A vazopresszin szabályozó szerepe akut és krónikus

stresszfolyamatok során Tanulmányok Brattleboro patkánytörzsön

Doktori értekezés

Domokos Ágnes Judit

Semmelweis Egyetem

Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Zelena Dóra tudományos főmunkatárs Ph.D.

Hivatalos bírálók: Dr. Hajszán Tibor tudományos munkatárs Ph.D.

Dr. Bódizs Róbert tudományos főmunkatárs Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Halász Béla egyetemi tanár, az MTA tagja

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nagy M. György egyetemi tanár, az MTA tagja

Dr. László Lajos egyetemi docens

Budapest

2012

2

Tartalomjegyzék

Tartalomjegyzék ............................................................................................................. 2

Rövidítések jegyzéke ...................................................................................................... 6

1. Bevezetés .................................................................................................................... 8

1.1. Stresszelméletek .......................................................................................... 9

1.2. Stresszorok ................................................................................................. 10

1.3. A hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely ........................................... 12

1.3.1. A hipotalamusz .................................................................................... 13

1.3.1.1. A nucleus paraventricularis hypothalami anatómiája és peptidjei 13

1.3.1.2. Kortikotropin elválasztást serkentő hormon (CRH) ...................... 15

1.3.2. A hipofízis ........................................................................................... 16

1.3.2.1. Adrenokortikotróp hormon (ACTH) ............................................. 17

1.3.3. Mellékvese ........................................................................................... 18

1.4. A stresszfolyamatok életkori sajátosságai: A perinatális kor .................... 22

1.5. Vazopresszin (AVP) .................................................................................. 23

1.5.1. Az AVP fő hatásai ............................................................................... 24

1.5.2. Az AVP hatása stresszben ................................................................... 27

1.5.3. Az AVP jelentősége pszichiátriai betegségekben ................................ 29

2. Célkitűzések ............................................................................................................. 32

3. Módszerek ................................................................................................................ 33

3.1. Kísérleti állatok .......................................................................................... 33

3.1.1. A Brattleboro törzs .............................................................................. 33

3.1.2. Tartási körülmények ............................................................................ 35

3.2. Mintavétel .................................................................................................. 36

3.2.1. Krónikus juguláris kanül beültetése vérminták vétele céljából ........... 36

3.2.2. Vérminta nyerése farokvénából ........................................................... 36

3.2.3. Vér és szövetminták nyerése dekapitálással ........................................ 36

3.3. Mérések ...................................................................................................... 37

3.3.1. Hormonmérések ................................................................................... 37

3.3.2. In situ hibridizáció ............................................................................... 38

3.3.2.1. Szövetelőkészítés ........................................................................... 38

3.3.2.2. Hibridizáció ................................................................................... 38

3.3.3. A mellékvesék szövettani feldolgozása ............................................... 40

3.3.4. Statikus inkubálás ................................................................................ 40

3.3.5. Szuperfúzió .......................................................................................... 41

3.4. Kísérletek-Kísérleti protokollok ................................................................. 42

3.4.1. Akut stressz kísérletek .......................................................................... 42

3.4.1.1. Újdonság stressz (Novelty) ............................................................ 42

3.4.1.2. Szociális elkerülés (Social avoidance) ........................................... 42

3.4.1.3. Emelt keresztpalló teszt (elevated plus maze (EPM)) ................... 42

3.4.1.4. Lipopoliszacharid (LPS) injekció .................................................. 43

3.4.1.5. Éter inhaláció ................................................................................. 43

3.4.1.6. Hipertóniás só oldat injekciója ...................................................... 43

3

3.4.1.7. Anafilaktoid reakció ...................................................................... 43

3.4.1.8. „Foot-shock” stressz (lábra mért áramütés) ................................... 44

3.4.1.9. Ulcerogén, hidegben történő immobilizáció .................................. 44

3.4.1.10. Mozgáskorlátozás (Restraint) ...................................................... 44

3.4.1.11. Szociális „kudarc” teszt (Social defeat) ....................................... 44

3.4.1.12. Hipoglikémia ............................................................................... 45

3.4.1.13. Forszírozott úszás stressz (forced swim test (FST)) .................... 45

3.4.1.14. A CRH érzékenység vizsgálata ................................................... 45

3.4.1.14.1. In vivo tesztelés ..................................................................... 45

3.4.1.14.2. In vitro tesztelés: statikus inkubálás ...................................... 45

3.4.1.15. Mellékvese inkubálás ................................................................... 46

3.4.1.16. AVP retrodialízis a PVN-be ........................................................ 46

3.4.1.17. Egyszeri morfin kezelés hatása .................................................... 47

3.4.2. Krónikus stressz kísérletek .................................................................. 48

3.4.2.1. Krónikus morfin kezelés utáni morfin megvonás hatása ............... 48

3.4.2.2. 28 napos ismételt mozgáskorlátozás (repeated restraint) .............. 48

3.4.2.3. Krónikus váltakozó, enyhe stressz ................................................. 49

3.4.2.4. Magatartás az emelt keresztpallón ................................................. 49

3.4.2.5. Magatartás az FST alatt ................................................................. 50

3.4.3. Perinatális kor vizsgálata ..................................................................... 50

3.4.3.1. Kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata ........................... 50

3.4.3.2. Perinatális kor: Nemek közötti különbségek ................................ 52

3.5. Statisztika ................................................................................................... 53

4. Eredmények .............................................................................................................. 54

4.1. A felnőtt Brattleboro patkányok akut stresszreaktivitása ......................... 54

4.1.1. Újdonság stressz (Novelty stress) ........................................................ 54

4.1.2. Szociális elkerülés (Social avoidence) ................................................. 54

4.1.3. Emelt keresztpalló teszt (EPM) ........................................................... 54

4.1.4. Lipopoliszacharid (LPS) injekció ........................................................ 55

4.1.5. Éter inhaláció ....................................................................................... 55

4.1.6. Hipertóniás só oldat injekciója ............................................................ 56

4.1.7. Anafilaktoid reakció ............................................................................ 56

4.1.8. „Foot-shock” stressz ............................................................................ 57

4.1.9. Ulcerogén, hidegben történő immobilizáció ........................................ 58

4.1.10. Mozgáskorlátozás (Restraint) ............................................................ 58

4.1.11. Szociális „kudarc” teszt (Social defeat) ............................................. 59

4.1.12. Hipoglikémia ..................................................................................... 60

4.1.13. Forszírozott úszás stressz (FST) ........................................................ 60

4.1.14. A hipofízis elülső lebeny CRH érzékenység vizsgálata .................... 61

4.1.14.1. In vivo tesztelés ........................................................................... 61

4.1.14.2. In vitro tesztelés: statikus inkubálás ............................................ 62

4.1.15. Mellékvese inkubálás..........................................................................62

4.1.16. A vazopresszin hiányos állatok forszírozott úszástesztben mutatott

stressz reaktivitása AVP retrodialízises kísérletben ......................................... 63

4

4.1.16.1. ACTH és kortikoszteron szintek változása ................................... 63

4.1.16.2. Oxitocin ........................................................................................ 64

4.1.16.3. Oxitocin és CRH mRNS in situ hibridizáció a PVN-ben..............64

4.1.16.4. Az FST során a PVN-ből nyert mikrodialízis minták elemzése ... 65

4.1.16.5. Szintetikus AVP retrodialízis hatásának vizsgálata FST alatt.......66

4.1.17. Vazopresszin hiányos állatok vizsgálata akut morfin kezelés után ..... 67

4.2. A vazopresszin hiányos állatok krónikus stresszhelyzetekben mutatott

stresszválaszának vizsgálata ............................................................................. 68

