ของพริก (Capsicum spp.) โดยชีววิธี Nematophagus Fungi in...

(1)

เช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยในเขตภาคใตของประเทศไทยและประสทธภาพในการควบคม

ไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita Chitwood)

ของพรก (Capsicum spp.) โดยชววธ Nematophagus Fungi in Southern Thailand and Their Efficacy in Biocontrol of

Root-knot Nematode (Meloidogyne incognita Chitwood)

on Chili (Capsicum spp.)

สมลกษณ วงษตาน Somlak Wongtanee

วทยานพนธน�เปนสวนหนPงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Master of Science in Plant Pathology Prince of Songkla University

2556 ลขสทธ_ของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(2)

ชPอวทยานพนธ เช อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยในเขตภาคใตของประเทศไทยและประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita

Chitwood) ของพรก (Capsicum spp.) โดยชววธ ผเขยน นายสมลกษณ วงษตาน สาขาวชา โรคพชวทยา

อาจารยทPปรกษาวทยานพนธหลก คณะกรรมการสอบ ................................................................. ..............................................ประธานกรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน) (รองศาสตราจารยพลลภา กฤษณไพบลย) อาจารยทPปรกษาวทยานพนธรวม ............................................................กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน) ................................................................. (ดร.มณรตน คหาพทกษธรรม) ............................................................กรรมการ

(ดร.มณรตน คหาพทกษธรรม)

............................................................กรรมการ (ดร.ชนนนท พรสรยา) บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร อนมตใหนบวทยานพนธฉบบน

เปนสวนหนBงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา

..................................................................... (รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ)

คณบดบณฑตวทยาลย

(3)

ขอรบรองวา ผลงานวจยน เปนผลมาจากการศกษาวจยของนกศกษาเอง และขอแสดงความขอบคณบคคลทBมสวนเกBยวของ

ลงชBอ................................................................. (รองศาสตราจารย ดร.วสนณ เพชรรตน) อาจารยทBปรกษาวทยานพนธ

ลงชBอ................................................................. (นายสมลกษณ วงษตาน) นกศกษา

(4)

ขาพเจาขอรบรองวา ผลงานวจยนไมเคยเปนสวนหนBงในการอนมตปรญญาในระดบใดมากอน และไมไดถกใชในการยBนขออนมตปรญญาในขณะน

ลงชBอ................................................................. (นายสมลกษณ วงษตาน) นกศกษา

(5)

ช�อวทยานพนธ เช� อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยในเขตภาคใตของประเทศไทยและประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita

Chitwood) ของพรก (Capsicum spp.) โดยชววธ ผเขยน นายสมลกษณ วงษตาน

สาขาวชา โรคพชวทยา ปการศกษา 2555

บทคดยอ

การศกษาประสทธภาพของเช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita Chitwood) ของพรกโดยชววธ ไดใชตวอยางเช�อราท;แยกไดจากตวอยางดนในแปลงปลกพรก ตวอยางช�นสวนของพชท;จมหรอลอยอยในน� า ตวอยางกลมไข (egg mass) ของไสเดอนฝอยรากปม และดนรอบๆตนพรกท;เกดโรครากปมในเขตภาคใตของประเทศไทย ไดแก จงหวดกระบ; ตรง นครศรธรรมราช นราธวาส พงงา พทลง ภเกต ยะลา สงขลา สตล และสราษฏรธาน สามารถแยกเช�อรากลมกบดกไสเดอนฝอยในหองปฏบตการได 4 ชนด ใน 2 สกล ไดแก Arthrobotrys oligospora, Monacrosporium bembicodes, M. aphrobrochum และ M. thaumasium รวมท� งส�น 54 ไอโซเลท นอกจากน� ยงพบเช�อรากลมท;เปนปรสตภายใน (endoparasites) ไดแก Harposporium cycloides แตไมสามารถเกบเช�อบรสทธL ไวได สวนเช�อราท;แยกไดจากกลมไขไสเดอนฝอยรากปม และดนรอบรากตนพรกท;เปนโรครากปม มจานวนท�งส�น 143 ไอโซเลท นาเช�อราท;แยกไดท� งหมดไปทดสอบประสทธภาพในการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ไข (egg) และความสามารถในการลดอตราการฟกไขของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita จากการทดสอบพบวา Paecilomyces lilacinus (EM06-08) และ Trichoderma sp. (SR06-05) เปนเช�อราท;มศกยภาพในการควบคม M. incognita โดยชววธ ดไดจากประสทธภาพในการเขาทาลายไข และกลมไข เม�อนาเชอราทงสองไอโซเลทและเช�อรากลมกบดกไสเดอนฝอย ท;มประสทธภาพท;สดจากการทดสอบ จานวน 2 ไอโซเลท ไปทดสอบประสทธภาพในการควบคมการเกดปมของรากพรกโดยชววธ พบวาเช�อรา P. lilacinus มประสทธภาพในการทาใหความรนแรงในการเกดปมของรากพรกลดลง โดยไมพบความแตกตางกนในทางสถต เม;อเปรยบเทยบกบการใชสาร carbofuran เม�อทาการจาแนกชนดของเช อราโดยใชเทคนค PCR เปรยบเทยบกบลาดบ นวคลโอไทดในฐานขอมลของ GenBank สามารถยนยนไดวาเปนเช�อรา P. lilacinus

(6)

Thesis Tiltle Nematophagus Fungi in Southern Thailand and Their Efficacy in Biocontrol of Root-knot Nematode (Meloidogyne incognita Chitwood) on Chili (Capsicum spp.) Author Mr. Somlak Wongtanee Major Program Plant Pathology

Academic Year 2012

ABSTRACT

The study on efficacy of nematophagus fungi for control of root-knot nematode (Meloidogyne incognita Chitwood) was started from collecting soil samples of chili crop, submerged plant material, root gall and soil around root gall of chili in area of southern Thailand (Krabi, Nakhon Si Thammarat, Narathiwat, Phangnga, Phatthalung, Phuket, Satun, Songkhla, Surat Thani, Trang and Yala) for fungal isolation. Fifty-four isolates of nematode-trapping fungi were baited and isolated into pure culture. They were identified to 4 species in 2 genera as follow: Arthrobotrys oligospora, Monacrosporium aphrobrochum, M. bembicodes and M. thaumasium.

The endoparasitic fungus, Harposporium cycloides, was also found infecting nematode but it could not be isolated into pure culture. In addition, 143 fungi were isolated from root knot egg mass attached to galled root and soil around root gall. Each fungal isolates was tested for their ability to colonize egg mass, egg and reduce egg hatching of M. incognita nematode. The result showed that Paecilomyces lilacinus (EM06-08) and Trichoderma sp. (SR06-05) exhibited high potential of biological control of M. incognita by infecting their egg or egg mass. Two species of egg colonizing and two species of nematode-trapping fungi were selected and further tested on potted chili for biological control of root-knot nematode. The result revealed that P. lilacinus showed highest efficacy in biological control of root-knot nematode of chili by reducing the galls on chili root and was not different from carbofuran treatment. The identification of P. lilacinus was confirmed by PCR and nucleotide sequencing technique and compared to the GenBank database.

(8)

สารบญ

หนา สารบญ (8) รายการตาราง (9) รายการตารางภาคผนวก (10) รายการภาพ (11) 1. บทนา 1

บทนาตนเร�อง 1 ตรวจเอกสาร 3 วตถประสงค 16

2. วสดอปกรณและวธการ 17 วสดและอปกรณ 17 วธการทดลอง 19

3. ผลการทดลอง 31 4. สรปและวจารณผลการทดลอง 51 เอกสารอางอง 55 ภาคผนวก 61 ประวตผเขยน 70

(9)

รายการตาราง

ตารางท� หนา 1. 2. 3. 4. 5.

กลไกการเปนปฏปกษของเช;อราควบคมไสเดอนฝอย

สถานท�เกบตวอยางและจานวนไอโซเลทของเช;อราปฏปกษ ไสเดอนฝอยท�แยกเช;อไดจากตวอยางดน และจากช;นสวนของพช ท�จมหรอลอยอยในน;า เปรยบเทยบลกษณะของเช;อราปฏปกษกลมกบดกไสเดอนฝอย ท�พบจากการสารวจ ประสทธภาพของเช;อราในการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ไข (egg) ของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ในหองปฏบตการ เปรยบเทยบคาเฉล�ยระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรก น; าหนกรากสด น; าหนกตนสด และน; าหนกผลผลตของพรก ท�เกบเก�ยวเม�ออาย 60 วน

7

35

36

41

46

(10)

รายการตารางภาคผนวก

ตารางภาคผนวกท� หนา 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

รหสและจานวนไอโซเลทของเช;อราท�ใชในการเกบตวอยาง ชนดและรหสไอโซเลทของเช;อราปฏปกษท�แยกไดจากตวอยางดน ชนดและรหสไอโซเลทของเช;อราปฏปกษท�แยกไดจากช;นสวนของพชท�จม หรอลอยอยในน;า วเคราะหความแปรปรวนระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรก (ระดบ 0-5) เม�ออาย 60 วน วเคราะหความแปรปรวนน;าหนกรากสดของพรก เม�ออาย 60 วน วเคราะหความแปรปรวนน;าหนกตนสดของพรก เม�ออาย 60 วน วเคราะหความแปรปรวนผลผลตพรก ท�เกบเก�ยวเม�ออาย 60 วน

64 66

67

68 68 68 69

(11)

รายการภาพ

ภาพท� หนา 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

อปกรณทอพวซ ท�ใชในการเตรยมกลมไขไสเดอนฝอยรากปม Monacrosporium aphrobrochum (Drechsler) Subram. Monacrosporium bembicodes (Drechsler) Subram. Monacrosporium thaumasium (Drechsler) de Hoog & Oorschot. Arthrobotrys oligospora Fres. Harposporium cycloides (endoparasites)

ตวอยางเช;อราท�มศกยภาพในการเขาทาลายกลมไข และไขของ

M. incognita

P. lilacinus ไอโซเลท EM06-08

ระดบระดบความรนแรงในการเกดปมของรากในแตละกรรมวธ

ผลผลตยน rDNA ของเช;อราปฏปกษท�สามารถควบคมไสเดอนฝอย รากปม M. incognita

22 32 32 33 33 34

38 40 47

50

1

บทท� 1

บทนา

บทนาตนเร�อง

พรก (Capsicum spp.) เปนพชท�สาคญชนดหน� งท�สามารถปลกไดเกอบท�วโลก

ในประเทศไทย พรกถกจดใหเปนพชวฒนธรรมของคนไทย มการใชประโยชนท2งในแงของการบรโภค ในรปของเคร�องเทศสาหรบปรงแตงรสชาต กล�นและส ใชเปนพชสมนไพร และใชในพธกรรมตางๆ นอกจากน2 ในปจจบนมการสกดสารเผดจากพรกท�เรยกวา แคปไซซน (capsaicin) ซ� งมฤทธ@ ทางเภสชวทยา มาทาผลตภณฑตางๆเพ�อใชประโยชนดานสขภาพ เชน กระตนการทางานของกระเพาะอาหาร กระตนการไหลเวยนของโลหต บารงหวใจ บรรเทาอาการปวดเม�อย ฉดพนรกษาอาการโรคไซนส รวมท2งใชเพ�อควบคมน2 าหนก นอกจากน2 ยงไดนาไปใชประโยชนดานอ�นๆ เชน ใชแทนแกสน2 าตาเพ�อปราบจลาจลและใชเคลอบสายไฟและสายไฟเบอรออปตกสตางๆ เพ�อปองกนการกดแทะของสตว เน�องจากพรกเปนพชท�มคณคาทางอาหารและยา มส รสชาตท�ไมอาจใชผลผลตจากพชอ�นๆทดแทนได จงทาใหพรกเปนพชผกท�มความสาคญทางเศรษฐกจชนดหน�ง ในดานการผลตน2นมการเพาะปลกมานานควบคกบชาตไทย เร�มจากปลกพรกในลกษณะสวนครวหลงบาน ตอมาไดปรบเปล�ยนมาเปนการปลกพรกเพ�อการคา เพ�อผลตพรกสดและพรกแหง สาหรบใชในการบรโภคและสงโรงงานอตสาหกรรมอาหารเพ�อแปรรปออกมาเปนผลตภณฑตางๆรวมท2งยงมการผลตเมลดพนธพรกลกผสมเพ�อการสงออกดวย จงทาใหแนวโนมการผลตพรกเพ�มสงข2นทกป (กมล เลศรตน, 2550)

พรกเปนพชท�มศกยภาพในการผลต เน�องจากมปรมาณการผลตและมลคาสง สามารถปลกไดในทกภาคของประเทศ มพ2นท�ปลกรวมท2งประเทศ 490,000 ไร ผลผลตรวม 548,800 ตน ผลผลตสวนใหญใชบรโภคภายในประเทศ มการสงออกไปตางประเทศในลกษณะของพรกสดและแปรรป จดเดนพรกของประเทศไทย คอสามารถปลกไดตลอดท2งปและปลกได ทกภาค มฐานพนธกรรมท�แพรหลาย มลกษณะจาเพาะท�เปนเอกลกษณ เชน ความเผด มกล�นหอม สามารถแปรรปไดหลากหลาย สาหรบการปลกพรกในเขตภาคใตของประเทศไทยน2น จากระบบรายงานขอมลภาวะการผลตพชแบบรายป ซ� งสารวจขอมลโดยกรมสงเสรมการเกษตร พบวา ฤดกาลเพาะปลก ป 2555/56 ภาคใตมพ2นท�ปลกพรกประมาณ 54,500 ไร แหลงผลตพรกท�สาคญของภาคใต ไดแก จงหวดนครศรธรรมราช สราษฎรธาน พทลง และจงหวดสงขลา ซ� งพบวา

2

การปลกพรกในพ2นท�ภาคใต มท2 งท�ปลกไวเพ�อจาหนายภายในประเทศและสงออกไปยงตางประเทศ ตลาดคาพรกท�สาคญของภาคใต ไดแก ตลาดหาดใหญ ตลาดหวอฐ และตลาดภเกต สวนตล าดสง ออกพ รกในตางป ระเท ศท� ส า คญ ไดแ ก ป ระ เท ศมาเล เ ซย และส งคโป ร (ปญญา ยวงเกต, 2552)

ปญหาท�สาคญของการปลกพรกคอ ศตรพช ซ� งมกพบการระบาดของแมลงศตรพรก ไดแก เพล2ยไฟ ไรพรก และโรคท�เกดจากเช2อสาเหตตางๆ ไมวาจะเปน เช2อรา ไวรส แบคทเรย และไสเดอนฝอย (นชนารถ ต2งจตสมคด และคณะ, 2552) ตามรายงานของ Chitwood, 2003

(อางถงใน Almaghrabi et al., 2013) พบวา ไสเดอนฝอยกอใหเกดความเสยหายแกผลผลตทางการเกษตรตอป คดเปนมลคา 125,000 ลานเหรยญดอลลารสหรฐอเมรกา โดยเฉพาะโรครากปมของพรกท�เกดจากไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita Chitwood) นบวาเปนศตรพชท�สาคญชนดหน� ง เพราะเม�อมไสเดอนฝอยรากปมเขาสรากพรกในระยะกลาเพยงตวเดยว ภายในเวลา 20 วน จะเพ�มจานวนประชากรในดน 400-500 ตว แลวกลบเขามาทาลายระบบรากและขยายพนธตอเน�องทนท เม�อตนพรกอาย 3 เดอน ไสเดอนฝอยจะมวงจรชวตรวม 3 ช�วอาย เกดความเสยหายตอพรกและสญเสยผลผลตมากกวา 50% (นชนารถ ต2งจตสมคด, 2550) ไสเดอนฝอยรากปมยงสามารถแพรระบาดไดดในเน2อดนชนดรวนปนทราย แพรระบาดไปกบระบบการใหน2 าหรอไหลไปกบน2าฝน รวมท2งตดไปกบดนเพาะกลาพรกและตดไปกบเคร�องมอเกษตรตางๆ เชน ลอรถไถ ดนท�ตดไปกบรองเทาของเกษตรกร และเคร�องมอเกษตรอ�นๆ (สรศกด@ มณขาว และคณะ, 2552)

การปองกนกาจดไสเดอนฝอยรากปมทาไดหลายวธ เชน การเขตกรรม การใชพนธตานทาน รวมท2งการใชสารเคม ซ� งเปนวธการท�มประสทธภาพท�สด แตกรรมวธคอนขางยงยาก และสงผลกระทบตอการเกดสารพษตกคางในระบบนเวศ การควบคมไสเดอนฝอยรากปมโดยชววธ (biological control) จงเปนอกทางเลอกหน�งท�มการศกษากนมาอยางกวางขวางและตอเน�อง โดยการนาศตรธรรมชาตมาใชควบคมไสเดอนฝอย และศตรธรรมชาตท�มการศกษากนมาก สวนใหญเปนการใชจลนทรยปฏปกษ (antagonistic microorganism) จาพวกเช2อรา หรอท�เรยกวา nematophagus fungi ซ� งมรายงานวาพบเช2อรามากกวา 30 สกล (genus) และ 80 ชนด (species) ท�สามารถควบคมไสเดอนฝอยได (Sun et al., 2006)

3

ตรวจเอกสาร

1. โรครากปมของพรก

โรครากปมพรกเกดจากไสเดอนฝอยรากปม M. incognita โดยวงจรของโรคเร�มตนจากตวออนระยะท� 2 หรอระยะเขาทาลายของไสเดอนฝอยท�แพรกระจายอยในดนปลกพช เจาะไชเขาสรากพรกบรเวณปลายราก แลวเคล�อนท�ตอไปยงทอน2าทออาหารและหยดน�ง จากน2นเร�มดดกนน2 าเล2 ยง และมการเจรญเตบโตดวยวธการลอกคราบจากตวออนระยะท� 2 เปนตวออนระยะท� 3 และระยะท� 4 ตามลาดบ จากน2นพฒนาไปเปนตวเตมวย ท�มท2งเพศผและเพศเมย โดยพบวาพรกเปนพชอาหารท�ด ไสเดอนฝอยท�เขาทาลายรากพรกจงมอตราการเปล�ยนแปลงเปนเพศเมยสงกวาเพศผในสดสวน 4:1 ของจานวนไสเดอนฝอยท�เขาทาลาย เพศเมยสามารถสรางไขท�มลกษณะเปนกลม ซ� ง 1 กลมไข ประกอบดวยไขจานวน 400-500 ฟอง หลงจากน2นไขจะพฒนาเปนตวออนระยะท� 1 ไดโดยไมตองผสมพนธกบเพศผ ตวออนจะลอกคราบภายในไขเปนตวออนระยะท� 2 ไสเดอนฝอยระยะน2จะออกจากไขลงสดนและเขาทาลายรากพชตอเน�อง รวมวงจรชวตจากตวออนระยะท� 2 ถงตวออนระยะท� 2 อกรน ใชเวลาเพยง 3-4 สปดาหเทาน2น ดงน2น การท�ไสเดอนฝอยแพรพนธไดงายจงเพ�มปรมาณเช2อในดนไดสง ทาใหความเสยหายของโรครากปมมความรนแรง (นชนารถ ต2งจตสมคด, 2550)

ลกษณะอาการของโรครากปม เม�อถอนตนพรกจะพบรากเปนปมปม สาเหตจากไสเดอนฝอยดดกนน2 าเล2 ยงของพชบรเวณทอน2 าทออาหาร มผลทาใหเซลลของพชบรเวณท�ถกทาลายแบงตวผดปกต เกดเปนเซลลขนาดใหญ ไปปดก2นทางเดนน2 าและแรธาตอาหารจากรากไปเล2ยงลาตนสวนเหนอดน ทาใหพรกแสดงอาการเห�ยวเฉา แคระแกรน ทรดโทรมหรอแหงตายในท�สด (สรศกด@ มณขาว และคณะ, 2552)

4

2. ไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita)

2.1 การจดอนดบหมวดหม ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita Chitwood มช�อเดมวา Oxyuris incognita และ M. incognita var. acrita Chitwood, 1949 (สบศกด@ สนธรตน, 2538) การจดอนดบหมวดหม มดงน2 Phylum Nematoda Class Heteroderidae Order Tylenchida Family Meloidogynidae Genus Meloidogyne

Species M. incognita

2.2 วงจรชวตและลกษณะสณฐานวทยา

ไสเดอนฝอยรากปมมวงจรชวตแบงออกเปน 2 ระยะ ดงน2 1. ระยะหากนเปนอสระ

ระยะไข เร� มจากไขเซลลเดยวท�มลกษณะยาวร ผวเรยบ ใส ขนาดประมาณ 0.04x0.08 มลลเมตร ซ� งอยเปนกลมจานวนหลายรอยฟอง โดยมสารเหนยวคลายวน (gelatinous matrix) หอหมอย มองเหนเปนกอนสน2 าตาลเรยกวา กลมไข (egg mass) ตดอยภายนอกราก ไขจะพฒนาการโดยแบงเซลลไปเร�อยๆ จนเปนตวออนระยะท� 1 อยในไข และมการลอกคราบ (molting) ภายในไข 1 คร2 ง กลายเปนตวออนระยะท� 2 เม�อไดรบความช2นมากพอ ไขจะฟกตวออนระยะท� 2 ออกมา (Taylor and Sasser, 1978)

