Actividad biológica de Usnea durietzii Motyka (Usneaceae) · 2013-08-14 · Castañeda,2 Edwin...

46Rev Acad Peru Salud 2012;19(2)

TESIS DE MAESTRÍA


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Bertha Ruth Zelada Mariluz,1 Ana Pastor de Abran,1 Frank Lizaraso Caparó,2 Benjamín Castañeda Castañeda,2 Edwin Zarzosa Norabuena,2 Lucy Ibáñez Vásquez2

El objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad biológica de los extractos del ácido úsni-co, procedente de Usnea durietzii, mediante los en-sayos de toxicidad aguda y subaguda en ratones y ratas, respectivamente. Al evaluar la toxicidad agu-da del ácido úsnico, se observó que con una dosis de 2.000 mg/Kg se produjo la mortalidad del 50% de la población sometida al estudio, mientras que en el caso del extracto etéreo no se produjo dicho efecto. Al estudiar la toxicidad subaguda del extrac-to etéreo y del ácido úsnico, administrados a la do-sis de 25 mg/Kg, se observó un efecto hepatotóxico en ambos casos. No se observaron alteraciones his-topatológicas en otros órganos. Se pudo comprobar que el ácido úsnico presentó un efecto hipoglice-miante, acción no reportada anteriormente.

Palabras clave: Usnea durietzii; ácido úsnico; actividad biológica; toxicidad

Actividad biológica de Usnea durietzii Motyka

(Usneaceae)

(1) Laboratorio de Productos Naturales, Pontificia Universidad Católica del Perú. Lima, Perú.(2) Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología, Instituto de Investigación de la Facultad de Medicina Hu-

mana, Universidad San Martín de Porres. Lima, Perú.

Enviar correspondencia a: Bertha Ruth Zelada Mariluz. Dirección electrónica: [email protected]

Recibido: marzo 2013. Revisado: mayo 2013. Aceptado: junio 2013

The objective of this research was to evaluate the biological activity of extracts of usnic acid, from Us-nea durietzii, by testing acute and subacute toxicity in mice and rats, respectively. To evaluate acute to-xicity of usnic acid, it was observed that a dose of 2,000 mg/Kg there was 50% mortality of the popu-lations under study; whereas in the case of the ether extract, there was no such effect. When studying the subacute toxicity of the ether extract, and usnic acid, administered at doses of 25 mg/Kg, hepatotoxic effect was observed in both cases. No histopathological changes were observed in other organs. It was found that usnic acid showed a hypoglycemic effect, action previously no reported.

Key words: Usnea durietzii; usnic acid; biologi-cal activity; toxicity

RESUMEN RESUMEN


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Actividad biológica de Usnea durietzii Motyka

(Usneaceae) Se reporta un amplio uso médico de líquenes que contienen ácido úsnico 1 en diversos continen-tes,2 mientras que los datos relacionados con su to-xicidad en humanos son escasos; ejemplo de ello tenemos a la dermatitis en trabajadores que tuvie-ron contacto con líquenes en zonas rurales 3 y la he-patotoxicidad producida por el consumo de líque-nes que contienen ácido úsnico como suplementos dietéticos, además de ataxia y muerte en animales que los ingirieron.4 A la especie en estudio, Usnea durietziise, se le atribuyen propiedades abortivas.5

Se ha reportado que la toxicidad aguda por el ácido úsnico en ratones se produce al administrar una dosis letal, 50% (DL50)* de 25 mg/Kg por vía intravenosa, mientras que en ratas y conejos la DL50 fue de 30 mg/Kg y en perros, de 40 mg/Kg.6 Aplica-do a ratones por vía oral la DL50 es de 838 mg/Kg y en conejos de 500 mg/kg. La DL50 vía subcutánea en ratones fue de 75 mg/Kg.7 No hay reportes a la fecha sobre estudios de toxicidad subaguda, subcrónica y crónica del ácido úsnico en ensayos in vivo. En este trabajo nos centramos en determinar la actividad biológica del ácido úsnico mediante ensayos de to-xicidad aguda y subaguda en roedores.