4.2.1. Krónikus morfin kezelés utáni drogmegvonás hatása ........................... 68

4.2.1.1. Szomatikus változások ..................................................................... 68

4.2.1.2. AVP mRNS szintek változása a PVN-ben ...................................... 69

4.2.1.3. CRH mRNS szintek változása..........................................................70

4.2.1.4. POMC mRNS szintek változása az adenohipofízisben ................... 70

4.2.1.5. Nyugalmi kortikoszteron szintek változása ..................................... 71

4.2.1.6. Krónikus morfin kezelést követő akut elvonás okozta

hormonváltozások ............................................................................................. 71

4.2.2. A vazopresszin szerepének vizsgálata a krónikus, 28 napos

mozgáskorlátozás kísérletben ........................................................................... 72

4.2.2.1. Testsúly és egyes szervsúlyok változásai ........................................ 72

4.2.2.2. Változások a mellékvesében ............................................................ 73

4.2.2.3. Változások az mRNS szintekben ..................................................... 74

4.2.2.4. Változások a hormonszintekben ...................................................... 77

4.2.3. Krónikus váltakozó enyhe stressz vizsgálata ......................................... 78

4.2.3.1. Szomatikus paraméterek változásai ................................................. 78

4.2.3.2. Változások a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyen ........... 79

4.2.3.3. Emelt keresztpalló teszt a szorongás mérésére ............................... 80

4.2.3.4. Forszírozott úszás, a depresszió-szerű magatartás mérője ............. 82

4.3. A vazopresszin szerepének vizsgálata perinatális korban ............................ 82

4.3.1. Kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata .................................... 82

4.3.1.1. HHM tengely aktiváció 24 órás anyai depriváció hatására 10 napos

korban ............................................................................................................... 83

4.3.1.2. HHM tengely aktiváció 1, 4, 12, 24 órás anyai deprivációra 10 napos

korban ............................................................................................................... 83

4.3.1.3. A HHM tengely aktiváció fejlődése a perinatális korban ................ 85

4.3.1.4. Hypnorm kezelés hatása 10 napos korban ....................................... 86

4.3.1.5. A Hypnorm kezelés hatása 5, 10, és 20 napos kispatkányokban ..... 87

4.3.1.6. A mellékvesék ACTH érzékenységének vizsgálata ........................ 87

4.3.1.7. Exogén ACTH iránti érzékenység: Synacten kezelés 10 napos

patkányban ........................................................................................................ 88

4.3.2. Különböző nemű kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata ....... 89

4.3.2.1. 24 órás anyai szeparáció .................................................................. 89

4.3.2.2. Ismételt éter stressz .......................................................................... 91

5. Megbeszélés ............................................................................................................. 92

5.1. A vazopresszin szerepének vizsgálata akut stresszhelyzetekben ...................... 92

5.1.1. Különféle akut stresszhelyzetek hatása ....................................................... 92

5

5.1.2. Mikrodialízis vizsgálatok ............................................................................. 97

5.1.3. A vazopresszin hiányos állatok vizsgálata akut morfin kezelés után ........ 101

5.2. Vazopresszin szerepe krónikus stresszben ...................................................... 101

5.2.1. Krónikus morfin kezelés utáni megvonás .................................................. 101

5.2.2. Mozgáskorlátozás 28 napig ....................................................................... 104

5.2.3. Krónikus váltakozó enyhe stressz (CMS) vizsgálata ................................. 108

5.3. Stressz reaktivitás a perinatális korban ............................................................ 110

5.3.1. A vazopresszin hatása a kispatkányok stresszreaktivitására ..................... 110

5.3.2. Különböző nemű kispatkányok stresszreaktivitásának vizsgálata ............ 114

6. Következtetések ...................................................................................................... 117

7. Összefoglalás .......................................................................................................... 118

7. Summary ................................................................................................................. 119

8. Irodalomjegyzék ..................................................................................................... 120

9. Saját publikációk jegyzéke ..................................................................................... 138

9.1 A disszertácó alapjául szolgáló közlemények, könyvfejezet ............................ 138

9.2 . Egyéb- nem az értekezés témájában megjelent- közlemények: ..................... 139

10. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................. 140

6

Rövidítések jegyzéke

ACTH adrenokortikotropin (angol: andrenocorticotropin hormone)

ADX mellékveseirtás (adrenalectomia)

AUC görbe alatti terület (angol: area under the curve)

AVP arginin vazopresszin

BSA szarvasmarha szérum albumin (angol: bovin serum albumin)

CeA centrális amigdala

CRH kortikotropin elválasztást serkentő hormon (angol: corticotropin

releasing hormone)

CMS krónikus váltakozó, enyhe stressz (angol: chronic mild stress)

DAG diacil-glicerol

DMEM Dulbecco’s minimal essential medium

EPM emelt keresztpalló (angol: elevated plus maze)

FST forszírozott úszás teszt, (angol: forced swim test)

GR glükokortikoid receptor

HAB high anxiety behavior, fokozott szorongási magatartást mutató állat

az EPM alapján

HHM tengely hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely

Hsp hősokk protein

ip intraperitoneális, hasüregbe történő injekció

IP3 inozitol trifoszfát

iv intravénás injekció

KPBS kálium-foszfát puffer

LAB low anxiety behavior, csökkent szorongási magatartást mutató állat az

EPM alapján

LPS lipopoliszacharid injekció, a bakteriális infekció modellje

MR mineralokortikoid receptor

OT oxitocin

PKA protein kináz A

7

PKC protein kináz C

PLC foszfolipáz C

POMC proopiomelanokortin

PVN hipotalamusz paraventrikuláris magja (nucleus paraventricularis

hypothalami)

RIA radioimmuno assay

SAP kockázatfelmérő magatartás (angol: stretched attend postures)

sc szubkután, bőr alá történő injekció

SCN hipotalamusz szuprakiazmatikus magja (nucleus suprachiasmaticus)

SHRP csökkent stressz reaktivitású időszak (angol: stress hyporesponsive

period)

SON hipotalamusz szupraoptikus magja (nucleus supraopticus

hypothalami)

SSC nátrium-klorid, trinátrium-citrát puffer (angol: saline-sodium citrate

buffer)

TRH tireotropin elválasztást serkentő hormon (angol: thyrotropin releasing

hormone)

8

1. Bevezetés A stressz fogalma a mindennapi életben széles körben elterjedt, gyakran halljuk,

olvassuk ezt a szót. Különböző tudományterületek is használják, bár a mai napig nincsen

általánosan elfogadott definíciója. A stresszt az élettudományok által definiáltan, mint

betegséget, sajátos kórállapotokat kiváltó tényezőt tekinthetjük. Az általános vélekedéssel

ellentétben a stressz maga nem betegség, hanem egy betegségsorozat elindítója lehet,

ugyanakkor a krónikusan fennálló betegségek komoly megterhelést jelentenek a szervezet

számára és a krónikus stresszre jellemző tünetegyüttest hozzák létre. Ismert, hogy a tartósan

stressznek kitett személyek immunrendszere legyengül, gyakrabban jelennek meg

fertőzések, és a rákos megbetegedések száma is növekszik [1]. A krónikus stresszel

kapcsolatba hozható betegségek közé sorolható a gyomorfekély [2], a magyar lakosságot is

egyre nagyobb számban érintő magas vérnyomás [3] és cukorbetegség is [4]. Régóta ismert

tény, hogy a stressznek a termékenység szabályozásában is nagy szerepe van [5]. A

pszichiátriai rendellenességek közül a depresszió [6], a skizofrénia [7], a post traumás

stressz betegség [8] és a szorongásos kórképek kialakulásával hozható összefüggésbe. A

probléma összetettségét mutatja, hogy az említett mentális betegségek további fizikális és

mentális problémákat vonzanak maguk után („enyhébb” esetben a dohányzást, az

alkoholizmust, a drogfüggőséget, szélsőséges esetben az öngyilkosságot, ön- és

közveszélyességet), amelyek - mintegy ördögi körként - maguk is stresszként szolgálnak a

szervezet számára.

