Agarose ou poliacrilamida Papel (celulose) experimental/aula5bioqexp.pdf · Fixação – metanol,...
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+ - +
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Meio (polímero): Agarose ou poliacrilamida Papel (celulose)
-
+
Solução tamponante
Solução tamponante
Amostra (proteínas, peptídeos e
ácidos nucleicos)
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CH2=CH-CO-NH2 CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH
CO NH2
CO NH2
CO NH2
acrilamida poliacrilamida
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2
Bis-acrilamida
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CH2=CH-CO-NH2 CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2
S2O8-2 à 2 SO4
-
polimerização
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CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2
CH2 NH2 CO CH-CH2- CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH
CO NH2
CO NH2
CO NH2
CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH---
CO NH2
CO NH2
CO NH2
CO NH2
-CH2-CH-
CO NH2
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CH2 NH2 CO CH-CH2- CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH
CO NH2
CO NH2
CO NH2
CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH---
CO NH2
CO NH2
CO NH2
CO NH2
-CH2-CH-
CO NH2
A concentração de monômeros e sua
proporção relativa determina a
porosidade do gel
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+
amostra
-
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logv = logv0 - kC
Migração na ausência de gel
Depende do peso molecular (diretamente proporcional)
Velocidade de migração
Concentração do polímero de
poliacrilamida (gel)
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Diferentes proteínas têm o mesmo v0?
A
B
- - - -3
-1 - - +
v0 = ZeE/f
h R Carga líquida Campo elétrico
(V. cm-1)
Coeficiente friccional
Velocidade de migração
Viscosidade
Resistência tamanho e forma;
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eletroforese
Não-desnaturante (proteínas na forma nativa)
Desnaturante
Separação por carga e peso molecular
Separação por peso molecular
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Proteínas reduzidas e desnaturadas por SDS podem ter o mesmo v0
- - + - - - + - - - - - -
- - - - - -
Calor, agente redutor, detergente
(SDS; dodecil-sulfato de sódio)
1 SDS/2 resíduos de aa (“capa” de cargas negativas)
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A - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - +
- - - - - -
- - - - - -
B
Ze f -24 2 -12 1 v0A = v0B
v0 = ZeE/f
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Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem gel, somente tampão). Assim, quando em um gel de poliacrilamida, estas proteínas podem ser separadas por peso molecular. logv = logv0 – kC, sendo que k depende diretamente do peso molecular
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SDS - PAGE
Gel de empilhamento baixa [acrilamida]
Gel de separação alta [acrilamida]
+
-
Tampão com SDS
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- - + -
-CH2-S S-CH2-
- -
- - - - - - - -
- - - - - -
- - - - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
100°C b-mercaptoetanol SDS
DTT
HS-CH2-CH2-OH (b-mercaptoetanol)
1 cadeia ou 2 cadeias polipeptídicas idênticas?
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Gel de empilhamento
Contém SDS Alta porosidade (pouca poliacrilamida) Permite as proteínas migrarem livremente A amostra forma uma pequena “pilha”
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Gel de emplilhamento Tris-HCl
Tampão Tris-Glicina pH 8,3
pHgel < pHtampão
6,7 8,3
Gly-
Cl_ Gly-
Cl_ Gly-
Fronteira proteínas
Gel separação pH = 8,9
Cl-
Gly- e Cl-
t1 t2 t3 t4
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Gel de separação
Contém SDS Porosidade controlada pela concentração de poliacrilamida. O gel separa proteínas por peso molecular (peneiramento). (logv = logv0 – kC)
maior peso molecular
menor peso molecular
Azul de bromofenol
Início final
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Visualização das proteínas
Fixação – metanol, ácido acético e formaldeído Comassie Blue R Coloração com AgNO3 íons Ag+ formam complexos com a proteína. A adição de Na2CO3 leva a formação de AgCO3 que em meio alcalino origina Ag2O (insolúvel e marrom)
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Gel de SDS-PAGE corado com AgNO3
Proteínas padrão de peso molecular
Amostras experimentais
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Cálculo do peso molecular
Mobilidade relativa = migração individual/migração total
Migração total (cm)
Migração 1
Migração 2
Azul de bromofenol
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97,4
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
kD
Mobilidade relativa