2. ระยะเปนปรสต เร�มจากตวออนระยะท� 2 โดยตวออนระยะน2จะออกจากไขแลวอยในดน มชวตเปนอสระ เคล�อนท�ระหวางฟลมน2าและผวดน ตวออนระยะน2 มอาหารสะสม ไดแก ไขมน 43% โปรตน 23-24% อยในเซลลของลาไสเลก (พลลภา กฤษณไพบลย, 2534) ระยะน2 เปนระยะท�เร�มทาลายพช (infective stage) โดยเคล�อนท�ระหวางฟลมน2 าเขาหารากพช บรเวณใกลปลายราก โดยอาศยสารซมจากราก (root exudate) ในการดงดดเขาไปหา แลวใชหลอดดดอาหาร (stylet) แทงลงไปในเซลลช2นคอรเทกซ (cortex) ของราก สวนหวแทงลงลกไปถงเซลลไพรไซเคล (pericycle) และเคล�อนท�เขาไปในราก โดยขนานลาตวไปกบแนวราก ในระยะแรกๆจะฝงหลอดอาหารเขากบเซลลพช ซ� งเปนเซลลท�ตอกบเซลลของทอน2 าทออาหาร ไสเดอนฝอยจะดดกนน2 าเล2 ยงและสรางน2 าลายไปกระตน

5

เซลลพชบรเวณรอบๆหวไสเดอนฝอย 5-9 เซลล ใหมขนาดโตข2นเปนเซลลยกษ (giant cells) เซลลยกษจะทาหนาท�เปนท�พกน2 าเล2 ยงท�ซมมาจากเซลลขางเคยง โดยพบวา nuclei และ nucleoli ของเซลลยกษมขนาดใหญกวาเซลลปกต ไซโตพลาสซมภายในเขมขนมากข2 น โปรตนใน ไซโตพลาสซมมมากกวาในเซลลปกต 10 เทา นอกจากน2 เซลลท�อยรอบๆยงมการแบงตวมากผดปกต (hyperplasia) จงทาใหรากบวมออก ไสเดอนฝอยมการลอกคราบอก 3 คร2 งในรากพช หลงจากลอกคราบคร2 งท� 3 ตวออนเพศเมยมลาตวพองออกเปนถง (saccate from) ลาตวเอยงทามมกบราก สวนกนถกดนออกมาอยใกลผวราก ทาใหรากบรเวณน2นขยายใหญเกดเปนปม ตวเตมวยเพศเมยสรางกลมไขออกมานอกราก โดยไขถกปลอยออกมารวมกนอยในถงไข ซ� งมประมาณ 300-s,ttt ฟอง ระยะเวลาเร�มจากเกดไขจนกระท2งเปนตวเตมวยและออกไขอกคร2 ง จะใชเวลาแตกตางกนข2 นอยกบ อณหภม ความช2น ชวงแสง ชนดของพชอาศย สวนเพศผกระบวนการ metamorphosis เม�อโตเตมวยกออกจากรากพชมชวตอยอยางอสระ รวมวงจรชวตประมาณ 3-5 สปดาห (Taylor and Sasser, 1978) 3. เช0อราปฏปกษควบคมไสเดอนฝอย

การนาจลนทรยมาใชในการปองกนกาจดศตรพชเปนปจจยหน�งท�สามารถลดหรอทดแทนการใชสารเคมทางการเกษตร ซ�งปจจบนเปนท�ยอมรบกนวาสารเคมกาจดศตรพชท�ตดมาหรอตกคางอยในพชผลทางการเกษตร มผลตอสขภาพอนามยของบคคลและตอส�งแวดลอม เช2อราจดเปนจลนทรยชนดหน� งท�นามาใชควบคมไสเดอนฝอยศตรพชโดยชววธ เน�องจากเปนศตรธรรมชาตของไสเดอนฝอย ท�เรยกวา เช2อราปฏปกษ โดยสามารถแบงกลมตามลกษณะการเขาทาลายไสเดอนฝอย ไดเปน 3 กลมหลกๆ คอ กลมท�สรางกบดกไสเดอนฝอย กลมท�เปนปรสตภายในของไสเดอนฝอยท�ตวเตมวยไมไดอยน�งกบท� และกลมท�เปนปรสตของไขและตวเตมวยท�มรปรางเปนถง เหตท� เ ช2 อราปฏปกษเหลาน2 ไดรบความสนใจและมการศกษาอยางลกซ2 ง สบเน�องมาจากศกยภาพในการควบคม ท�มแนวโนมสงวาจะสามารถควบคมไดสาเรจ โดยเฉพาะอยางย�งเช2อราปฏปกษตอไขและไสเดอยฝอยท�มรปรางเปนถง นอกจากน2 เช2อราปฏปกษยงสามารถพบไดในทกกลมหลกของเช2อราท2งหมด เช2อราท�สรางกบดกสวนใหญสามารถดารงชวตในรป saprophyte ในดน สวนเช2อราท�เปนปรสตภายในมกดารงชวตแบบ obligate parasite ในไสเดอยฝอย และยงพบไดท�วไปในดนธรรมชาตทกประเภท (Nordbring-Hertz et al., 2006)

6

3.1 เช0อรากบดกไสเดอนฝอย (nematode-trapping fungi)

เช2 อรากบดกไสเดอนฝอย (nematode-trapping fungi) หรอบางคร2 งเรยกวา predatory fungi (Stirling, 1991) เช2อราปฏปกษกลมน2 จะมโครงสรางกบดกหลากหลายรปแบบ รปแบบของโครงสรางกบดกข2นอยกบ ชนด สายพนธ หรอสภาพแวดลอมท2งท�มชวตและไมมชวต โดยสภาพแวดลอมท�มชวตท�สาคญท�สดคอ ตวไสเดอนฝอยท�ยงมชวตอย ซ� งจะกระตนใหเช2อราสรางกบดกแบบตางๆโดยการไปสมผสกบเสนใยของเช2อราปฏปกษ ความสามารถในการดกจบไสเดอนฝอยข2นอยกบ การพฒนาโครงสรางเฉพาะของเสนใยเช2อราปฏปกษ โดยจะมการพฒนาโครงสรางของเสนใยแบบพเศษ เชน เสนใยเปนตาขาย ปมปม ก�งกาน หรอวงแหวน ไสเดอนฝอยจะถกจบโดยสารเหนยวหรอวธกล ดงท�แสดงรปแบบของกบดกไวในตารางท� 1 และพบวาเช2อราสกลเดยวกน แตตางสปชยกนกอาจมรปแบบของกบดกตางกนได เชน Arthrobotrys oligospora, A. conoides, A. musiformis และ A. superba ใชเสนใยแบบตาขายเปนกบดก แต A. dactyloides ใชเสนใยท�มลกษณะเปนวงแหวนในการดกจบ กบดกไมจาเปนตองมพฒนาการเตมรปแบบกสามารถจบไสเดอนฝอยได เช2อราบางชนด เชน A. superba จบไสเดอนฝอยดวยก�งท�มสารกาวเหนยวหรอตาขายท�ยงไมเจรญเตมรปแบบ นอกจากน2สปอรท�เพ�งงอกกอาจดกจบไสเดอนฝอยได เม�อปลอยใหงอกเองตามธรรมชาต เช2อรา A. oligospora ท�กลายพนธนอกจากจะสรางสปอรท�มสารกาวเหนยวต2งแตอยบนกานชสปอร ยงสรางกบดกจานวนมากบนเสนใยดวย แสดงถงความสามารถในการเพ�มประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยในธรรมชาต และยงสามารถเปนปรสตของ เช2อราชนดอ�น โดยการพนและรดรอบเสนใยของเช2อราชนดอ�น แสดงใหเหนถงความสามารถในการปรบตวใหมชวตรอดในสภาพแวดลอมท�หลากหลาย (Nordbring-Hertz et al., 2006)

7

ตารางท� 1 กลไกการเปนปฏปกษของเช2อราควบคมไสเดอนฝอย

ชนดของกลไก ชนดของเช0อราปฏปกษ ช0น (Class)

ตาขายเสนใยท�มสารกาวเหนยว (adhesive nets)

Arthrobotrys oligospora

Arthrobotrys conoides

Arthrobotrys musiformis

Arthrobotrys superba

Duddingtonia flagrans

Deuteromycetes

ก�งกานเสนใยท�มสารกาวเหนยว (adhesive branches)

Monacrosporium

gephyropagum Deuteromycetes

ตมเสนใยท�มสารกาวเหนยว (adhesive knobs)

Monacrosporium ellipsosporum Monacrosporium haptotylum

Deuteromycetes

วงแหวนแบบรดตวได (constricting rings)

Arthrobotrys dactyloides Arthrobotrys brochopaga

Deuteromycetes

ตมและสปอรท�มสารกาวเหนยว (adhesive knobs and adhesive spores)

Nematoctonus concurrens Basidiomycetes

สปอรท�มสารกาวเหนยว (adhesive spores)

Nematoctonus leiosporus Drechmeria coniospora Hirsutella rhossoliensis

Basidiomycetes Deuteromycetes

ไสเดอนฝอยกนเขาไป (ingested spores)

Harposporium anguillulae Deuteromycetes

สปอรท�วายน2าได (zoospores) Catenaria anguillulae Haptoglossa dickii

Chytridiomycetes Oomycetes

เสนใยท�มสารกาวเหนยว (adhesive hyphae)

Stylopage hadra Cystopage cladospora

Zygomycetes

หยดสารพษ (toxic droplets) Pleurotus ostreatus Basidiomycetes เสนใยโปงพองท�ใชแทงเขาไปในไสเดอนฝอย (appressoria)

Pochonia chlamydosporia Deuteromycetes

ท�มา : ดดแปลงจาก Nordbring-Hertz และคณะ (2006)

8

3.2 เช0อราจาพวกปรสตภายใน (endoparasites)

เช2อราจาพวกปรสตภายในตอไสเดอนฝอยสามารถพบไดท�วไปในธรรมชาต เช2อราปรสตภายในเขาทาลายไสเดอนฝอยดวยสปอร โดยการเกาะตดกบผวหนงของไสเดอนฝอยห ร อ ก า ร ท� ไ ส เ ด อ น ฝ อ ย ก น ส ป อ ร เ ขา ไ ป แ ล ะ เ จ ร ญ อ า ศย อ ย ภ า ย ใ น ซ� ง ไ ดแ ก เ ช2 อ ร า Drechmeria coniospora, Hirsutella rhossoliensis และ Catenaria anguillulae เช2อราปรสตภายในสามารถเพ�มจานวนไดอยางรวดเรวในไสเดอนฝอย พบวา D. coniospora สรางสปอรไดถง 1,000 สปอรจากไสเดอนฝอย 1 ตว ในขณะท� H. rhossoliensis สรางสปอรได 100-1,000 สปอรจากไสเดอนฝอย 1 ตว โดยสปอรของเช2อราท2ง 2 ชนดน2 มหนอ (bud) ซ� งมสารกาวเหนยวสาหรบยดตดกบตวไสเดอนฝอย สวน Harposporium anguillulae จะสรางสปอรรปรางแบบพเศษท�เม�อไสเดอนฝอยกลนเขาไป สปอรจะไปตดอยท� oesophagus ของไสเดอนฝอยและเร�มเขาทาลาย ณ จดน2น ขณะท� C. anguillulae จะเขาทาลายไสเดอยฝอยดวย zoospore ท�สลดหาง และเกาะยดตดกบผวของไสเดอนฝอย (Nordbring-Hertz et al., 2006) เช2อราท�ปรสตภายในลาตวของไสเดอนฝอยศตรพชตลอดชพจกรของรา เชน C. auxiliaries ซ� งเปนปรสตไสเดอนฝอยเพศเมยของ Heterodera schachtii, H. avenae และ Globodera สวนเช2อรา Nematophthora gynophila เขาทาลายอยภายในลาตวของไสเดอยฝอย Heterodera carotae, H. cruciferae, H. goettingiana, H. schachtii และ H. trifolii โดยปรมาณสปอรของเช2อราจานวนมากจะอยภายในลาตวของไสเดอนฝอย ทาใหลาตวบวมเตง ท�อณหภม 13 อ ง ศ า เ ซ ล เ ซ ย ส ส ป อ ร ส า ม า ร ถ อ ย ใ น ด น ไ ดน า น ถ ง 5 ป เ น� อ ง จ า ก ส ป อ ร ม ผ นง ห น า (พลลภา กฤษณไพบลย, 2534)

3.3 เช0อราท�ทาลายไขไสเดอนฝอย (egg-parasitic fungi) เช2อรากลมน2 เปนปรสตตอไสเดอนฝอยไดดในขณะท�ไสเดอนฝอยไมเคล�อนท� เชน

ในระยะไข (Nordbring-Hertz et al., 2006) โดยเช2อใชเสนใยแผขยายรอบผนงของไข ตอมาจะแทงทะลเขาไปภายในไขและทาลายไขท�กาลงเจรญเปนตวออนระยะตางๆ เช2อราท�พบเปนชนดแรก คอ Verticillium chlamydosporium ตอมาพบอกหลายชนด เชน V. bulbillosum, Mortierella nana, Acremonium bacillosporum, Helicoon farinosum และ Paecilomyces lilacinus ซ� งสามารถเขาทาลายไขของไสเดอนฝอย Meloidogyne incognita, Globodera papillida และ G. rostochiensis เช2อราบางชนดจะเขาทาลายทางชองเปดของอวยวะสบพนธ หรอสวนคอท�ฉกขาด จากน2นจะเจรญและแผเสนใยลอมรอบไขท�อยภายในลาตวของไสเดอนฝอยอกทหน� ง โดยเช2อรา Verticillium เปนเช2 อท�สาคญชนดหน� งในกลมน2 ซ� งมการบนทกไววาเช2 อสามารถเขาทาลายถงหรอไข

9

ไสเดอนฝอย Meloidogyne, Globodera และ Heterodera สวนเช2อรา P. lilacinus ท�พบกระจายอยท�วไปโดยเฉพาะอยางย�งในเขตอบอน โดยเปนเช2อราท�มสายพนธใกลชดกบเช2อรา Penicillium เปน สายพนธสาคญสายพนธหน�งท�ทาใหเกดความสนใจในการนามาใชควบคมไสเดอนฝอยโดยชววธ (Stirling, 1991) 4. การแยกเช0อราปฏปกษและการทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอย ภมรทพย อกษรทอง (ม.ป.ป.) สมเกบตวอยางดนจากแปลงปลกพชบนท�สง ภายในศนยพฒนาจานวน 8 ศนย ของมลนธโครงการหลวง ไดแก ศนยพ ฒนาหนองหอย แมปนหลวง ขนวาง มอนเงาะ แมแฮ ปางดะ หวยน2 ารน และอางขาง จากน2นนาดนมาแยกหาเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอย ดวยวธ Scattering method พบเช2อรา Monacrosporium bembicodes (Drechsler) Subram. จากศนยพฒนาหนองหอยและแมปนหลวง เช2อรา M. aphrobrochum

(Drechsler) Subram. จากปางดะ เช2อรา Arthrobotrys oligospora Fres. จากขนวาง มอนเงาะ แมแฮ ปางดะ และหวยน2 ารน เช2อรา A. conoides Drechsler จากหนองหอย แมปนหลวง และอางขาง สวนศนยพฒนาท�มท2ง A. oligospora Fres. และ A. conoides Drechsler ไดแก ศนยพฒนาปางดะ หวยน2ารน และขนวาง

กนกพรรณ โสมาศร (2544) ศกษาศกยภาพของเช2อราในดนสาหรบควบคมไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ในมะเขอเทศ โดยแยกเช2อราจากกลมไขไสเดอนฝอยรากปมและตวอยางดนจากแปลงปลกมะเขอเทศและพชผก ในเขตภาคตะวนออกเฉยงเหนอตอนบน โดยนาเช2อราท�แยกไดท2งหมด 193 ไอโซเลท มาทดสอบประสทธภาพในการเปนปรสตตอกลมไข (egg mass) ไข (egg) และตวออนระยะท� 2 (juvenile stage 2 หรอ J2) ของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita พบเช2อราท�มประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปมไดด คอ Curvularia lunata (EKK 0101), Paecilomyces lilacinus (EKK 0503), Penicillium sp. (SKK 3003 และ SUD 0806) เม�อนาเช2อราดงกลาวและเช2 อราจากสานกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต (สวทช.) คอ P. lilacinus และ T. harzianum ไปทดสอบประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปมในมะเขอเทศพนธสดา ท�ปลกในกระถางในสภาพเรอนทดลอง พบวา การเจญเตบโตของมะเขอเทศ (ความสง น2 าหนกสด น2 าหนกรากสด) ความรนแรงการเกดปม (คดเปนเปอรเซนตตอระบบราก) และจานวน J2 ในดนปลกมะเขอเทศ ซ� งปลกเช2อราแตละไอโซเลทในอตราตางๆรวมกบไสเดอนฝอยรากปม มความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญย�ง โดยเช2อรา C. lunata (EKK 0101) ทาใหมะเขอเทศมการเจญเตบโตดท�สด เช2อรา Penicillium sp. (SKK 3003) ทาใหเกดรากปมนอยท�สด

10

และพบจานวน J2 ในดนนอยท�สดจากเช2อรา C. lunata (EKK 0101) และ Penicillium sp. (SUD 0806)

ยวด ชประภาวรรณ และคณะ (2550) สารวจและเกบรวบรวมเช2อราในดนจากแหลงปลกพชท�มการระบาดของโรครากปมจากพช 17 ชนด ใน 31 แปลงปลกในเขตภาคตะวนเฉยงเหนอตอนลาง สามารถแยกเช2อราจากกลมไขไสเดอนฝอยได 618 ไอโซเลท เชน Pochonia

chlamydosporia var. catenulata, P. chlamydosporia var. chlamydosporia, Penicillium digitatum, P. purpurogenum, Paecilomyces lilacinus, Fusarium sp., F. oxysporum, Aspergillus niger และ A. parasiticus และแยกเช2อราจากดนได 1,207 ไอโซเลท เชน Lecanicillium tenuipes, Talaromyces

flavus, Penicillium marneffei, P. lilacinus, Botrytis sp., Metarhizium anisopliae, P. spinulosum, P. frequentans, P. fungiculosum, P. nigrican, P. islandicum, Trichoderma sp., T. harmatum, Rhizopus sp., A. niger และ Aureobasidium sp. เม�อนาเช2อราท2งหมด 1,825 ไอโซเลท มาทดสอบการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ของไสเดอนฝอยรากปม (M. incognita) สามารถคดเลอกเช2อราไดจานวน 60 ไอโซเลท มาทาการทดสอบการเขาทาลายไข (eggs) ไสเดอนฝอยรากปม ผลการศกษาพบวาเช2อราสามารถเขาทาลายไขเฉล�ยต2งแต 1.60-84 เปอรเซนต การฟกไขลดลงต2งแต 10.31-53.90 เปอรเซนต และสามารถควบคมการเกดปมท�รากถ�วเขยวไดต2งแต 0-95.83 เปอรเซนต จากการทดลองดงกลาว สามารถคดเลอกเช2อราท�มประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปมไดดจ านวน 11 ไอโซเลท ไดแก Lecanicillium tenuipes (SYT14-11 และ SNM77-06), Pochonia chlamydosporia var. catenulata (EUB02-08), P. chlamydosporia var. chlamydosporia (EUB02-02, EYT11-09 และ EUB26-01), Talaromyces flavus (SSK17-07), Penicillium marneffei (SUB01-13), Paecilomyces. lilacinus (SSR21-09) และเช2อราท�ยงไมสามารถบงบอกชนดไดอก 2 ไอโซเลท ไดแก ไอโซเลท ESR41-06 และ SSR24-09

Cabanillas และคณะ (1989) นาเช2อรา Paecilomyces lilacinus จานวน 13 ไอโซเลท จากสถานท�ตางๆ ท�มความแตกตางกนทางลกษณะภมศาสตร มาทดสอบอทธพลของอณหภมท�มตอประสทธภาพของเช2อในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ในมะเขอเทศ พบวาเช2อรา P. lilacinus ท�ควบคม M. incognita ไดดท�สด คอ ไอโซเลทจากประเทศเปร และ ไอโซเลทท�ผสมจากสถานท�ตางๆรวมกน และพบวาเช2 อเจรญไดดท�สดท�อณหภม 24 ถง 30 องศาเซลเซยส โดยวดจากน2 าหนกแหงของเสนใย เช2อเจรญไดนอยท�สดท�อณหภม 12 ถง 36 องศาเซลเซยส เม�ออณหภมของดนสงข2นจาก 16 ถง 28 องศาเซลเซยส จะพบการเขาทาลายของ M. incognita เพ�มสงข2น เชนเดยวกบการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ของเช2อ P. lilacinus ท�เพ�มสงข2นตามไปดวย ผลการทดสอบยงพบอกวา การใชเช2อ P. lilacinus ในการควบคม M. incognita

11

สงผลใหการเกด gall ท�ราก อาการ necrosis และพฒนาการของไขไสเดอนฝอยลดลง และสงเสรมการเจรญของสวนยอด

