengamatan bakteri untuk meningkatkan

kontras bakteri dan lingkungan sekelilingnya. Pengamatan ini menggunakan

bantuan mikroskop merk Olympus CX22 produksi Jepang tahun 2014. Prosedur

pewarnaan menggunakan metode Lay (1994). Biakan cair yang telah diberi

perlakuan ekstrak disiapkan terlebih dahulu. Kaca objek yang akan digunakan

dibersihkan menggunakan alkohol, oleskan suspensi MIC dengan cotton swab ke

bagian tengah kaca objek kemudian teteskan zat warna safranin, dicuci dan

dikeringkan dengan kertas saring. Pengamatan dilakukan menggunakan

mikroskop dengan perbesaran 100 kali. Prosedur pengamatan bakteri dengan

pewarnaan ditunjukan pada Lampiran 11.

3.6.7 Pengamatan Bakteri dengan Scanning Electron Microscop (Anita,

2016)

Pengamatan menggunakan SEM dilakukan pada suspensi yang ditetapkan

sebagai nilai MIC dari tiga spesies cacing. Preparasi SEM menggunakan metode

Anita (2016), preparasi SEM bakteri Escherichia coli dimulai dengan fiksasi

kimiawi preparat dalam larutan glutaraldehide 2% selama selama 3 jam pada

suhu 40C. Suspensi kemudian dicuci menggunakan buffer phosphate pH 7,4

pada suhu 40C dan diaduk. Dilanjutkan dengan proses dehidrasi oleh etanol

bertingkat (20%, 50%, 70%, 96%, absolut) masing-masing selama 15 menit.

Suspensi dioleskan pada cover glass dan dilanjutkan dengan pelapisan emas

paladium. Preparat yang telah siap selanjutnya dimasukan ke perangkant SEM

TM 3000 Hitachi with SwiftED 3000 X-ray microanalysis dan dilakukan eksplorasi

43

dan observasi terhadap sampel uji. Proses preparasi pengamatan bakteri

menggunakan SEM ditunjukan pada Lampiran 12.

Fiksasi berfungsi mematikan sel tanpa mengubah struktur sel yang akan

diamati. Selanjutnya sampel didehidrasi. Dehidrasi pada objek yang diamati

bertujuan tidak hanya membersihkan kelebihan larutan fiksasi namun

membersihkan spesimen dan partikel-partikel lain yang melekat. Larutan etanol

paling banyak digunakan sebab menyebabkan pengerasan jaringan. Proses

dehidrasi merupakan cara untuk membuang air dari dalam sel, sehingga tidak

mengganggu proses pengamatan (Anita, 2016).

44

4. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Ekstrak Kasar Aquades Cacing Laut Nereis sp., Cacing Tanah Lumbricus rubellus dan Cacing Tanah Eisenia foetida

Sampel cacing yang dipakai berupa cacing laut Nereis sp. dan dua cacing

tanah yaitu Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida. Ketiga sampel cacing terlebih

dahulu ditepungkan sebelum diekstraksi dengan metode dekokta menggunakan

pelarut aquades. Filtrat hasil ekstraksi dievaporasi menggunakan evaporator

untuk menguapkan pelarut yang masih tercampur sehingga diperoleh ekstrak

kental.

Sebanyak 50 gram tepung cacing laut Nereis sp. yang dilarutkan dalam

500 mL aqudes mengasilkan 20 gram ekstrak kental. Efisiensi evaporasi sebesar

92,8% dimana dari larutan sebelum evaporasi 485 mL diperoleh sisa pelarut hasil

evaporasi sebanyak 450 mL. Kenampakan ekstrak yang diperoleh yaitu

berwarna kehitaman, kental dan bau amis menyengat, Tepung cacing tanah

Lumbricus rubellus sebanyak 50 gram yang dilarutkan dalam 500 mL aquades

meghasilkan 15,5 gram ekstrak kental. Efisiensi evaporasi sebesar 93,8%

dimana dari larutan sebelum evaporasi 490 mL diperoleh sisa pelarut hasil

evaporasi sebanyak 460 mL. Kenampakan ekstrak yang diperoleh yaitu

berwarna coklat kehitaman, kental dan bau agak amis. Tepung cacing tanah

Eisenia foetida sebanyak 50 gram yang dilarutkan dalam 500 mL aquades

menghasilkan 10,6 gram ekstrak kental. Efisiensi evaporasi sebesar 96,9%

dimana dari larutan sebelum evaporasi 490 mL diperoleh sisa pelarut hasil

evaporasi sebanyak 475 mL. Kenampakan ekstrak yang diperoleh yaitu coklat

kehitaman, kental dan agak amis. Hasil ekstraksi aquades dari ketiga sampel

cacing ditunjukan pada tabel 7.

45

Volume pelarut hasil evaporasi yang berkurang dibandingkan dengan

volume pelarut awal disebabkan oleh adanya pelarut yang menguap pada saat

proses ekstraksi dan masih adanya pelarut yang menempel pada residu tepung

cacing sampel, seperti yang dinyatakan oleh Sundari, et al (2015) bahwa

penurunan volume air setelah perlakuan panas disebabkan karena pemanasan

suhu tinggi. Perhitungan rendemen ekstrak ditunjukan pada Lampiran 20.

Tabel 1. Hasil Pembuatan Ekstrak Aquades

No Ekstrak

Aquades Foto Ekstrak Berat Rendemen

Persentase Pelarut

Terevaporasi

1 Nereis sp.

20 gram

40 % 92,8 %

2 Lumbricus

rubellus

15,5 gram

31 % 93,8 %

3 Eisenia foetida

10,6 gram

21,2 % 96,9 %

Aquades digunakan dalam proses ekstraksi karena dengan pelarut ini

memungkinkan dilakukan ekstraksi dengan cara sederhana dan metode

tradisional seperti perebusan yang mirip dengan metode dekokta. Rohmah

(2016), menyatakan bahwa kebanyakan masyarakat menggunakan cara yang

hampir mirip dengan ekstraksi metode dekokta dengan pelarut aquades, yaitu

menaikan suhu mencapai 90oC selama 30 menit untuk membuat air rebusan

cacing sebagi obat.

46

4.2 Kepadatan Suspensi Bakteri Uji

Suspensi bakteri uji yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri

ditentukan kepadatanya sdalam CFU/mL menggunakan kurva standar Brown.

Kurva standar Brown diperoleh dari regresi linier absorbansi larutan standar

Brown 1 sampai Brown 10. Absorbansi optimum larutan standar Brown

didapatkan pada panjang gelombang 650 nm. Panjang gelombang optimum

yang dipilih berdasarkan hasil kurva regresi yang sesuai dengan hukum Lambert-

Beer. Menurut Sudarmadji, et al (1996), hukum Lambert-Beer adalah hubungan

lineralitas absorbansi dengan konsentrasi larutan sampel. Pada panjang

gelombang 550 nm dan 750 nm terjadi penyimpangan hukum Lambert-Beer yaitu

dengan adanya penambahan konsentrasi larutan, absorbansi tidak bertambah

secara liniar.

Analisis regresi linier hasil aplikasi minitab 17 diperkuat dengan

perhitungan melalui MS Excell berdasarkan metode Prajitno (1985) untuk

memeroleh nilai masing-masing koefisien. Kepadatan suspensi bakteri

Escherichia coli yang digunkanan dalam penelitian ditunjukan pada tabel 8.

Perhitungan rumus regresi linier yang diperoleh ditunjukan pada Lampiran 21.

Rumus regresi linier untuk perhitungan kepadatan suspensi bakteri uji sebagai

berikut :

Y = 0,01319 + 1,597x10-10X

Keterangan: Y : absorbansi pada λ 650 nm X : kepadatan suspensi bakteri (CFU/mL)

Tabel 2. Kepadatan Suspensi Bakteri Escherichia coli

Jenis Uji Absorbansi (Y) Kepadatan dalam 106 CFU/mL

(X)

Uji Daya Hambat 0,138 ± 0,001 784

Uji MIC 0,162 ± 0,001 932

47

Kepadatan suspensi bakteri Escherichia coli dalam larutan NaCl fisiologis

0,9% yang diperoleh setelah pengukuran adalah sesuai dengan Brown 2.