Az Egészségügyi Világszervezet előrejelzése szerint egy évtized múlva a stresszel

igen szoros kapcsolatot mutató depresszió lesz a fejlett világban az egyik leggyakoribb

betegség [9]. A felnőtt lakosság 6-15%-a esik át életében egyszer egy depressziós epizódon

[10]. Magyarországon kb. 400 000 depressziós beteg van, de csak töredéküknél ismerik fel

a betegséget, és még kevesebb azok száma, akik a megfelelő terápiában részesülnek.

Munkánk során Selye János elméletéből kiindulva [11] a stresszt a szervezet bonyolult és

összetett válaszának tekintjük minden, a szervezetet érintő negatív kihívásra.

9

1.1. Stresszelméletek

Fontos tudománytörténeti mozzanat volt az a felismerés, hogy az élő szervezet mind

a belső biológia rendszerének változásaira, mind pedig a külső környezetből érkező

negatív, esetenként pozitív ingerekre, változásokra azonos módon képes reagálni. Selye

János fogalmazta meg az „általános adaptációs szindróma elméletét” és a „stressz”

fogalmát, mellyel örökre beírta magát a tudománytörténetbe [11]. Alapvető megfigyelései

közé tartozott az, hogy különféle ingerek – az ingerektől független módon - nagyon hasonló

válaszreakciókat váltanak ki a szervezetben. Ezek a mellékvesék megnagyobbodása, a

csecsemőmirigy visszafejlődése, a gyomrot és a beleket érintő fekélyek megjelenése. A

kiváltó ingereket stresszornak, ezen tüneteket összefoglaló néven pedig „stressz-

szindrómának” nevezte el és a glükokortikoid hormonok tartós és fokozott elválasztásával

hozta kapcsolatba. Felismerte azt is, hogy a glükokortikoidok alapvető fontosságúak a

szervezet védekezőképességének fenntartásában. Bár a glükokortikoidok szerepe bizonyos

élettani funkciók vonatkozásában jól ismert - a kardiovaszkuláris tónus fenntartása, az

immunrendszer működésének gátlása, energia raktár mobilizálás - a stresszfolyamatok

vonatkozásában napjaink kutatásainak sikerül újabb és újabb kérdésekre választ adnia.

Selye munkásságából kiindulva, illetve vele párhuzamosan számos más stresszelmélet

létezik, melyek más és más nézőpontból közelítik meg és értelmezik a stressz fogalmát.

Alan Munck elmélete szerint a glükokortikoidok elsődleges funkciója egy sajátos

„önkorlátozó” szerep a stresszre adott válaszokban. Vagyis megakadályozzák azt, hogy

ezen válaszok elszabaduljanak és a szervezetben lejátszódó folyamatok károsak legyenek

az egyénre nézve. Munck ezen elméletét látszanak alátámasztani azok a kísérletek, melyben

a glükokortikoidok tartós elvonása krónikus gyulladásos kórképek megjelenését

eredményezi [12].

Bruce McEwen sajátos oldalról közelíti meg a homeosztázis fennmaradásának és a

stressznek a kérdéskörét. Elméletében egy homeosztatikus és egy allosztatikus rendszert

jelenít meg. A homeosztatikus rendszerben a paraméterek csak egy nagyon szűk

tartományon belül változhatnak, és ezen paraméterek mérhetetlenül nagy változásai az

egyed halálát is okozhatják. Az allosztatikus rendszerben azonban a paraméterek egy

10

tágabb tartományon belül képesek a változásra és éppen ezek a változások lesznek azok,

amelyek állandóságot biztosítanak az egyed számára. Ebben a megközelítésben az endokrin

rendszer és ezen belül is a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely (HHM tengely) az

allosztatikus rendszerek mintapéldája. Egyes kutatók szerint az allosztázis jelenségének

létezése kérdéses, fogalmának bevezetése szükségtelen [13].

Elgondolkodtató modellt állít fel Gerald Hüther. A stresszt nem a homeosztatikus

paramétereket befolyásoló folyamatnak írja le, hanem mint a törzsfejlődés, a szelekció

egyik eszközét [14]. Elméletében arra világít rá, hogy minden egyed rendelkezik egy

úgynevezett „archaikus stresszválasszal”, mely genetikailag kódolt, ennél fogva szűk

keretek közé szorított. A törzsfejlődést követve, a magasabb rendű gerincesek felé haladva

az archaikus stresszválasz egyre bonyolultabb viselkedési mintázatokkal egészül ki. Vagyis

a stressz jelentősége ebben a modellben az, hogy a stresszválasz során bekövetkező

sajátságos tanulási folyamatok megváltoztatják az egyedek viselkedési stratégiáit és az

egyed eljuthat a stresszhez való adaptáció szintjére (kontrollálható stressz). Amennyiben

azonban az egyed tartós stresszhelyzetben van, súlyos patológiai változások alakulhatnak

ki. Ilyenek például a gonadotróp funkciók csökkenése, a depresszió, melyek

nagymértékben csökkentik az egyed szaporodásra való képességét, ezáltal az adott

genotípus eltűnhet a populációból. Hüther elméletét alátámaszthatja, hogy a

stresszfolyamatokban kitüntetett szerepű glükokortikoidok receptorai legnagyobb számban

a tanulási, emocionális folyamatokban központi szerepet játszó limbikus területeken

találhatóak [15].

1.2. Stresszorok

Meglehetősen nehéz dolgunk van, ha arra készülünk, hogy a különböző

stresszorokat csoportosítsuk, hiszen rengeteg szempont szerint tehetjük ezt.

Csoportosíthatjuk őket intenzitásuk (erős vagy gyenge) alapján. Beszélhetünk

pszichológiai (pl. újdonság stressz, szociális elkerülés), fizikai (pl. „foot-shock”, fertőzés,

vérzés [16]), metabolikus (pl. hipoglikémia, hipertóniás só injekció, éhezés [17])

stresszről. Lehet a stressz kognitív (pl. mozgáskorlátozás - restraint), vagy nem kognitív

11

(pl. fertőzés) [18]; illetve szisztémás (pl. ozmótikus stressz stimulus vagy kardiovaszkuláris

veszélyhelyzet) vagy neurogén (fizikai, pl. immobilizáció) [19].

A stresszkutatás mai nézetei szerint alapvetően két fő irányvonalat vázolhatunk fel a

stresszorok csoportosításában. A csoportosítás alapja az, hogy vajon a stressz

feldolgozásában magasabb előagyi struktúrák (pl. limbikus területek) részt vesznek-e vagy

sem. A fizikai stresszorok valamely homeosztatikus paraméter viszonylagos állandóságát

veszélyeztetik, ezek például metabolikus, ozmotikus, immunológiai megterhelést

jelentenek. Jellemző, hogy az agykérgi aktiváció minimális, a stresszorok közvetlenül

aktiválják az agytörzsi viszceroszenzoros központokat. Innen az ingerület egyszerű, néhány

neuronos pályákon keresztül jut el a HHM tengelyhez. A neuronális bemenetek többfélék

lehetnek és az aktivált területek is a stresszor természetétől függnek. A baroreceptorok, a

tápcsatorna, a szív, a máj, a légzőrendszer kemoreceptorai a nucleus tractus solitarii-n

keresztül érik el a hipotalamuszt [20, 21]. A plazma ozmolalitás változásai a

cirkumventrikuláris szervekre vannak hatással [22], míg a testhőmérséklet változásai a

hipotalamusz termoreceptív területeit aktiválják [23].