Zhang และคณะ (1996a) สารวจพบเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยชนดใหม 2 ชนด คอ Monacrosporium guizhouense และ Monacrosporium yunnanense จากท2งหมด 22 ชนด ท�แยกไดจากตวอยางดนและโรครากปมในบางมณฑลของประเทศสาธารณรฐประชาชนจน

Zhang และคณะ (1996b) สารวจเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยในดนจากภเขา Fanjing มณฑล Guizhou ประเทศสาธารณรฐประชาชนจน โดยการนาตวอยางดนท�ปะปนไปดวยรากพชท�ยอยสลาย วางลงบนอาหารเล2 ยงเช2อ 2% corn meal agar (CMA) โดยใชไสเดอนฝอย Paragrellus redivius ซ� งเปนไสเดอนฝอยหากนอสระ (free-living nematode) จานวน 1,000 ตว เปนเหย�อลอ โดยรายงานการพบ Arthrobotrys obovata ซ� งเปนเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยชนดใหม จากวธการคลายคลงกนน2 Liu และ Zhang (2003) รายงานการคนพบเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยชนดใหม Dactylella shizishanna ท�ไดจากการสารวจดนบนภเขา Shizi สวน Su และคณะ (2005) รายงานการคนพบเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยชนดใหม Monacrosporium multiseptatum

ท�ไดจากสารวจดนในมณฑลยนาน ขณะท� Yang และคณะ (2005) รายงานการคนพบเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยชนดใหม Dactylellina illaqueata ท�ไดจากสารวจดนในมณฑลยนาน และไดทาการวเคราะห phylogenetic analysis ดวย 18S rDNA ของเช2อท�พบ เพ�อยนยนการคนพบเช2อชนดใหม ตอมา Zhang และคณะ (2005) สารวจดนในมณฑลยนานตะวนตก พบเช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยชนดใหม คอ Dactylella zhongdianensis เม�อนาไปทดสอบศกยภาพการควบคมไสเดอนฝอย บนอาหาร Water Agar (WA) โดยใชไสเดอนฝอยศตรพช 2 ชนด คอ Bursaphelenchus xylophilus และ Meloidogyne arenaria รวมกบ free-living nematode 1 ชนด คอ P. redivivus พบวา Dactylella zhongdianensis สามารถควบคมไสเดอนฝอยท2ง 3 ชนดดงกลาวขางตนได 75.6%, 80.3% และ 78.5% ตามลาดบ ซ� งแสดงใหเหนวาเช2อรา Dactylella zhongdianensis ไมไดเฉพาะเจาะจง (host specific) ตอการเขาทาลายไสเดอนฝอยชนดใด

Amer-Zareen และคณะ (2000) แยกเช2อราท�เปนปรสตของไสเดอนฝอยรากปม โดยสารวจและเกบตวอยางจากแปลงปลกพชในประเทศปากสถาน ท�แสดงอาการโรครากปม จานวน 150 ตวอยาง มาแยกเช2อจากกลมไข จากไข จากตวเตมวยเพศเมยของไสเดอนฝอยรากปม และจากดนในแปลงปลก สามารถแยกเช2อราท�เปนปรสตของไสเดอนฝอยรากปมไดท2 งหมด 28 ชนด จาก 16 สกล โดยพบเช2อท�ยงไมเคยมการรายงาน คอ Aspergillus terreus. A. nidulans, A. ramarri และ Fusarium anthophellum นอกจากน2 ยงพบเช2อท�เปนการรายงานคร2 งแรกในปากสถาน ไดแก Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, Aspergillus sp., Acremonium butyri,

12

Alternaria alternata, Catenaria sp., Cephalosporium sp., Cladosporium cladosporoides, Cladosporium sp., Cunninghamella elegance, Curvularia lunata, Fusarium exosporium, Fusarium sp., Ulocladium atrum, Paecilomyces lilacinus, Arthrobotys sp. และ เช2อราท�ไมสรางสปอร 1 ชนด

Sharon และคณะ (2001) นาเช2อรา Trichoderma harzianum มาทดสอบการควบคมไสเดอนฝอยรากปม Meloidogyne javanica พบวา T. harzianum ทาให gall ท�รากลดลง และยงทาใหน2าหนกสดของตนมะเขอเทศท�ถก M. javanica เขาทาลายแลวเพ�มมากข2น นอกจากน2 ยงไดทาการทดสอบเปรยบเทยบสายพนธ T. harzianum สายพนธ wild-type strain (WT) กบสายพนธ

proteinase Prb1-transformed line (P-2) พบวาท2 งสองสายพนธสามารถควบคมไข และ second-stage juveniles (J2) ของไสเดอนฝอยรากปมไดดพอกน แตสายพนธ P-2 จะควบคมกลมไขไดดมากข2น

Li และคณะ (2003) รายงานการคนพบเช2อรา Monacrosporium janus ซ� งเปน เช2อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยแบบสรางกบดก (nematode-trapping hyphomycete) สามารถควบคมเช2อราสาเหตโรคพช Sclerotinia sclerotiorum ซ� งทาใหเกดความเสยหายอยางรนแรงในถ�วเหลอง โดยพบวา M. janus เปน mycoparasite ท�มกลไกการควบคมโดยใชเสนใยไปพนรอบเสยใยของ

S. sclerotiorum และเจรญปกคลมโครงสราง sclerotia ของ S. sclerotiorum Hao และคณะ (2004) สารวจเช2อราในน2 าท�เปนปฏปกษตอไสเดอนฝอย บรเวณ

ทะเลสาบ Dianchi ประเทศสาธารณรฐประชาชนจน โดยนาไมท�จมอยในน2 ามาแยกเช2อ และนาตะกอนดนบรเวณผวน2 ามาวางลงบนอาหารเล2 ยงเช2อ CMA ใชไสเดอนฝอย Paragrellus redivius เปนเหย�อลอ ซ� งพบเช2อรา Dactylella ชนดใหม คอ Dactylella dianchiensis ตอมา Hao และคณะ (2005) ศกษานเวศวทยาของ nematode-trapping hyphomycetes ในน2 าทางภาคตะวนตกเฉยงใตของประเทศ โดยเกบตวอยางตะกอนดนใตแหลงน2 าตางๆและสระบวกวา 1,000 ตวอยางมาแยกเช2อ พบ nematode-trapping hyphomycetes สวนใหญท�ระดบความลกของน2 า 20 เซนตเมตร และไมพบเลยท�ระดบความลกของน2 า 4 เมตร โดยพบ nematode-trapping hyphomycetes ถง 35 ไอโซเลท สวนมากไดแก Arthrobotrys oligospora, A. musiformis, Monacrosporium thaumasium และ M. longiphorum โดยพบวาเปนเช2อท�สรางกบดกแบบ adhesive networks มากท�สด

Khan และคณะ (2006) ทดสอบการใชเช2 อรา Paecilomyces lilacinus และ Monacrosporium lysipagum ในการควบคมไสเดอนฝอย 3 ชนด คอ ไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne javanica) ในมะเขอเทศ ไสเดอนฝอย cereal cyst nematode (Heterodera avenae) ในขาวบารเลย และไสเดอนฝอย burrowing nematode (Radopholus similis) ในกลวยท�เพาะเล2ยง

13

เน2อเย�อ (tissue culture) ทาการทดสอบการควบคมโดยใชเช2อแตละชนดและใชเช2อท2งสองรวมกน ผลการทดสอบพบวา การเกดปมในมะเขอเทศลดลง 62% ตวออนระยะ juveniles ของ M. javanica ลดลง 94% และ cyst ท�เกดจาก H. avenae ลดลง 65% จากการใชเช2อท2งสองรวมกน สวนการควบคม R. similis พบวาถาใชเช2อ Monacrosporium lysipagum อยางเดยวสามารถควบคมได 86% และควบคมได 96% เม�อใชเช2อท2งสองรวมกน

Kiewnick และ Sikora (2006) ทดสอบการใชเช2อรา Paecilomyces lilacinus strain 251 (PL251) ซ� งเปนสายพนธท�ทาการจาหนายในเชงพานชย ในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม Meloidogyne incognita ในมะเขอเทศ พบวา PL251 สามารถลดการเกด gall ท�ราก 66% ลดจานวนกลมไข (egg mass) 74% และลดจานวนไสเดอนฝอยรากปมบรเวณราก 71% นอกจากน2ยงพบวาการควบคมจะไดผลมากนอยเพยงใด ข2นอยกบความเขมขน conidia ของ PL251

Sun และคณะ (2006) แยกเช2อราจากไขและตวเตมวยเพศเมยของไสเดอนฝอย Meloidogyne spp. ท�ไดจากการสารวจรากพช และดนท�พบการเขาทาลายของไสเดอนฝอยในประเทศสาธารณรฐประชาชนจน สามารถแยกเช2อราไดท2 งส2น 455 ไอโซเลท จาก 24 genus ซ� งไดแก Paecilomyces lilacinus (49.3% จากไอโซเลทท2งหมด), Fusarium spp. (7.9%), Pochonia

chlamydosporia (6.9%), Penicillium spp. (5.7%), Aspergillus spp. (3.2%) และ Acremonium spp. (2.8%) นอกจากน2 ยงพบ actinomycetes 52 ไอโซเลท (10.3%) โดยพบวาเปนเช2 อราและ actinomycetes ท�เปนปฏปกษตอไขไสเดอนฝอย ซ� งสงผลตอการฟกไขและการเคล�อนท�ของตวออนไสเดอนฝอยท2งส2น 350 ไอโซเลท โดยม 29.1% ท�เปนปรสตตอไขไสเดอนฝอยมากกวา 90% หลงทดสอบได 4 วน นอกจากน2 ยงพบวาเช2อราและ actinomycetes จานวน 17 ไอโซเลท ทาใหการฟกไขของไสเดอนฝอยต�ากวา 10% และ 3 ไอโซเลท ยบย 2งการฟกไขไดท2งหมด หลงผานไป 7 วน เม�อนาเช2อรา 17 ไอโซเลท และ actinomycetes 4 ไอโซเลท ท�มศกยภาพไปทดสอบในเรอนกระจก พบวาลดการ gall ในรากมะเขอเทศได 13.4-58.9%

Su และคณะ (2007) ศกษาอทธพลของสถานท�และฤดกาลท�มตอ nematode-trapping fungi ในมลปศสตว โดยทาการเกบตวอยางมลปศสตว 660 ตวอยาง จากท�ราบสง 3 แหง ท�มความสงจากระดบน2าทะเลตางกน แถบมณฑลยนานตะวนตก ประเทศจน โดยนามลปศสตว 2-3 กรม มา spread plates กบอาหารเล2ยงเช2อ CMA ใสไสเดอนฝอย Paragrellus redivius เปนเหย�อลอประมาณ 200 ตวตอจานอาหารเล2ยงเช2อ พบ nematode-trapping fungi ท2งหมด 17 species โดยพบเช2 อรากลมหลกๆท�พบจากท�ราบสงท2 ง 3 แหงท� เกบตวอยาง คอ Arthrobotrys oligospora, A. musiformis, Monacrosporium ellipsosporum และ M. thaumasium โดยพบวาเปนเช2อราท�สราง

14

กบดกแบบ adhesive networks มากท�สด นอกจากน2ผลการศกษายงพบ nematode-trapping fungi มากท�สดในฤดรอน รองลงมา คอ ฤดใบไมรวง ฤดใบไมผล และฤดหนาว ตามลาดบ

Sharma และ Pandey (2009) ทดสอบการควบคมไสเดอนฝอยรากปม Meloidogyne incognita โดยชววธ ในพชสมนไพร Withania somnifera โดยใชเช2 อรา Trichoderma harzianum, Paecilomyces lilacinus, Arthrobotrys oligospora และสารสกดสะเดา (Azadiracta indica) เปรยบเทยบกบการควบคมโดยใชสารเคม carbofuran โดยผลการทดสอบตางๆท�ความเช�อม�นทางสถต 95% พบวา gall ท�รากลดลงไดดท�สดเม�อใชเช2อ T. harzianum และสารเคม carbofuran ในการควบคม ตามมาดวย P. lilacinus, A. oligospora และ Neem compound ตามลาดบ การใชเช2อ P. lilacinus ทาใหไดน2 าหนกสด น2 าหนกแหง ความยาวของยอดและรากมากท�สด รองลงมาคอ การใชเช2อ T. harzianum สวนการใชเช2อ A. oligospora แสดงใหเหนวาความยาวของรากเพ�มข2น การใชสารสกดสะเดามสวนชวยในการสงเสรมการเจรญ นอกจากน2 ยงสงเกตพบวา การใชสารเคม carbofuran สวนยอดและรากมน2 าหนกสด รากมน2 าหนกแหง และความยาวราก ดกวาการใชสารสกดสะเดา

Naserinasab และคณะ (2011) ประเมนความสามารถของเช2อ Trichoderma

harzianum สายพนธ BI ในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม Meloidogyne javanica โดยทา Culture filtrates ของเช2อในอตราสวนท�แตกตางกน โดยพบวา ถาอตราสวนของเช2อ T. harzianum สายพนธ BI เพ�มข2น ประสทธภาพในการควบคม M. Javanica กจะเพ�มข2นตามไปดวย

Shamalie และคณะ (2011) ศกษาประสทธภาพของเช2อ Trichoderma viride ท�ผสมกบวสดตางๆท�ใชในการเพาะปลก เปรยบเทยบกบการใชสารเคม Carbofuran ท�มช�อการคาวา Curator® ในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม Meloidogyne spp. ท�เขาทาลายตนใบบวบก Gotukola (Centella asiatica L.) พบวา เช2อ T. viride ท�ผสมกบวสดตางๆท�ใชในการเพาะปลก ท2งการผสมกบปยหมก ผสมกบมลไก ผสมกบปยเคม และท�ผสมกบดน มประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปมดกวาการใชสารเคม Carbofuran อยางมนยสาคญทางสถต

Zakaria และคณะ (2013) ศกษาประสทธภาพของ soil bioagents ในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม Meloidogyne incognita พบวาเช2อรา Verticillium chlamydosporium และsymbiotic แบคทเรย Photorhabdus luminescens มประสทธภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปม ท2งแบบการใชเช2อเด�ยวๆในการควบคม หรอการใชเช2อท2งสองชนดควบคมรวมกน

15

5. การตรวจสอบชนดของเช0อราปฏปกษควบคมไสเดอนฝอยดวยวธชวโมเลกล Ahrén และคณะ (1998) ไดทาการศกษาสายสมพนธของเช2อรา nematode-trapping

fungi และ closely related nonparasitic species จานวน 15 ชนด ไดแก เช2อราในสกล Arthrobotrys, Dactylaria, Dactylella, Monacrosporium, Duddingtonia ซ� งจดเปนกลมท�มบรรพบรษเดยวกน (monophyletic group) โดยทาการเพ�มปรมาณยนในสวน 18S rDNA ดวนเทคนค PCR โดยใช ไพรเมอร คอ NS1, NS8, 18S1rev, 18S2for, 18S2rev, 18S3for, 18s3rev, 18s4for, 18S4rev และ 18S5for เม�อนาผลท�ไดไปตรวจวเคราะหสายสมพนธของเช2อรา สามารถจาแนกไดเปน 3 กลม คอ กลมท�สรางวงแหวนแบบรดตว (constricting rings), กลมท�เปน non-parasitic species และกลมท�สรางสารกาวเหนยว (adhesive) แบบตางๆ (ตาขาย, เสนใย, ตม และ non-constricting rings)

Meyer และคณะ (2005) ศกษาลกษณะสนฐานวทยาและชวโมเลกลของเช2อรา Monacrosporium drechsleri เปรยบเทยบกบเช2อรา Monacrosporium สายพนธอ�นๆ โดยทาการสกด DNA ของเช2อไปทาการเพ�มปรมาณยนในสวน internal transcribed spacers โดยใชคไพรเมอร ITS5 และ ITS4 และยนในสวน elongation factor 1-alpha (EF1-α) โดยใชไพรเมอร 983F, 2218R, 1567RintB, 1577F และ 2212R ตามลาดบ เม�อนาผลท�ไดไปวเคราะหสายสมพนธ พบวาเช2อรา

M. drechsleri มสายสมพนธใกลเคยงกบ M. ellipsosporum Li และคณะ (2006) ศกษาเช2อรา nematode-trapping fungi จานวน 2 ชนด ท�ถก

คนพบข2นมาใหม คอ Dactylellina sichuanensis และ D. varietas ซ� งตรวจสอบจากลกษณะสนฐานและวธการทางชวโมเลกล โดยการสกด DNA ของเช2อไปทาการเพ�มปรมาณยนในสวน small subunit ribosomal DNA โดยใชคไพรเมอร NS1 และ NS4 ยนในสวน large subunit ribosomal DNA โดยใชคไพรเมอร LROR และ LR5 ยนในสวน internal transcribed spacers โดยใชค ไพรเมอร ITS5 และ ITS4 และยนในสวน beta tubulin โดยใชไพรเมอ รBt1A, Bt1B, Bt2A และ Bt2B ภายหลงวเคราะหสายสมพนธแลว พบวาเช2อท2งสองชนดจดอยในตระกล Orbiliaceae Zhang และคณะ (2013) ไดใชเทคนค PCR ในการศกษาความสมพนธของระบบนเวศวทยา ตอความหลากหลายทางพนธกรรมของเช2อรา Arthrobotrys oligospora ท�พบใน ประเทศจน ผลท�ไดพบวา ระบบนเวศวทยามผลเพยงเลกนอยตอการเปล�ยนแปลงลกษณะทาง พนธกรรมของเช2อ

16

วตถประสงค

1. เพ�อสารวจและรวบรวมเช2อราท�มพฤตกรรมเปนปฏปกษตอไสเดอนฝอยรากปม

ในเขตภาคใตของประเทศไทย 2. เพ�อทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอยรากปมท�เขาทาลายพรกของเช2อรา

ท2งในสภาพหองปฏบตการและแปลงทดลอง 3. เพ�อตรวจสอบชนดของเช2อราปฏปกษควบคมไสเดอนฝอยรากปมดวยวธชวโมเลกล 4. เพ�อเกบรวบรวมสายพนธเช2อราจากการวจยในรปของเช2อบรสทธ@

17

บทท� 2 วสด อปกรณ และวธการ

วสดและอปกรณ

1. อปกรณเคร�องแกว ไดแก จานอาหารเล�ยงเช�อ หลอดทดลอง ขวด vial บกเกอร flaskกระบอกตวง haemacytometer แผนสไลด และ cover slip

2. อปกรณในการแยกเช�อ ไดแก เขมเข�ย loop มดผาตด แทงแกวสามเหล�ยม ปากคบ cork borer ตะเกยงแอลกอฮอล และอ�นๆ

3. microtube, pasture pipette, micro pipette, pipettes tip 4. กระดาษกรอง Whatmann เบอร 1 5. หมอน�งความดน 6. ตบมเช�อ 7. ตเข�ยเช�อ 8. ตอบฆาเช�อ 9. เคร�องเขยาผสม (vortex mixture) 10. เคร�องช�งไฟฟาละเอยด (analytical balance) 11. กลองจลทรรศน ชนด compound และ stereo binocular 12. ตเยน 13. ไมโครเวฟ 14. rotary shaker 15. กลองถายรป 16. เคร�อง UV transilluminator 17. วสดและอปกรณการเกษตร ไดแก เมลดพนธพรก กะบะเพาะกลา กระถางพลาสตก

ขนาด 9x7 น�ว ปายพลาสตก ดนผสม พลาสตกคลมแปลง ปยสตร 15-15-15 และ ปยสตร 46-0-0

18. ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita 19. ไสเดอนฝอยกาจดแมลงศตรพช Steinernema carpocapsae

18

อาหารเล�ยงเช�อจลนทรย 1. Potato dextrose agar (PDA) 2. Potato dextrose broth (PDB) 3. Water agar (WA) 4. Martin’s medium 5. Luria-Bertani medium (LB Broth medium)

สารเคมท�ใชในการทดลอง 1. 0.5 เปอรเซนต และ 1 เปอรเซนต sodium hypochlorite (Clorox) 2. 70 เปอรเซนต และ 95 เปอรเซนต ethanol 3. Streptomycin sulfate 4. HgCl2

5. Carbofuran 6. สารปฏชวนะแอมพซลน 7. ฟนอล/คลอโรฟอรม 8. เอธเดยมโบรไมด 9. 2x Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (2 เปอรเซนต CTAB, 100 มลลโมลาร

Tris–HCl, 1.4 โมลาร NaCl, 20 มลลโมลาร EDTA, pH 8)

10. พลาสมด pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA) 11. 1 เปอรเซนต อะกาโรสเจล ใน 0.5x TBE บฟเฟอร 12. QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)

13. QIAprepSpin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 14. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) (Fermentas, Hanover, USA) 15. IPTG (Isopropyl-β-D Thiogalactopyranoside) (Fermentas, Hanover, USA)

19

วธการทดลอง 1. การแยกเช�อราปฏปกษจากตวอยางดน และการทดสอบศกยภาพในการควบคม ไสเดอนฝอย 1.1 การเกบตวอยางดน