Obtención de extractos para las pruebas de toxicidad aguda y subaguda

Una muestra del liquen Usnea durietzii (vou-cher N° 242694-USM) se encuentra depositado en el Herbario San Marcos del Museo de Historia Natural, de la Universidad Nacional Mayor de San

marcos. Mediante el método de Ciulei 8 se mace-raron 510 g de material seco y molido del liquen, con solventes de polaridad creciente (éter dietílico, alcohol etílico y agua destilada) por un espacio de 48 horas, lo cual permitió la obtención de extractos etéreo, alcohólico y acuoso para las pruebas de toxi-cidad aguda y subaguda. Mientras, el ácido úsnico fue aislado e identificado mediante técnicas espec-troscópicas.9

Evaluación de la toxicidad aguda 10

Se emplearon ratones albinos macho Mus mus-culus (cepa BALB/c), de 1,5 meses de edad, con peso promedio aproximado de 30 ± 5 g, obteni-dos en el Instituto de Salud del Ministerio de Salud (INS), los cuales fueron previamente aclimatados en el bioterio durante 3-4 días. Se formaron doce grupos, de seis animales cada uno. A seis grupos se les aplicó dosis de 313, 500, 750, 1000, 1500 y 2000 mg/Kg de solución de ácido úsnico, respec-tivamente; a los otros seis grupos se les administró dosis de 375, 550, 750, 1000, 1500 y 2000 mg/Kg de solución del extracto etéreo, respectivamente. Las diversas dosis se administraron por vía oral a través de una cánula orogástrica, previo ayuno de 12 horas. Para la determinación de la dosis letal se evaluaron los cambios de comportamiento, signos de toxicidad y/o muerte que experimentaron los animales durante las primeras 72 horas y se reali-zó un seguimiento de hasta 14 días posteriores a la administración.

Evaluación de la toxicidad subaguda 11

Se utilizaron 30 ratas albinas machos Rattus norvegicus (cepa Holtzman), de 2 a 2,5 meses, con peso promedio aproximado de 225 ± 25 g, obteni-dos en el INS. Los animales se mantuvieron en el bioterio durante una semana para su aclimatación. Se formaron tres grupos de diez animales cada uno. Al primer grupo, que se denominó grupo control, se le administró 10 mL/Kg de agua destilada. Al se-gundo grupo se le trató con una dosis de 25 mg/Kg de una solución de extracto etéreo de 15 mg/mL. Al tercer grupo se le administró una solución de ácido úsnico de 25 mg/Kg, a la concentración de 15 mg/mL. La administración fue por vía oral a través de

INTRODUCCIÓN

PARTE EXPERIMENTAL

(*) En toxicología, se denomina DL50 (abreviatura de Dosis Letal, 50%) a la dosis de una sustancia o radiación que resulta mortal para la mitad de un conjunto de animales de prueba. Los valores de la DL50 son usados con frecuencia como un in-dicador general de la toxicidad aguda de una sustancia. [Nota del editor].


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una cánula orogástrica. Previamente, las soluciones se calentaron en baño maría a 37 °C. Las ratas fue-ron observadas para evaluar su respuesta fisiológi-ca, conducta y mortalidad. El consumo de alimento y la ingesta de agua se controlaron diariamente. El peso corporal se registró al inicio y al final y a inter-valos de dos veces a la semana a lo largo de todo el experimento. Todos los días, durante la mañana se realizó la limpieza de la jaula, que involucró el cam-bio de viruta, lavado de los recipientes de comida y la botella de agua, previa a la dosificación de las sustancias en estudio.

Análisis bioquímico, hematológico y enzimático de sangre

La extracción de sangre de las ratas se rea-lizó después de un ayuno de 12 horas. Este pro-cedimiento se realizó el primer día, a los 15 y 30 días y se registró el peso corporal antes y después de la extracción de sangre. La extracción de 1 mL de sangre se realizó mediante la ruptura del plexo retro-orbital del ojo derecho con capilares hepari-nizados y las muestras fueron empleadas para los análisis bioquímicos, enzimáticos y hematológicos respectivos. Luego de la extracción, las ratas fueron dejadas en sus jaulas para observación y asistencia.