Pszichogén stresszorok például a megszokottól eltérő környezet, a bezártság,

immobilizáció. Ebben az esetben sokkal összetettebb szomatoszenzoros (esetenként

nociceptív) ingerek azok, melyek a HHM tengely fokozott működését váltják ki.

Pályakövetéses és léziós vizsgálatok arra engednek következtetni, hogy a prefrontális

cortex, a hippokampusz, az amigdala elsődleges szerephez jut ezen stresszorokra adott

endokrin válaszok kialakításában [24-27].

Noha az előbb említett két fő csoportba besorolhatjuk valamennyi stresszort, valójában

minden stimulus fizikai és pszichogén elemeket egyaránt magába foglal eltérő arányban.

Még az irodalom sem egységes a stressz időbeni fennállásának megítélésével

kapcsolatban. Ezen szempont alapján beszélhetünk akut, krónikus, valamint a két

kategória közé eső szubakut stresszről. Az irodalom nagy része az akut stresszfolyamatok

tanulmányozásáról szól, hiszen ez kívánja a legkevesebb munkát és ez okozza a

legkevesebb szenvedést az állatoknak. Nehézséget jelenthet azonban az akut stressz

megfogalmazása: az állatok új környezetbe helyezése történhet 5-10, de akár 30-60 perces

időtartamra is, és egy immunválaszt kiváltó egyszeri lipopoliszacharid (LPS) injekció

12

aktiváló hatása még napok múlva is kimutatható. Általános következtetések levonásához

célszerű többféle stresszor összehasonlítása, akkor is, ha mindegyiket akut hatásúnak

tekintjük is.

A humán patofiziológiás vonatkozások szempontjából azonban sokkal nagyobb a

jelentősége a krónikus stressznek. Az állatkísérletekben alkalmazott időskála itt is elég

széles. Az 5 naptól (streptozotocinnal kialakított cukorbetegség [28]) az 5-9 hétig (a

depresszió modellnek számító krónikus enyhe stressz [29]) sokféle időtartammal

találkozhatunk az irodalomban. Az ismétlődések hatására háromféle válaszkészség változás

jöhet létre. 1.) az ismétlődő stresszorra deszenzitizáció, míg egy új stimulusra fokozott

érzékenység jöhet létre. 2.) az ismétlődő ingerre ugyan nincs adaptáció, de az új ingerre

hiperaktivitás figyelhető meg, mely főként ismételt fájdalmas ingerekre, és inzulin

hipoglikémia esetén alakul ki. 3.) csökkent, elnyújtott stresszhormon válasz [30]. Mivel

mindhárom esetben a HHM tengely működése eltérő mértékben, de megtartott, ezért

feltételezték, hogy a szabályozás oly módon változik, hogy a megemelkedett

glükokortikoid szintek negatív feedback hatása kevésbé érvényesül. Kimutatták, hogy a

hipotalamuszban a neuropeptidek összetétele eltolódik. A glükokortikoidok negatív

visszacsatolására kevésbé érzékeny vazopresszin (arginine vasopressin, AVP) mennyisége

megnő [31]. Ezekből az adatokból Mary Dallman [32] és Greti Aguilera [30] arra a

következtetésre jutottak, hogy az AVP lenne a HHM tengely fő hipotalamikus szabályozója

krónikus stressz során. Saját vizsgálataink megkezdése előtt ez az elmélet kezdett szélesebb

körben elfogadottá válni, bár bizonyító erejűnek számító vizsgálatok hiányoztak (pl. AVP

hiányos állatokon kialakul-e a krónikus stressz).

1.3. A hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely

A stresszválaszok kialakításában számos agyi terület vesz részt, melyek a vegetatív,

az endokrin, és a magatartási válaszkomponensek finom összehangolásával teszik lehetővé

az egyed számára a túlélést. Ugyan a különböző stresszorok eltérő agyi területeket

mozgósítanak a központi idegrendszerben, az ingerek minden esetben a végső feldolgozás

13

helyére, a hipotalamuszban található hipofizeotróp kissejtes (parvocelluláris) neuronokba

futnak be. A feldolgozandó ingerek hatására ezek a sejtek kortikotropin elválasztást

serkentő hormont (CRH) és AVP-t juttatnak az agyalapi mirigy sajátos portális

keringésébe. A portális vérbe jutott CRH és AVP fokozza a hipofízis elülső lebenyének

(adenohipofízis) adrenokortikotróp hormonjának (adrenocorticotropin, ACTH)

termelődését, mely végső soron a mellékvesék kéregállományában található sejtek

glükokortikoid szekrécióját fokozza (1. ábra).

1. ábra A hipotalamusz-hipofízis rendszer

sdt.sulinet.hu

1.3.1. A hipotalamusz

1.3.1.1. A nucleus paraventricularis hypothalami anatómiája és peptidjei

A hipotalamusz paraventrikuláris magja (PVN) a harmadik agykamra két oldalán

elhelyezkedő sejtcsoport, szövettani metszeteken Nissl festéssel (magnocelluláris sejteket

festi) jellegzetes alakjáról könnyen felismerhető (2. ábra).

2. ábra

Magnocelluláris

neuronok

AVP; OXT

Magnocelluláris

neuronok

AVP; OXT

A hipotalamikus PVN felépítése és almagjai

dp = dorzális parvocelluláris almag, mp = mediális parvocelluláris almag, pp = periventriculáris

parvocelluláris almag, vp = ventrális parvocelluláris almag, M= magnocelluláris neuronok http://www.endotext.org/neuroendo/neuroendo3b/neuroendo3b_4.htm

14

A mag a benne található sejtek felépítése, alakja, peptidtartalma, afferens és efferens

kapcsolatai alapján több jól elkülönülő almagra osztható.

A mag oldalsó, felső részében találhatóak a nagysejtes (magnocelluláris) neuronok. Az

elsődleges hormontartalmuk alapján ezeket vazopresszinerg és oxitocinerg sejtekre

oszthatjuk. Mindkét sejt a két fő hormonon kívül további peptideket is termel, valamit az

AVP és az oxitocin (OT) egyetlen sejtben is jelen lehet és különböző élethelyzetekben (pl.

laktáció) a koexpresszió mértéke megváltozik [33]. Ezek a neuronok a hipofízis hátsó

lebenyébe küldik rostjaikat.

A mag mediális része a parvocelluláris neuronokat tartalmazza, melyek egy része

neuroendokrin, más része pedig autonóm funkcióval bír. Neuroendokrin sejtcsoportokat az

anterior és a dorzális mediális parvocelluláris, illetve a periventrikuláris területeken

találunk. Ezen sejtek axonjai az eminencia mediana területén végződnek a hipofízis

kapillárisrendszerén és a szerv elülső lebenyének hormontermelését szabályozzák. A

vegetatív funkciójú sejtek a neuroendokrin sejtektől elkülönülten, dorzálisan helyezkednek

el („dorsal cap”). Ezen parvocelluláris rostok kilépve a hipotalamuszból az agytörzs és a

gerincvelő preganglionáris központjaiban végződnek.

Az egyes sejtcsoportok nem csak anatómiájukban és elhelyezkedésükben, hanem

funkcionálisan is eltérnek egymástól. A periventrikuláris területek jellemző hormonja a

szomatosztatin, míg a tireotropin elválasztást serkentő hormon (TRH) termelő neuronok

elsősorban a periventrikuláris területekről laterálisan elhelyezkedő részeken találhatóak. A

CRH termelő sejteket a TRH neuronoktól még laterálisabban találjuk. Mind a

magnocelluláris, mind a parvocelluláris sejtcsoportokra jellemző hogy a sejtek nem

kizárólagosan egy neuropeptidet, hanem azok egy csoportját termelik. A TRH, CRH sejt

stb. elnevezés arra utal, hogy mi a sejt fő hormonja, neuroaktív anyagja.