ทาการเกบตวอยางดนในแปลงปลกพรกและพชผก จากพ�นท� 10 จงหวดในเขตภาคใตของประเทศไทย ไดแก จงหวดกระบ� ตรง นครศรธรรมราช พงงา พทลง ภเกต ยะลา สงขลา สตล และสราษฏรธาน โดยใชเหลกเจาะดน (soil auger) ขนาดเสนผานศนยกลาง 2.50 เซนตเมตร เจาะลก 20 เซนตเมตร ไมจากดจานวนหลมข�นกบขนาดของพ�นท� ใหไดตวอยางดนบรรจในถงพลาสตกขนาด 30x45 เซนตเมตร บนทกวนท�และสถานท� เกบโดยละเอยด นาดนมาย งหองปฏบตการ จากน�นคลกดนใหท�วเปน composite soil

1.2 การเตรยมไสเดอนฝอยแขวนลอย (nematode suspension) และการแยกเช�อราปฏปกษจากตวอยางดน

เตรยมไสเดอนฝอยแขวนลอย (nematode suspension) เพ�อใชเปนเหย�อลอ โดยตกไสเดอนฝอยกาจดแมลงศตรพช Steinernema carpocapsae นามาใสในน� ากล�นน� งฆาเช�อ กวนเบาๆใหเขากน จากน� นนาดนมาแยกหาเช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยโดยวธ Scattering method (ภมรทพย อกษรทอง, 2545) โดยใชชอนชาตกดน 1 ชอนพน (ประมาณ 3 มลลกรม) วางลงเบาๆตามแนวเสนผานศนยกลางของจานอาหารเล� ยงเช� อ (Petri-dish) ขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร ท�บรรจอาหาร water agar (WA) 1.2% ใช micropipette ดด nematode suspension ท�เตรยมไว ปรมาตร 1 มลลลตร แลวหยด nematode suspension ลงท�ง 2 ดานของแนวดนประมาณดานละ 0.50 มลลลตร โดยหยดเปนแนวยาวประมาณ 2 เซนตเมตร ขนานกบแนวดน และหางจากแนวดนประมาณ 2 เซนตเมตร นาจานแกววางเกบไวในหองปฏบตการท�อณหภมหอง (27-30 องศาเซลเซยส) ตรวจสอบกจกรรมการเปนปฏปกษของ เช�อราตอไสเดอนฝอยทกวนดวยกลองจลทรรศนแบบ compound และ stereo เม�อพบการเปนปฏปกษของเช�อราตอไสเดอนฝอย ทาการบนทกผลและถายรปเกบไว ภายหลงจากท�เช�อราไดรบอาหารเพยงพอจะสราง conidiophore พรอม conidia ใหเตรยมเขมเข�ย (needle) ลนเปลวไฟท�ปลาย เสรจแลวยาย conidiophore พรอม conidia มาทาสไลดก�งถาวรใน lactophenol cotton blue เพ�อจดจาแนกชนดเช�อรา สวน conidia ท�เหลอนามาทาใหเปนเช�อบรสทธ{ โดยวธ single spore isolation หรอ hypha tip isolation ยายไปเพาะเล�ยงบนอาหาร potato dextrose agar (PDA) ท�ผสมกบสเตรปโตมยซนซลเฟต (streptomycin sulfate)

20

ความเขมขน 500 ppm บมเช�อไวท�อณหภมหอง เพ�อใหเช�อราสราง conidia ใหไดจานวนมาก และเกบเช�อบรสทธ{ ไวในหลอดอาหารเอยง PDA สาหรบใชเปน inoculum 2. การแยกเช�อราปฏปกษจากช�นสวนของพชท�จมหรอลอยอยในน�า และการทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอย

2.1 การเกบตวอยางและแยกเช�อราปฏปกษ

ทาการเกบตวอยางช�นสวนของพชท�จมหรอลอยอยในน� า จากพ�นท�ปาสงวนแหงชาตพรควนเครง อ.ชะอวด จ.นครศรธรรมราช พ�นท�ศนยวจยและศกษาธรรมชาตปาพรสรนธร อ.สไหงโก-ลก จ.นราธวาส อางเกบน� าในพ�นท�สวนขวญเมอง อ.เมอง จ.ยะลา และสระบวในพ�นท� อ.หาดใหญ จ.สงขลา โดยเร�มจากการเตรยมจานช�น (moist chamber) เตรยมโดยใชจานอาหารเล�ยงเช�อ ขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร โดยตดกระดาษทชชแบบหนาใหเทากบกระดาษกรองเบอร 1 หลงจากน�นนามาใสจานเล�ยงเช�อ 3-4 ช�น โดยช�นบนสดใชกระดาษกรองเบอร 1 แลวพรมดวยน�ากล�นน� งฆาเช�อ ทกข�นตอนกระทาโดยปราศจากการปนเป� อน (aseptic technique) ทาการเกบตวอยางช�นสวนของพชท�จมหรอลอยอยในน� า ตดใหมความยาว 5 เซนตเมตร ใสในจานช�น ซ� งแตละจานใสตวอยาง 3-4 ช�น ตามความเหมาะสม นามาศกษาตอในหองปฏบตการ หลงจากบมตวอยางช�นสวนของพช 3-4 วน ทาการตรวจหาเช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอย ท�ปรากฏบนตวอยางช�นสวนของพชภายใตกลอง stereo เม�อพบเช�อราทาการจดบนทก และนามาทาสไลดก� งถาวรใน lactophenol cotton blue เพ�อจดจาแนกชนดเช�อรา ทาการแยกเช�อราท�ไดจากตวอยางช�นสวนของพช โดยใชวธ direct isolation ไปเพาะเล�ยงบนอาหาร PDA ท�ผสมสเตรปโตมยซนซลเฟต ความเขมขน 500 ppm บมเช�อไวท�อณหภมหอง เพ�อใหเช�อราสราง conidia ใหไดจานวนมาก และเกบเช�อบรสทธ{ ไวในหลอดอาหารเอยง PDA สาหรบใชเปน inoculum

2.2 การทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอย

นาเช�อราปฏปกษท�ไดจากขอ 2.1 บนอาหาร PDA ท�อาย 3-5 วน ไปทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอย โดยใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 มลลเมตร เจาะบรเวณขอบโคโลนเช�อรา วางช�นวนบนอาหาร WA 1.2% ท�บรรจในจานอาหารเล� ยงเช�อ ขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร โดยวางในแนวเสนผานศนยกลางของจาน ใหหางจากขอบจานเขามาประมาณ 2 เซนตเมตร และใช micropipette ดด nematode suspension ท�เตรยมไว โดยวธการเหมอนขอ 1 โดยดดมาเพยง 1 มลลลตร แลวหยด nematode suspension ลงอกดานท�ตรงขามกบช�นวนเปนแนวยาวประมาณ 2 เซนตเมตร และหางจากขอบจานเขามาประมาณ 2 เซนตเมตร

21

นาจานวางเกบไวในหองปฏบตการท�อณหภมหอง ตรวจสอบกจกรรมการเปนปฏปกษของเช�อราตอไสเดอนฝอยทกวนดวยกลองจลทรรศนแบบ compound และ stereo เม�อพบการเปนปฏปกษของเช�อราตอไสเดอนฝอย ทาการบนทกผลและถายรปเกบไว

3. การแยกเช�อราบรสทธBจากกลมไข (egg mass) ไสเดอนฝอยรากปม และดนรอบราก ตนพรกท�เปนโรครากปม

3.1 การเกบตวอยางตนพรกและดนรอบๆตนพรกท�เกดโรครากปม เกบตวอยางตนพรกและดนรอบๆตนพรกท�เกดโรครากปมได จานวน 6 ตวอยาง

จากแปลงปลกพรกในจงหวดนครศรธรรมราช พทลง ยะลา สงขลา สตล และสราษฏรธาน โดยเกบจากแปลงท�มตนพรกแสดงอาการเหลองหรอแคระแกรน และขดดนบรเวณรอบๆรากพรก ความลกไมเกน 20 เซนตเมตร อยางนอย 500 กรม ใสถงพลาสตก บนทกวนท�และสถานท�เกบโดยละเอยด นาตวอยางมาทดสอบตอท�หองปฏบตการ

3.2 การแยกเช�อราบรสทธBจากกลมไข (egg mass) ไสเดอนฝอยรากปม นาตวอยางรากพรกท�เปนโรครากปมจากขอ 3.1 ลางน� าเบาๆใหสะอาด เข�ยกลมไข

ไสเดอนฝอยรากปมมาทาการฆาเช�อท�พ�นผว (surface sterilization) โดยใสกลมไขลงในภาชนะพเศษท�ทาดวยทอพวซ ขนาดเสนผานศนยกลาง 3 เซนตเมตร สง 1.5 เซนตเมตร ท�ปดสวนปลายทอดวยผาไนลอน (ภาพท� 1) แลวนากลมไขไปแชพรอมเขยาเบาๆในสารละลาย sodium hypochlorite (NaOCl) เขมขน 0.5% โดยปรมาตร นาน 2 นาท ลางดวยน� ากล�นน� งฆาเช�อ 2 คร� งๆละ 2 นาท จากน�นนากลมไขไปวางบนอาหาร WA 1.2% ท�บรรจในจานอาหารเล� ยงเช�อ ขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร บมไวในท�มด ท�อณหภมหอง (ยวด ชประภาวรรณ และคณะ, 2550) เม�อสงเกตเหนเสนใยเช�อราเจรญออกจากกลมไข ใชเขมเข�ยปลายแหลมตดช�นวนบรเวณปลาย เสนใย ไปเพาะเล�ยงบนอาหาร PDA ท�ผสมสเตรปโตมยซนซลเฟต ความเขมขน 500 ppm บมเช�อไวท�อณหภมหอง เพ�อใหเช�อราสราง conidia ใหไดจานวนมาก และเกบเช�อบรสทธ{ ไวในหลอดอาหารเอยง PDA สาหรบใชเปน inoculum

22

ภาพท� 1 อปกรณทอพวซ ท�ใชในการเตรยมกลมไขไสเดอนฝอยรากปม (ก) ลกษณะของทอพวซ ท�ใชในการเตรยมกลมไขไสเดอนฝอยรากปม (ข) กลมไขไสเดอนฝอยรากปมท�บรรจในทอพวซ แลวนาไปลางดวยน�ากล�นน�งฆาเช�อ

3.3 การแยกเช�อราบรสทธBจากดนรอบรากพรกท�เปนโรครากปม นาตวอยางดนจากขอ 3.1 มาผ�งลมใหแหง นาไปรอนผานตะแกรงขนาด 60 mesh

นาดนน� าหนก 10 กรม ผสมกบน� ากล�นน� งฆาเช�อ 90 มลลลตร ท�บรรจในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร นาไปหมนเหว�ยงดวยความเรว 120 รอบตอนาท นาน 30 นาท เจอจางดนแขวนลอยคร� งละ 10 เทา (tenfold serial dilution) ใหไดความเขมขน 10-3 นามาแยกเช�อราโดยวธ spread plate technique โดยดดมา 1 มลลลตร ใสในจานอาหารเล�ยงเช�อ ขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร ท�อบฆาเช�อแลว เทอาหารเล�ยงเช�อ Martin’s medium ท�ผสมสเตรปโตมยซนซลเฟต ความเขมขน 300 ppm ท�อณหภม 45 องศาเซลเซยส และหมนใหดนแขวนลอยกระจายคลกเคลาในอาหารอยางท�วถง นาไปบมไวในท�มด ท�อณหภมหอง เม�อสงเกตเหนเสนใยเช�อราปรากฏบนอาหาร เลอกเกบโคโลนเช�อราท�มลกษณะแตกตางกน (ดดแปลงจาก ยวด ชประภาวรรณ และคณะ, 2550) โดยใชเขมเข�ยปลายแหลมตดช�นวนบรเวณปลายเสนใย ไปเพาะเล� ยงบนอาหาร PDA ท�ผสม สเตรปโตมยซนซลเฟต ความเขมขน 500 ppm บมเช�อไวท�อณหภมหอง เพ�อใหเช�อราสราง conidia ใหไดจานวนมาก และเกบเช�อบรสทธ{ ไวในหลอดอาหารเอยง PDA สาหรบใชเปน inoculum

ก. ข.

23

4. การเตรยมตนกลาพรก และการเพ�มปรมาณไสเดอนฝอยรากปมบรสทธB เพ�อใช ในการทดสอบ

4.1 การเตรยมตนกลาพรก นาเมลดพนธพรกไปเพาะในกระบะเพาะขนาด 27x35 ตารางเซนตเมตร (72 หลม)

ท�บรรจดนผสมน� งฆาเช� อ หลมละ 1 เมลด รดน� าทกวน เม�อครบ 2 สปดาห ใหปยยเรย 46-0-0 จานวน 10 กรมตอตน แลวรดน� าตอทกวนจนอายครบ 1 เดอน จงคดเลอกตนกลาพรกท�มการเจรญเตบโตสม�าเสมอกนไปใชในการทดสอบตอไป

4.2 การเตรยมไสเดอนฝอยรากปมบรสทธB ทาการเตรยมไสเดอนฝอยรากปม ซ� งดดแปลงจากวธการของ กนกพรรณ โสมาศร

(2544) เร�มจากนาตวอยางตนพรกท�เปนโรครากปมท�ไดจากการเกบตวอยางในขอ 3.1 เลอกปมรากท�มกลมไขสน� าตาลของไสเดอนฝอยรากปม ใชปากคบปลายแหลมเลอกเกบกลมไขท�มขนาดใกลเคยงกน ใสในขวด vial ท�บรรจน�ากล�นน�งฆาเช�อ 5 มลลลตร หลอดละ 1 กลมไข นาไปปลกเช�อลงตนพรกท�เตรยมไวในขอ 4.1 ซ� งไดยายตนกลาพรกท�เตรยมไวไปปลกในกระถางขนาด 9x7 น�ว ท�มดนผสมน�งฆาเช�อแลว และมท�รองกนกระถาง เพ�อปองกนการปนเป� อน ทาการปลกเช�อโดยใสกลมไข จานวน 1 กลมไข/ตน ในหลมท�เจาะลกประมาณ 5 เซนตเมตร ใกลกบรากพรก แลวกลบดนฝงกลมไข หลงจากปลกเช�อ 45 วน นารากปมของพรกบางสวนมาเข�ยเอาตวเตมวยเพศเมย ทาการตรวจรอยยนบรเวณสวนกน (perineal pattern) เพ�อเปนการยนยนวาเปนไสเดอนฝอยรากปม M. incognita โดยเตรยมช�นสวนกน จานวน 10 ช�น/สไลด ซ� งมาจากรากพรกตนเดยวกน แลวตรวจภายใตกลองจลทรรศนแบบ compound เปรยบเทยบรอยยนบรเวณสวนกนท�พบกบภาพตวอยางมาตรฐานของ International Meloidogyne Project (IMP) ในหนงสอของ Taylor และ Sasser (1978)

4.3 การเพ�มปรมาณไสเดอนฝอยรากปม เม�อไดไสเดอนฝอยรากปม M. incognita บรสทธ{ แลว นารากและดนปลกท�เหลอ

ไปผสมกบดนน� งฆาเช�อ บรรจลงในกระถางขนาด 9x7 น�ว มท�รองกนกระถาง เพ�อปองกนการปนเป� อน ยายตนกลาพรกท�เตรยมไวมาลงในกระถาง รดน� าวนละ 1 คร� ง ใสปยสตรเสมอ 15-15-15 จานวน 20 กรมตอตนทกๆ 2 สปดาห จนพรกอาย 60 วน ซ� งแสดงอาการรากปมชดเจน ใหทาตามวธการขางตนอกคร� ง ทาเชนน�ไปเร�อยๆ เพ�อใหมปรมาณรากปมเพยงพอสาหรบการทดสอบตอไป

24

5. การทดสอบการเขาทาลายกลมไขไสเดอนฝอยรากปม 5.1 การตรยมกลมไขไสเดอนฝอยรากปม เ ข� ยก ลมไข ท� ม สน� าตาลและขนาดใกลเ คยงกนของไส เ ดอนฝอยรากปม

M. incognita จากรากพรกท�แสดงอาการรากปม ใสในทอนทอพวซ (PVC) ขนาดเสนผานศนยกลาง 3 เซนตเมตร สง 1.5 เซนตเมตร ท�ปดก�นดวยผาไนลอน ลางดวยน� ากล�นน� งฆาเช�อ และแชใน HgCl2

ใน ethanol ความเขมขน 1,000 ppm นาน 2 นาท แลวจงลางดวยน� ากล�นน� งฆาเช�ออก 4 คร� งๆละ 2 นาท (กนกพรรณ โสมาศร, 2544)

5.2 การทดสอบการเขาทาลายกลมไขไสเดอนฝอยรากปม นาเช�อราบรสทธ{ ท�แยกไดจากขอ 1, 2.1, 3.2 และ 3.3 มาเล� ยงบนอาหาร PDA นาน

10-15 วน ใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 มลลเมตร เจาะบรเวณขอบโคโลนเช�อรา ยายช�นวนวางบนกลางอาหาร WA 1.2% ท�บรรจในจานอาหารเล� ยงเช�อ ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 เซนตเมตร นากลมไขไสเดอนฝอยรากปม จานวน 4 กลมไข วางรอบช�นวนเช�อรา โดยมระยะหางจากช�นวนเช�อราประมาณ 1 เซนตเมตร ทาการทดลอง 3 ซ� า นาไปบมไวในท�มด ท�อณหภมหอง นาน 10 วน ตรวจผลการเขาทาลายกลมไขภายใตกลอง stereo เปรยบเทยบกบชดควบคม (control) ซ� งใชช�นวนอาหารท�ไมมเสนใยเช�อรา (กนกพรรณ โสมาศร, 2544) ทาการตรวจกลมเสนใยท�เจรญบนกลมไขและประเมนผลการเขาทาลายกลมไขเปน 3 ระดบ ตามวธการของ ยวด ชประภาวรรณ และคณะ (2550) คอ

ระดบ 1 : ไมพบเสนใยเช�อราเขาทาลายกลมไข (not colonization) ระดบ 2 : พบเสนใยเช�อราเขาทาลายกลมไข แตเสนใยไมปกคลมกลมไขท�งหมด

(colonization) ระดบ 3 : พบเสนใยเช�อราเขาทาลายกลมไข โดยเสนใยปกคลมกลมไขหนาแนน

จนมองไมเหนกลมไข (full colonization)

25

6. การทดสอบการเขาทาลายไขไสเดอนฝอยรากปม 6.1 การตรยมไขไสเดอนฝอยรากปม นาก ลมไข ท� ม สน� าตาลและขนาดใกลเ คยงกนของไส เ ดอนฝอยรากปม

M. incognita แชในสารละลาย sodium hypochlorite เขมขน 1% โดยปรมาตร นาน 3 นาท เพ�อละลายผนงกลมไข ทาใหไขหลดออกมา รนผานตะแกรงขนาด 500 mesh ลางดวยน� ากล�นน� งฆาเช�อ 4 คร� งๆละ 2 นาท เทไขใสบกเกอร และทาสารแขวนลอย (suspension) ใหมความหนาแนนของไขประมาณ 100 ไข/มลลลตร โดยเขยาทกคร� งกอนใชในการทดสอบ (กนกพรรณ โสมาศร, 2544)

6.2 การเตรยมเช�อราบรสทธBสาหรบทดสอบ คดเลอกเช�อราท�มระดบในการเขาทาลายกลมไข ในขอ 4 ท�มคาเฉล�ยต�งแตระดบ

2.5 ข�นไป มาทดสอบการเปนปรสตตอไขไสเดอนฝอยรากปม โดยเล�ยงเช�อราบรสทธ{ ในจานอาหารเล� ยงเช�อ PDA เปนเวลา 10-15 วน เตมน� ากล�นน� งฆาเช�อลงในจานอาหารเล� ยงเช�อ 10 มลลเมตร เขยาเบาๆตรวจนบจานวนสปอรดวย haemacytometer ปรบสปอรแขวนลอยของเช�อรา ใหมความเขมขน 1.5x106 สปอร/มลลลตร เกบไวในขวด vial โดยเขยาทกคร� งกอนใชในการทดสอบ (กนกพรรณ โสมาศร, 2544)

6.3 การทดสอบการเขาทาลายไขไสเดอนฝอยรากปม ดดไขไสเดอนฝอยรากปมท�มความหนาแนน 100 ไข/มลลลตร จานวน 1 มลลลตร

ใสในอาหาร WA 1.2% ท�บรรจในจานอาหารเล� ยงเช�อ ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 เซนตเมตร จากน�นดดสปอรแขวนลอยของเช�อราความเขมขน 1.5x106 สปอร/มลลลตร จานวน 1 มลลลตร ลงไปผสมบนอาหาร หมนจานอาหารไปมาเบาๆ เพ�อใหสปอรและไขไสเดอนฝอยกระจายตวสม�าเสมอท�วท�งจานอาหาร ทาการทดลอง 3 ซ� า นาไปบมไวในท�มด ท�อณหภมหองเปนเวลา 10 วน สงเกตการเขาทาลายของเช�อราเปรยบเทยบกบชดควบคม (control) ท�ไมใสสปอรของเช�อรา ตรวจผลการเขาทาลายไขภายใตกลอง stereo โดยการนบไขท�ถกเช�อราเขาทาลายและจานวนไขท�ฟก เพ�อเปรยบเทยบเปอรเซนตไขท�ถกเช�อราแตละไอโซเลทเขาทาลาย และเปอรเซนตการลดลงของการฟกไข (ยวด ชประภาวรรณ และคณะ, 2550)