Para el análisis hematológico, la sangre colec-tada en capilares heparinizados fue centrifugada a 11.000 rpm durante 5 minutos para la determi-nación directa del hematocrito (Hto), utilizando el lector de tubos de microhematocrito modelo Cri-tocaps® (Oxford, McCormick Scientific). La estima-ción de la hemoglobina (Hb) se efectuó empleando la tabla de valores normales del volumen globular por el hematocrito.

Para el análisis bioquímico y enzimático, la sangre colectada se centrifugó a 3.500 rpm durante 5 minutos. El suero obtenido se empleó en el ana-lizador automatizado modelo Vitalab Selectra 2® (Vital Scientific) para la determinación de los pará-metros bioquímicos (glucosa, proteína, bilirrubina

total, bilirrubina directa, albúmina) y enzimáticos (creatinina, fosfatasa alcalina, transaminasa glutá-mico oxalacético - TGO, transaminasa glutámico pirúvica - TGP, gamma glutamiltransferasa - GGT).

Estudios histopatológicos

Después de la última colecta de sangre, se sa-crificaron los animales para la extracción de los órganos siguientes: hígado, riñón, pulmón, estoma-go, esófago, bazo, cerebro y cerebelo, de los cuales se determinaron las dimensiones y características externas. Luego, se realizaron cortes tomográficos para cada órgano de unos 3 mm de espesor, que se mantuvieron en formol al 10%.

Para el procesamiento de tejidos, los cortes se deshidrataron y aclararon para la inclusión con pa-rafina en el dispensador de parafina modelo AP280® (Microm). Luego, estas preparaciones se sometie-ron a cortes de 3 micras de espesor con el micró-tomo rotatorio modelo HM 360®, serie Nº 14417 (Richard-allan). Posteriormente, las preparaciones se tiñeron y fijaron con bálsamo de Canadá para su lectura por el médico anatomopatólogo con el microscopio Carl Zeiss©, modelo AXIOSKOP®, se-rie Nº 231960; control de fotografía: modelo MC-80DX®, serie Nº 230403.

Análisis estadístico

Los datos bioquímicos, hematológicos y enzi-máticos fueron trabajados en Excel, expresados en promedio (media) y desviación estándar. A los da-tos procesados se les aplicó el análisis de varianza (ANOVA), usando el software SPSS versión 15 para determinar la significancia estadística de los resul-tados (p < 0,05). Los datos bioquímicos, hematoló-gicos y enzimáticos trabajados en Excel permitieron graficar la significancia de la variación a los 15 y 30 días. Además, se realizó el análisis discriminante de los parámetros bioquímicos y enzimáticos no sig-nificativos en relación con el peso de los animales.


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Previo a los ensayos de toxicidad, se analizaron por cromatografía de capa fina los extractos etéreo, alcohólico y acuoso. Este análisis permitió identi-ficar como componente químico común al ácido úsnico, que se encontró mayoritariamente en el ex-tracto etéreo (EE), el que se seleccionó para la rea-lización del estudio de toxicidad aguda y subaguda.

Al evaluar la toxicidad aguda del EE, se encon-tró que con la dosis límite de 2.000 mg/Kg ninguno de los ratones murió a las 72 horas de observación. Para el caso del ácido úsnico (AU), con una dosis de 2.000 mg/Kg muere el 50% de la población, mien-tras que con una dosis de 1.000 mg/Kg no se pro-dujo muerte alguna. La dosis a la cual se empieza a observar mortalidad en la población estudiada es de 1.500 mg/Kg (tabla 1).

