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Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
PERSPECTIVES D’AMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA
FEMME RHD NEGATIVE
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
INTRODUCTION INCOMPATIBILITES RHD
FOETO-MATERNELLES EN FRANCE
INCIDENCE estimée(pour 1000 naissances)
MORTALITE estimée &
MORBIDITE SEVERE
1966 5 à 6 ‰ ≥ 12% des casPrévention Rh cibléeBaisse de l’indice de
fécondité
Dépistage biologiqueMédecine néonatale
Échographie fœtaleTransfusions
fœtales IV
2006 ≈ 0,8 ‰ ≈ 4% des cas
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
Taux cumulés d ’immunisation anti-D en fin
de grossesses chez la femme Rh négatif
Spontané
Après Ig Rh post partum seulement
+ Ig Rh ante partum systématique
1.0%
12.0%
16.8%18.1%
1.0%
12.0%
2.5%
16.8%
5.2%
18.1%
10.2%
1.0%0.4%
12.0%
2.5%
0.5%
16.8%
5.2%
0.5%
18.1%
10.2%
3.5%
Nº1 Nº2 Nº3Nº4
Rang de grossesse
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Efficacité
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Le Principe Actif
Basée sur l’utilisation d’immunoglobulines polyclonales anti-D (IgRh) :
- Seule source : fractionnement de plasma humain, contenant un titre élevé d’anticorps dirigés contre l’antigène RhD
- Plasma humain : fourni par des donneurs RH-, hyperimmunisés par injections répétées de globules rouges RH+(rémunérés)97 % de plasmas collectés aux Etats-Unis
- Spécialité commercialisée en France :RHOPHYLACR (LFB : laboratoire Français du fractionnement et des Biotechnologies)
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Mécanismes possibles
3 MECANISMES POSSIBLES :Tous dépendent de la formation d’un Immun-complexe
IgG anti-D
Antigène RhD
I- Masquage des épitopes RhD par saturation des sites antigéniques RhD.
II- Inhibition des lymphocytes B spécifiques par interaction entre le RFcIIb lymphocytaire et le segment Fc des IgG anti-D.
III- Destruction antigénique par clairance macrophagique très rapide des globules rouges RhD+
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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Inconvénients
- Médicaments dérivés du sang :
- Mesures maximales en matière de sécurité virale et autres agents infectieux (pour octroi d’AMM par Afssaps)… néanmoins toujours possibilité de transmission d’agents non répertoriés
- Règles de traçabilité
- Information systématique des patientes concernant un médicament dérivé du sang (nature des produits utilisés, risques liés à leur utilisation, mesures de sécurité prises pour la fabrication des produits)
- Liés au mode de préparation de ces Ig anti-D :
- Problème d’approvisionnement en plasmas hyperimmuns
-Problème d’ordre éthique liés à l’immunisation de sujets volontaires sains
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives
1- Ig MONOCLONALES
Actuellement l’immunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % d’entre elles portent un enfant RH-
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
Anticorps monoclonaux humains
• Transformation de lymphocytes humains par l’EBV
Ac 1
Ac 2EBV
clonagesélection
lymphocytes Btransformés
cellulesmononucléées
• Biologie moléculaire : Ac Mo humains recombinants• Souris humanisées : greffe des loci IgG humains
lignées B
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production d’Ig MONOCLONALES
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
ADNc
Lymphocytes B (EBV)
PCRL
H
Vecteurd’expression
Transfection
CHOLignées cellulaires : BHK NS0…
anticorpsrecombinants
ARN
Clonagepromoter cassette vector
5720 bp
Amp r
néo
Kappa
intron chimérique pCIneo
promoter/enhancer
BGH polyA
polyA synthétique SV40 Enh-prom préc
Col E1 ori
SV40 ori
Ori f1
Aat IIBgl II
Pme I
Spe I
Nhe I
PRINCIPE
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production d’Anti-D recombinants
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALESCANDIDAT IDEAL 1- AFFINITE +++ pour l’antigène RhD
(rendement de fixation, saturation des épitopes)
2-SPECIFICITE+++pas de réaction croisée avec une autre cible antigénique
3- SENSIBILITE+++ reconnaissance d’un maximum de variant
4- PHARMACOCINETIQUE équivalent à une IgG polyclonale
5- FORT POTENTIEL d’activation des récepteurs FcImportance de la glycosylation post-traductionnelle
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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALESTESTS FONCTIONNELS
Pour mesurer la fixation des IgG anti-D aux différents récepteurs FcMesure ADCC (antibody/dependent/cellular/cytotoxicity), permet la mesure des interactions avec le récepteur FcRIIIa
Ag
FcRIFcRII
FcRIII
Ac
IgG
Lyse
Lymphocyte
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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Test de clairance des hématies
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
IgG polyclonalesVolontaire RhD- injection de 1,5 ml de GR RhD+ marqués au Cr51Injection de 10 g de poly D H0Injection de 100 g de poly D H50T1/2 : 18h pour 10 g T1/2: 3h pour 100 g
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
IgG monoclonalesVolontaire RhD- injection de 1,3 ml de GR RhD+ marqués au Cr51Injection de 871 g de MONO-DT1/2: 13,7 jours
100 g
10 g
Etude Yves Brossard CNRHP
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
AD1+AD3
Poly-D
Poly-D : n=4 AD1+AD3: n=8
Time
Test de survie des GRs
AD1+AD3mAbs
AD1+AD3 : clairance moins rapide et incomplète par rapport à celle obtenue avec les Ig polyclonales anti-D
Etude clinique : sujets Rh-, hématies Rh+ Cr51,
Ig polyclonale anti-D WinRh0,
Ac monoclonaux humains AD1+AD3 (V:V)
(1996)
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS 1ers anticorps
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
R297 anticorps monoclonal du LFB Excellente clairance en comparaison avec un anti-D polyclonal
I.V. injection of autologous 51Cr RhD+ RBC into male volunteers:
- 51Cr RBC only, n=2 - 51Cr RBC 25% saturation with marketed Poly-D antibodies , n=7 - 51Cr RBC 25% saturation with Emabling® R297 anti-RhD mAb , n=7
51Cr RBC only #151Cr RBC only #2
Marketed poly-D #3
R297 #8
R297 #9
R297 #100
20
40
60
80
100
120
0.01 0.1 1 10 100
Time (h)
RhD
+ R
BC
(%
of
15
min
51C
r v
alu
e)
Marketed poly-D
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Clairance des GRs marqués au
51Cr
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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES
Plusieurs anticorps monoclonaux sont en cours de développement et ont été évalués en clinique :
- Rheseclone : Russie , produit par une lignée lymphoblastoïde EBV, aucune donnée disponible
- BRAD-3 (IgG3) et BRAD-5 (IgG1) Royaume Uni par BPL (Bioproduct Labratories) seuls ou en association : capable d’induire une immunosupression chez des sujets RhD- ayant reçu des GR RhD+, mais clairance des hématies moins rapide que les Ig polyclonales
- MonoRh0 : Suisse, ZLB-CSL : testé chez volontaire Rh négatif immunosupression bien clairance d’hématies RhD+ injecté beaucoup plus faible qu’avec le RhophylacR
- R597 : France, LFB, sélection d’ un anticorps humain monoclonal recombinant sur la base de son activité fonctionnelle : Forte liaison aux récepteurs FcRIII, activation des cellules NK avec lyse des hématies RhD+, clairance d’hématies RhD+ aussi rapide que RhophylacR
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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES
INCONVENIENTS :
-Problème des résistances éventuelles : développement d’anti-idiotype
-Pour prouver efficacité et pour envisager de remplacer les IgG polyclonales : besoin d’une évaluation à grande échelle
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives
2- GENOTYPAGE
Actuellement l’immunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % d’entre elles portent un enfant RH-
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh
Protéine RHD :protéine transmembranaire du Globule Rouge15000 sites par GR RhD+
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LA PROTEINE RHD
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH
Isolement et séquençage du gène RHD par l’équipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis . Blood 1991 ; 28 : 2747-52
Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Liquide amniotique - Plasma
I - Génotypage RHD fœtal réalisable sur l’ADN des cellules amniotiques (année 90)P.R. BENNET et al. N.eng.J.Med. 1993; 329:607-610
J.T. AUBIN et al. Br J Haematol 1997 ; 98 (2) : 356-364.
- Diagnostic invasif
II – Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD – Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes ( 1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire)LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : 768-775.
- Diagnostic non invasif
Limite du test : femme ne doit pas posséder dans leur génome des séquences non exprimées du gène RHD.
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel
ADN fœtaldans le plasma
Quantité de Génomes
(par ml de plasma maternel)
25 (3 à 70) à 15 S.A.
290 (77 à 769) à terme
Isolement
Rapide, simple
Persistance in vivo
Demi-vie< 1 heure
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL INTERET
I- GROSSESSES AVEC IMMUNISATION ANTI-D
Diagnostic d’Incompatibilité foeto-maternelle RhD
(environ 1000 cas / an en France avec 90% de fœtus Rh+)
II- GROSSESSES SANS IMMUNISATION ANTI-D :
Cibler l’immunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI
itératives aux seules femmes Rh - avec fœtus Rh+ (environ 120.000 femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+)
Validation du génotypage non invasif par une étude portant sur 851 femmes enceintes au CNRHPC. Rouillac-Le Sciellour et all Large scale Pre-Diagnosis study of Fetal RHD Genotyping by PCR on plasma DNA from RhD-negative Pregnant women. Mol Diagn 2004 ; 8; 23-31.
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE
- Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml), 48h max entre prélèvement et réception au laboratoire
- Centrifugation puis décantation plasma- Extraction de l’ADN plasmatique- Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD :
- exon 7 ( plus spécifique mais moins sensible)
- exon 10 (plus sensible mais moins spécifique)- Les 2 amplifications distinctes permettant d’augmenter la sensibilité du test
et détecter un maximum de variant du système RH
SI FŒTUS RH- REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT• Concentration plus élevée d’ADN fœtal
2) Rattraper une erreur d’étiquetage
3) Rattraper un croisement per-analytique des échantillons
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EVOLUTION
Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE (INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY) Trousse développée en 2006-2007Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter
fluorescent.Marquage CE obtenu en JUIN 2007 Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman
Projet STIC 2007-2008: Génotypage RHD fœtal non invasif systématiqueParis-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes OBJECTIFS MEDICO-ECONOMIQUES:
-Diminution des injections inutiles d’IgRH et des RAI chez les femmes avec fœtus Rh négatif ?- Amélioration de la compliance à la prévention Rh anténatale, ciblée ou systématique chez les femmes avec fœtus Rh positif ?
- Evaluer la faisabilité et le coût d’un programme de Génotypage fœtal RH systématique dans le cadre actuel du suivi prénatal en France.
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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION
Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement :
Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionale d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine.
Par des biologistes agrées par l’Agence de Biomédecine.