26

7. การทดสอบประสทธภาพของเช�อราปฏปกษ ในการควบคมการเกดปมของรากพรก

7.1 การเตรยม inoculum ของเช�อรา นาเช�อราปฏปกษท�มประสทธภาพดท�สด จานวน 2 ไอโซเลท จากการทดสอบ

การเขาทาลายไขไสเดอนฝอยรากปม ในขอ 6.3 และเช0อรากลมกบดกไสเดอนฝอยท�มประสทธภาพในการเขาทาลายไขไสเดอนฝอยรากปมท�ดท�สด จานวน 2 ไอโซเลท มาเล�ยงบนอาหาร PDA นาน 10-15 วน ใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 มลลเมตร เจาะบรเวณขอบโคโลนเช�อรา ยายช�นว นไปเล� ยงบนเมลดขาวฟางท�ผานการน� งฆา เช� อ จ านวน 5 ช�นตอถง บมไวในความมด ท�อณหภมหอง เม�อเช�อราเจรญคลมเมลดขางฟางนาน 20 วน จงนาไปทดสอบในข�นตอนตอไป (ยวด ชประภาวรรณ และคณะ, 2550)

7.2 การตรยมกลมไขไสเดอนฝอยรากปม วธการเตรยมเหมอนในขอ 5.1 แลวจงบรรจกลมไขไวในขวด vial ท�มน� ากล�นน� ง

ฆาเช�อปรมาตร 10 มลลลตร จานวน 5 กลมไข/ขวด เพ�อใชในการทดสอบตอไป 7.3 การเตรยมตนกลาพรก วธการเตรยมเหมอนในขอ 4.1 ทาการคดเลอกตนกลาพรกท�มการเจรญเตบโต

สม�าเสมอกนมาใชในการทดสอบ 7.4 การปลกเช�อราลงบนตนพรก นาดนน�งฆาเช�อ 1.5 กโลกรม ผสมเมลดขาวฟางท�มเช�อราเจรญอย 75 กรม บรรจ

ลงในกระถางขนาด 9x7 น�ว ยายตนกลาพรกท�เตรยมไวมาลงในกระถาง รดน� าวนละ 1 คร� ง เม�อยายตนพรกครบ 7 วน จงใสกลมไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท�บรรจในขวด vial ท�มน� ากล�นน� งฆาเช�อปรมาตร 10 มลลลตร จานวน 5 กลมไข/ตน โดยหยอดลงในหลมท�เจาะลกประมาณ 4 เซนตเมตร ใกลกบรากพรกแลวกลบดน วางแผนการทดลองแบบ CRD แบงการทดลองเปน 7 กรรมวธ กรรมวธละ 20 ซ� า ซ� าละ 1 ตน ไดแก

27

กรรมวธท� 1 : ตนพรกปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม + เช�อราปฏปกษ ไอโซเลทท� 1

กรรมวธท� 2 : ตนพรกปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม + เช�อราปฏปกษ ไอโซเลทท� 2

กรรมวธท� 3 : ตนพรกปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม + เช�อราปฏปกษ กลมกบดกไสเดอนฝอย ไอโซเลทท� 1

กรรมวธท� 4 : ตนพรกปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม + เช�อราปฏปกษ กลมกบดกไสเดอนฝอย ไอโซเลทท� 2

กรรมวธท� 5 : ตนพรกปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม + Carbofuran 2.5 กรม/กระถาง

กรรมวธท� 6 : ตนพรกปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปมอยางเดยว (control) กรรมวธท� 7 : ตนพรกปกตท�ไมปลกเช�อใดๆ (check)

รดน� าวนละ 1 คร� ง และใสปยสตรเสมอ 15-15-15 จานวน 20 กรมตอตน ทกๆ 2 สปดาห หลงปลกเช�อ 60 วน ประเมนความรนแรงในการเกดปม โดยคดเปอรเซนตตามดชนการเกดปมท�ระบบราก ซ� งแบงไดเปน 6 ระดบ ตามวธของ Hussey และ Jansaen (2001) ดงน�

ระดบ 0 : ไมมปม ระดบ 1 : มปมเกดข�นเลกนอย ระดบ 2 : เกดปมนอยกวา 25% ของระบบราก ระดบ 3 : เกดปม 25-50% ของระบบราก ระดบ 4 : เกดปม 51-75% ของระบบราก ระดบ 5 : เกดปมมากกวา 75% ของระบบราก

วเคราะหผลการทดลองโดยการวเคราะหความแปรปรวน (ANOVA) และเปรยบเทยบคาเฉล�ยดวย Duncan’s new multiple rang test (DMRT) ท�ระดบความเช�อม�น 95% (ดดแปลงวธการจาก กนกพรรณ โสมาศร, 2544; ยวด ชประภาวรรณ และคณะ, 2550)

28

8. การจาแนกเช�อราปฏปกษควบคมไสเดอนฝอยรากปมดวยเทคนค PCR

8.1 การเพ�มปรมาณเช�อราในอาหารเล�ยงเช�อ ดดแปลงจากวธการของ Jeewon และคณะ (2002) โดยนาเช�อราปฏปกษควบคม

ไสเดอนฝอยรากปม ท�มประสทธภาพดท�สดในการควบคมการเกดปมของรากพรก จากการทดสอบในขอ 7.4 นามาเล� ยงบนอาหาร PDA จากน�นยายสปอรเด�ยวๆ ของเช�อราไปเล�ยงบนอาหาร PDA บมไวท�อณหภมหอง เปนเวลา 10-15 วน เตรยมสปอรแขวนลอยโดยเตมน� ากล�นน� งฆาเช�อปรมาตร 5 มลลลตร ผสมน�ากล�นและสปอรของเช�อราใหเขากน ใชไมโครปเปตดดสปอรแขวนลอยปรมาตร 1 มลลลตร ใสลง flask ท�มอาหาร Potato Dextrose Broth (PDB) ปรมาตร 50 มลลลตร นาไปเขยาตอท�อณหภมหอง ดวยความเรว 200 รอบตอนาท เปนเวลา 5-10 วน กรองเสนใยของเช�อราดวยกระดาษกรอง Whatmann เบอร 1 ลางสปอรเช� อราดวยน� ากล�นน� งฆาเช�อ ปรมาตรคร� งละ 100 มลลลตร จานวน 2-3 คร� ง เกบเสนใยราท�เตรยมไดไวท�อณหภม -20 องศาเซลเซยส เพ�อนาไปแยกสกดดเอนเอในข�นตอนตอไป

8.2 การแยกสกดดเอนเอของเช�อรา การแยกสกดดเอนเอจากเสนใยของเช�อรา ดดแปลงจากวธการของ Jeewon

และคณะ (2002) โดยบดเสนใยเช�อราในไนโตรเจนเหลวจนละเอยด นาเสนใยเช�อราท�บดละเอยดแลวใสลงในหลอดไมโครเซนตรฟวก ขนาด 1.5 มลลลตร เตมสารละลาย 2x Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (2 เปอรเซนต CTAB, 100 มลลโมลาร Tris–HCl, 1.4 โมลาร NaCl, 20 มลลโมลาร EDTA, pH 8) ปรมาตร 600 ไมโครลตร ลงในหลอดหลอดไมโครเซนตรฟวก จากน�นนาไปบมท�อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 40 นาท เม�อครบเวลาเตมสารละลายฟนอล/ โคโรฟอรม (phenol/Chroloform; 1:1) ปรมาตร 600 ไมโครลตร นาสารละลายไปป�นท�ความเรว 13,000 รอบตอนาท ท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ดดสารละลายสวนน� าใสท�อยดานบนออกใสหลอดไมโครเซนตรฟวก ใหม เตม 100 เปอรเซนต เอทธานอล ป�นตกตะกอนดเอนเอท�ความเรว 13,000 รอบตอนาท ท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เทสวนน� าใสท�ง ลางตะกอนดเอนเอดวย 70 เปอรเซนต แอลกอฮอล ตากดเอนเอใหแหงท�อณหภมหอง แลวละลายตะกอนดเอนเอดวยน� ากล�นน� งฆาเช�อปรมาตร 15-20 ไมโครลตร เกบดเอนแชเยนท�อณหภม -20 องศาเซลเซยส

29

8.3 การเพ�มปรมาณดเอนเอดวยเทคนค Polymerase chain reaction (PCR) เพ�มปรมาณดเอนเอของเช�อราในสวนของ ribosomal DNA (rDNA) ตาแหนง

Internal Transcribed Spacer (ITS) ทกไอโซเลทดวยเทคนค PCR ซ� งดดแปลงจากวธการของ นฤมล และคณะ (ม.ป.ป.) โดยใชคไพรเมอร ITS5 (5’- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G -3’) เปน forward primer และ ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) เปน reverse primer (Meyer et al. , 2005) โดยมข�นตอนการเตรยมปฏกรยาในหลอด PCR ปรมาตรรวม 20 ไมโครลตร ดงน�

ดเอนเอเปาหมาย 2.0 ไมโครลตร 10x PCR buffer 2.0 ไมโครลตร 50 มลลโมลาร MgCl2 1.0 ไมโครลตร 10 มลลโมลาร dNTP 1.0 ไมโครลตร 100 พโคโมลาร ITS5 0.7 ไมโครลตร 100 พโคโมลาร ITS4 0.7 ไมโครลตร Taq DNA polymerase (5 ยนตตอไมโครลตร) 0.1 ไมโครลตร RNase-free water 12.5 ไมโครลตร

ผสมสวนผสมใหเขากนด จากน�นนาสวนผสมเขาเคร�อง Thermal cycler ท�ต�ง

ปฏกรยาในการสงเคราะหดเอนเอ ดงน� อณหภม 94 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 นาท จานวน 1 รอบ ตอดวยอณหภม 94 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท อณหภม 52 องศาเซลเซยส เปนเวลา 45 วนาท อณหภม 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท จานวน 35 รอบ และอณหภม 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จานวน 1 รอบ ตรวจสอบผลผลตดเอนเอดวย 1 เปอรเซนต อะกาโรสเจล อเลคโตโฟรซส (agarose gel electrophoresis) ใน 0.5x TBE buffer ใชกระแสไฟฟา 100 โวลต นาน 30 นาท จากน�นนาเจลไปแชในสารละลายเอธเดยมโบรไมด นาน 10 นาท ตรวจดแถบดเอนเอ (rDNA) ท�เพ�มปรมาณไดบนเคร�อง UV transilluminator ตดแถบดเอนเอท�ตองการออกจากเจล แยกสกดดเอนเอออกจากเจล โดยใช QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)

30

8.4 การโคลนยน rDNA และ การวเคราะหลาดบนวคลโอไทด เช�อมตอช�นยนไรโบโซมอลดเอนเอ (rDNA) ท�เพ�มปรมาณไดจากเช�อราแตละ

ไอโซเลทเขากบ พลาสมด pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA) โดยใชเอนไซม T4 DNA ligase (Promega, Madison, USA) ท�งน� การเช�อมตอยน rDNA ของเช�อราแตละไอโซเลทกบ พลาสมด pGEM-T Easy จะทาแยกหลอดกนซ� งในปฏกรยา ligation ปรมาตร 10 ไมโครลตร แตละหลอดประกอบดวย

ดเอนเอ (10 นาโนกรมตอไมโครลตร) 10.0 ไมโครลตร 2x Rapid ligation buffer 1.0 ไมโครลตร พลาสมด pGEM-T Easy (50 นาโนกรมตอไมโครลตร) 0.5 ไมโครลตร เอนไซม T4 DNA Ligase (3 ยนตตอไมโครลตร) 1.0 ไมโครลตร น�ากล�นน�งฆาเช�อ 7.5 ไมโครลตร ผสมสารละลายใหเขากน นาไปบมท�อณหภม 4 องศาเซลเซยส นานขามคน

(12-16 ช�วโมง) เคล�อนยายพลาสมดลกผสมแตละชนดเขาส competent cell ของแบคทเรย

Escherichia coli สายพนธ DH5α (Qiagen, Hilden, Germany) ดวยวธ Heat shock transformation ท�อณหภม 42 องศาเซลเซยส เปนเวลา 90 วนาท แลวแชน� าแขง 2 นาท จากน�นดดสารละลายแบคทเรยท�งหมดใสลงในอาหารเหลว 2xYT ท�เตมสารปฏชวนะแอมพซลลน 100 ไมโครกรม ตอมลลลตร (2xYT+ Amp) ปรมาตร 1 มลลลตร เขยาดวยความเรว 200 รอบตอนาท ท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ช�วโมง คดเลอกโคโลนของเช�อแบคทเรยท�มช�นสวนของยน rDNA ของเช�อราดวยวธ blue-white selection โดยดดสารละลายเซลลแบคทเรยปรมาตรอยางละ 300 ไมโครลตร spread แยกกนบนอาหารแขง 2xYT+Amp ท�เตม IPTG (Isopropyl-β-D Thiogalactopyranoside) (Fermentas, Hanover, USA) ใหมความเขมขนสดทายเปน 1 มลลโมลาร และ X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) (Fermentas, Hanover, USA) 50 ไมโครกรมตอมลลลตร จากน�นนาไปบมท�อณหภม 37 องศาเซลเซยส ขามคน (Sambrook et al., 1989) ตรวจสอบโคโลนของแบคทเรยท�ไดรบพลาสมดลกผสมดวยเทคนค PCR โดยใชคไพรเมอร ITS5 และ ITS4 ตามวธการในขอ 8.3 จากน�นสกดพลาสมดลกผสมออกจากเซลลแบคทเรยดวย High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid, Taipei, Taiwan) นาพลาสมดท�สกดได สงตรวจเพ�อหาลาดบนวคลโอไทดในข�นตอนตอไป โดยใชคไพรเมอร T7 และ SP6 และจาแนกยนดวยโปรแกรม Blastn (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Blast)

31

บทท� 3 ผลการทดลอง

1. การแยกเช�อราปฏปกษจากตวอยางดน และการทดสอบศกยภาพในการควบคม ไสเดอนฝอย

เกบตวอยางดนในแปลงปลกพรกและพชผก จากพ�นท" 10 จงหวดในเขตภาคใตของประเทศไทย ไดแก จงหวดกระบ" ตรง นครศรธรรมราช พงงา พทลง ภเกต ยะลา สงขลา สตล และสราษฏรธาน จานวน 31 ตวอยาง เม"อนาดนมาแยกหาเช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยโดยวธ Scattering method และตรวจสอบกจกรรมการเปนปฏปกษของเช�อราตอไสเดอนฝอย จากการสารวจพบเช อราปฏปกษไสเดอนฝอย จานวน 38 ไอโซเลท จาแนกเปนเช อรากลมกบดกไสเดอนฝอย จานวน 35 ไอโซเลท ไดแก Arthrobotrys oligospora จานวน 4 ไอโซเลท, Monacrosporium

aphrobrochum จานวน 7 ไอโซเลท, M. bembicodes จานวน 14 ไอโซเลท, และ M. thaumasium จานวน 10 ไอโซเลท โดยเช อรา M. aphrobrochum (ภาพท" 2) และ M. bembicodes (ภาพท" 3) จะสรางกบดกแบบวงแหวนรดตวได (constricting rings) สวน M. thaumasium (ภาพท" 4) และ A. oligospora (ภาพท" 5) จะใชตาขายเสนใยท>มสารกาวเหนยว (adhesive networks) ในการดกจบไสเดอนฝอย นอกจากน ยงสารวจพบเช อราในกลมท>เปนปรสตภายใน (endoparasites) ไดแก Harposporium cycloides (ภาพท" 6) จานวน 3 ไอโซเลท รายละเอยดตามขอมลในตารางท" 2 2. การแยกเช�อราปฏปกษจากช�นสวนของพชท�จมหรอลอยอยในน�า และการทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอย

เกบตวอยางช�นสวนของพชท"จมหรอลอยอยในน� า จากพ�นท"ปาสงวนแหงชาตพรควนเครง อาเภอชะอวด จงหวดนครศรธรรมราช พ�นท"ศนยวจยและศกษาธรรมชาตปาพรสรนธร อาเภอสไหงโก-ลก จงหวดนราธวาส อางเกบน� าในพ�นท"สวนขวญเมอง อาเภอเมองยะลา จงหวดยะลา และสระบวในพ�นท" อาเภอหาดใหญ จงหวดสงขลา โดยวธ Moist chamber ตรวจหาเช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอย ท"ปรากฏบนตวอยาง และตรวจสอบกจกรรมการเปนปฏปกษของเช�อราตอไสเดอนฝอย จากการสารวจพบเช อรากลมกบดกไสเดอนฝอย จานวน 19 ไอโซเลท ไดแก A. oligospora จานวน 1 ไอโซเลท, M. aphrobrochum จานวน 4 ไอโซเลท, M. bembicodes

32

จานวน 8 ไอโซเลท และ M. thaumasium จานวน 6 ไอโซเลท (ตารางท" 2) สาหรบลกษณะของเช�อราปฏปกษกลมกบดกไสเดอนฝอยท>พบ ท ง 4 ชนด มความแตกตางกน ดงแสดงไวในตารางท" 3

ภาพท� 2 Monacrosporium aphrobrochum (Drechsler) Subram. (ก) วงแหวนรดตวได (constricting rings) ท"ใชในการดกจบไสเดอนฝอย (ข) ลกษณะ conidia

ภาพท� 3 Monacrosporium bembicodes (Drechsler) Subram. (ก) วงแหวนรดตวได (constricting rings) ท"ใชในการดกจบไสเดอนฝอย (ข) ลกษณะ conidia

ก.

ก.

ข.

ข.

20 µµµµm

20 µµµµm

33

ภาพท� 4 Monacrosporium thaumasium (Drechsler) de Hoog & Oorschot. (ก) ตาขายเสนใยท>มสารกาวเหนยว (adhesive networks) ท"ใชในการดกจบไสเดอนฝอย (ข) ลกษณะ conidia

ภาพท� 5 Arthrobotrys oligospora Fres. (ก) ตาขายเสนใยท>มสารกาวเหนยว (adhesive networks) ท"ใชในการดกจบไสเดอนฝอย (ข) ลกษณะ conidia

ก. ข. 20 µµµµm

ก. ข. 20 µµµµm

34

ภาพท� 6 Harposporium cycloides (endoparasites) (ก) ไอโซเลท SS18-01 (ข) ไอโซเลท SS18-04

ก.

ข.