Dosis(mg/Kg)

Mortalidad a horas24 48 72

2 000 3/6 3/6 3/61 500 2/6 2/6 2/61 000 0/6 0/6 0/6

750 0/6 0/6 0/6500 0/6 0/6 0/6313 0/6 0/6 0/6

El valor de la dosis para el ácido úsnico con la cual muere el 50% de la población es de 2.000 mg/Kg, que es superior a lo reportado por Frankos (DL50: 838 mg/kg);7 pero dicho autor no indica el tipo de cepa, cantidad, edad ni peso de los ratones empleados, mientras que en nuestro trabajo estos parámetros están claramente definidos.

Para estudiar la toxicidad subaguda, se admi-nistraron el EE y AU en dosis diarias de 25 mg/Kg,

RESULTADOS Y DISCUSIÓN durante 30 días (se ha reportado que con esta dosis no se producen efectos serios).7 Este ensayo se fun-damenta en los resultados obtenidos a nivel bioquí-mico, hematológico, enzimático e histopatológico.

En los parámetros bioquímicos (tabla 2) se ob-servó que el nivel de proteínas a los 15 días en las ratas tratadas con AU y tratadas con EE, en compa-ración con las del grupo control, mantuvo algunas diferencias sin que estas fueran notorias como para presumir su influencia negativa o positiva frente a la salud de los animales estudiados. Respecto a los niveles de albúmina, se observó variación en las ra-tas tratadas con AU con respecto a las ratas control; sin embargo, esta diferencia no se mantuvo en el tiempo, por lo que no puede ser atribuida a efec-tos del AU. Los valores de bilirrubina total en suero de sangre mostraron mínimos niveles de variación entre ratas tratadas con AU y con EE frente a las de los grupos control, pero no se mantuvieron con el tiempo. Por otro lado, la bilirrubina directa no mostró variaciones en sus niveles a lo largo del en-sayo biológico. En el caso de la glucosa, sus niveles disminuyeron notablemente en el AU comparados con las del grupo control a lo largo del experimen-to. Se puede inferir que el AU presenta un efecto hipoglicemiante, que no ha sido reportado previa-mente en las publicaciones científicas.

Al analizar la variación de los pesos a los 15 días, no se observó incremento significativo de peso en los grupos control, EE y AU. A los 30 días se encontró incremento de peso en las ratas trata-das con AU. A través del análisis discriminante de los parámetros bioquímicos y enzimáticos no signi-ficativos de: proteínas, albúmina, bilirrubina total, bilirrubina directa, TGP y GGT en contraposición al peso, se determinó que el incremento de peso no fue estadísticamente significativo y este se en-contraba dentro de los rangos normales reportados comparado con el peso ganado por las ratas control

12,13 (tabla 2) en relación con el tiempo.

Tabla 1. Mortalidad en ratones tratados con ácido úsnico


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Los valores de los parámetros hematológicos de las ratas tratadas con EE y AU no presentaron variación en comparación con el control durante el desarrollo del experimento. En relación con los parámetros enzimáticos (tabla 3), se observaron va-riaciones en los niveles de la transaminasa GGT en ratas tratadas con AU respecto al control, pero esta diferencia no se mantuvo en el tiempo. Mientras que para la transaminasa TGO, se observaron ni-veles de variación que se mantuvieron en el tiempo en ratas tratadas con AU en relación con las ratas control. Para el caso de ratas tratadas con EE, com-paradas con las de control se observó un incremen-to de la TGO a los 30 días. Se sabe que si un proce-so patológico provoca daños en células activas, se observa paralelamente un aumento de niveles de transaminasas en el suero, tales como las del tipo de la TGO.14 En afecciones hepáticas se observó la mayor elevación de la TGO, sobre todo en los casos de hepatitis con necrosis. Evaluando el daño hepá-

tico producido por el AU y EE, a través de la actividad enzimática, observamos que el ni-vel de la transaminasa TGP se mantuvo den-tro de los rangos nor-males hasta los 30 días, en comparación con la TGO, que fue varian-do de forma estadísti-camente significativa. Estos resultados, coin-ciden con lo reportado por Alarcón-Corre-dor,15 quienes recono-cen actividades más altas de TGO que de TGP, o a la inversa; no constituyen un error de

medición, sino un indicador de procesos fisiopato-lógicos diversos y, con ello, de diferentes afecciones o de distintos estadios patológicos.