Kepadatan ini sudah dianggap layak untuk digunakan sebagai suspensi bakteri

uji pada uji aktivitas antimikroba dimana kepadatanya setara dengan 108 CFU/ml,

sesuai dengan pernyataan Hermawan, et al (2007), syarat jumlah bakteri uji

untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah 105-108 CFU/mL. Hendrayati, et al

(2012) menyatakan bahwa dalam penelitian mengenai aktivitas antibakteri

digunakan suspensi bakteri Escherichia coli dengan kepadatan suspensi sebesar

108 CFU/mL.

4.3 Uji Daya Hambat

Daya hambat yang dihasilkan ekstrak sampel dapat diketahui dengan

adanya zona bening disekitar cakram, kekuatan daya hambat berbanding lurus

dengan besarnya diameter zona bening dalam satuan milimeter. Pengukuran

dilakukan dengan cara menghitung total diameter yang terbentuk dikurangi

dengan diameter kertas cakram yang digunakan (6mm). Uji daya hambat beserta

pengukuran zona bening yang dihasilkan dilakukan pengulangan sebanyak tiga

kali. Daya hambat berbagai konsentrasi ekstrak sampel ditunjukan pada Tabel 9.

Zona hambat yang diperoleh dilakukan uji rancangan acak lengkap faktorial

pada taraf 5% dan dilakukan uji lanjut beda nyata jujur (BNJ) atau tukey. Hasil

analisis ANOVA pada taraf 5% menunjukan bahwa terdapat perbedaan nyata

dari perlakuan yang diberikan. Notasi yang berbeda pada rata-rata diameter tiap-

tiap perlakuan menunjukan terdapat beda nyata, sehingga perlu dilakukan uji

lanjut. Berdasarkan uji lanjut BNJ untuk membedakan perlakuan antar sampel

didapatkan bahwa ekstrak kasar aquades cacing tanah Lumbricus rubellus

kosentrasi 100.000 ppm memiliki daya hambat paling kuat terhadap bakteri

48

Escherichia coli dibandingkan dengan perlakuan lain. Data daya hambat

ditunjukan pada Lampiran 23.

Tabel 3. Diameter Zona Bening

No Jenis Ekstrak Konsentrasi Zona Bening

(mm)

1

Ekstrak Aquades Nereis sp.

0 ppm 0±0a

10 ppm 0±0a

100 ppm 0±0a

1000 ppm 0±0a

10.000 ppm 0±0a

100.000 ppm 2,02±0,01c

Kloramfenikol 30 ppm 18,56±0,13f

2

Ekstrak Aquades Lumbricus rubellus

0 ppm 0±0a

10 ppm 0±0a

100 ppm 0±0a

1000 ppm 0±0a

10.000 ppm 2,08±0,11c

100.000 ppm 3,07±0,07e

Kloramfenikol 30 ppm 18,64±0,04f

3

Ekstrak Aquades Eisenia foetida

0 ppm 0±0a

10 ppm 0±0a

100 ppm 0±0a

1000 ppm 0±0a

10.000 ppm 1,84±0,04b

100.000 ppm 2,56±0,06d

kloramfenikol 30 ppm 18,57±0,03f

Bakteri Escherichia coli menunjukan sifat yang tergolong resisten terhadap

ekstrak kasar aquades Nereis sp., Lumbricus rubellus maupun Eisenia foetida

berdasarkan kriteria zona hambat menurut Permadani, et al (2015) dimana

diameter zona bening yang dihasilkan kurang dari 5 mm. Berdasarkan kriteria

daya hambat menurut Bonang dan Koeswardono (1982), bakteri Escherichia coli

menunjukan sifat yang tergolong peka terhadap kontrol positif berupa antibiotik

kloramfenikol, dimana diameter zona bening yang dihasilkan lebih dari 18 mm.

Zona bening yang dari berbagai ekstrak ditunjukan pada Gambar 7.

49

(a) (b)

(c)

Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Nereis sp. (a), Lumbricus rubellus (b), dan Eisenia foetida (c)

Keterangan : 1 : kontrol positif kloramfenikol 2 : konsentrasi 100.000 ppm 3 : konsentrasi 10.000 ppm 4 : konsentrasi 1000 ppm 5 : konsentrasi 100 ppm 6 : konsentrasi 10 ppm 7 : konsentrasi 0 ppm

Antibiotik kloramfenikol yang digunakan sebagai kontrol positif terbukti

efektif untuk menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli, terlihat dari

besarnya diameter zona yang dihasilkan. Gunawan (2007) menyatakan bahwa

bakteri Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphilococcus aureus dan Salmonella

thypi merupakan bakteri-bakteri yang sensitif terhadap kloramfenikol. Dian, et al

(2015) menyatakan bahwa kloramfenikol adalah antibiotik spektrum luas yang

1

2

3

4

5

6

7

5

6

1

2

3

4

7 7

1

2

3

4

5

6

50

efektif terhadap beberapa jenis bakteri. Bakteri Escherichia coli termasuk dalam

kategori sensitif terhadap antibiotik kloramfenikol (30 ppm) dengan hasil diameter

zona hambat sebesar 20 mm. Ditambahkan oleh Sasongko (2014), Escherichia

coli memiliki tingkat resistensi yang relatif kecil terhadap antibiotik kloramfenikol,

sehingga penggunaan kloramfenikol untuk infeksi Escherichia coli masih efektif.

Mekanisme kloramfenikol dalam menghambat bakteri adalah dengan cara

menghambat sintesis protein sel bakteri. Antibiotik ini menghalangi pelekatan

asam amino pada rantai peptida yang baru timbul pada ribosom (Wasitaningrum,

2009). Kloramfenikol akan menghambat peptidil transferase pada fase

pemanjangan sehingga mengganggu sisntesis protein dalam waktu 3-5 jam

setelah pemakaian oral (Taufiq, et al. 2015), obat ini memblokir ikatan asam

amino pada rantai peptida yang mulai timbul pada unit 50s ribosom dengan

mengganggu kerja peptidil transferase (Erviani, 2013). Enzim peptidil tranferase

inilah yang membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang masih

melekat pada tRNA-nya, dan asam terakhir peptida yang masih berkembang, hal

ini menyebabkan proses sintesis protein terhenti seketika (Dian, et al. 2005),

Hasil penelitian menunjukan adanya lima kelompok daya hambat dari

seluruh ekstrak yang masing-masing kelompok menunjukan perbedaan nyata.

Ekstrak Lumbricus rubellus 100.000 ppm menunjukan daya hambat tertinggi

sebesar 3,07 mm, berbeda nyata terhadap kelompok kedua yaitu ekstrak Eisenia

foetida 100.000 ppm dengan daya hambat 2,56 mm. Kelompok ketiga adalah

ekstrak Lumbricus rubellus 10.000 ppm dan ekstrak Nereis sp. 100.000 ppm

masing-masing dengan 2,08 mm dan 2,02 mm. Kelompok ke empat yaitu ekstrak

Eisenia foetida 10.000 ppm dengan daya hambat sebesar 1,84 mm. Kelompok

kelima yaitu ekstrak Nereis sp. 10-10.000 ppm, Lumbricus rubellus 10-1000 ppm

dan Eisenia foetida 10-1000 ppm yang tidak menghasilkan daya hambat

51

terhadap Escherichia coli (0 mm). Daya hambat semakin besar seiring

bertambahnya konsentrasi ekstrak yang diberikan, hal ini sesuai pernyataan

Pelczar dan Chan (1977) bahwa semakin besar tingkat konsentrasi antibakteri

yang diberikan maka sifat toksiknya akan semakin tinggi terhadap bakteri uji.

Ekstrak aquades cacing laut Nereis sp. menghasilkan zona penghambatan

terhadap Escherichia coli sebesar 2,08 mm, hasil ini menunjukan adanya

senyawa yang bersifat antibakteri terhadap Escherichia coli dalam ekstrak

tersebut. Tasiemski, et al (2006) melaporkan bahwa cacing laut Nereis sp.

memiliki peptida antimikroba bernama hedistin yang bersifat antibakteri.