35

ตารางท� 2 สถานท"เกบตวอยาง และจานวนไอโซเลทของเช�อราปฏปกษไสเดอนฝอย ท"แยกเช�อไดจากตวอยางดน และจากช�นสวนของพชท"จมหรอลอยอยในน�า

จงหวด

จานวนไอโซเลท

A.

oligospora

M.

aphrobrochum

M.

bembicodes

M.

thaumasium

H.

cycloides

ตวอยางดน

กระบ" (2 ตวอยาง) 1 - - 4 -

ตรง (1 ตวอยาง) - - 2 - -

นครศรธรรมราช (12 ตวอยาง) 2 2 - - -

พงงา (1 ตวอยาง) - - 1 3 -

พทลง (1 ตวอยาง) - - - - -

ภเกต (1 ตวอยาง) - - 5 - 3

ยะลา (1 ตวอยาง) - - - - -

สงขลา (7 ตวอยาง) 1 3 4 2 -

สตล (1 ตวอยาง) - - - - -

สราษฏรธาน (4 ตวอยาง) - 2 2 1 -

รวม (1) 4 7 14 10 3

สวนของพชท�จมหรอลอยอยในน�า

นครศรธรรมราช 1 2 4 1 -

นราธวาส - - 2 2 -

สงขลา - 1 1 2 -

ยะลา - 1 1 1 -

รวม (2) 1 4 8 6 -

รวมท�งส�น (1+2) 5 11 22 16 3

36

ตารางท� 3 เปรยบเทยบลกษณะของเช�อราปฏปกษกลมกบดกไสเดอนฝอย ท"พบจากการสารวจ

ลกษณะ A. oligospora M. aphrobrochum M. bembicodes M. thaumasium

- ชนดกบดก ตาขายเสนใย ท"มสารกาวเหนยว

(adhesive networks)

วงแหวนรดตวได (constricting rings)

วงแหวนรดตวได (constricting rings)

ตาขายเสนใย ท"มสารกาวเหนยว

(adhesive networks)

- เสนใย ใส (hyaline) ใส (hyaline) ใส (hyaline) ใส (hyaline)

- โคนเดย

รปราง คลายรปไข

(obovoid) ทรงร ตรงกลางโปง

คลายกระสวย(broadly or spindle)

รปทรงร (ellipsoid)

ทรงร ตรงกลางโปง คลายกระสวย

(broadly or spindle)

ผนงก�น 1 2 2-3 2-3

เมดส ใส (hyaline) ใส (hyaline) ใส (hyaline) ใส (hyaline)

ความกวาง (ไมครอน) 11.33-14.17 14.63-15.98 12.19-14.82 15.42-17.97

ความยาว (ไมครอน) 21.18-23.40 29.19-31.65 32.82-34.99 34.69-39.15 - การเจรญบนอาหาร PDA เม"ออาย 7 วน (เซนตเมตร)

9.00 7.96 7.88 7.42

3. การแยกเช�อราบรสทธBจากกลมไข (egg mass) ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita และดนรอบรากตนพรกท�เปนโรครากปม

เกบตวอยางตนพรกและดนรอบๆตนพรกท>เกดโรครากปมได จานวน 6 ตวอยาง จากแปลงปลกพรกในจงหวดนครศรธรรมราช พทลง ยะลา สงขลา สตล และสราษฏรธาน นารากพรกมาแยกเช อราจากกลมไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ได จานวน 60 ไอโซเลท และแยกเช อราจากดนรอบรากตนพรกท>เปนโรครากปมได จานวน 83 ไอโซเลท ตวอยางเชน Acremonium spp., Acremonium murorum, Alternaria sp., Aspergillus spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cladosporium cladosporioides, Curvularia spp. Curvularia deightonii, Fusarium spp., Fusarium acuminatum, Fusarium oxysporum, Paecilomyces spp., Paecilomyces lilacinus, Penicillium spp., Pestalotiopsis spp., Trichoderma spp. และ Trichoderma harmatum

ซ" งเช�อราบางไอโซเลทไมไดทาการจาแนกชนด เน"องจากไดทดสอบเบ�องตนในหองปฏบตการ พบวาไมมประสทธภาพในการเปนปฏปกษตอไสเดอนฝอยรากปม M. incognita

37

4. การทดสอบการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita นาเช�อราบรสทธd ท"แยกไดจากตวอยางดน ตวอยางช�นสวนของพชท"จมหรอลอยอย

ในน� า และตวอยางตนพรกและดนรอบๆตนพรกท>เกดโรครากปม รวมท งส น 197 ไอโซเลท มาทาการทดสอบการเขาทาลายกลมไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ประเมนผลการเขาทาลายกลมไขเปน 3 ระดบ สามารถคดเลอกเช อราท>มระดบในการเขาทาลายกลมไข ท>มคาเฉล>ยต งแตระดบ 2.5 ข นไปได จานวน 71 ไอโซเลท (ภาพท" 7) ตวอยางเชน Acremonium spp., Acremonium

murorum, Alternaria sp., Aspergillus spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus

niger, Cladosporium cladosporioides, Curvularia spp. Curvularia deightonii, Fusarium spp., Fusarium acuminatum, Fusarium oxysporum, Paecilomyces spp., Paecilomyces lilacinus, Penicillium spp., Pestalotiopsis spp., Trichoderma spp. และ Trichoderma harmatum

เช อราท> มประสทธภาพในการเขาทาลายกลมไขไดดท> สด (ตารางท> 4) คอ Aspergillus sp. (EM01-07), Curvularia sp. (EM01-04), Paecilomyces lilacinus (EM06-08), Penicillium sp. (SR04-12) และ Trichoderma spp. (SR02-09 และ SR06-05) โดยเช อราสามารถสรางเสนใยคลมสวน gelatinous matrix ของกลมไขทกกลมไขท>ทดสอบ (ระดบคาเฉล>ย 3.00) รองลงมาไดแก Aspergillus sp. (SR04-03), Curvularia sp. (SR05-09), Fusarium sp. (EM04-08), Penicillium sp. (SR02-06) และ Trichoderma sp. (SR03-03) ซ> งสรางเสนใยคลมกลมไขไดในระดบคาเฉล>ย 2.92

38

ภาพท� 7 ตวอยางเช�อราท"มศกยภาพในการเขาทาลายกลมไข และไขของ M. incognita (ก) Acremonium sp., (ข) Acremonium murorum, (ค) Alternaria sp., (ง) Aspergillus sp., (จ) Aspergillus fumigatus, (ฉ) Aspergillus niger, (ช) Cladosporium cladosporioides, (ซ) Curvularia sp.

ก. ข.

ค. ง.

จ. ฉ.

ช. ซ

39

ภาพท� 7 ตวอยางเช�อราท"มศกยภาพในการเขาทาลายกลมไข และไขของ M. incognita (ตอ) (ฌ) Curvularia deightonii, (ญ) Fusarium acuminatum, (ฎ) Paecilomyces lilacinus, (ฏ) Penicillium sp., (ฐ) Pestalotiopsis sp., (ฑ) Trichoderma sp.1, (ฒ) Trichoderma sp.2, (ณ) Trichoderma harmatum

ฌ. ญ.

ฎ. ฏ.

ฐ. ฑ.

ณ. ฒ.

40

5. การทดสอบการเขาทาลายไข (egg) ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita นาเช อราท>มระดบในการเขาทาลายกลมไข ท>มคาเฉล>ยต งแตระดบ 2.5 ข นไป

จานวน 71 ไอโซเลท มาทดสอบ พบเช อราท>มประสทธภาพในการเขาทาลายไขของ M. incognita ได ด ท> สด (ตา รา ง ท> 4 ) ค อ Paecilomyces lilacinus (EM06 -08 ) สา มา รถทาล าย ไข ได ส ง 63.67 เปอรเซนต รองลงมา คอ Trichoderma sp. (SR06-05) และ Curvularia sp. (SR05-09) ซ> งทาลายไขได 53.00 และ 49.33 เปอรเซนต ตามลาดบ สวนเช อราในกลมกบดกไสเดอนฝอยท>มประสทธภาพในการเขาทาลายไขไดดท>สด คอ Arthrobotry oligospora (SS09-03) สามารถทาลายไขได 19.67 เปอรเซนต รองลงมา คอ Monacrosporium thaumasium (SS16-01) ซ> งทาลายไขได 16.67 เปอรเซนต สาหรบเช อราท>มประสทธภาพในการลดอตราการฟกไขของ M. incognita ไดดท>สด (ตารางท> 4) คอ P. lilacinus (EM06-08) สามารถลดอตราการฟกไขไดสง 52.33 เปอรเซนต (ภาพท" 8) รองลงมา คอ Curvularia sp. (SR05-09) และ Trichoderma sp. (SR06-05) สามารถลดอตราการฟกไขได 47.00 และ 45.33 เปอรเซนต ตามลาดบ สวนเช อราในกลมกบดกไสเดอนฝอย ท>มประสทธภาพในการลดอตราการฟกไขไดดท>สด คอ A. oligospora (SS09-03) สามารถลดอตราการฟกไขได 16.33 เปอรเซนต รองลงมา คอ M. thaumasium (SS16-01) ซ> งสามารถลดอตราการ ฟกไขได 15.67 เปอรเซนต

ภาพท� 8 P. lilacinus ไอโซเลท EM06-08 : ทาลายไข (ก. และ ข.) ทาลายกลมไข (ค. และ ง.)

ก.

ง. ค.

ข.

41

ตารางท� 4 ประสทธภาพของเช�อราในการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ไข (egg) ของไสเดอนฝอย รากปม M. incognita ในหองปฏบตการ

เช�อรา ไอโซเลท ระดบการเขา ทาลายกลมไข1

การเขาทาลายไข2 (เปอรเซนต)

ลดอตราการฟกไข3 (เปอรเซนต)

Acremonium spp. EM03-03 2.67 13.00 ± 4.36 2.33 ± 2.31

EM03-04 2.42 5.67 ± 3.06 0.33 ± 0.58

SR05-04 2.00 9.33 ± 4.16 7.67 ± 6.66

Acremonium murorum EM01-03 2.50 9.67 ± 6.66 19.33 ± 3.51

Alternaria sp. EM05-01 2.58 6.67 ± 4.04 9.33 ± 3.51

Aspergillus spp. EM01-06 2.75 27.00 ± 13.08 27.00 ± 7.55

EM01-07 3.00 23.00 ± 7.00 7.67 ± 8.14

EM03-06 2.83 8.00 ± 5.00 7.00 ± 4.36

SR02-04 2.08 35.00 ± 13.11 17.00 ± 8.54

SR04-03 2.92 41.67 ± 19.35 16.33 ± 10.07

Aspergillus flavus SR06-15 2.33 3.33 ± 2.52 16.67 ± 10.79

Aspergillus fumigatus EM03-05 2.75 26.67 ± 7.02 3.67 ± 3.79

SR02-10 2.83 24.33 ± 6.43 12.67 ± 5.51

SR05-08 2.83 19.67 ± 9.61 14.00 ± 4.36

Aspergillus niger EM04-14 2.67 23.00 ± 6.24 24.67 ± 6.03

EM06-04 2.83 30.00 ± 15.10 23.00 ± 3.46

SR01-01 2.08 30.67 ± 7.51 29.00 ± 3.61

SR06-11 2.08 16.33 ± 10.21 13.67 ± 5.03

1 คดคาเฉล>ยจาก 3 ซ าของจานวนกลมไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท>มเสนใยของ เช อราเจรญปกคลม จากจานวน 4 กลมไข/จานเล ยงเช อ 2 คดคาเฉล>ยจาก 3 ซ าของจานวนไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท>มสดาหรอน าตาล และมเสนใยของเช อราเจรญออกมา จากจานวน 100 ไข/จานเล ยงเช อ

3 คดคาเฉล>ยจาก 3 ซ าของจานวนไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท>มอตราของการ ฟกไขลดลง จากจานวน 100 ไข/จานเล ยงเช อ

42

ตารางท� 4 (ตอ) ประสทธภาพของเช�อราในการเขาทาลายกลมไข (egg mass) ไข (egg) ของ ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ในหองปฏบตการ

เช�อรา ไอโซเลท ระดบการเขา

ทาลายกลมไข1 การเขาทาลายไข2

(เปอรเซนต) ลดอตราการฟกไข3

(เปอรเซนต)

Arthrobotry oligospora SS09-02 2.67 15.67 ± 5.86 11.00 ± 2.65

SS09-03 2.75 19.67 ± 4.04 16.33 ± 5.03

Cladosporium cladosporioides EM02-01 2.58 9.33 ± 5.86 10.33 ± 3.79

Curvularia spp. EM01-04 3.00 35.33 ± 10.97 23.00 ± 4.58

EM02-05 2.50 23.00 ± 4.00 10.33 ± 6.66

SR04-08 2.00 16.00 ± 4.36 10.00 ± 9.64

SR04-09 2.33 11.00 ± 6.08 4.67 ± 2.52

SR05-09 2.92 49.33 ± 4.51 47.00 ± 9.00

Curvularia deightonii SR01-14 2.33 19.33 ± 5.51 3.00 ± 1.00

Fusarium spp. EM03-07 2.83 23.67 ± 1.53 19.00 ± 8.54

EM04-07 2.42 21.00 ± 8.89 14.00 ± 6.56

EM04-08 2.92 27.33 ± 11.68 8.00 ± 4.00

EM04-09 2.50 22.00 ± 11.79 1.33 ± 1.15

SR03-01 2.92 21.00 ± 6.08 24.67 ± 4.16

SR06-17 2.42 21.67 ± 5.86 22.67 ± 6.03

Fusarium acuminatum EM01-08 2.17 25.00 ± 14.53 26.33 ± 7.57

EM04-02 2.83 18.00 ± 8.89 18.67 ± 4.04

Fusarium oxysporum EM06-09 2.75 21.33 ± 5.51 19.00 ± 2.65



43






Monacrosporium bembicodes SS28-03 2.58 14.67 ± 4.04 8.33 ± 5.51

WS02-02 2.00 4.67 ± 2.08 7.33 ± 2.31

Monacrosporium thaumasium SS16-01 2.67 16.67 ± 10.60 15.67 ± 4.04

SS16-05 2.25 11.33 ± 7.51 11.00 ± 3.00

SS26-03 2.17 9.00 ± 6.24 13.33 ± 5.51

Paecilomyces spp. EM05-06 2.42 36.00 ± 8.89 15.67 ± 4.73

EM05-07 2.17 24.67 ± 10.21 27.33 ± 2.52

Paecilomyces lilacinus EM06-08 3.00 63.67 ± 8.50 52.33 ± 9.50

SR04-04 2.75 36.33 ± 10.60 10.67 ± 7.37

Penicillium spp. EM02-04 2.42 16.33 ± 7.51 13.33 ± 4.93

EM02-08 2.50 28.33 ± 5.69 23.33 ± 7.09

EM04-13 2.33 26.00 ± 7.00 24.67 ± 5.03

SR01-11 2.83 14.00 ± 4.58 5.67 ± 4.04

SR01-12 2.58 32.00 ± 11.53 21.00 ± 12.12

SR02-06 2.92 34.67 ± 7.09 19.67 ± 3.06

SR04-12 3.00 30.00 ± 10.82 9.67 ± 2.08

SR04-13 2.58 37.00 ± 11.00 25.67 ± 10.41

SR05-06 2.33 18.67 ± 11.55 24.67 ± 9.02

SR06-08 2.25 37.67 ± 3.06 27.33 ± 6.66



44






Pestalotiopsis spp. SR05-01 2.00 8.67 ± 6.43 0.67 ± 0.58

SR05-05 2.42 5.00 ± 2.00 9.00 ± 5.29

Trichoderma spp. EM04-10 2.58 25.00 ± 14.11 30.00 ± 4.36

EM06-03 2.83 19.67 ± 5.69 9.33 ± 4.51

SR01-04 2.83 24.00 ± 7.00 3.00 ± 3.61

SR01-07 2.75 31.00 ± 3.61 10.00 ± 1.73

SR02-09 3.00 32.67 ± 8.39 11.67 ± 2.52

SR02-12 2.33 39.33 ± 7.09 24.33 ± 5.69

SR03-03 2.92 31.67 ± 6.03 5.00 ± 4.00

SR04-05 2.33 19.67 ± 4.93 11.33 ± 5.13

SR05-02 2.58 35.67 ± 6.11 10.33 ± 7.09

SR06-05 3.00 53.00 ± 5.57 45.33 ± 12.50

SR06-10 2.25 23.33 ± 7.77 6.33 ± 4.16

Trichoderma harmatum SR01-02 2.17 28.67 ± 14.36 31.00 ± 7.94

SR03-06 2.83 32.67 ± 6.11 23.00 ± 8.19

SR06-06 2.50 33.33 ± 6.03 29.33 ± 7.02

Control - 0.00 0.00 ± 0.00 2.33 ± 1.53



45

6. การทดสอบประสทธภาพของเช�อราปฏปกษ ในการควบคมการเกดปมของรากพรก

นาเช อราท>มประสทธภาพในการเขาทาลายไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท>ดท>สด จากการทดสอบ จานวน 2 ไอโซเลท และเช อรากลมกบดกไสเดอนฝอยท>มประสทธภาพในการเขาทาลายไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท>ดท>สด จานวน 2 ไอโซเลท มาทาการทดสอบ โดยวางแผนการทดลองแบบ CRD แบงการทดลองเปน 7 กรรมวธ กรรมวธละ 20 ซ า ไดแก

กรรมวธท> 1 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ Paecilomyces lilacinus (EM06-08) กรรมวธท> 2 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ Trichoderma sp. (SR06-05) กรรมวธท> 3 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ Arthrobotrys oligospora (SS09-03) กรรมวธท> 4 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ Monacrosporium thaumasium (SS16-01) กรรมวธท> 5 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ สาร Carbofuran 2.5 กรม/กระถาง กรรมวธท> 6 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปมอยางเดยว (control)

กรรมวธท> 7 ตนพรกปกตท>ไมปลกเช อใดๆ (check)

จากการวเคราะหความแปรปรวนและเปรยบเทยบคาเฉล"ยดวย Duncan’s new multiple rang test (DMRT) ท"ระดบความเช"อม"น 95% (ตารางท> 5) พบวาเม"อเปรยบเทยบคาเฉล"ยระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรกเม"ออาย 60 วน (ภาพท" 9) พบวาตนพรกปกตท"ไมไดปลกเช�อใดๆ (check) ไมพบความรนแรงในการเกดปม คอ ระดบ 0.00 สวนตนพรกท"ปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita รวมกบสาร carbofuran มระดบความรนแรงในการเกดปมนอยท"สด คอ 0.55 รองลงมาคอ การปลกเช�อรวมกบ P. lilacinus และ Trichoderma sp. ท"ระดบ 0.85 และ 1.10 ตามลาดบ โดยพบวาเม"อเปรยบเทยบการปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran กบการปลกเช�อรวมกบ P. lilacinus มคาเฉล"ยระดบความรนแรงของการเกดปมท"ไมแตกตางกนทางสถต แตเม"อเปรยบเทยบกบการปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. มความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญ

46

ตารางท� 5 เปรยบเทยบคาเฉล"ยระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรก น�าหนกรากสด น�าหนกตนสด และน�าหนกผลผลตของพรก ท"เกบเก"ยวเม"ออาย 60 วน

ทรตเมนต ระดบความรนแรง น�าหนกรากสด น�าหนกตนสด น�าหนกผลผลต

ในการเกดปมของราก1 (กรม) (กรม) (กรม)

T1 : N + P. lilacinus (EM06-08) 0.85 ± 0.11 bc2 6.54 ± 0.21 b 15.02 ± 0.33 b 23.01 ± 0.54 b

T2 : N + Trichoderma sp. (SR06-05) 1.10 ± 0.14 cd 7.11 ± 0.29 ab 17.19 ± 0.41 a 27.29 ± 1.01 a

T3 : N + A. oligospora (SS09-03) 1.40 ± 0.13 de 4.97 ± 0.28 c 13.84 ± 0.38 cd 19.17 ± 0.51 c

T4 : N + M. thaumasium (SS16-01) 1.50 ± 0.15 e 3.86 ± 0.20 d 13.16 ± 0.47 d 16.50 ± 0.57 d

T5 : N + Carbofuran 2.5 กรม/กระถาง 0.55 ± 0.15 b 7.63 ± 0.30 a 17.31 ± 0.34 a 28.74 ± 0.88 a

T6 : กลมไขไสเดอนฝอยรากปมอยางเดยว (N) 3.85 ± 0.15 f 2.61 ± 0.14 e 10.33 ± 0.32 e 11.04 ± 0.54 e

T7 : ตนพรกปกตท"ไมปลกเช�อใดๆ (check) 0.00 ± 0.00 a 4.99 ± 0.20 c 14.73 ± 0.34 bc 18.72 ± 0.67 c

C.V. (%) 44.32 19.93 11.43 15.18 1 ดชนการเกดปมท"ระบบราก แบงเปน 6 ระดบ ตามวธของ Hussey และ Jansaen (2001)

ระดบ 0 : ไมมปม ระดบ 1 : มปมเกดข�นเลกนอย ระดบ 2 : เกดปมนอยกวา 25% ของระบบราก ระดบ 3 : เกดปม 25-50% ของระบบราก ระดบ 4 : เกดปม 51-75% ของระบบราก ระดบ 5 : เกดปมมากกวา 75% ของระบบราก

2 คาเฉล>ยตามดวยตวอกษรภาษาองกฤษตวพมพเลกท>เหมอน ไมมความแตกตางกนทาง สถตท>ระดบความเช>อม>น 95% โดยวธ DMRT N = กลมไข (egg mass) ของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita

47

ภาพท� 9 ระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรกในแตละกรรมวธ

(T1) = กรรมวธท> 1 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ P. lilacinus (EM06-08) (T2) = กรรมวธท> 2 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ Trichoderma sp. (SR06-05) (T3) = กรรมวธท> 3 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ A. oligospora (SS09-03) (T4) = กรรมวธท> 4 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ M. thaumasium (SS16-01) (T5) = กรรมวธท> 5 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปม รวมกบ สาร Carbofuran 2.5 กรม/กระถาง (T6) = กรรมวธท> 6 ตนพรกปลกเช อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปมอยางเดยว

(control) (T7) = กรรมวธท> 7 ตนพรกปกตท>ไมปลกเช อใดๆ (check)

T1 T2 T3

T5 T6

T4

T7

48

การเปรยบเทยบคาเฉล"ยน� าหนกรากสดของตนพรก เม"ออาย 60 วน พบวาตนพรกท"ปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran ทาใหไดน� าหนกเฉล"ยรากสดสงสด 7.63 กรม/ตน รองลงมาคอ ปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. และ P. lilacinus ท"ทาใหไดน� าหนกรากสดเทากบ 7.11 กรม/ตน และ 6.54 กรม/ตน ตามลาดบ โดยพบวาเม"อเปรยบเทยบการปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran กบการปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. มคาเฉล"ยน� าหนกรากสดท"ไมแตกตางกนทางสถต แตเม"อเปรยบเทยบกบการปลกเช�อรวมกบ P. lilacinus จะมความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญ

การเปรยบเทยบคาเฉล"ยน�าหนกตนสดของตนพรก เม"ออาย 60 วน พบวาตนพรกท"ปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran ทาใหไดน�าหนกตนสดสงสด 17.31 กรม/ตน รองลงมาคอ ปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. และ P. lilacinus ซ" งทาใหไดน� าหนกตนสดเทากบ 17.19 กรม/ตน และ 15.02 กรม/ตน ตามลาดบ โดยไมพบความแตกตางทางสถตระหวางการปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran และการปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. แตจะพบความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญ เม"อเปรยบเทยบกบการปลกเช�อรวมกบ P. lilacinus