Los valores de los parámetros enzimáticos, como creatinina y fosfatasa alcalina (FA), de anima-les tratados con EE y AU presentaron variaciones a los 30 días. La creatinina, compuesto altamente difusible, se elimina del organismo casi exclusiva-mente por filtración renal. Su determinación en el suero es muy utilizada para evaluar la función re-nal. Los valores de creatinina en las ratas tratadas con EE mostraron un incremento en relación con las de control, por lo que se podría inferir que el EE produjo un efecto tóxico en la actividad renal en ratas. Los niveles aumentados de FA se presentaron en la enfermedad obstructiva hepática.16,17 En nues-tro estudio, la actividad elevada de la FA nos indica que podría deberse a daño hepático, ocasionado en mayor grado por el AU y en menor grado por el EE.

Tabla 2. Parámetros bioquímicos de la sangre de ratas tratadas:datos basales (antes del tratamiento) al finalizar el estudio

Los valores se expresan como la media ± desviación estándar. Se observó diferencia significati-va: p < 0,05 (*). No se observó diferencia significativa: p > 0,05.


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Evaluación histopa-tológica

Los resultados del análisis histopa-tológico confirmaron que no se presentaron efectos tóxicos en los órganos diana como: cerebro-cerebelo, es-tómago-esófago, pul-món, bazo y riñón. La bronco pulmonía asociada con bacte-rias, que se observó en el grupo control (sin tratamiento) y en el de EE, podrían deberse a que en muchos ani-males de experimen-tación inicialmente cuando son sometidos a estrés generado por las condiciones experimentales se pueden crear si-tuaciones que contribuyan a la introducción y di-seminación de colonias de agentes que provocan enfermedades infecciosas18 o por la manipulación durante la administración de los extractos.19

Los resultados del estudio microscópico de los órganos diana observados para los tres grupos de estudio se presentan en la tabla 4.

En la mayoría de animales del grupo I (control) no se observaron alteraciones patológicas en los diferentes órganos analizados microscópicamen-te, a excepción de un 30% que presentaron bronco pulmonía asociada con bacterias e hiperplasia del agregado linfoide peribronquiolar; algunos desa-rrollaron una atipia celular leve.

En el grupo II, tratado con EE a la dosis de 25 mg/Kg, el 90% de los hí-gados estudiados presen-taron alteraciones celula-res con una disminución del tamaño hepatocelular, picnosis nuclear y acido-filia citoplasmática, prin-cipalmente en la zona pericentrolobulillar. En el 30 de las muestras de pul-mones se evidenció bron-

Tabla 3. Parámetros enzimáticos de la sangre de ratas tratadas:datos basales (antes del tratamiento) al finalizar el estudio

Los valores se expresan como la media ± desviación estándar. Se observó diferencia significativa: p < 0,05 (*). No se observó diferencia significativa: p > 0,05.

SAP: No se observan alteraciones patológicas.

Tabla 4. Resultados del estudio histopatológico de las ratas tratadas


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co pulmonía asociada con bacterias, observándose edema y daño pulmonar, pero no se registraron alteraciones patológicas en alguno de los otros ór-ganos.

En el grupo III, tratado con AU a la dosis de 25 mg/Kg, se observó que el 30% de las muestras de hígado presentaban escasas células con núcleo picnótico y citoplasma acidófilo; sin embargo, no se encontraron alteraciones patológicas en ninguno de los otros órganos.

Todas las láminas de las muestras de hígado fueron enviadas al laboratorio de histología, em-briología y patología veterinaria de la UNMSM, en donde se eligieron al azar tres láminas de cada grupo, I, II y III, y se obtuvieron los siguientes re-sultados:

Grupo I: Control (figura 1). Los cortes de híga-do evaluados no muestran cambios aparentes; sin

embargo, se identificó un caso en el que se observó tumefacción de hepatocitos con vacuolas de bor-des definidos (hepatosis grasa) y conservación de la citoarquitectura con pérdida del detalle celular (necrosis). Esta hepatosis grasa se puede producir debido a problemas en la síntesis de proteínas, défi-cit de elementos como la metionina, etc.20

Grupo II: EE (figura 2). En los cortes de híga-do se observa conservación de la citoarquitectura con pérdida del detalle celular (necrosis), así como dilatación de los vasos sanguíneos (congestión vas-cular).