A parvocelluláris sejtekre különösen jellemző, hogy nem egyetlen, hanem több neuropeptid

jelenléte is kimutatható egy adott sejtcsoport sejtjeiben (koexpresszió). Így például jelen

vannak enkefalinok, galanin, angiotenzin II, neurotenzin és az AVP [34]. Az AVP

kivételével ezen hormonok jelentősége a stressz szempontjából kevésbé vizsgált. Jellemző,

hogy a koexpresszió folyamatosan fennáll, de mértéke dinamikusan változik.

15

1.3.1.2. Kortikotropin elválasztást serkentő hormon (CRH)

A stresszválaszok kialakításában az elsődleges szerep a CRH-nak tulajdonítható, az

emlősök többségében ez az első számú molekula, amely a hipofizeális adrenokortikotropin

(ACTH) elválasztását fokozza. A 41 aminosavból álló polipeptid egy 196 aminosavas

prepro-CRH molekulából enzimatikusan hasítódik ki. A központi idegrendszerben a

legnagyobb CRH sejtpopulációt a PVN parvocelluláris neuronjai adják. Normál

körülmények között a sejttestekben CRH csak nagyon kis mennyiségben mutatható ki, míg

az eminentia mediana zona externa-hoz futó axonokban jelentős a hormonmennyiség [35].

A CRH tartalmú vezikulák ebben a térben tárolódnak és stimulus hatására ürülnek a

hipofízis portális keringésébe. A központi idegrendszerben nem a PVN az egyetlen terület,

ahol CRH immunreaktivitás kimutatható. CRH termelő sejtek megtalálhatóak a

supraopticus, a periventricularis és mediális preopticus régióban. Extrahipotalamikusan

főként az agykéregben, az amigdala centrális magjában, a locus coeruleusban és a

kisagyban mutathatók ki CRH sejtek [36]. Ezen kívül a perifériás szervekben is, mint

például a placentában, a herében, a mellékvesék velőállományában, a petefészkekben,

tüdőben is kimutatható CRH jelenléte [37].

Korábbi vizsgálatok két receptor jelenlétét tárták fel, melyek felelősek a CRH

hatásainak közvetítésében. Mindkét receptorban közös, hogy 7 transzmembrán doménnel

rendelkező G-fehérje kapcsolt proteinek, mindkét receptor serkenti az adenilát-cikláz

aktivitását, s így az intracelluláris cAMP-protein kináz A (PKA) szignáltranszdukciós

kaszkádon keresztül hatnak.

Az 1-es típusú CRH receptor (CRH-R1) egy 70 kDa molekulatömegű fehérje. Nagy

affinitással köti meg a CRH-t. Elsősorban a hipofízis elülső lebenyét alkotó sejtek

membránjában található meg. Előfordul még az amigdala mediális és bazolaterális

magjában, a neocortexben, a kisagy sejtjeiben [38, 39].

A 2-es típusú CRH receptorok (CRH-R2) ugyan kisebb affinitást mutatnak a CRH

irányába, de más, részben szekvencia homológ anyagokat, így például urokortinokat

(mintegy 45%-os szekvenciahomológiát mutatnak a CRH-val: az urokortin I, urokortin II,

urokortin III) nagy affinitással kötnek meg. Funkcionális változatai közül a CRH-R2α-

16

főleg szubkortikálisan, szinte kizárólag a limbikus struktúrákban van jelen, míg a CRH-R2β

perifériás elhelyezkedésű [40, 41].

A stressz által indukált HHM tengely aktivációban a CRH-R1 tölt be központi szerepet és

ez a receptor tehető felelőssé a stresszhez kapcsolható viselkedési elemek megjelenésért is.

Ezt CRH-R1 génkiütött egerekkel végzett kísérletek is alátámasztják. Ezek az egerek a

különféle viselkedéstesztek során csökkent szorongást mutatnak, valamint bennük csökkent

mértékű a HHM tengely stresszreaktivitása is. Hasonló eredményeket mutatnak a szelektív

CRH-R1 antagonistákkal végzett kísérletek is [42-44].

1.3.2. A hipofízis

A HHM tengely következő eleme, a hipofízis, kettős eredetű szerv, amely a

koponya töröknyergében (sella turcica) helyezkedik el. A szerv hátulsó lebenye, a

neurohipofízis, idegi eredetű, a harmadik agykamra kitüremkedéséből alakul ki. Ezzel

ellentétben az elülső lebeny, az adenohipofízis, hám eredetű, a Rathke-tasak származéka

(3.ábra).

3. ábra

A hipofízis fejlődése http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/hypopit/histo_pit.html

Funkcionálisan is két részre különül a szerv. Míg a neurohipofízis a hipotalamusz

magnocelluláris sejtjeiben termelődő AVP-t és OT-t raktározza, addig az adenohipofízis a

hipotalamusz parvocelluláris sejtjeiből származó serkentő és gátló hormonok hatására saját

hormonok termelésével reagál. Ezen hormonok a nagyvérkörön keresztül a perifériás

szervek hormontermelését szabályozzák. A stressz szempontjából a CRH/AVP szabályozás

alatt álló kortikotróp sejtek fontosak, melyek ACTH-t termelnek.

harmadik agykamra

chiasma opticum

neurohipofízis

adenofipofízis Rathke-tasak

diencephalon

17

1.3.2.1. Adrenokortikotróp hormon (ACTH)

Az ACTH egy 39 aminosavból álló egyláncú polipeptid, amely egy prekurzor

molekula, a proopiomelanokortin (POMC) részeként termelődik. A molekuláris

átalakulások során a prekurzorból 3 fő termék hasad ki. Az első az N-terminális fragment,

melyből később az enzimatikus hasítások során a középső lebenyben a γ-MSH lesz. A

második maga az ACTH, melyből a hipofízis közti lebenyében a α-MSH és a kortikotropin

szerű középső lebeny hormon (CLIP) hasad ki. A harmadik pedig a β-lipotropin (β-LPH),

amelyből a középső lebenyben további hormonok, a γ-LPH (ebből később a β-MSH), β-

endorfin (ebből később a met-enkefalin) vágódik ki (4. ábra).

4. ábra

A POMC molekula és a belőle kihasadó peptidek vivo.colostate.edu

Az elülső lebenyből felszabaduló ACTH a mellékvese kérgének mindhárom zónájában

fokozza a hormontermelést és szekréciót. Fokozza a mellékvese kérgi sejtjeinek koleszterin

felvételét, és a szteroid hormonok szintézisének limitáló lépését, a koleszterin-pregnenolon

átalakulását is katalizálja. Az ACTH kötéséért felelős receptor az úgynevezett melanokortin

receptor család tagja. Közös jellemzője az eddig öt tagot számláló családnak, hogy

mindannyian 7 transzmembrán doménnel rendelkeznek és G fehérje kapcsoltak. Az ACTH

a melanokortin receptor 2 (MC2R) specifikus agonistája. A receptorhoz való kötődés az

adenilát cikláz-cAMP-PKA útvonalat aktiválja [45].

18

1.3.3. Mellékvese

A tengely harmadik szintje, a mellékvese fejlődéstani szempontból szintén összetett

szerv. A kéregállomány a mezoderma származéka, míg a velőállomány neurális ektoderma

eredetű (5. ábra) [46].

5. ábra

A mellékvese makroszkópos és mikroszkópos felépítése

capsule= a mellékvese kötőszövetes tokja, adrenal cortex= mellékvesekéreg,

adrenal medulla= mellékvesevelő http://www.endocrinesurgery.net.au/adrenal-anatomy/

.