จากการเปรยบเทยบคาเฉล"ยน� าหนกผลผลตพรก ท"เกบเก"ยวเม"ออาย 60 วน พบวาตนพรกท"ปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran ทาใหไดน� าหนกผลผลตพรกสงสด 28.74 กรม/ตน รองลงมาคอ ปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. และ P. lilacinus ซ" งทาใหไดน� าหนกผลผลตพรกเทากบ 27.29 กรม/ตน และ 23.01 กรม/ตน ตามลาดบ โดยไมพบความแตกตางทางสถตระหวางการปลกเช�อรวมกบสาร carbofuran และการปลกเช�อรวมกบ Trichoderma sp. แตจะพบความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญ เม"อเปรยบเทยบกบการปลกเช�อรวมกบ P. lilacinus นอกจากน� ยงพบวา ระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรก น� าหนกรากสด น�าหนกตนสด และน�าหนกผลผลตของพรกท"ไดรบการปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนรากปม รวมกบเช�อราปฏปกษ เปรยบเทยบกบตนพรกท"ไดรบการปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปมเพยงอยางเดยว จะมความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญ และพบวาเม"อเปรยบเทยบตนพรกท"ไดรบการปลกเช�อดวยกลมไขไสเดอนฝอยรากปมเพยงอยางเดยวกบตนพรกท"ไมไดรบการปลกเช�อใดๆ กมความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญเชนกน

49

7. การจาแนกเช�อราปฏปกษควบคมไสเดอนฝอยรากปมดวยเทคนค PCR

ทาการยนยนผลการจาแนกเช�อราปฏปกษท"พบวาสามารถควบคมการเกดปมของรากพรกได จ านวนท� งส� น 4 ชนด ไดแก Paecilomyces lilacinus ไอโซเลท EM06-08, Trichoderma sp. ไอโซเลท SR06-05, Monacrosporium thaumasium ไอโซเลท SS16-01 และ Arthrobotrys oligospora ไอโซเลท SS09-03 อกคร� ง ดวยเทคนค PCR จากการเพ"มปรมาณยน rDNA โดยใชคไพรเมอรท"จาเพาะตอ Internal Transcribed Spacer (ITS) และทาการตรวจสอบขนาดของยน rDNA ดวย 1 เปอรเซนต อะกาโรสเจลอเลคโตโฟรซส ผลท"ไดพบวาเช�อรา P. lilacinus ไอโซเลท EM06-08, Trichoderma sp. ไอโซเลท SR06-05 และ M. thaumasium ไอโซเลท SS16-01 จะใหแถบดเอนเอขนาดประมาณ 700 คเบส และ A. oligospora ไอโซเลท SS09-03 จะใหแถบดเอนเอขนาดประมาณ 1,200 คเบส ตามลาดบ (ภาพท" 10) การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของยน rDNA ขนาดประมาณ 700 คเบส ของเช�อ P. lilacinus ไอโซเลท EM06-08, Trichoderma sp. ไอโซเลท SR06-05 และ M. thaumasium ไอโซเลท SS16-01 และขนาดประมาณ 1,200 คเบส ของเช�อรา A. oligospora ไอโซเลท SS09-03 ท"เพ"มปรมาณได กบลาดบนวคลโอไทด rDNA ท"มรายงานอยในฐานขอมลของ GenBank พบวาลาดบนวคลโอไทดของยน rDNA ท"เพ"มปรมาณไดจากเช�อรา P. lilacinus ไอโซเลท EM06-08 มความคลายคลงกบลาดบนวคลโอไทดของยน rDNA ของเช�อรา P. lilacinus มากถง 99 เปอรเซนต แสดงวาเปนเช�อชนดเดยวกน ลาดบนวคลโอไทดของยน rDNA เช�อรา Trichoderma sp. ไอโซเลท SR06-05 มความคลายคลงกนของลาดบนวคลโอไทดของยน rDNA ของเช�อรา T. asperellum 99 เปอรเซนต แสดงวาเช�อรา Trichoderma sp. ไอโซเลท SR06-05 ท"คดเลอกไดเปนเช�อรา T. asperellum อยางไรกตามในการทดลองไมสามารถจาแนกเช�อรา M. thaumasium (SS09-03) และ เช� อรา A. oligospora (SS16-01) ไดเน"องจากลาดบนวคลโอไทดของ rDNA ของเช�อรา M. thaumasium (SS09-03) มความคลายคลงกบลาดบนวคลโอไทดของ rDNA ของเช�อรา M. thaumasium, M. eudermatum และ A. thaumasia มากถง 98 เปอรเซนต ในขณะท"ลาดบ นวคลโอไทดของ rDNA ของเช�อรา A. oligospora (SS16-01) มความคลายคลงกบลาดบ นวคลโอไทดของ A. conoides, A. superba และ A. cladodes 87 เปอรเซนต ผลการจาแนกท"เกดข�นไมชดเจน อาจมสาเหตมาจากการเลอกตาแหนงของ ITS บนยน rDNA ท"นามาใชในการจาแนกมความแตกตางของยนคอนขางนอย ซ" งการจาแนกเช�อราแตละชนดมความจาเปนท"จะตองศกษาเพ"อหาตาแหนงของยนท"เหมาะสมกบเช�อราชนดน�นๆ

50

ภาพท� 10 ผลผลตยน rDNA ของเช�อราปฏปกษท"สามารถควบคมไสเดอนฝอยรากปม M. incognita

ขนาดประมาณ 700 คเบส และ 1,200 คเบส จากปฏกรยา PCR โดยใชคไพรเมอร ITS5 และ ITS4, M คอ DNA marker (GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder, Fermentas), ชองท" 1 คอ P. lilacinus (EM06-08) ชองท" 2 คอ Trichoderma sp. (SR06-05) ชองท" 3 คอ A. oligospora (SS16-01) และ ชองท" 4 คอ M. thaumasium (SS09-03) ตามลาดบ

51

บทท� 4 สรปและวจารณผลการทดลอง

1. การแยกเช�อราปฏปกษจากตวอยางดน จากช�นสวนของพชท�จมหรอลอยอยในน�า และการทดสอบศกยภาพในการควบคมไสเดอนฝอย

จากการสารวจพบวา M. bembicodes เปนชนดของเช�อรากบดกไสเดอนฝอยท!พบมากท!สด ท� งจากตวอยางดน และจากตวอยางช�นสวนของพชท!อยในแหลงน� า เม!อทาการเปรยบเทยบชนดของเช�อรากบดกไสเดอนฝอยท!พบในเขตภาคใต กบท!พบในเขตภาคเหนอ ตามรายงานของ ภมรทพย อกษรทอง (ม.ป.ป.) พบวามความใกลเคยงกน โดยสารวจพบเช�อรากบดกไสเดอนฝอยเหมอนกนถง 3 ชนด คอ A. oligospora, M. aphrobrochum และ M. bembicodes นอกจากน� ผลสารวจยงมความใกลเคยงกบท!สารวจพบบรเวณท!ราบสงของประเทศจน จานวน 2 ชนด คอ A. oligospora และ M. thaumasium (Su et al., 2007)

รปแบบของโครงสรางกบดกของเช�อข�นอยกบ ชนด สายพนธ สภาพแวดลอมท�งท!มชวตและไมมชวต โดยสภาพแวดลอมท!มชวตท!สาคญท!สดคอ ตวไสเดอนฝอยท!ยงมชวตอย ซ! งจะกระตนใหเช� อราสรางกบดกแบบตางๆ โดยการไปสมผสกบเสนใยของเช� อรา สาหรบเช� อ A. oligospora ท!กลายพนธนอกจากจะสรางสปอรท!มสารกาวเหนยวต� งแตอยบนกานชสปอร ยงสรางกบดกจานวนมากบนเสนใยดวย แสดงถงความสามารถในการเพ!มประสทธภาพในการดกจบไสเดอนฝอยในธรรมชาต และยงสามารถเปนปรสตของเช�อราชนดอ!น โดยการพนและรดรอบเสนใยของเช� อราชนดอ!น แสดงใหเหนถงความสามารถในการปรบตวใหมชวตรอดในสภาพแวดลอมท!หลากหลาย (Nordbring-Hertz et al., 2006) ซ! งเหมาะแกการนาไปใชควบคมไสเดอนฝอยศตรพชในระยะท!เคล!อนท!ได เชน การนาไปควบคมไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ขณะท!เปนตวออนระยะท! 2 (juvenile stage 2)

2. การแยกเช�อราบรสทธ5จากกลมไข (egg mass) ไสเดอนฝอยรากปม M. incognita และดนรอบรากตนพรกท�เปนโรครากปม

เช�อราท!แยกไดจากกลมไขไสเดอนฝอยรากปม M. incognita และดนรอบรากตนพรกท!เปนโรครากปม สวนใหญเปน Imperfect fungi เชน Aspergillus spp., A. flavus, A. fumigates, A. niger, Curvularia spp. C. deightonii, Fusarium spp., F. acuminatum, F. oxysporum,

52

Paecilomyces spp., P. lilacinus, Penicillium spp., Trichoderma spp. และ T. harmatum ซ! งพบวา มจานวนไอโซเลทของเช�อ Trichoderma spp. มากท!สดซ! งเปนเช�อราในดนท!ชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของพช และมศกยภาพในการแขงขนกบเช�อสาเหตโรคพชหลายชนด รวมท�งไสเดอนฝอยรากปม โดยเขาไปทาลายไขและตวออนของไสเดอนฝอยรากปม ทาใหพบโรคไดนอยลง (กนกพรรณ โสมาศร, 2544)

3. การทดสอบการเขาทาลายกลมไข (egg mass) และไข (egg) ไสเดอนฝอยรากปม

M. incognita

เช�อราท!มประสทธภาพในการเขาทาลายกลมไข ไข และสามารถในการลดอตราการฟกไขของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ไดดท!สด คอ Paecilomyces lilacinus (EM06-08) สามารถเขาทาลายกลมไขท!ระดบคาเฉล!ย 3.00 ทาลายไขได 63.67 เปอรเซนต และลดอตราการฟกไขได 52.33 เปอรเซนต ซ! งสอดคลองกบผลการทดลองของ กนกพรรณ โสมาศร (2544) ยวด ชประภาวรรณ และคณะ (2550) และ Kiewnick และ Sikora (2006) รองลงมาคอ Trichoderma sp. (SR06-05) ซ! งสามารถเขาทาลายกลมไขท!ระดบคาเฉล!ย 3.00 ทาลายไขได 53.00 เปอรเซนต และลดอตราการฟกไขได 47.00 เปอรเซนต โดยพบวา Trichoderma sp. (SR06-05) มความสามารถในการลดอตราการฟกไขนอยกวา Curvularia sp. (SR05-09) แตศกยภาพโดยรวมในการเขาทาลายยงเหนอกวา สวนเชAอรากลมกบดกไสเดอนฝอยท!มประสทธภาพในการเขาทาลายกลมไข ไข และสามารถในการลดอตราการฟกไขของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ไดดท!สด คอ Arthrobotry oligospora (SS09-03) สามารถเขาทาลายกลมไขท!ระดบคาเฉล!ย 2.75 ทาลายไขได 19.67 เปอรเซนต และลดอตราการฟกไขได 16.33 เปอรเซนต รองลงมาคอ Monacrosporium

thaumasium (SS16-01) ซ! งสามารถเขาทาลายกลมไขท!ระดบคาเฉล!ย 2.67 ทาลายไขได 16.67 เปอรเซนต และลดอตราการฟกไขได 15.67 เปอรเซนต จากผลการทดสอบในครA งนA เชAอราท!ทาลายกลมไขไดด แตเม!อนาไปทดสอบการเขาทาลายไขกลบพบเปอรเซนตการเขาทาลายนอยกวาเชAอราท!เขาทาลายกลมไขไดปานกลางหรอคอนขางต!า ตามรายงานของ Agudelo และคณะ (2004) และ Khan และคณะ (2004) (อางถงใน ยวด ชประภาวรรณ และคณะ, 2550) วา การท!เช�อราเจรญเตบโตไดดจนข�นปกคลมกลมไขไดน�น เปนเพยงการเจรญเตบโตอยบนสารเมอก (gelatinous matrix) ท!ทาหนาท!หอหมกลมไขเทาน�น แตไมสามารถแทงทะลผานเปลอกไขเขาไปเจรญภายในไขไสเดอนฝอยรากปมไดหรอเขาไปไดนอย ในขณะท!เช�อราท!มเขาทาลายกลมไขไดต !าอาจจะมบทบาทของเอนไซนยอยสลายท!ขบออกมา

53

นอกเซลล (extracellular enzyme) เชน chitinase และ protease เขามาเก!ยวของกบความสามารถของเสนใยในการแทงทะลเปลอกไขเขาไปทาลายไขท!อยภายใน นอกจากนA ยงสงเกตไดวา เชAอราท!มศกยภาพในการเขาทาลายไข อาจจะไมมศกยภาพในการลดอตราการฟกไขของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ไดในเปอรเซนตท!ใกลเคยงกน ตวอยางเชน Aspergillus sp. (EM01-07), Fusarium sp. (EM04-09), Penicillium sp. (SR04-12) และ Trichoderma sp. (SR03-03) ซ! งจะเหนไดวาเปอรเซนตในการลดอตราการฟกไข จะลดลงจากเปอรเซนตการเขาทาลายไขอยางเหนไดชด ทAงนA อาจเน!องมาจากเชAอราเขาทาลายไขโดยแทงเสนใยเขาไป แตไมสามารถแทงเสนใยเขาไปทาลายตวออนของไสเดอนฝอยรากปม M. incognita ท!อยในไขได 4. การทดสอบประสทธภาพของเช�อราปฏปกษ ในการควบคมการเกดปมของรากพรก

จากการทดลองแสดงใหเหนวา สาร carbofuran มประสทธภาพในการควบคมการเกดปมของรากพรกไดดท!สด ทาใหความรนแรงในการเกดปมของรากพรกลดลง และทาใหการเจรญเตบโตของพรก (น�าหนกรากสด น�าหนกตนสด น�าหนกผลผลต) เพ!มข�น สาหรบเช�อราท!มประสทธภาพในการควบคมการเกดปมของรากพรกไดด คอ P. lilacinus (EM06-08) และ Trichoderma sp. (SR06-05) โดยพบวา P. lilacinus มประสทธภาพในการทาใหความรนแรงในการเกดปมของรากพรกลดลงโดยไมพบความแตกตางกนในทางสถต แตจะพบความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญในการทาใหพรกเจรญเตบโต เม!อเปรยบเทยบกบการใชสาร carbofuran สวน Trichoderma sp. ทาใหความรนแรงในการเกดปมของรากพรกลดลง ซ! งสอดคลองกบรายงานของ Sharon และคณะ (2001) โดยจะพบความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญเม!อเปรยบเทยบกบการใชสาร carbofuran แตไมพบความแตกตางกนในทางสถตเม!อเปรยบเทยบกบ P. lilacinus ถามองในสวนของการทาใหการเจรญเตบโตของพรกเพ!มข�นน�น จะไมพบความแตกตางกนในทางสถต เม!อเปรยบเทยบกบการใชสาร carbofuran ซ! งผลท!ไดเปนไปในทศทางเดยวกนกบการทดลองของ Sharma และ Pandey (2009) จากการทดลองแสดงใหเหนวา เม!อเปรยบเทยบเช�อรากลมกบดกไสเดอนฝอยท!นามาทดสอบ คอ A. oligospora (SS09-03) และ M. thaumasium (SS16-01) กบเช�อราอก 2 ชนด คอ P. lilacinus (EM06-08) และ Trichoderma sp. (SR06-05) จะพบความแตกตางกนทางสถต อยางมนยสาคญในสวนของการทาใหการเจรญเตบโตของพรกเพ!มข�น เชนเดยวกบการทาใหความรนแรงในการเกดปมของรากพรกลดลง ยกเวน A. oligospora (SS09-03) ท!ไมพบความแตกตางกน

54

ในทางสถตในการทาใหความรนแรงในการเกดปมของรากพรกลดลงเม!อเปรยบเทยบกบ Trichoderma sp. (SR06-05)

ในปจจบนท!กระแสของผบรโภคใหความสาคญกบการบรโภคพชผกท!ปลอดภยจากสารเคม โดยเฉพาะกลมผรกสขภาพท!หนมาบรโภคพชผกเหลาน� มากข�น รวมถงประเทศท!นาเขาผลผลตพชผกกตองการสนคาท!มมาตรฐาน และมกจะออกมาตรการกดกนการใชสารเคมท!เกนระดบมาตรฐาน โดยเฉพาะเม!อสาร carbofuran อยในขายของสารเคมทางการเกษตรท!เฝาระวง ซ! งมประเทศท!ระงบหรอหามไมใหใชสารเคมชนดน�แลว คอ สหภาพยโรป และอเมรกา ดงน�นการใชสารชวภณฑจงเปนอกทางเลอกหน!งในการใชปองกนกาจดศตรพช เพ!อเพ!มปรมาณและคณภาพของผลผลต ใหตรงตามมาตรฐานท!ผบรโภคหรอประเทศผคาตองการ 5. การจาแนกชนดของเช�อราปฏปกษควบคมไสเดอนฝอยรากปมดวยเทคนค PCR

การจาแนกชนดของเช�อราปฏปกษจานวนท�งส�น 4 ไอโซเลท ท!สามารถใชควบคมการเกดปมของรากพรกได ดวยเทคนค PCR โดยใชคไพรเมอร ITS5 และ ITS4 จากการเปรยบเทยบความคลายคลงของลาดบนวคลโอไทดในสวน rDNA ตาแหนง ITS ของเช�อราแตละชนด กบลาดบนวคลโอไทดท!มรายงานในฐานขอมลของ GenBank สามารถจาแนกเช�อราได 2 ชนด คอ P. lilacinus (EM06-08) ซ! งมความคลายคลงกบเช�อรา P. lilacinus 99 เปอรเซนต และ Trichoderma sp. (SR06-05) ท!มความคลายคลงกบเช�อรา T. asperellum 99 เปอรเซนต ในขณะท! M. thaumasium (SS09-03) และ A. oligospora (SS16-01) ไมสามารถยนยนชนดของเช�อราได ท�งน�อาจเปนผลสบเน!องมาจากตาแหนงของ ITS ท!เลอกนามาใชในการศกษาคร� งน�อาจไมเหมาะสมตอการนามาใชในการจาแนกเช�อราท�ง 2 ชนด ซ! งมความจาเปนท!จะตองทาการศกษาเพ!อหาตาแหนงท!เหมาะสมของ ITS ตอการจาแนกเช�อราท�ง 2 ชนดน� ตอไป

55

เอกสารอางอง

กนกพรรณ โสมาศร. 2544. ศกยภาพของเช�อราในดนสาหรบการควบคมไสเดอนฝอยรากปม (Meloidogyne incognita Chitwood) เชงชววธในมะเขอเทศ. วทยานพนธวทยาศาสตร มหาบณฑต สาขาวชาโรคพชวทยา มหาวทยาลยขอนแกน.

กมล เลศรตน. 2550. การผลต การปลก การแปรรป และการตลาดของพรกและผลตภณฑพรกใน

ประเทศไทย. คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน (ระบบออนไลน). เขาถงไดจากhttp://www.trf.or.th/tips/x.asp?Art_ID=143 (เขาถงเมQอ 2 พฤษภาคม 2553).

กรมสงเสรมการเกษตร. 2556. รายงานขอมลภาวะการผลตพช (รต.01) แบบรายป 2555/56 (ระบบออนไลน). เขาถงไดจาก http://production.doae.go.th/report/report_main2. php?report_type=1 (เขาถงเมQอ 7 พฤษภาคม 2556). นฤมล ต�งธระสนนท, สพตรา โพธ] เอQยม, เกษม สรอยทอง, พมพพรรณ สมมาตย และเสาวนตย

โพธ] พนศกด] . ม.ป.ป. การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยา และพนธกรรมของเช�อราสกล Metarhizium โดยอาศยลาดบนวคลโอไทดของบรเวณ ITS (ระบบออนไลน). เขาถงไดจาก http://plantpro.doae.go.th/disease-research/L-4506.pdf (เขาถงเมQอ 27 พฤษภาคม 2553).

นชนารถ ต�งจตสมคด. 2550. การควบคมโรครากปมในพรก. กรมวชาการเกษตร. กรงเทพฯ. 4 หนา. นชนารถ ต�งจตสมคด, วราภรณ ประกอบ และสรกล วะส. 2552. การคดเลอกและประเมนพนธ พรกตานทานไสเดอนฝอยรากปม. รายงานการประชมวชาการอารกขาพชแหงชาตคร� งทQ 9. 24-26 พฤศจกายน 2552. โรงแรมสนย แกรนด จงหวดอบลราชธาน. หนา 331-341. ปญญา ยวงเกต. 2552. การปลกพรกในภาคใต. ศนยบรหารศตรพชจงหวดสงขลา (ระบบออนไลน). เขาถงไดจาก http://pmc06.doae.go.th/chilly.htm (เขาถงเมQอ 7 พฤษภาคม 2556). พลลภา กฤษณไพบลย. 2534. ไสเดอนฝอยศตรพช. โครงการจดต�งภาควชาการจดการศตรพช

คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. สงขลา. 307 หนา.

56

ภมรทพย อกษรทอง. (ม.ป.ป.). เช�อราปฏปกษตอไสเดอนฝอยในเขตภาคเหนอของประเทศไทย ตอนทQ 1 เช�อรา Arthrobotrys oligospora Fres. และราสกลอQนๆทQพบในแปลงปลกพชบน พ�นทQสง (highland). ภาควชาโรคพช คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม (ระบบออนไลน). เขาถงไดจาก http://plantpro.doae.go.th/disease-research/B-06.pdf (เขาถงเมQอ 2 พฤษภาคม 2553).