Grupo III: AU (figura 2). En los cortes de híga-do se observó conservación de la citoarquitectura con pérdida del detalle celular (necrosis).

Se puede afirmar de los animales que recibie-ron el EE presentaron mayor daño histopatológico, frente a los tratados con AU. El EE produce lesión

Figura 1. Hígado de rata sin tratamiento. Cordones de he-patocitos con células normales (C). Los hepatocitos (H) po-seen un núcleo central (N), nucleolo visible y contornos bien definidos. Vena centrolobulillar (V).

Coloración: hematoxilina y eosina. M.O. 400X

Figura 2. Hígado de rata con tratamiento. Presenta necro-sis: no se observa detalle celular. Las células hepáticas (H) están tumefactas, otras presentan membranas del núcleo de hepatocitos ligeramente engrosados, núcleos pequeños «pic-nosis» (N) y otras carecen de núcleo (S).Coloración: hematoxilina y eosina M.O. 400X.

H

V

N

C

H

C

N

S


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histológica (necrosis) y también, aunque en menor grado, lesión enzimática. Justificaría esta observa-ción la compleja composición de EE, donde el AU es uno de los componentes mayoritarios. Mientras que, en ratas tratadas con AU se observó una mayor alteración enzimática, por el incremento significa-tivo de la TGO y fosfatasa alcalina. Esto podría su-gerir que la lesión enzimática producida por el AU es más severa que la lesión histológica ocasionado por el EE, por la dosis letal de AU con la que muere el 50% de la población de ratas tratadas. Se confir-ma lo reportado por Ariyibi,21 quien indica que las condiciones patológicas y fisiológicas de los anima-les pueden ser valoradas por el análisis de sangre, pues la sangre es un elemento importante para va-lorar el estado de salud de los animales.

1. El estudio de la actividad biológica confirmó que con una dosis de 2.000 mg/Kg de extrac-to etéreo no ocurre la muerte de ratones a las 72 horas de observación. Mientras que con esa misma dosis de ácido úsnico muere el 50% de la población de ratones.

2. La administración diaria de 25 mg/Kg de ex-tracto etéreo durante 30 días produjo altera-ciones celulares en el 90% de las muestras de hígado. Con esa misma dosis, el ácido úsnico originó alteraciones celulares en el 30% de las muestras de hígado, con un incremento signifi-cativo de la TGO y FA, lo cual sugiere una ma-yor alteración enzimática.

3. La administración oral de una dosis de 25 mg/Kg de peso por día durante 30 días, tanto de ácido úsnico como de extracto etéreo, no pro-dujo modificaciones en los parámetros hema-tológicos ni alteraciones histológicas en los di-ferentes órganos analizados.

4. En la evaluación de la toxicidad subaguda del ácido úsnico, se observó que este tiene un efec-to hepatotóxico en las ratas tratadas.

5. Se comprobó la actividad hipoglicemiante del ácido úsnico, que no ha sido reportada hasta el momento.

6. Puesto que líquenes que contienen ácido ús-nico son empleados como producto dietéticos por seres humanos, se recomienda realizar la investigación minuciosa de la farmacocinética de los componentes del extracto etéreo y del ácido úsnico en humanos pues no se encontra-ron hasta la fecha estudios previos al respecto.

En la Facultad de Medicina Humana de la Universi-dad San Martín de Porres, al personal especializado del Instituto de Investigación, por su colaboración y apoyo durante el desarrollo del estudio de toxicidad.

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CONCLUSIONES

AGRADECIMIENTOS

REFERENCIAS


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20. Comunicación personal con la Dra. Rosa Perales, La-boratorio de Histología, Embriología y Patología Ve-terinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universi-dad Nacional Mayor de San Marcos.

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