Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su...
-
Upload
humberto-minjarez -
Category
Documents
-
view
13 -
download
7
Transcript of Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su...
![Page 1: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/1.jpg)
Aislamiento del productoAislamiento del producto
Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento.
En este caso particular consideramos como producto:
ProteínaCAROLINA VITA
![Page 2: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/2.jpg)
Aislamiento de una proteínaAislamiento de una proteína
Se requiere conocimiento de la Se requiere conocimiento de la proteínaproteína– De que tipo de célula provieneDe que tipo de célula proviene– De que parte de la célulaDe que parte de la célula– Qué hace esa proteínaQué hace esa proteína
Particularmente útil si se conoce :Particularmente útil si se conoce :– TamañoTamaño– ComposiciónComposición
![Page 3: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/3.jpg)
Aislamiento de una proteínaAislamiento de una proteína
Selección de la fuente proteicaSelección de la fuente proteica
Ej: de tejidos de animalales como pollos, Ej: de tejidos de animalales como pollos, cerdos, vacas, ratas son los elegidoscerdos, vacas, ratas son los elegidos
Distribución de la proteina (mayor Distribución de la proteina (mayor concentración)concentración)
Ej: microorganismosEj: microorganismos1.1. bacterias: bacterias: E. coliE. coli2.2. Levaduras: Levaduras: Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae Tecnicas de clonado molecularTecnicas de clonado molecular
![Page 4: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/4.jpg)
Métodos de solubilizaciónMétodos de solubilización
Es el primer paso obligado de la Es el primer paso obligado de la purificación purificación
la proteína debe estar en la proteína debe estar en solución solución
![Page 5: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/5.jpg)
Estabilizacón de la proteinaEstabilizacón de la proteinaExistencia de agentes que provocan un Existencia de agentes que provocan un
daño irreversible daño irreversible pH pH TT Proteasas Proteasas Interfase agua–aire Interfase agua–aire Adsorción a la pared de los Adsorción a la pared de los
recipientesrecipientes Crecimiento de microorganismos Crecimiento de microorganismos
![Page 6: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/6.jpg)
En el caso de proteína intracelular En el caso de proteína intracelular muy baja concentracion y muy baja concentracion y acompanada de millares de proteinas acompanada de millares de proteinas y otras macromoleculasy otras macromoleculas
En el caso de proteínas En el caso de proteínas extracelulares pueden estar en baja extracelulares pueden estar en baja concentración y también concentración y también acompañada o ser el principal acompañada o ser el principal producto extracelularproducto extracelular
![Page 7: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/7.jpg)
EstrategiaEstrategia
Remover del organismo la proteína Remover del organismo la proteína pura en la menor cantidad de pasos pura en la menor cantidad de pasos con la menor pérdida de actividad con la menor pérdida de actividad posibleposible
![Page 8: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/8.jpg)
ObjetivoObjetivo Purificación de una proteína de interésPurificación de una proteína de interés
Para ello se cuenta con Para ello se cuenta con métodosmétodos de de purificaciónpurificación
Los métodos se utilizan en etapas Los métodos se utilizan en etapas Serie de pasos independientes que Serie de pasos independientes que
utilizan las caracteristicas utilizan las caracteristicas fisicoquimicas de las proteínas para fisicoquimicas de las proteínas para separarlas de otras proteínas o de otras separarlas de otras proteínas o de otras sustanciassustancias
![Page 9: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/9.jpg)
Metodos de purificaciónMetodos de purificación
Basado en las siguientes propiedades Basado en las siguientes propiedades proteicas:proteicas:
Tamaño Tamaño SolubilidadSolubilidad CargaCarga AdsorciónAdsorción Afinidad Afinidad
![Page 10: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/10.jpg)
CaracterístiCaracterística ca
ProcedimientosProcedimientos
Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifufacion
Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH
Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica
Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque
Selectividad Cromatografia de afinidad
![Page 11: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/11.jpg)
TamañoTamañoDiálisisDiálisis
Utiliza membrana semipermeable donde Utiliza membrana semipermeable donde
moleculas de agua y las de solutos moleculas de agua y las de solutos pequeños la atraviesenpequeños la atraviesen
LAS LAS PROTEÍNAS PROTEÍNAS SON SON
RETENIDASRETENIDAS
![Page 12: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/12.jpg)
DiálisisDiálisis
![Page 13: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/13.jpg)
TamañoTamaño
UltrafiltracionUltrafiltracionSe utiliza una membrana semipermeable Se utiliza una membrana semipermeable