ภมรทพย อกษรทอง. 2545. บทความส�น: เทคนคอยางงายในการแยกเช�อราปฏปกษสกล

Arthrobotrys sp. จากดน. วารสารเกษตร 18 : 88. ยวด ชประภาวรรณ, วระศกด] ศกด] ศรรตน, อนนต หรญสาล และนวฒ เสนาะเมอง. 2550.

การสารวจ รวบรวมและประเมนประสทธภาพเช�อราในดนในเขตภาคตะวนออกเฉยงเหนอ ตอนลางตอการควบคมไสเดอนฝอยรากปม. วารสารแกนเกษตร 35 : 104-114.

สรศกด] มณขาว, นชนารถ ต�งจตสมคด, พเยาว พรหมพนธใจ, นวลจนทร ศรสมบต และบญช

สายธน. 2552. การทดสอบเทคโนโลยการควบคมโรครากปมพรกแบบเกษตรกรมสวน รวม. รายงานการประชมวชาการอารกขาพชแหงชาตคร� งทQ 9. 24-26 พฤศจกายน 2552. โรงแรมสนย แกรนด จงหวดอบลราชธาน. หนา 355-369.

สบศกด] สนธรตน. 2538. ไสเดอนฝอยศตรพชในประเทศไทย. ภาควชาโรคพช คณะเกษตรศาสตร

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. สานกพมพร� วเขยว. กรงเทพฯ. 275 หนา Ahrén, D., Ursing, B.M. and Tunlid, A. 1998. Phylogeny of nematode trapping fungi based on

18S rDNA sequences. FEMS Microbiology Letters 158 : 179-184. Almaghrabi, O.A., Massoud, S.I. and Abdelmoneim, T.S. 2013. Influence of inoculation with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on tomato plant growth and nematode reproduction under greenhouse conditions. Saudi Journal of Biological Sciences 20 : 57-61.

57

Amer-Zareen, Siddiqui, I.A. and Zaki, M.J. 2000. Fungal parasites of root-knot nematodes. Pakistan Journal of Biological Sciences 3 : 478-480.

Cabanillas, E., Barker, K.R. and Nelson, L.A. 1989. Growth of isolates of Paecilomyces lilacinus

and their efficacy in biocontrol of Meloidogyne incognita on tomato. Journal of Nematology 21 : 164-172.

Hao, Y.E., Luo J. and Zhang K.Q. 2004. A new aquatic nematode-trapping hyphomycete.

Mycotaxon 89 : 235-239. Hao, Y.E., Mo, M., Su, H. and Zhang, K. 2005. Ecology of aquatic nematode-trapping

hyphomycetes in southwestern China. Aquatic Microbial Ecology 40 : 175-181. Hussey, R.S. and Janssen, G.J.W. 2001. Root-knot nematodes : Meloidogyne species, Pages

43-70. In Starr, J.L., Cook R. and Bridge J. (eds). Plant Resistance to Parasitic Nematodes. CABI Publishing, New York. 103 pp.

Jeewon, R., Liew, E.C.Y. and Hyde, K.D. 2002. Phylogenetic relationships of Pestalotiopsis and

allied genera inferred from ribosomal DNA sequences an morphological characters. Molecular Phylogenetics and Evolution 25 : 378-392.

Kiewnick, S. and Sikora, R.A. 2006. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne

incognita by Paecilomyces lilacinus strain 251. Biological Control 38 : 179-187. Khan, A., Williams, K.L. and Nevalainen, H.K.M. 2006. Control of plant-parasitic nematodes by

Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum in pot trials. BioControl 51 : 643-658.

58

Li, S.D., Miao, Z.Q., Zhang, Y.H. and Liu, X.Z. 2003. Monacrosporium janus sp. nov., a new nematode-trapping hyphomycete parasitizing sclerotia and hyphae of Sclerotinia

sclerotiorum. Mycological Research 107 : 888-894. Li, Y., Jeewon, R., Hyde, K.D., Mo, M.H. and Zhang, K.Q. 2006. Two new species of nematode-

trapping fungi: relationships inferred from morphology, rDNA and protein gene sequence analyses. Mycological Research 110 : 790-800

Liu, X.F. and Zhang, K.Q. 2003. Dactylella shizishanna sp. nov., from Shizi Mountain, China.

Fungal Diversity 14 : 103-107. Meyer, S.L.F., Carta, L.K. and Rehner, S.A. 2005. Morphological variability and molecular

phylogeny of the nematophagous fungus Monacrosporium drechsleri. Mycologia 97 : 405-415.

Naserinasab, F., Sahebani, N. and Etebarian, H.R. 2011. Biological control of Meloidogyne

javanica by Trichoderma harzianum BI and salicylic acid on Tomato. African Journal of Food Science 5 : 276-280. Nordbring-Hertz, B., Jansson, H.-B. and Tunlid, A. 2006. Nematophagous fungi. Encyclopedia of

Life Sciences (Online). Available from: http://www.ua.es/personal/hb.jansson/Reprints/ N-Hertz%20et%20al%20ELS%202006.pdf (Accessed 17 May 2010).

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

vol. 1. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1,659 pp. Sharma, P. and Pandey, R. 2009. Biological control of root-knot nematode; Meloidogyne

incognita in the medicinal plant; Withania somnifera and the effect of biocontrol agents on plant growth. African Journal of Agricultural Research 4 : 564-567.

59

Shamalie, B.V.T., Fonseka R.M. and Rajapaksha, R.G.A.S. 2011. Effect of Trichoderma viride and Carbofuran (Curator®) on Management of Root Knot Nematodes and Growth Parameters of Gotukola (Centella asiatica L.). Tropical Agricultural Research 23 : 61-69. Sharon, E., Bar-Eyal, M., Chet, I., Herrera-Estrella, A., Kleifeld, O. and Spiegel, Y. 2001.

Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma

harzianum. Biological Control 91 : 687-693.

Stirling, G.R., 1991. Biological Control of Plant Parasitic Nematodes. Wallingford CAB International. UK: Redwood Press Ltd. 282 pp.

Su, H., Hao, Y.E., Mo, M. and Zhang, H. 2007. The ecology of nematode-trapping hyphomycetes

in cattle dung from three plateau pastures. Veterinary Parasitology 144: 293-298. Su, H.Y., Li, Y., Mo, M.H. and Zhang, K.Q. 2005. Monacrosporium multiseptatum, a new

predacious fungus from China. Mycotaxon 92: 193-196. Sun, M. H., Gao, L., Shi, Y.X., Li, B.J. and Liu, X.Z. 2006. Fungi and actinomycetes associated

with Meloidogyne spp. eggs and females in China and their biocontrol potential. Journal of Invertebrate Pathology 93: 22-28.

Taylor, A.L. and Sasser, J.N. 1978. Biology, Identification and Control of Root-Knot Nematodes

(Meloidogyne species). International Meloidogyne Project. North Carolina State University. Raleigh, North Carolina. 111 pp.

Yang, D., Chen, W., Huang, Y., Mo, M. and Zhang, K. 2005. A new predatory fungus from

China. Mycotaxon 89 : 235-239.

60

Zakaria, H. M., Kassab, A.S., Shamseldean, M.M., Oraby, M.M. and El-Mourshedy, M.M.F. 2013. Controlling the root-knot nematode, Meloidogyne incognita in cucumber plants using some soil bioagents and some amendments under simulated field conditions. Annals of Agricultural Science (Online). Available from: http://dx.doi.org/10.1016/

j.aoas.2013.01.011 (Accessed 9 April 2013). Zhang, J., Mo, M.H., Deng, J.S., Liu, X.F., Bi, T.J. and Zhang, K.Q. 2005. Dactylella

zhongdianensis sp. nov., a new predacious antagonist of nematodes. Mycotaxon 92 : 289-294.

Zhang, Y., Qiao, M., Xu, J., Cao, Y., Zhang, K.Q. and Yu, Z.F. 2013. Genetic diversity and recombination in natural populations of the nematode-trapping fungus Arthrobotrys

oligospora from China. Ecology and Evolution 3 : 312-325. Zhang, K.Q., Liu, X.Z. and Cao, L. 1996(a). A new species of Arthrobotrys from China.

Mycological Research 100 : 274-276. Zhang, K.Q., Liu, X.Z., Cao, L. and Gao, R.H. 1996(b). Nematophagous species of

Monacrosporium from China. Mycological Research 100 : 527-530.

61

ภาคผนวก

62

ภาคผนวก ก

สตรอาหารเล�ยงเช�อจลนทรย

1. Martin’s medium

MgSO4.7H2O 0.5 กรม KH2PO4 1 กรม Peptone 5 กรม Dextrose 10 กรม Agar 20 กรม Rose bongal (1%) 3.3 มลลลตร น,ากล.น 1,000 มลลลตร Streptomycin sulfate 30 มลลกรม

วธการ

1. นาน, ากล.นผสมกบสวนผสมท.เตรยมไวตามสตร ยกเวน streptomycin sulfate นาสวนผสม เค.ยวใหวนละลายเขากนด

2. นาสวนผสมท.ไดไปน.งฆาเช,อ (autoclave) ท.อณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนด/ตารางน,ว นาน 15 นาท

3. ปลอยใหพออน เตม streptomycin sulfate แลวเทอาหารในจานเล,ยงเช,อท.อบฆาเช,อแลว 2. Potato Dextose Broth (PDB)

Potato 200 กรม Dextose 20 กรม น,ากล.น 1,000 กรม

วธการ 1. นามนฝร.งมาปอกเปลอกและลางใหสะอาด ห.นเปนรปลกเตาขนาด 1 X 1 X 1 ลกบาศก

เซนตเมตร ตมใหสก กรองแยกเอาน,าตมมนฝร.งมาผสมกบสวนผสมอ.นๆตามสตร 2. นาสวนผสมท.ได ปรมาณ 50 มลลลตร บรรจลงในหลอดทดลอง 3. น. งฆาเช,อ (autoclave) ท.อณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนด/ตารางน,ว นาน

15 นาท

63

3. Potato Dextose Agar (PDA)

Potato 200 กรม Dextose 20 กรม Agar 15 กรม น,ากล.น 1,000 กรม

วธการ

1. นามนฝร.งมาปอกเปลอกและลางใหสะอาด ห.นเปนรปลกเตาขนาด 1 X 1 X 1 ลกบาศก เซนตเมตร ตมใหสก กรองแยกเอาน,าตมมนฝร.งมาผสมกบสวนผสมอ.น ๆ ตามสตร เค.ยวใหวนละลายเขากนด

2. น. งฆาเช,อ (autoclave) ท.อณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอดน/ตารางน,ว นาน 15 นาท

3. ปลอยใหพออนแลวเทอาหารลงในจานเล,ยงเช,อท.อบฆาเช,อแลว 4. Water Agar (WA) 1.2 %

Agar 12 กรม น,ากล.น 1,000 กรม

วธการ

1. นาสวนผสมเค.ยวใหวนละลายเขากนด 2. น. งฆาเช,อ (autoclave) ท.อณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนด/ตารางน,ว นาน

15 นาท 3. ปลอยใหพออนแลวเทอาหารลงในจานเล,ยงเช,อท.อบฆาเช,อแลว

64

ภาคผนวก ข

ตารางภาคผนวกท; 1 รหสและจานวนไอโซเลทของเช,อราท.ใชในการเกบตวอยาง

รหสไอโซเลท จานวนไอโซเลท ตวอยางท;แยก แหลงท;มา

SS01- 2 ดนแปลงปลกพรก อ.อาวลก จ.กระบ. SS02- 3 ดนแปลงปลกพรก อ.อาวลก จ.กระบ. SS03- 2 ดนแปลงปลกพรก อ.เมอง จ.ตรง SS04- - ดนแปลงปลกพรก อ.ชะอวด จ.นครศรธรรมราช SS05- - ดนแปลงปลกพรก อ.ชะอวด จ.นครศรธรรมราช SS06- - ดนแปลงปลกพรก อ.เชยรใหญ จ.นครศรธรรมราช SS07- - ดนแปลงปลกพรก อ.เชยรใหญ จ.นครศรธรรมราช SS08- - ดนแปลงปลกพรก อ.ปากพนง จ.นครศรธรรมราช SS09- 2 ดนแปลงปลกพรก อ.ปากพนง จ.นครศรธรรมราช SS10- - ดนแปลงปลกพรก อ.ปากพนง จ.นครศรธรรมราช SS11- 1 ดนแปลงปลกพรก อ.ปากพนง จ.นครศรธรรมราช SS12- - ดนแปลงปลกพรก อ.รอนพบลย จ.นครศรธรรมราช SS13- - ดนแปลงปลกพรก อ.ระโนด จ.นครศรธรรมราช SS14- 1 ดนแปลงปลกพรก อ.ระโนด จ.นครศรธรรมราช SS15- - ดนแปลงปลกพรก อ.หวไทร จ.นครศรธรรมราช SS16- 4 ดนแปลงปลกพรก อ.ตะก.วทง จ.พงงา SS17- - ดนแปลงปลกพรก อ.ปาบอน จ.พทลง

SS18- 8 ดนแปลงปลกพรก อ.ถลาง จ.ภเกต SS19- - ดนแปลงปลกพรก อ.เมอง จ.ยะลา SS20- 1 ดนแปลงปลกพรก อ.ควนเนยง จ.สงขลา SS21- - ดนแปลงปลกพรก อ.ควนเนยง จ.สงขลา SS22- - ดนแปลงปลกพรก อ.ควนเนยง จ.สงขลา SS23- 3 ดนแปลงปลกพรก อ.ควนเนยง จ.สงขลา SS24- - ดนแปลงปลกพรก อ.บางกล.า จ.สงขลา

65


SS25- 4 ดนแปลงปลกพรก อ.บางกล.า จ.สงขลา SS26- 2 ดนแปลงปลกพรก อ.หาดใหญ จ.สงขลา SS27- - ดนแปลงปลกพรก อ.ทาแพ จ.สตล SS28- 2 ดนแปลงปลกพรก อ.กาญจนดษฐ จ.สราษฎรธาน SS29- 3 ดนแปลงปลกพรก อ.กาญจนดษฐ จ.สราษฎรธาน SS30- - ดนแปลงปลกพรก อ.พระแสง จ.สราษฎรธาน SS31- - ดนแปลงปลกพรก อ.เมอง จ.สราษฎรธาน

WS01- 8 ช,นสวนพชใน

แหลงน,า จ.นครศรธรรมราช (ปาพรควนเครง)

WS02- 4 ช,นสวนพชในแหลงน,า

จ.นราธวาส (ปาพรโตะแดง)


จ.ยะลา (อางเกบน,าสวนขวญเมอง)


จ.สงขลา (สระบว)

EM01- 10 กลมไขไสเดอน

ฝอยรากปม อ.ปากพนง จ.นครศรธรรมราช

EM02- 9 กลมไขไสเดอนฝอยรากปม

อ.ปาบอน จ.พทลง


อ.เมอง จ.ยะลา


อ.ควนเนยง จ.สงขลา


อ.ทาแพ จ.สตล


อ.กาญจนดษฐ จ.สราษฎรธาน

66


SR01- 18 ดนท.พบโรค รากปมของพรก

อ.ปากพนง จ.นครศรธรรมราช


อ.ปาบอน จ.พทลง


อ.เมอง จ.ยะลา


อ.ควนเนยง จ.สงขลา


อ.ทาแพ จ.สตล


อ.กาญจนดษฐ จ.สราษฎรธาน

ตารางภาคผนวกท; 2 ชนดและรหสไอโซเลทของเช,อราปฏปกษท.แยกไดจากตวอยางดน

เช�อรา ไอโซเลท

Arthrobotrys oligospora SS02-02 SS09-02 SS09-03 SS20-01

Monacrosporium bembicodes SS03-01 SS03-04 SS16-04 SS18-01 SS18-02

SS18-03 SS18-04 SS18-05 SS25-01 SS25-02

SS25-03 SS25-04 SS28-02 SS28-03

Monacrosporium aphrobrochum SS11-02 SS14-02 SS23-01 SS23-02 SS23-03

SS29-02 SS29-03

Monacrosporium thaumasium SS01-02 SS01-05 SS02-01 SS02-03 SS16-01

SS16-03 SS16-05 SS26-02 SS26-03 SS29-04

Harposporium cycloides SS18-01 SS18-02 SS18-04

67

ตารางภาคผนวกท; 3 ชนดและรหสไอโซเลทของเช,อราปฏปกษท.แยกไดจากช,นสวนของพชท.จม หรอลอยอยในน,า

สถานท; ไอโซเลท ชนดของเช�อรา วสดท;พบ

จ.นครศรธรรมราช WS01-01 Arthrobotry oligospora ใบไมไมทราบชนด

(พรควนเครง) WS01-02 Monacrosporium aphrobrochum ก.งไมไมทราบชนด

WS01-03 Monacrosporium aphrobrochum เปลอกไมเสมด

WS01-04 Monacrosporium bembicodes ใบกระถนณรงค

WS01-05 Monacrosporium bembicodes กกไมทราบชนด

WS01-06 Monacrosporium bembicodes จอกแหนไมทราบชนด

WS01-07 Monacrosporium bembicodes ใบบว

WS01-08 Monacrosporium thaumasium สาหรายไมทราบชนด

จ.นราธวาส WS02-01 Monacrosporium bembicodes กานบว

(พรโตะแดง) WS02-02 Monacrosporium bembicodes สาหรายไมทราบชนด

WS02-03 Monacrosporium thaumasium ใบสาค

WS02-04 Monacrosporium thaumasium ลกหลมพ

จ.ยะลา WS03-01 Monacrosporium aphrobrochum ใบไผ

(อางเกบน,าสวนขวญเมอง) WS03-02 Monacrosporium bembicodes ใบประด

WS03-03 Monacrosporium thaumasium ก.งไมไมทราบชนด

จ.สงขลา WS04-01 Monacrosporium aphrobrochum ใบบว

(สระบว) WS04-02 Monacrosporium bembicodes วชพชน,าไมทราบชนด

WS04-03 Monacrosporium thaumasium ผกตบชวา

WS04-04 Monacrosporium thaumasium ผลไมทราบชนด

68

ภาคผนวก ค

ตารางภาคผนวกท; 4 วเคราะหความแปรปรวนระดบความรนแรงในการเกดปมของรากพรก (ระดบ 0-5) เม.ออาย 60 วน

Source df SS MS F Treatment 6 180.886 30.148 87.834* Error 133 45.650 0.343 Total 139 226.536

C.V. 44.32% *แตกตางทางสถตอยางมนยสาคญท. p<0.05 ตารางภาคผนวกท; 5 วเคราะหความแปรปรวนน,าหนกรากสดของพรก เม.ออาย 60 วน

Source df SS MS F Treatment 6 394.380 65.730 56.992* Error 133 153.391 1.153 Total 139 547.771

C.V. 19.93% *แตกตางทางสถตอยางมนยสาคญท. p<0.05 ตารางภาคผนวกท; 6 วเคราะหความแปรปรวนน,าหนกตนสดของพรก เม.ออาย 60 วน

Source df SS MS F Treatment 6 701.568 116.928 42.507* Error 133 365.853 2.751 Total 139 1,067.421

C.V. 11.43% *แตกตางทางสถตอยางมนยสาคญท. p<0.05

69

ตารางภาคผนวกท; 7 วเคราะหความแปรปรวนผลผลตพรก ท.เกบเก.ยวเม.ออาย 60 วน

Source df SS MS F Treatment 6 4,610.524 768.421 78.225* Error 133 1,306.495 9.823 Total 139 5,917.019

C.V. 15.18% *แตกตางทางสถตอยางมนยสาคญท. p<0.05

70

ประวตผเขยน

ช;อ สกล นายสมลกษณ วงษตาน รหสประจาตวนกศกษา 5110620029 วฒการศกษา

วฒ ช;อสถาบน ปท;สาเรจการศกษา

วทยาศาสตรบณฑต (เกษตรศาสตร)

มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2547

รฐศาสตรบณฑต(ความสมพนธระหวางประเทศและการเมอง

การปกครองเปรยบเทยบ)

มหาวทยาลยสโขทยธรรมาธราช 2553

ตาแหนงและสถานท;ทางาน

ตาแหนง นกวชาการสงเสรมการเกษตรชานาญการ สถานท.ทางาน กลมอารกขาพช สานกงานเกษตรจงหวดนราธวาส

การตพมพเผยแพรผลงาน

สมลกษณ วงษตาน และ วสนณ เพชรรตน. 2554. เช,อรากบดกไสเดอนฝอยในเขตภาคใตของ ประเทศไทย. รายงานการประชมวชาการวทยาศาสตรและเทคโนโลย คร, ง ท. 9 (วทยาศาสตรและวทยาศาสตรเพ.อสขภาพ). วนท. 30 มถนายน 2554. คณะวทยาศาสตรและ เทคโนโลย มหาวทยาลยธรรมศาสตร ศนยรงสต. หนา 76-82.

ของพริก (Capsicum spp.) โดยชีววิธี Nematophagus Fungi in...

Documents

Transcript of ของพริก (Capsicum spp.) โดยชีววิธี Nematophagus Fungi in...