ADN recombinante Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED.
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ADN recombinante
Dr. Luis A. Mora B.Cátedra de BioquímicaUCIMED
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IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Diagnóstico Medicina forense Terapia génica Producción de medicamentos
insulina
factores de la coagulación
activador del plasminógeno
hormona de crecimiento
Producción de vacunas
Antihepatitis B
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IMPORTANCIA BIOMÉDICA
·Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN
(base molecular de la enfermedad)
• Hipercolesterolemia familiar
• Drepanocitosis
• Talasemias
• Fibrosis Quística
• Distrofia Muscular
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ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN
Forma (doble hélice de nucleótidos)
Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces
fosfodiéster)
Apareamiento de las bases (A:T, G:C)
Pares de bases en genoma haploide humano (3x109)
Longitud de genes (3x103)
Empacamiento del ADN (histonas)
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ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN
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EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN
Replicación
Transcripción (Exones e intrones)
Traducción
Síntesis de proteínas
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EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Aislamiento del ADN
Desnaturalización
Manipulación
Endonucleasas
Polimerasas
Formación de moléculas quiméricas
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
endonucleasas
Endonucleasas:
enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir de
una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ;
estos tienen entre 4 y 12 pb.
Cortan ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos
extremos: romos y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas.
Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina
humana.
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Organismos procarióticos (bacterias) Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para
distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. No pueden cortar ADN metilado.
Isoesquizómeros: de diferentes especies idéntica diana dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:
endonucleasas
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Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos: GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA EcoRI BamHI HindIII
2. Abruptos: AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC SspI SmaI
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan). o cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo) o dejan extremos cohesivoso Necesitan ATP o Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores.
Tipo 2: Sólo restricción. o otras enzimas metilan. o cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy
cerca de él. o son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas)o sólo requieren Mg+2 como cofactor. o no necesitan ATP.
Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades)o cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. o requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la
misma cadena de ADN. o Necesitan ATP, Mg y SAM.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
endonucleasas
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Nomenclatura
El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:
1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco)
2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )
3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.
4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
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DefiniciónVectores
PlásmidosbacterianosADN circular de doble bandaInserción de 6-10 Kb
FagosviralesADN lineal de doble bandainserción de 10-20 Kb
CósmidosSon plásmidos con características de fagosADN circular de doble bandainserción de 35-60 Kb
YACSon cromosomas artificiales de levaduras
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:
vectores
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Propiedades de los vectores
Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera
Secuencias de ADN conocidas
Copias únicas
Cromosoma más pequeño que el del hospedero
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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Definición:
1. m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos,
originado por reproducción asexual a partir de una única célula u
organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.
2. m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico
obtenidos a partir de una misma secuencia original.
CLONACIÓN
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CLONACIÓN
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Gracias