Penelitian Jekti, et al (2008) membuktikan bahwa cacing laut dari kelas polycheta

yang telah difraksinasi mampu memberikan aktivitas penghambatan terhadap

beberapa bakteri diantaranya Escherichia coli, Klebsiella sp. dan Staphylococcus

aureus masing-masing 5 mm, 2 mm dan 5 mm. Zat antibakteri pada cacing laut

berfungsi sebagai pertahanan diri terhadap bakteri pada habitat aslinya.

Deloffre, et al (2003) melaporkan adanya hemerythrin yang bersifat

sebagai antibakteri. Senyawa tersebut dihasilkan oleh cacing laut Nereis

diversicolor. Protein hemerythrin berfungsi sebagai cadmium scavenger atau

pemakan cadmium dan iron scavenger atau pemakan zat besi yang digunakan

cacing tersebut dalam mempertahankan diri dari serangan bakteri. Protein

hemerythrin tersebut diproduksi dan diekspresikan dalam pusat haematopoitik

yang melayang bebas dalam cairan lambung sebelum disimpan dalam

granulosit. Pada saat terjadi gangguan bakteri maka protein hemerythrin tersebut

akan dibawa ke pembuluh darah dan aktif sekitar 10 jam setelah infeksi terjadi.

Ekstrak aquades Lumbricus rubellus mulai menunjukan penghambatan

terhadap Escherichia coli pada konsentrasi 10.000 ppm yaitu sebesar 2,08 mm,

sedangkan pada konsentrasi 100.000 ppm besar penghambatan 3,07 mm.

52

Penelitian Deni (2015) membuktikan adanya aktivitas antibakteri ekstrak air

cacing Lumbricus rubellus terhadap bakteri gram negatif Salmonella thypi

sebesar 9,875 mm dengan konsentrasi ekstrak 50%. Penelitian Indriati, et al

(2012) juga menunjukan adanya aktivitas antinakteri dari air rebusan cacing

Lumbricus rubellus terhadap Escherichia coli pada konsentrasi 80% sebesar 7,92

mm. Kemampuan antibakteri dari air rebusan cacing tanah Lumbricus rebellus ini

karena memiliki senyawa antimikroba yaitu lumbricin. Menurut Tasiemski (2008),

Lumbricin merupakan senyawa antibakteri dalam cacing tanah yang termasuk ke

dalam golongan peptida antimikroba yang umumnya dimiliki hewan sebagai

bentuk pertahanan diri terhadap mikroorganisme di lingkungan aslinya.

Suryani, et al (2015) menyatakan bahwa Lumbricin adalah senyawa

peptida yang disusun oleh asam amino yang lengkap terutama prolin, dan secara

in vitro mampu menghambat bakteri seperti Escherichia coli dan Staphylococcus

aureus. Menurut Cho, et al (1998), Lumbricin I merupakan senywa peptida

antimikroba yang diisolasi dari cacing Lumbricus rubellus. Lumbricin I

mempunyai aktivitas antimikroba berspektrum luas yang dapat menghambat

bakteri gram positif, gram negatif. Menanisme aksi antibakteri dari lumbricin

belum diketahui dengan pasti sampai saat ini, mekanisme dari sekian banyak

peptida antimikroba berbeda-beda. Secara umum sifat antibakteri dari peptida ini

dengan cara merusak keseimbangan formasi membran sel atau dengan

berinteraksi dengan DNA atau RNA setelah penetrasi ke dalam membran sel.

Deri, et al (2015) menunjukan adanya senyawa alkaloid dari cacing tanah

Lumbricus rubellus yang diekstraksi menggunakan pelarut air. Alkaloid ini juga

diduga berpotensi sebagai senyawa antibakteri. Ditambahkan oleh Indriati, et al

(2012) bahwa dari serangkaian pengujian kimia menunjukan senyawa aktif yang

dimiliki cacing tanah adalah golongan alkaloid yang mengandung atom nitrogen

53

dan bersifat basa. Aktivitas antibakteri alkaloid menurut Oktavia, et al (2013)

yaitu dengan cara mengubah susunan rantai DNA pada inti sel bakteri.

Ekstrak aquades Eisenia foetida menunjukan penghambatan terhadap

Escherichia coli pada konsentrasi 10.000 ppm dan 100.000 ppm masing-masing

sebesar 1,84 mm dan 2,56 mm. Govindarajan dan Prabakaran (2012)

melaporkan bahwa cacing tanah Eisenia foetida mampu menghambat bakteri

Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Menurut Grdisa, et al (2013),

senywa antibakteri pada cacing tanah Eisenia foetida berfungsi dalam

mekanisme pertahan diri pada lingkungan. Senyawa antibakteri ini terdiri dari

beberapa protein seperti lisozim dan fetidin. Ditambahkan oleh Suryani (2010),

mekanisme imunitas cacing melibatkan enzim lysosomal (lisozim) untuk

melindungi diri dari serangan mikroba patogen.

Liu, et al (2004) melaporkan senyawa peptida yang bersifat antibakteri

pada Eisenia foetida yang disebut OEP3121 dengan sequensi asam amino

ACSAG dengan berat molekul 510,8 Da. Menurut Istiqomah, et al (2014), cacing

tanah Eisenia foetida telah dilaporkan memiliki senyawa bioaktif yang dapat

menghambat bakteri patogenik. Senyawa aktif tersebut antara lain

glikolipoprotein G-90 dan Fetidin. Popovic, et al (2005) melaporkan bahwa efek

penghambatan terbaik dari glikolipoprotein G-90 yang terdapat pada Eisenia

foetida terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus pyogenes

diperoleh pada konsentrasi 10µg/mL. Senyawa ini disintesis dan disekresikan

oleh coelomocutes pada cacing ketika bakteri menyerang, coelomocytes

mensekresi protein yang menyerang bakteri, membentuk agregasi dan

menghambat pertumbuhan poliferasi bakteri. Protein-protein yang disekresikan

menyerang lektin (semacam monosakarida) dari membran sel dan membentuk

ikatan dari fosfolipid membran sel sehingga menyebabkan sitolisis.

54

Menurut Wahyuni (2014), aktivitas antibakteri dari ekstrak cacing laut dan

cacing tanah diduga dengan merusak membran plasma bakteri karena

mengandung polipeptida. Membran plasma mengendalikan transport berbagai

metabolit ke luar dan ke dalam sel yang bersifat semi permeabel. Antibakteri

yang merusak membran plasma akan menghambat atau merusak kemampuan

membran plasma sebagai penghalang osmosis, juga mengganggu sejumlah

proses biosintesis yang diperlukan dalam membran. Willey, et al (2009)

menyatakan bahwa Peptida antimikroba memiliki kemampuan untuk merusak

membran plasma bakteri patogen dengan cara interaksi elektrostatik dengan

dinding sel bakteri sehingga terbentuk lubang ionik atau celah yang

menyebabkan terjadinya perubahan pada permeabilitas membran sel.

Ditambahkan oleh Rinanda, et al (2014) bahwa interaksi antara peptida

antimikroba dengan sel bakkteri dipengaruhi daya elektrostatik. Interaksi kation

peptida antimikroba dan anion membran sel bakteri menyebabkan perubahan

permeabilitas sel sehingga senyawa antibakteri bisa menembus ke dalam

sitoplasma dan menyebabkan kerusakan sel.

Peptida antimikroba yang telah ditemukan mayoritas merupakan kationik

peptida antimikroba, yang menyerang membran sel bakteri dengan berinteraksi

dengan muatan negatif dari membran sel dan menyebabkan disintegrasi struktur

lapisanya. Peptida antimikroba dapat membunuh bakteri dengan cara

menganggu beberapa jalur penting dalam sel seperti replikasi DNA dan sisntesis

protein. Efek antibakteri dari peptida antimikroba tidak hanya karena perusakan

membran tetapi juga bisa dari masuknya senyawa ini dalam sel bakteri (Bahar

dan Ren, 2013).