A mellékvesevelő (medulla) állományát hálózatos gerendákba rendeződött ún. kromaffin

sejtek alkotják. A gerendák között szinuszok találhatóak. A kromaffin sejtekben

membránnal határolt szekréciós granulomok találhatók, melyek a hormonokat raktározzák.

A kromaffin granulumok tartalma adrenalin vagy noradrenalin, chromograninok

(vivőfehérjék), ATP, enkefalinok stb. A sejtek 80%-a adrenalint, 20%-uk noradrenalint

választ el.

A kéregállomány mikroszkópikusan és funkcionálisan 3 részre osztható (5.ábra):

A legkülső zona glomerulosa vékony réteg, közvetlenül a kötőszövetes

tok alatt. Sejtjei fészkekbe rendeződnek. A sejtcsoportokat szinuszoid

kapillárisok veszik körül. Sejtjei termelik a mineralokortikoidokat. Ezen

hormonok a só- és vízháztartás fő szabályozói, a Na+ és a K

+ ionok

anyagcseréjében vesznek részt.

A középső zona fasciculata sokszögű sejtjei a felszínre merőleges

gerendákat képeznek. A gerendák között, velük párhuzamosan futnak a

19

szinuszok. A réteg sejtjei termelik a glükokortikoidokat. A hormonok

sokrétű hatással vannak a szervezet egészére. Fokozzák a fehérje

lebontást, a májban fokozódik a glikogenezis és glikoneogenezis,

csökkentik a vérben keringő immunsejtek számát, ezáltal

immunszupresszív hatást fejtenek ki. Korlátozzák a gyulladásos

folyamatokat, csökkentik a csontképződést.

A belső zona reticularis hálózatos sejtkötegekből áll, melyek között

szinuszok futnak. A sejtek elsődleges szerepe a szexuálszteroidok

szintézise (elsősorban dehidroepiandroszteron, androszténdion).

A glükokortikoidoknak (ember esetében főleg a kortizolnak, míg rágcsálókban elsősorban a

kortikoszteronnak) jut elsődleges szerep a stresszfolyamatok szabályozásában (6. ábra).

Szteroid voltuknak köszönhetően a sejtek membránján szabadon képesek átdiffundálni, fő

hatásukat intracelluláris magreceptorokon keresztül fejtik ki.

6. ábra

A kortizol és a kortikoszteron molekulaszerkezete. A piros kör a két molekula közötti egyetlen hidroxilcsoportbeli

különbséget jelzi. en.citizendium.org

A magreceptorok egyik csoportja az I.-es típusú receptor vagy mineralokortikoid

receptor (MR). Ezek a receptorok igen nagy affinitással kötik meg a kortikoszteront és a

kortizolt, ezen kívül az aldoszteront. Az MR eloszlás az agyon belül specifikus mintázatot

mutat, főleg a limbikus rendszerben mutatható ki jelentős számban (laterális szeptum,

Kortizol Kortikoszteron

Kortizol

20

amigdala, hippokampusz [47]). A II.-es típusú receptor (glükokortikoid receptor, GR)

sokkal szélesebb körű elterjedést mutat, kevésbé specifikus, mint az MR. Megtalálható a

legtöbb agyterületen, pl. az agytörzsben, a limbikus rendszerben, a neokortexben és az

adenohipofízisben is. Affinitása a kortizolhoz, és a kortikoszteronhoz kisebb, mint az MR-

é, ugyanakkor a szintetikus dexametazont nagy affinitással köti. Mind a két receptor

jellemzője, hogy a nukleáris receptorok hatalmas családjának tagjai. Tulajdonképpen

ligandok által aktivált transzkripciós faktorok, és szerkezetileg 3 doménből állnak. 1.) a C-

terminálisan megtalálható domén a ligandkötőhely; 2.) a molekula közepén helyet foglaló

domén a DNS kötéséért felel, míg 3.) a molekula N-terminális vége a transzaktivációs

kötőhely. Sajátságos a szteroidok által közvetített hatás. A receptorok C-terminális része a

citoplazmában helyezkedik el és ott hősokk proteinekkel (Hsp 70, Hsp 90) alkot komplexet.

Szteroid hormon kötődés hatására ezek a dajka Hsp molekulák leválnak a C-terminális

részről, az MR esetében helyet adva egy másik szteroid-receptor komplexnek. A GR nem

dimerizálódik, hanem úgynevezett transzkripciós faktorokat köt. A dimerizáció, illetve a

transzkripciós faktorok kötődése után képes a hormon-receptor komplex a sejtmagba

vándorolni. A sejtmagban kitüntetett DNS szakaszokhoz kötődik, majd a célgének

transzkripcióját pozitívan vagy negatívan szabályozza. Ez a glükokortikoid hormonok lassú

genomiális hatásának az alapja [48].

Létezik egy úgynevezett gyors, nem-genomiális hatás is, mellyel a

glükokortikoidok befolyásolni képesek az idegrendszer neuronális aktivitását [49, 50]. Ez

független a génexpresszió változásaitól, gyorsan kialakul. A jelenség oka feltehetően az,

hogy a szteroid hormonok a sejtmembránon való áthaladásukkor kölcsönhatásba lépnek a

membránfehérjékkel, ezzel pedig azok működését, így végső soron a sejtek, sejtcsoportok

aktivitását változtatni képesek.

A HHM tengely szabályozásának egyik kulcspontja: A glükokortikoid feedback

A glükokortikoidok attól függően, hogy szintjük alacsony, vagy magas,

eltérőképpen szabályozzák a HHM tengely működését. Alacsony szintjük mellett

fennmarad a HHM tengely működése, míg magas szintjük mind az ACTH, mind a CRH

elválasztását gátolja [51-53]. A feedback során mind az MR-ek, mind a GR-ek fontos

szerephez jutnak, ám más-más módon. A glükokortikoidok termelődése jellegzetes napi,

21

azaz cirkadián ritmust mutat. Emberben reggel, patkányokban este (mivel éjszaka aktívak),

ébredés előtt a legmagasabb a plazma kortizol, illetve kortikoszteron szintje. Stresszmentes

körülmények között az MR-ek kötik meg a glükokortikoidokat, míg a GR-ek nagyfokú

telítődése csak a reggeli órákban, a hormonszint maximumán, illetve stressz során

figyelhető meg. Ezen megfigyelésekre alapozva mondhatjuk, hogy a cirkadián csúcs idején

bekövetkező HHM tengely aktiválódás korlátozásához elengedhetetlen a GR-ek jelenléte,

hiszen az MR-ek nagy százalékban már telítettek. Értelemszerűen az adenohipofízis GR

rendszere is csak a magas kortikoszteron szintek esetében aktivizálódik [54].

Feltételezhetően a MR rendszer az, amely a HHM tengely bazális működését szabályozza,

az alaptónus beállítását, durvahangolást végez a rendszeren. A GR rendszer ugyanakkor a

cirkadián csúcs idején, illetve a HHM tengely aktiválódása során lép előtérbe, negatívan

szabályozza annak működését, és a perifériás stresszválaszok kialakítását koordinálja [53].