que retiene las proteínasque retiene las proteínas
La presión o fuerza centrífuga se usa La presión o fuerza centrífuga se usa para separar por filtración el medio para separar por filtración el medio acuoso y las moléculas de tamaño acuoso y las moléculas de tamaño pequeñopequeño
• Uso de celofán o membranasUso de celofán o membranas
![Page 14: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/14.jpg)
CentrifugaciónCentrifugación
Método separación y análisisMétodo separación y análisis
Centrifugation en gradiente de Centrifugation en gradiente de densidaddensidad
Gradientes continuos de sacarosaGradientes continuos de sacarosa tubo de centrifugatubo de centrifuga
Recuperación del materia:Recuperación del materia:
Se perfora el tubo o bien se congela y Se perfora el tubo o bien se congela y se corta en capasse corta en capas
![Page 15: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/15.jpg)
CentrifugaciónCentrifugación
Los componentes de la mezcla se Los componentes de la mezcla se separan por:separan por:
PesoPeso TamañoTamaño DensidadDensidad FormaForma
![Page 16: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/16.jpg)
Coeficiente de Coeficiente de sedimentaciónsedimentación
S = M (1-VS = M (1-V) ) N fN f
M: peso molecularM: peso molecularV: Volumen espécificoV: Volumen espécifico: : densidad de la solucióndensidad de la soluciónN : numero de avogadroN : numero de avogadroF: coeficiente de fricciónF: coeficiente de fricción
Las proteínas migran de forma proporcional Las proteínas migran de forma proporcional a este coeficientea este coeficiente
![Page 17: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/17.jpg)
SolubilidadSolubilidad
Muy utilizados en los primeros pasos Muy utilizados en los primeros pasos de la purificaciónde la purificación
Mantiene nativa a la proteinaMantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividadRedisolucion sin perdida de actividad
![Page 18: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/18.jpg)
SolubilidadSolubilidad
Proteina composicion de aa Proteina composicion de aa le le otorga un comportamiento diferenteotorga un comportamiento diferente
La solubilidaad de la proteína La solubilidaad de la proteína depende:depende:
Interacción intraproteinaInteracción intraproteina Interaccíon proteína-proteínaInteraccíon proteína-proteína Interacción proteína- disolvente Interacción proteína- disolvente
![Page 19: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/19.jpg)
SolubilidadSolubilidad
Interacciones mencionadas dependen Interacciones mencionadas dependen de:de:
pHpH Fuerza iónicaFuerza iónica DisolventeDisolvente TemperaturaTemperatura
![Page 20: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/20.jpg)
Solubilidad-pHSolubilidad-pH
La carga neta de las proteína depende del La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicoscontenido de aa ácidos y de aa básicos
El valor del pH donde la carga neta de la El valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero proteína es cero pI pI (punto isoelectrico)(punto isoelectrico)
Solubilidad es míninaSolubilidad es mínina
Ej: Ej: contenido de aa ácidos contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)pI bajo (4-5)
![Page 21: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/21.jpg)
Solubilidad-pHSolubilidad-pH
![Page 22: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/22.jpg)
Solubilidad-Fuera iónicaSolubilidad-Fuera iónica
Salting inSalting in
Salting outSalting out
![Page 23: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/23.jpg)
Salting inSalting in
Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M)
aumenta con la [ sales] Salting inSalting in
Las proteínas en HLas proteínas en H22O tienden a formar O tienden a formar
COMPLEJOS electrostáticos COMPLEJOS electrostáticos precipitan precipitan
Al aumentar la [sales]
proteina se rodea de contraiones
más soluble por > interacción proteína-solvente
![Page 24: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/24.jpg)
Salting outSalting out
La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting outSalting out
La alta [sal] remueve la esfera de La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteínasolvatación de la proteína
Sales capturan el H2O > interacción prot-prot
![Page 25: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/26.jpg)
Solubilidad-DisolventesSolubilidad-Disolventes
Adición de disolventes neutros miscibles Adición de disolventes neutros miscibles en agua en agua (ACETONA, ETANOL)(ACETONA, ETANOL)
Se usan en distintas proporcionesSe usan en distintas proporciones Bajan el poder de solvatación de las Bajan el poder de solvatación de las
soluciones acuosassoluciones acuosas
![Page 27: Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto:](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022061301/54dd4ab6497959a82a8b4a5b/html5/thumbnails/27.jpg)
Solubilidad- TemperaturaSolubilidad- Temperatura
0-40 0-40 ooC C >T > solubilidad.>T > solubilidad. 40-5040-50ooC C inestabilidad inestabilidad
DESNATURALIZAN (DESNATURALIZAN ( solubilidad) solubilidad)