55

Gambar 2. Mekanisme dari Peptida Antimikroba (Bahar dan Ren, 2013)

Zona hambat dari ekstrak aquades Nereis sp., Lumbricus rubellus, dan

Eisenia foetida terhadap Escherichia coli tergolong kecil, hal ini menandakan

bahwa bakteri Escherichia coli bersifat resisten terhadap ketiga jenis ekstrak

tersebut. Resistensi ini disebabkan karena sifat bakteri Escherichia coli yang

termasuk dalam bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif lebih resisten

terhadap zat antibakteri dibanding bakteri gram positif. Rahayu (2000),

menyatakan bahwa daya tahan yang lebih kuat pada bakteri gram negatif

dibanding bakteri gram positif disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel.

Susunan komponen dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks dibanding

gram positif sehingga lebih sulit ditembus senyawa antimikroba.

Makagansa, et al (2015) menyatakan bahwa perbedaan struktur dinding sel

menentukan aktivitas senyawa antibakteri. Bakteri gram positif memiliki struktur

dinding sel dengan lebih banyak peptidoglikan, sedikit lipid dan dinding sel

mengandung polisakarida (asam teikoat), sedangkan bakteri gram positif seperti

Escherichia coli mempunyai dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (11-

22%) dan struktur dinding sel multilayer yaitu lipoprotein, membran luar fosfolipid

dan lipopolisakarida.

56

Gambar 3. Mekanisme Resistensi Bakteri Gram-Negatif terhadap Peptida

Antimikroba (Nizet, 2006)

Bakteri gram negatif menggunakan beberapa mekanisme untuk

menimbulkan resistensi dari serangan peptida antimikroba. Bakteri ini dapat

mengubah struktur permukaan untuk menolak peptida antimikroba, membentuk

biofilm untuk meningkatkan resistensi, memompa peptida atimkroba keluar sel,

memproduksi protease untuk mendegradasi peptida antimikroba dan mengubah

respon imun untuk mencegah induksi (Band dan Weiss, 2015). Resistensi bakteri

terhadap peptida antimikroba karena modifikasi muatan anion normal permukaan

sel dengan molekul bermuatan kation, akibatnya peptida antimkroba yang

bermuatan positif tertolak sebelum dapan menjangkau membran sitoplasma

(Nizet, 2006). Pada penelitian ini belum dapat dipastikan mekanisme aksi

penghambatan ekstrak aquades Nereis sp., Lumbricus rubellus, dan Eisenia

foetida terhadap Escherichia coli. Dibutuhkan penelitian lebih lanjut secara

molekuler dengan mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawa aktif dari ketiga

cacing untuk dapat mengetahui bagian sel bakteri yang diserang sehingga

pertumbuhanya terhambat.

57

4.4 Minimum Inhibition Concentration (MIC)

Tujuan pengujian MIC adalah untuk mengetahui konsentrasi terendah dari

ekstrak yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli. MIC

dapat diketahui dengan adanya penurunan absorbansi pada biakan cair

trypticase soy broth setelah dilakukan inkubasi. Absorbansi yang tinggi

menunjukan tingginya kekeruhan dan meningkatnya kekeruhan pada biakan cair

menandakan adanya pertumbuhan koloni bakteri. Hasil uji MIC menunjukan

bahwa MIC ekstrak aquades Nereis sp pada konsentrasi 50.000 ppm, sedangkan

ekstrak aquades Lumbricus rubellus dan ekstrak aquades Eisenia foetida pada

konsentrasi 12.500 ppm. Nilai absorbansi yang diamati sebelum dan sesudah

inkubasi ditunjukan pada Tabel 10, sedangkan data absorbansi sebelum dan

sesudah inkubasi ditunjukan pada Lampiran 24.

Tabel 4. Hasil Absorbansi MIC (λ 686 nm)

No Sampel Konsentrasi

Optical Density

Escherichia coli sebelum

inkubasi

Optical Density

Escherichia coli setelah

inkubasi

1 Ekstrak Aquades Nereis sp.

100.000 ppm 50.000 ppm 25.000 ppm 12.500 ppm 0 ppm Ampicilin 10.000 ppm

1,876±0,002 1,112±0,001 0,726±0,002 0,389±0,002 0,036±0,001 0,317±0,003

1,786±0,002 1,046±0,001 0,767±0,002 0,447±0,003 0,118±0,003 0,036±0,003

2 Ekstrak Aquades Lumbricus rubellus


1,565±0,005 1,006±0,004 0,677±0,005 0,372±0,001 0,032±0,000 0,322±0,001

1,379±0,003 0,905±0,004 0,556±0,002 0,304±0,001 0,120±0,001 0,032±0,001

3 Ekstrak Aquades Eisenia foetida


1,477±0,001 0,986±0,002 0,598±0,002 0,366±0,001 0,028±0,001 0,337±0,002

1,226±0,001 0,855±0,003 0,489±0,002 0,308±0,001 0,111±0,002 0,042±0,001

58

Ampicilin yang digunakan sebagai kontrol positif terbukti mampu

menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli. Mekanisme penghambatan

oleh ampicilin menurut Yanti (2014), yaitu dengan cara menghancurkan

peptidoglikan pada sel bakteri. Hal ini disebabkan karena gugus amino pada

ampicilin mampu menembus membran terluar pada bakteri gram positif maupun

negatif. Menurut Siswandono dan Soekarjo (1995), ampicilin mampu

menghambat biosintesis peptidoglikan yang menyebabkan lemahnya dinding sel

sehingga sel menjadi pecah.

Jekti, et al (2008) melaporkan bahwa konsentrasi hambat minimum (MIC)

dari ekstrak cacing laut nyale (polychaeta) terhadap bakteri Escherichia coli pada

konsentrasi 100 ppm. Suryani (2010) melaporkan bahwa MIC dari ekstrak

aquades cacing tanah Lumbricus sp. terhadap bakteri Vibrio cholerae dan

shigella flexneri berturut-turut 167.000 ppm dan 20.800 ppm. Penelitian Deni

(2015) membuktikan bahwa kadar hambat minimum ekstrak cacing tanah

Lumbricus rubellus terhadap salmonella thypi yaitu lebih dari 350.000 ppm.

Senyawa antibakteri dapat bersifat bakteriostatik, yaitu hanya dapat

menghambat pertumbuhan bakteri, namun sifatnya bisa meningkat menjadi

bakterisidal jika konsentrasinya ditambah. Menurut Krisnata, et al (2014),

senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas bakteriostatik dapat meningkat

menjadi bakterisid jika kadar senyawa antibakteri itu ditingkatkan melebihi kadar

hambat minimal. Hal ini sesuai dengan pernyataan Nuraini (2007), bahwa faktor-

faktor yang mempengaruhi kemampuan zat antibakteri dalam menghambat

bakteri diantaranya adalah konsentrasi zat dan sifat mikroba.

4.5 Minimum Bacterisidal Consentration (MBC)

Sifat bakterisidal atau bakteriostatik dari antibakteri ekstrak dapat diketahui

melalui uji MBC. Suspensi bakteri yang telah terpapar ekstrak dalam tabung

59

pengujian MIC dipindahkan pada media steril baru, kemudian diinkubasi untuk

mengetahui sifat senyawa antibakteri dari ekstrak. Hasil uji MBC ditunjukan pada

Tabel 11. Dokumentasi uji MBC ditunjukan pada Lampiran 25.

Hasil uji MBC menunjukan terdapat kekeruhan pada semua tabung uji,

kecuali tabung kontrol positif ampicilin 10.000 ppm. Kekeruhan pada tabung uji

menandakan masih adanya pertumbuhan dari bakteri Escherichia coli yang telah

terpapar ekstrak. Hasil ini menunjukan bahwa ekstrak aquades cacing laut Nereis

sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida bersifat bakteriostatik

terhadap Escherichia coli. Berdasarkan penelitian ini, nilai konsentrasi bunuh

minimum (MBC) dari ketiga ekstrak terhadap Escherichia coli diatas

100.000 ppm.

Tabel 5. Hasil Uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration)

No. Sampel Konsentrasi Kekeruhan

1

Ekstrak aquades

Nereis sp.