A glükokortikoid feedback hipotalamikus és extrahipotalamikus összetevőket egyaránt

tartalmaz. Mellékvese irtott (adrenalectomia, ADX) állatokban megfigyelték, hogy

erőteljesen fokozódik a CRH termelése [55], emelkedik az AVP és CRH koexpresszió

mértéke, a POMC expresszió és az ACTH szekréció. A folyamat a PVN közelébe, vagy a

hippokampuszba implantált dexametazonnal visszafordítható [56-58]. A hippokampusznak,

illetve a limbikus területeknek kitüntetett szerepet tulajdonítanak a glükokortikoidok

negatív visszacsatolásában. Kísérletes körülmények között a hippokampusz hipotalamikus

kapcsolatainak sérülése, vagy átvágása (fornix, ventrális szubikulum) a plazma

kortikoszteron, illetve ACTH szintjének emelkedéséhez vezet, illetve AVP hiperszekréciót

is eredményez [59, 60]. A limbikus rendszer szerepét mutatja az is, hogy az előagyi GR

rendszer zavara vagy hiánya markánsan emeli a kortikoszteron szinteket. Ezzel együtt, míg

a PVN-ben nem változik sem a CRH mRNS szintje, sem a GR-ek mennyisége, az AVP

mRNS mennyisége másfélszeresére nő. Ezek alapján feltételezhető, hogy az előagyi

területekről induló negatív szabályozás elsődleges célpontja a parvocelluláris AVP. A

negatív feedback molekuláris mechanizmusa részben már tisztázott: Glükokortikoidra

érzékeny rész (glucocorticoid responsive element, GRE) található a CRH, az AVP és a

POMC gén promóter szakaszán, vagyis a génexpresszió közvetlen szabályozása így

megvalósulhat [61].

22

A depressziós betegekben megfigyelhető patológiásan magas kortizol szintek is a kórosan

vagy elégtelenül működő feedback-re vezethetőek vissza [42-44].

1.4. A stresszfolyamatok életkori sajátosságai: A perinatális kor

Felnőtt patkányokban az ACTH elválasztását elsősorban a PVN parvocelluláris

neuroszekréciós sejtjeiben termelődő CRH és AVP szabályozza. Ezen hormonoknak a

részvétele az ACTH felszabadításában feltehetőleg stresszorspecifikus [62]. Általánosan

elfogadott, hogy a fő ACTH szekretagóg a CRH, míg az AVP ezt a hatást fokozza [63].

Amíg a felnőtt korban lejátszódó folyamatokról, neuroendokrin szabályozásáról sok

ismerettel rendelkezik az irodalom, addig a HHM tengely fejlődéséről meglehetősen

keveset tudunk.

Kispatkányoknál a HHM tengely már a késő magzati korban is működőképes. A

magzatokban magas kortikoszteron szinteket mutattak ki, és a magas hormonszint a

születés után is megfigyelhető az újszülöttekben. A második posztnatális napra a

kortikoszteron szintje jelentősen lecsökken és a 14. napig alacsony szinten marad [64, 65].

Ezalatt az idő alatt a HHM tengely különböző stresszorok (éter stressz, hideg stressz, anyai

depriváció) által kiváltott stresszválasza erősen csökkent mértékű [66]. Az irodalomban ezt

stressz hiporeszponzív periódusként (SHRP) említik és emberek és patkányok esetében is

megfigyelték. Az SHRP létezése egyértelműen jelzi, hogy a HHM tengelynek, illetve a

szabályozási folyamatoknak egy érési folyamaton kell átesnie ahhoz, hogy a felnőttkori

működési szintet elérje [66, 67]. Az SHRP alatt végbemenő folyamatok nem kellően

tisztázottak. Egyes cikkek azt feltételezik, hogy a plazma meglehetősen alacsony

transzkortin (glükokortikoid kötő plazmafehérje) szintjének a következménye az

emelkedett nyugalmi kortikoszteron szint. Ennek eredménye pedig a hipofízis szintjén ható

erőteljes negatív feedback [66, 68, 69]. Más nézőpontok szerint a hipotalamikus ACTH

szekretagógok alacsony termelődési szintje és/vagy transzportja az, mely stressz hatására

csökkent kortikoszteron választ eredményez [70]. Feltételezhetően a CRH gén

expressziójának glükokortikoidok általi szabályozása még nem elég érett az SHRP alatt

[71]. Ezzel ellentétesen az AVP gén expressziójának szabályozása meglehetősen korán

éretté válik [71, 72], ez pedig arra enged következtetni, hogy az SHRP alatt az AVP a fő

23

faktor, amely az ACTH termelődését és elválasztását szabályozza [73, 74]. Az

intézetünkben tartott és tenyésztett AVP-hiányos Brattleboro patkányok megfelelő alanyai

annak vizsgálatára, hogy a korai posztnatális időben lejátszódó (vagyis az SHRP alatti)

stressz aktiválta hormonális válaszokat nyomon kövessük.

A Brattleboro törzsről bővebben a „Módszerek” fejezet „Kísérleti állatok” pontja

alatt írtam.

1.5. Vazopresszin (AVP)

Az AVP egy nagyobb molekula

(prepropresszofizin) részeként

szintetizálódik (7. ábra). Fő forrása a

hipotalamikus szupraoptikus mag

(SON) és a PVN magnocelluláris sejtjei.

Ezen sejtekben termelődő AVP a

hipotalamo-hipofizeális traktuson, a

hipofízis nyélen keresztül haladva éri el a

hipofízis neuronális eredetű hátsó

lebenyét, ahol az úgynevezett Gömöri-féle testekben raktározódik.

A neurohipofízis felépítése sajátságos: gliaszerű sejtek tömegéből áll, melyeknek

önálló hormontermelése nincsen, ugyanakkor rengeteg idegvégződés található itt,

melyeknek feltételezhetően a szabályozásban van szerepe. AVP termelés számos idegsejtre

jellemző a központi idegrendszeren belül és kívül egyaránt. A PVN magnocelluláris

neuronjain kívül jelen vannak AVP-t termelő sejtek a bed nucleus of stria terminalisban

(BNST), a mediális és centrális amigdalában. A cirkadián változásokért felelős

szuprakiazmatikus mag (SCN) fő neurotranszmittere is AVP [75, 76]. A HHM tengely

szabályozása szempontjából kitüntetett szerepe van annak, hogy az AVP a CRH-val együtt

kolokalizáltan is termelődik a PVN parvocelluláris sejtjeiben [30].

A vazopresszin hatását 3 különböző receptor közvetíti. Közös bennük, hogy

mindhárom receptor 7 transzmembrán doménnel rendelkezik és G-fehérje kapcsoltak. Az

1-es (V1) (Gq kapcsolt) típusú receptor a foszfolipáz C (PLC)/inozitol trifoszfát

3. ábra

7. ábra

A vazopresszin gén és a vazopresszin molekula

SP=szignálpeptid, NP-II= neurofizin II,

GP=C-terminális glikopeptid comprehensivephysiology.com

24

(IP3)/diacil-glicerol (DAG) szignalizációs jelátvitelt „használja”. A receptoron való kötődés

eredménye az intracelluláris Ca2+

szint megemelkedése. A V1a altípus a májban, az erek

simaizomzatában, herékben, számos más perifériás szövetben található meg. A központi

idegrendszerben patkányok esetében a hippokampusz, az SCN, a ventrális tegmentális area,

a szubsztancia nigra, a dorzális rafe, colliculus superior, laterális szeptum területén

mutatható ki [77]. V1b típusának fő előfordulása a központi idegrendszerben a hipofízis

elülső lebenyében van [78], de megtalálható még a szaglógumóban, a hippokampusz CA2

rétegének piramis sejtjeiben, az SCN, a kisagy és a kortex területén is [79]. Megtalálható

ezen kívül perifériásan a hasnyálmirigy Langerhans-sziget sejtjeiben, a mellékvesében, a

vesében is [80].

A 2-es típusú (V2) receptor szintén G fehérje kapcsolt (Gs), az adenilát-cikláz/cAMP/PKA

szignalizációs útvonalon keresztül közvetíti az AVP hatását. Aktiválásának hatására

megemelkedik a vese gyűjtőcsatornáiban a sejtek vízáteresztése azáltal, hogy a sejtek

apikális membránjában nagy számban jelennek meg az aquaporin-2 molekulák [81, 82].