12.500 ppm Keruh

25.000 ppm Keruh

50.000 ppm Keruh

100.000 ppm Keruh

2 Ekstrak aquades

Lumbricus rubellus

12.500 ppm Keruh

25.000 ppm Keruh

50.000 ppm Keruh

100.000 ppm Keruh

3 Ekstrak aquades

Eisenia foetida

12.500 ppm Keruh

25.000 ppm Keruh

50.000 ppm Keruh

100.000 ppm Keruh

4 Kontrol Ampicillin 10.000 ppm Bening

Ekstrak 0 ppm Keruh

4.6 Pengamatan Bakteri

4.6.1 Pengamatan Bakteri dengan Pewarnaan

Bakteri dari suspensi uji MIC yang telah dilakukan pewarnaan diamati

menggunakan mikroskop cahaya. Hasil pengamatan menggunakan mikroskop

cahaya perbesaran 100 kali belum dapat diketahui perubahan morfologi dari

60

bakteri Escherichia coli yang terpapar ekstrak, perbedaan hanya terlihat pada

kerapatan koloniya saja. Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang

dapat menyerap zat warna merah seperti safranin. Lay (1994), menyatakan

bahwa bakteri gram negatif akan berwarna merah karena mempunyai dinding sel

dengan kandungan lipid yang tinggi. Lipid akan larut oleh larutan pemucat

sehingga sel bakteri menyerap zat warna merah dari safranin.

Hasil pengamatan bakteri Escherichia coli yang terpapar ekstrak aquades

Nereis sp. menunjukan adanya bakteri pada tiap konsentrasi yang diamati, hanya

saja terdapat pemisahan serta berkurangnya kepadatan koloni yang terlihat pada

konsentrasi 50.000 ppm dan 100.000 ppm. Hal ini sesuai dengan hasil MIC yang

menunjukan bahwa konsentrasi minimal ekstrak aquades Nereis sp. untuk

menghambat pertumbuhan Escherichia coli yaitu 50.000 ppm. kontrol positif

ampicilin 10.000 ppm menunjukan koloni yang lebih sedikit dibandingkan

perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak. Gambar 10. menunjukan hasil

pengamatan bakteri Escherichia coli yang terpapar ekstrak aquades Nereis sp.

menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 100 kali.

Escherichia coli yang terpapar ekstrak aquades Lumbricus rubellus

menunjukan pemisahan serta berkurangnya kepadatan koloni seiring

meningkatnya konsentrasi ekstrak. Hal ini sesuai dengan hasil MIC ekstrak

aquades Lumbricus rubellus terhadap Escherichia coli 12.500 ppm. kontrol positif

ampicilin 10.000 ppm menunjukan koloni yang lebih sedikit dibandingkan

perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak. Gambar 11. menunjukan hasil

pengamatan bakteri Escherichia coli yang terpapar ekstrak aquades Lumbricus

rubellus menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 100 kali.

Escherichia coli yang terpapar ekstrak aquades Eisenia foetida juga

menunjukan pemisahan serta berkurangnya kepadatan koloni seiring

61

meningkatnya konsentrasi ekstrak. Hal ini sesuai dengan hasil MIC ekstrak

aquades Eisenia foetida terhadap Escherichia coli yaitu 12.500 ppm. Gambar

12. menunjukan hasil pengamatan bakteri Escherichia coli yang terpapar ekstrak

aquades Eisenia foetida menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 100 kali.

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

Gambar 4. Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Nereis sp. (Perbesaran 100 kali)

(a) 0 ppm (b) 12.500 ppm (c) 25.000 ppm (d) 50.000 ppm (e) 100.000 ppm (f) Kontrol positif ampisilin 10.000 ppm

62

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

Gambar 5. Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Lumbricus rubellus (Perbesaran 100 kali)


63

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

Gambar 6. Escherichia coli terpapar Ekstrak aquades Eisenia Foetida (Perbesaran 100 kali)


64

4.6.2 Pengamatan Bakteri dengan Scanning Electron Microscope

Pengamatan menggunakan scanning electron microscope dilakukan pada

perbesaran 15.000 kali, dari hasil pengamatan tidak ditemukan kerusakan

morfologi secara menyeluruh pada sel bakteri Escherichia coli. Sel bakteri yang

terpapar ekstrak hanya mengalami sedikit kerusakan seperti adanya pengerutan

atau lipatan pada permukaan sel serta pemisahan koloni bakteri. Hasil ini

disebabkan karena ekstrak aquades Nereis sp., Lumbricus rubellus dan Eisenia

foetida bersifat bakteriostatik terhadap Escherichia coli. Hasil pengamatan SEM

pada Escherichia coli yang terpapar ekstrak aquades Nereis sp., Lumbricus

rubellus dan Eisenia foetida berturut-turut ditunjukan pada Gambar 13, 14

dan 15.

Senyawa bakteriostatik menyerang bakteri dengan cara menghambat

sintesis protein dengan mengikat ribosom, sedangkan bakterisidal mencegah

pertumbuhan dan menyebabkan kematian, namun tidak menyebabkan sel

bakteri menjadi lisis. Berbeda dengan bakterisidal, bakteriostatik bekerja dengan

cara membuat lisis sel-sel bakteri. Proses lisisnya sel bakteri terlihat dari

penurunan jumlah sel ataupun kekeruhan setelah bahan tersebut ditambahkan

(Brock dan Madigan, 1994). Sedangkan sedikitnya jumlah sel bakteri yang tanpa

mengalami lisis atau kerusakan sel bakteri kemungkinan disebabkan karena

penghambatan pembelahan sel bakteri (Hendrayati, 2012).

Wahyuni (2014), menyatakan bahwa antibakteri ekstrak cacing laut dan

cacing tanah menghambat pertumbuhan bakteri diduga dengan merusak

membran plasma bakteri karena mengandung polipeptida. Menurut Parhusip

(2006), membran sel yang mengalami gangguan fungsi permeabilitas tidak

menyebabkan kematian sel mikroba, tetapi diduga hanya memperlambat proses

metabolik dalam sel mikroba sehingga hanya menghambat pertumbuhan sel.

65

Gambar 7. Pengamatan Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Nereis

sp. menggunakan Scanning Electron Microscope (Perbesaran 15.000 kali)

Gambar 8. Pengamatan Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades

Lumbricus rubellus menggunakan Scanning Electron Microscope (Perbesaran 15.000 kali)

66

Gambar 9. Pengamatan Escherichia coli terpapar Ekstrak Aquades Eisenia

foetida menggunakan Scanning Electron Microscope (Perbesaran 15.000 kali)

Nizet (2006) menyatakan bahwa sasaran utama peptida antimikroba pada

bakteri target yaitu membran sitoplasma. Peptida antimikroba harus dapat

menembus permukaan sel bakteri sebelum dapat menjangkau bagian ini. Bakteri

gram negatif seperti Escherichia coli memiliki struktur permukaan multilayer

meliputi matriks peptidoglikan dalam ruang periplasma dibawah membran luar.

Membran luar mengandung ikatan kompleks lipid A, polisakarida inti dan rantai

spesifik (O) polisakarida yang disebut lipopolisakarida (LPS). Lipid A dalam

polisakarida ini yang dimodifikasi oleh bakteri gram negatif menjadi bermuatan

kationik sehingga peptida antimikroba yang juga bermuatan positif (kationik)

akan tertolak sebelum dapat menjangkau bagian membran sitoplasma sel

bakteri.

Sel Escherichia coli yang diberi perlakuan peptida antimikroba Human

Epididimis 2 (HE2) diamati permukaan sel menggunakan scanning electrone

67

microscope. Morfologi Escherichia coli tanpa perlakuan menunjukan permukaan

sel yang normal dan halus, sedangkan morfologi sel setelah pemberian peptida

antimikroba HE2 menunjukan perubahan yaitu adanya kerutan dan lipatan pada

permukaan sel (Yenugu, et al. 2004). Moorfologi Escherichia coli setelah

pemberian peptida antimikroba α-helical peptidyl-glycylleucine-carboxyamide

(PGLa) menunjukan ukuran sel yang lebih pendek daripada kondisi normal, hal

ini mengindikasikan bahwa Escherichia coli tidak tumbuh maksimal setelah

diberi perlakuan peptida antimikroba (Hartman, et al. 2010).

(a)

(b) (c)

Gambar 16. Escherichia coli Normal (a) dan Setelah Pemberian Peptida Antimikroba HE2 (b) dan PGLa (c) (Yenugu, et al. 2004; Hartman, et al. 2010)

5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Hasil penelitian ini menunjukan adanya aktivitas antibakteri yang bersifat

bakteriostatik dari ekstrak aquades cacing laut Nereis sp., cacing tanah

Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida terhadap Escherichia coli. Aktivitas

antibakteri terbaik pada ekstrak Lumbricus rubellus dengan daya hambat 3,07

mm pada konsentrasi ekstrak 100.000 ppm dan MIC 12.500 ppm. Hasil

pengamatan mikroskopis pada Escherichia coli yang terpapar ekstrak

menggunakan mikroskop cahaya menunjukan adanya penurunan jumlah koloni,

sedangkan hasil scanning electron microscope menunjukan perubahan

morfologi berupa kerutan dan lipatan pada permukaan sel bakteri.

5.2 Saran

Sebaiknya dilkukan uji lanjutan mengenai identifikasi dan karakterisasi

dugaan senyawa antibakteri yang terdapat dalam ekstrak aquades cacing laut

Nereis sp., cacing tanah Lumbricus rubellus dan Eisenia foetida serta dilakukan

penelitian mengenai manfaat dari ekstrak ketiga jenis cacing tersebut selain

sebgai antibakteri.

69

DAFTAR PUSTAKA

Afriyansyah, B. 2010. Vermicomposting oleh cacing tanah (Eisenia foetida dan Lumbricus rubellus) pada empat jenis bedding. Tesis. Sekolah

Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor

Aninda, G. R. 2016. Aktivitas ekstrak cacing laut Siphonosoma australe sebagai antihiperglikemik pada tikus galur Sprague dawley yang diinduksi streptozotocin. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor

Anita, Y. 2016. Ekstrak kasar teh Sargassum cristaefolium dengan pelarut berbeda terhadap morfologi Vibrio parahaemolyticus menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM). Skripsi. Fakultas Perikanan dan

Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya Malang

Anshari, M. H. 2011. Pengaruh penambahan senyawa polisiloksan pada komposit katun dan poliester dengan nanosilver terhadap stabilitas antibakteri. Skripsi. Fakultas Teknik. Universitas Indonesia

Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2008. Acuan Sediaan Herbal :Volume Keempat Edisi Pertama. Jakarta

Bahar, A. A. dan D. Ren. 2013. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals 6: 1543-1575

Band, V. I. dan D. S. Weiss. Mechanism of antimicrobial peptides resistance in gram-negative bacteria. Antibiotics 4: 18-41

Bonang, G. dan E. S. Koeswardono. 1982. Mikrobiologi Kedokteran untuk Laboratorium dan Klinik. Gramedia. Jakarta

Brock, T. D. dan M. T. Madigan. 1994. Biology of Microorganism: Fifth Edition. Prentice Hall International. New Jersey

Campbell, N. A., J. B. Reece dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi Edisi Kelima. Erlangga . Jakarta

Cho, J. H., C. B. Park, Y. G. Yoon, dan S. C. Kim. 1998. Lumbricin I, a novel proline rich antimicrobial peptide from the earthworm: purification, cDNA cloning and molecular characterization. Biochim Biophys Acta.1408 : 67-76

Dahlan, M. S. 2013. Besar Sampel dan Cara Pengambilan Sampel dalam Penelitian Kedokteran dan Kesehatan. Salemba Medika. Jakarta

Deloffre, L., B. Salzet, D. Vieau, J. C., Andries, dan M. Salzet. 2003. Antibacterial properties of hemerythrin of the sand worm Nereis diversicolor. Neuroendocrinology Lett. 24(1-2) :39-45. ISSN 0172–780X

70

Deni, F. 2015. Uji daya hambat ekstrak air cacing tanah (Lumbricus rubellus) terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella thypi secara in vitro. Skripsi.

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Deri, I. R., K. M. Yuliawati dan E. R. Sadiyah. 2015. Isolasi dan karakterisasi senyawa alkaloid dari cacing tanah (Lumbricus rubellus Hoffmeister). Prosiding Penelitian SPeSIA Unisba. ISSN 2460-6472

Dian, R., Fatinawali dan F. Budiarso. 2015. Uji resistensi bakteri Escherichia coli yang diisolasi dari plak gigi terhadap merkuri dan antibiotik kloramfenikol. Jurnal e-Biomedik 3 (1)

Dika, E. 2006. Performa produksi cacing tanah Lumbricus rubellus yang

mendapat pakan sisa makanan dari warung tegal. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor

Elfidasari, D., A .M. Saraswati, G. Nufadianti, R. Samiah, V. Setiowati. 2011. Perbandingan kualitas es di lingkungan Universitas Al azhar Indonesia dengan restoran fast food di daerah senayan dengan indikator jumlah Escherichia coli terlarut. Jurnal Al- Azhar Indonesia Seri Sanis dan Teknologi 1 (1)

Endriani, R., F. Andrini dan D. Alfina. 2010. Pola resistensi bakteri penyebab infeksi saluran kemih (ISK) terhadap antibakteri di Pekanbaru. Jurnal Natur Indonesia 12 (2)

Erviani, A. 2013. Analisis multidrug resistensi terhadap antibiotik pada Salmonella thypi dengan teknik multiplex PCR. J.Ilmiah Biologi 1 (1) :

51-60. ISSN 2302-1616

Fadaee, R. 2012. A review on earthworm Eisenia foerida and its aplication. Annals of Bological Research 3(2): 2500-2506. ISSN 0976-1233

Govindarajan, B dan V. Prabakaran. 2012. Antibacterial activity of vermiwash of Eisenia foetida (earthworm). Int. J. Bio. Tech. 3 (3) 15-16. ISSN: 0976- 4313

Grdisa, M., K. Grsic dan M. D. Grdisa. 2013. Earthworms – role in soil fertility to the use in medicine and as a food. University of Zagreb. ISJ 10: 38-45

Gunawan, S. G. 2007. Farmakologi dan terapi. Jakarta: Departemen Farmakalogi dan Terapeutik. Fakultas kedokteran. Universitas Indonesia

Hafner, B. 2007. Scanning Electron Microscope Primer. Characterization Facility University of Minnesota

Halim, C.N., dan E. Zubaidah. 2013. Studi kemampuan probiotik isolat bakteri asam laktat penghasil eksopolisakarida tinggi asal sawi asin (Brassica juncea). J. Pang. dan Agro. 1(1): 129-137

Hamdi, A. S., dan E. Bahruddin. 2014. Metode Penelitian Kuantitatif Aplikasi Dalam Pendidikan. Yogyakarta : Deepublish

71

Handayani, D., M. Deapati, Marlina, dan Meilan. 2009. Skrining aktivitas antibakteri beberapa biota laut dari perairan Pantai Painan, Sumatera Barat. Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang

Hartman H., M. Berditsch., J. Hawecker., M. F. Ardakani., D. Gerthsen dan A. S. Ulrich. 2010. Damage of the bacterial cell envelope by antimicrobial peptides gramicidin s and PGLa as revealed by transmission and scanning electron microscopy. Antimicrob. Agent Chemoter. 54 : 3132-3142

Hasyim, Z., D. R. Husain dan P. Lestari. 2012 Potensi ekstrak cacing biru Peryonix excavatus sebagai senyawa antibakteri pada pelarut kloroform terhadap beberapa bakteri patogen. Prosiding SNSMAIP. ISSN: 978-602-98559-1-3

Hayati, S. N., H. Herdian, E. Damayanti, L. Istiqomah, dan H. Julendra. 2011. Profil asam amino ekstrak cacing tanah (Lumbricus rubellus) terenkapsulasi dengan metode spray drying. J. Tek. Ind. 34: 1-7. ISSN: 0126-1533

Hendrayati, T. I. 2012. Perubahan morfologi Escherichia coli akibat paparan ekstrak etanol biji kakao (Theobroma cacao) secara in vitro. Skripsi.

Fakultas Kedokteran. Universitas Jember

Hermawan, A., Hana, W., dan Wiwik, T. 2007. Pengaruh ekstrak daun sirih (Piper betle L.) terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Eschericia coli dengan metode difusi disk. Skripsi. Universitas Airlangga

Indriati, G., M. Sumitri., dan R. Widiana. 2012. Pengaruh air rebusan cacing tanah (Lumbricus rubelus) terhadap pertumbuhan bakteri Escherchia coli. J.Prosiding Semirata BKS PTN-B MIPA 978-602-9115-20-8

Irvan., P. B. Manday., dan J. Sasmitra. 2015. Ekstraksi 1,8-cineole dari minyak daun Eucslyptus urophylla dengan metode soxhletasi. J.Teknik Kimia USU 4 (3)

Istiqomah. 2013. Perbandingan metode ekstraksi maserasi dan sokletasi terhadap kadar piperin buah cabe jawa (Piperis retrofracti fructus).

Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta

Istiqomah, L., E. Damayanti, H. Julendra, D. Istika dan S. Winarsih. 2014. Daya hambat granul ekstrak cacing tanah (Lumbricus rubellus) terhadap bakteri patogenik in vitro. J. Sain Vet. 32 (1): 93-104. ISSN: 0126-0421

Iswara, A. 2015. Pola sensitivitas Escherichia coli terhadap antibiotik metrodinazole. The Second University Research Coloqium. ISSN 2407-9189

Jawetz, E., J. L, Melnick, dan E. Adelberg. 1996. Medical Microbiology. Apleton and Lange. New York

72

Jekti, D. S. D., A. A. Purwoko, dan Z. Muttaqin. 2008. Nyale cacing laut sebagai bahan antibakteri. J. Ilm. Das. 9 (1):120-126

Junardi., E. Rusmiyanto., dan P. Wardoyo. 2008. Struktur komunitas dan karakteristik substrat cacing laut (Polychaeta) di perairan pantai mangrove Peniti Kalimantan Barat. J.Biodiversitas 9 (3) : 213-216

Krisnata, A. B., Y. Rizka, D. Mulawarmanti. 2014. Daya hambat ekstrak daun mangrove (Avicennia marina) terhadap pertumbuhan bakteri mixed periodontopatogen. Denta J. Ked. Gigi 8 (1): 11-22. ISSN: 1907-5987

Kusmiyati dan N. W. S Agustini, 2006. Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri Dari MikroalgaPorphyridium cruentum. Pusat Penelitian Bioteknologi,

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong

Kusumawardani, A. 2016. Gambaran kepekaan berbagai antibiotik dan profil plasmid Escherichia coli isolat air sumur gali Kabupaten Demak. Skripsi. Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan. Universitas Muhammadiyah Semarang

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba dalam Laboratorium. Raja Grafindo Persada. Jakarta

Lestari, Ayu., M. Jamhari dan I.N. Kundera. 2013. Daya hambat ekstrak daun tembelek (Lantara camara L.) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli. e-Jipbiol 1: 42-49. ISSN 2338-1795

Liu, Y. Q., Z. J. Sun, C. Wang, S. J Li dan Y. Z. Liu. 2004. Purification of novel antibacterial short peptide in earthworm Eisenia foetida. Acta Biochimica et Biophysica Sinica 36 (4): 297-302. ISSN 0582-9879

Makagansa, C., C. F. Mamuaja dan L. C. Mandey. 2015. Kajian aktivitas antibakteri ekstrak biji pangi (Pangium edule Reinw) terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa dan Escherichia coli secara in vitro. J. Ilmu dan Teknologi Pangan 3 (1)

Maharani, T., D. Sukandar dan S. Hermanto. 2016. Karakterisasi senyawa hasil isolasi dari ekstrak etil asetat daun namnam (Cynometra cauliflora L.) yang memiliki aktivitas antibakteri. J. Kim. Val. 2 (1): 55-62. ISSN: 2460-

6065

Maulida, A. A. A. 2015. Budidaya Cacing Tanah Unggul Ala Adam Cacing. Agro Media Pustaka. Jakarta

Mukhriani. 2014. Ekstraksi, pemisahan senyawa, dan identifikasi senyawa aktif. J. Kes. 7(2): 361-367. ISSN: 2086-3098

Mulyati, E. S. 2009. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat daun ciremai (Phyllantus acidus L. Skell) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dan Bioautografinya. Skripsi. Fakultas Farmasi.

Universitas Muhamadiyah Surakarta

73

Ngajow, M., J. Abidjulu dan V. S. Kamu. 2012. Pengaruh antibakteri ekstrak kulit batang matoa (Pometia pinnata) terhadap bakteri Staphylocccus aureus secara in vitro. J. MIPA Unsrat 2 (2); 128-132

Nizet, V. 2006. Antimicrobial peptide resistance mechanisms of human bacterial pathogens. Curr. Issues Mol. Biol. 8 (1):222-238

Noviana, H. 2004. Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dari berbagai spesimen klinis. J kedokter Trisakti 23 (4)

Nugraha, R. N. 2014. Uji daya hambat tepung cacing tanah (Lumbricus rubellus) dengan konsentrasi berbeda terhadap Aeromonas salmonicida dan Streptococcus pyogenes. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan. Universitas Brawijaya Malang

Nurmala, I. G. N. Virgiandhy, Andriani dan D. F. Liana. 2015. Resistensi dan sensitivitas bakteri terhadap antibiotik di RSU dr. Soedarso Pontianak Tahun 2011-2013. Resistensi dan Sensitivitas Bakteri 3 (1)

Nuraini, A. D. 2007. Ekstraksi komponen antibakteri dan antioksidan dari biji teratai (Nymphaea pubescebs Willd). Skripsi. Institut Pertanian Bogor

Oemarjati, B. S. dan W. Wardhana. 1990. Taksonomi Avertebrata: Pengantar Praktikum Laboratorium. Penerbit Universitas Brawijaya. Jakarta

Oktavia, G. A. E., M. Ibrahim dan L. Lisdiana. 2013. Pengaruh pemberian ekstrak etanol biji mahoni (Swietenia mahagoni) terhadap penghambatan pertumbuhan Escherichia coli dengan metode difusi cakram. J. LenteraBio 2 (3)

Oktaviana, A. 2009. Teknologi Penginderaan. Makalah. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sebelas Maret

Parhusip, A. J. N. 2006. Kajian mekanisme antibakteri ekstrak andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) terhadap bakteri patogen

pangan.Thesis .Intitut Pertanian Bogor

Permadani I. A., P. Surjowardojo, Sarwiyono. 2015. Daya hambat ekstrak daun beluntas (Pluchea indica L.) menggunakan pelarut ethanol terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Esherichia coli

penyebab mastitis pada sapi perah. Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya

Permata, D. 2006. Reproduksi cacing tanah (Eisenia foetida) dengan memanfaatkan daun dan pelepah kimpul (Xhanthosoma sagittifolium)

pada media kotoran sapi perah. Skripsi, Fakultas Peternakan. Institiut Pertanian Bogor

Pelczar, M. J., R. D. Reid dan E. C. S. Chan, 1977. Microbiology. McGraw Hil. Caloocan City

74

Polapa, F. S. 2015. Potensi antibakteri dari ekstrak kasar bakteri asosiasi karang batu yang terinfeksi penyakit Brown Band (BrB) terhadap bakteri patogen Staphylococcus aurues dan Escherichia coli. Skripsi. Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan. Universitas Hasanuddin, Makassar

Popovic, M., M. Grdisa dan T.J. Hrzenjak. 2005. Glycolipoprotein G-90 obtained from the earthworm Eisenia foetida exerts antibacterial activity. Veterinarski arhiv 75 (2): 119-128. ISSN: 0372-5480

Prayitno, D. 1985. Analisis Regresi dan Korelasi untuk Penelitian Pertanian. Liberty. Jogjakarta

Prayoga, E. 2013. Perbandingan efek ekstrak daun sirih hijau (Piper betle L.)

dengan metode difusi disk dan sumuran terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta

Purschke, G., C. Bleidorn, dan T. Struck. 2014. Systematic, evolution and phylogeny of annelida: a morphological perspective. Memoirs of Museum Victoria 71: 247-269. ISSN: 1447-2546

Rahayu, W. P. 2000. Aktivitas antimkroba bumbu masakan tradisional hasil olahan industri terhadap bakteri patogen dan perusak. Bul. Teknol. dan Industri Pangan 11 (2)

Rasidi. 2012. Pembenihan cacing laut Dendronereis pinnaticiris suatu upaya awal penyediaan benih cacing laut untuk budidaya. J.Media Akuakultur 7 (2)

Rianita, Y., C. S. Widodo dan Masruroh. 2014. Studi identifikasi komposisi obat dan limbah balur benzonquinon (BQ) hasil terapi pembaluran dengan scanning Electron Microscope (SEM). Phys. Stud. Jour. 2 (1): 43-47. ISSN: 1978-8738

Rohmah, I. S. 2016. Uji efektifitas daya antelmintik dekokta daun buah mangga (Mangifera indica Linn.) terhadap Ascais suum, Goeze secara in vitro. Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Muhammadiyah Ciamis

Rinanda, T. 2014. Broad spectrum antimicrbobial activity of Lumbricus rubellus powder against drug resistant microbes. J. Proceedings of the 4th Annual International Conference Syiah Kuala University (AIC Unsyiah)

Russel, B dan D. Denning. 2000. The biology of annelids. BioMedia Associates

Sari, M. 2015. Uji bakteriologis dan resistensi antibiotik terhadap bakteri Escherichia coli dan Shigella sp. pada makanan gado-gado di kantin UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta

Sasmito. 2000. Analisis senyawa dalam ekstrak cacing tanah (Lumbricus rubellus) dan efek aprodisiaka. Majalah Farmasi Indonesia 11 (4): 224-233

75

Sasongko, H. 2014. Uji resistensi bakteri Escherichia coli dari sungai boyong kabupaten Sleman terhadap antibiotik amoksisilin, kloramfenikol, sulfametoxasol dan streptomisin. Jurnal Bioedukatika 2 (1). ISSN 2338-6630

Septiana, A. T., dan A. Asnani. 2012. Kajian sifat fisikokimia ekstrak rumput laut alga coklat Sargassum duplicatum menggunakan berbagai pelarut dan metode ekstraksi. Agrointek 6 (1): 22-30. ISSN: 1907-8056

Sibuea, F. S. Y. 2015. Ekstraksi tanin dari kluwak (Pangium edule R.) menggunakan pelarut etanol dan aquades dan aplikasinya sebagai pewarna makanan. Fakultas Teknik. Universitas Negeri Semarang

Simandjutak, A. K., dan D. Waluyo. 1982. Cacing Tanah Budidaya dan Pemanfaatannya. Penebar Swadaya. Jakarta

Siswandono dan Soekardjo. 1995. Kimia Medisinal. Erlangga. Surabaya

Soleha, T. U. 2015. Uji kepekaan terhadap antibiotik. J. Kes. Unila 5 (9):121-123.

ISSN: 2339-1277

Sudarmadji, S., B. Haryono, dan Suhardi. 1996. Analisis Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty. Yogyakarta

Sudarmi, Masfria dan E. W. Manik. 2012. Aktivitas antibakteri ekstrak etanol cacing tanah (Megascolex sp.) terhadap bakteri Salmonella thyphosa, Escherichia coli, Shigella dysenteriae. Prosiding Forum Ilmiah Nasional. Buletin Khasanah Lingkungan RONA 11(2)

Suhardi. 1982. Evolusi Avertebrata. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta

Sujatno, A., R. Salam, Bandriyana dan A. Dimyati. 2015. Studi scanning electron microscope (SEM) untuk karakterisasi proses oksidasi paduan zirkonium. J.For. Nuklir 9 (2): 44-50. ISSN: 1978-8738

Sundari, D., Almasyhuri, dan A. Lamid. 2015. Pengaruh proses pemasakan terhadap komposisi zat gizi bahan pangan sumber protein. Jurnal Media Litbangkes. 25(4):235-242

Suryana. 2010. Metodolgi Penelitian Model Praktis Penelitian Kuantitatif dan Kualitatif. Buku ajar : Universitas Pendidikan Indonesia

Suryani, L. 2010. Aktivitas antibakteri ekstrak cacing tanah (Lumbricus sp.) terhadap berbagai bakteri patogen secara in vitro. Mutiara Medika 10 (1):16-21

Suryani, Y., L. W. Sophia., T. Cahayanto., I. Kinasih. 2015. Uji Aktivitas Antibakteri Dan Antioksidan Infusum Cacing Tanah (Lumbricus Rubellus) Dengan Tambahan Kitosan Udang Pada Salmonella Thypi. ISSN 1979-8911 9(2):16-21

76

Tantri, B. U. N. 2016. Identifikasi bakteri Escherichia coli, Shigella sp., dan Salmonella sp. pada air sumur di wilayah pembuangan limbah tahu dan

limbah ikan Kota Bandar Lampung. Skripsi. Fakultas Kedokteran. Universitas Lampung

Tasiemski, A. 2008. Antimicrobial peptides in annelids. Université de Lille1, France, ISJ 5: 75-82

Tasiemski, A., D. Schikorski, F. L. Marrec-Croq, C. P-V. Camp, C. Boidin-Wichlacz and P. E. Sautiere. 2006. Hestidin: a novel antimicrobial peptide containing bromotryptophan constitutively expressed in the nk cells-like of the marine annelid, Nereis diversicolor. Dev. and Comp. Immun., 31: 749–762

Taufiq, S., U. Yuniarni dan S. Hazar. 2015. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji buah pepaya (Carica papaya L.) terhadap Escherichia coli dan Salmonella thyphi. Prosiding Penelitian Spesial Unisba: 652-651

Wahyuni, L. R. 2014. Uji aktivitas antibakteri ekstrak kubis (Brassica oleracea L.var.capitata L) terhadap bakteri Eschericia coli.Laporan Penelitian.UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta

Waluyo. 2008. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. UMM Press. Malang

Warbung, Y. Y., V. N. S. Wowor, dan J. Posangi. 2013. Daya hambat ekstrak spons laut Callyspongia sp. terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. J. E-Gigi 1 (2): 1-12

Wasitaningrum, I. D. A. 2009. Uji resistensi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari isolat susu sapi segar terhadap beberapa antibiotik. Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas Muhammadiyah Surakarta

Wigati, P. E. A. 2016. Uji daya hambat ekstrak kasar mikroalga Skeletonema costatum terhadap aktivitas Staphylococcus aureus. Skripsi. Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan. Universitas Brawijaya

Wijarni dan D. Arfiati. 1984. Diktat Avertebrata Air. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya

Wilson, W. H. dan R. E. Ruff. 1988. Sandworm and Bloodworm. US Fish and Wildlife Service. Lousiana

Willey J. M., L. M. Sherwood, and C. J. Woolverton. 2009. Prescott's Principles of Microbiology. McGraw-Hill International Edition, New York

Wistreich, G. 1999. Microbiology prespectives: A photographic survei of the microbial world. Prentice, New Jersey

Yanti, Y. N., dan S. Mitika. 2017. Uji efektivitas antibakteri ekstrak etanol daun sambiloto (Andrographis panicuata nees) terhadap bakteri Staphylococcus aureus. J. Ilmiah Ibnu Sina 2 (1)

77

Yenugu, S., K. G. Hamil., F. S. French dan S. H. Hall. 2004. Antimicrobial actions of the human epididymis 2 (HE2) protein isoform, HE2alpha, HE2beta and HE2beta2. Reproduc. Bio. Endocrino. 2: 61

Yuliani, S dan S. Satuhu. 2012. Panduan Lengkap Minyak Asiri. Jakarta: Penebar Swadaya

Yusriana, C. S., C. S. Budi., dan T. Dewi. 2014. Uji daya hambat infusa daun nangka (Artocarpus heterophyllus) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. J.Permata Indonesia 5 (2) : 1-7

Zamani, N. P., dan M. Muhaemin. 2016. Penggunan spektofotometer sebagai deteksi kepadatan sel mikroalga laut. J. Maspari. I 8 (1): 39-48.

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KASAR AQUADES CACING LAUT Nereis sp. CACING TANAH...

Documents

Transcript of AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KASAR AQUADES CACING LAUT Nereis sp. CACING TANAH...