Fokozódik ezen sejtekben a szabad víz visszavétele, csökken a vizelet mennyisége. A

receptorok fő előfordulási helye a vese gyűjtőcsatornáinak bazolaterális membránja.

Extrarenálisan egyedül a kisagyban mutatták ki [83].

1.5.1. Az AVP fő hatásai [84]:

Vízvisszatartás a vesében V2 receptor által közvetítetten.

Nagy dózisban a simaizmok kontrakcióját okozza V1a receptor által közvetítetten: a

vazokonstrikció vérnyomás és pulzusszám emelkedést okoz, a gyomor és a belek

izomzatán fokozott mozgást vált ki.

Mitogén aktivitás V1a receptor közvetítetten: kinázok foszforilációja, DNS szintézis

és a sejtproliferáció fokozódása [85].

Feltételezhetően direkt hatással rendelkezik - a máj V1a receptorai által

közvetítetten - egyes metabolikus folyamatok szabályozására is: hiperglikémia,

glükozuria, csökkent glükóz tolerancia (másodlagos hatás is a glükokortikoidok

által) [86].

25

Mint „belső lázcsillapító” a preoptikus régió, és az anterior hipotalamusz

termoregulációs neuronjainak szabályozásában vehet részt [87]. Noha az AVP

elválasztás fokozódása lázas állapotokban előnyös lehet, a nagy mennyiségű AVP

már hátrányos.

Cirkadián ritmus: az emlősök viselkedési mintázatára az egyedek cirkadián ritmusa

hatással bír. A központi cirkadián ritmus kialakításában a SCN-nek jut a főszerep.

Az első hormon, amit az SCN-ben nagy mennyiségben azonosítottak az AVP volt

[88]. Az AVP segít fenntartani más hormonok szekréciójának cirkadián ritmusát is

[89].

Fájdalomérzékelés: abban az esetben, amikor fájdalmas stimulus éri az egyedet,

fokozódik a PNV-ben az AVP termelődése és szekréciója. Az agykamrákba adott

AVP a fájdalomküszöb emelkedését, míg a lokális AVP neutralizáció a

fájdalomérzet fokozódását eredményezi. Ezekből az adatokból arra

következtethetünk, hogy az AVP mint endogén antinociceptív anyag van jelen a

PVN-ben [90, 91].

Szociális viselkedés, interakciók:

1. agresszió, mely függ az állat szociális „előéletétől”, a korábban megélt

élethelyzetektől. A V1b receptorok nagy száma a hippokampusz CA2

mezőjében arra enged következtetni, hogy ennek a receptor altípusnak lehet

szerepe a szociális memória kialakításában, melynek a korábbi élethelyzeteknek

a tárolásában lehet szerepe. Aranyhörcsögökkel végzett kutatások arra

világítanak rá, hogy a mediális preoptikus és az anterior hipotalamikus

területeken található V1a [92], illetve V1b receptorok [93] közvetítette

szignáloknak is szerepe lehet az agresszív magatartás szabályozásában.

Génkiütött egerekben a V1b receptorok közvetítette szabályozás látszik az

elsődlegesnek [94, 95].

2. szociális kapcsolatok, melyek növelik a szociális biztonságot, ezáltal

csökkenteni képesek a stresszt és a szorongást. A pockokban a szociális

monogámia (amely egyébként az emlősöknek kevesebb, mint 5%-ra jellemző)

szorosan összefügg az agyuk V1a receptor eloszlásával. A monogám pockoknál

26

a laterális szeptumban kisebb, míg az amigdalában nagyobb az AVP

mennyisége, mint a poligám pockoknál [96]. Erős korreláció áll fenn a szülői

gondoskodás mértéke és az AVP szintek között is. Míg az AVP laterális

szeptumba történő beadása a szülői magatartást erősíti, addig V1a receptor

antagonisták annak mértékét csökkentik [97].

3. Hasonló különbségek figyelhetők meg más fajokban is. Patkányok esetében a

vemhesség késői szakaszában, a vajúdás és a szoptatás alatt is emelkedett AVP

szintek mutathatók ki mind az SON, mind a PVN területén [88]. Ennek egyik

kézenfekvő magyarázata az lehet, hogy a vemhesség majd szoptatás alatt az

AVP segít fenntartani a szervezet víz- és sóháztartásának egyensúlyát.

4. Tanulási és memória folyamatok: Nagy szerep tulajdonítható az AVP-nek a

szociális interakciók során lejátszódó folyamatok szabályozásában, így például a

szociális felismerés, a szociális memórianyomok kialakításában. Míg emberben

és főemlősökben a hallás és látás jut elsődleges szerephez, addig a rágcsálók

esetében a szaglás a legfontosabb érzékelés. Egy a Nature-ben megjelent

közlemény alapján feltételezhetjük, hogy az olfaktórikus területen található

AVP részt vesz a szociális felismerésben [98]. A laterális szeptum V1a

receptorainak is fontos a szerepe [99], valamint a hippokampális V1b receptor

rendszer a memórianyomok rögzítése és ezen memórianyomok „visszahívása”

kapcsán vesz rész a folyamatban. Ez a rendszer lehet továbbá a kulcsa a

szociális felismerés által kiváltott viselkedési válaszok megjelenésének [100].

Az első, a viselkedési mintázatok és az AVP közötti kapcsolatot leíró tanulmány

(egy shuttlebox segítségével végzett nem-szociális memória teszt) a 1960-as

években jelent meg [101]. Azóta számos cikk számolt be az AVP és a nem

térbeli memóriát érintő tanulás, a memória és különösképpen a memórianyomok

„előhívása” közötti kapcsolatról [88]. További cikkek a V1a receptorok

fontosságáról írnak ennek a folyamatában [102]. Az endogén AVP jelenléte

szükségesnek látszik a térbeli memória kialakításában is. Ezt az is bizonyítja,

hogy a természetes mutáció révén AVP hiányos Brattleboro patkányok

munkamemóriája kisebb mint egészséges kontroll társaiké [103].

27

1.5.2. Az AVP hatása stresszben

Az AVP nagy fontossággal bír az adenohipofízis ACTH elválasztása

szempontjából. Az AVP ugyan önmagában meglehetősen gyenge ACTH szekretagóg,

ugyanakkor CRH jelenlétében, annak ACTH elválasztást fokozó hatását jelentősen

potencírozni képes. Ezt in vivo és in vitro kísérletek is bizonyítják [104]. Az ACTH

felszabadulás cAMP függő. Ugyanakkor az AVP a hipofízis sejtek V1b receptorain

kötődve a PLC/IP3/DAG utat aktiválja. Az IP3 a megemelkedett intracelluláris Ca2+

szint

révén az ACTH raktárak gyors ürülését eredményezi CRH-tól független módon. A

sejtekben képződő DAG ezzel párhuzamosan a protein kináz C (PKC) útvonalat aktiválja

és a CRH-R1-en keresztüli ACTH szekréciót fokozza. Vagyis az AVP a CRH/CRH-

R1/PKC/cAMP útvonalat képes indirekt módon felerősíti, így emelve az adenohipofízis

ACTH elválasztását [105]. Fontos hozzátenni azonban, hogy míg a CRH az ACTH raktárak

gyors ürülését és az ACTH prekurzor POMC génjének átíródását is fokozza, addig az AVP

a POMC átíródására nincsen hatással.

Kiemelkedő jelentősége van a stresszfolyamatok szabályozása szempontjából

annak, hogy a magnocelluláris neuronokon kívül a parvocelluláris neuronokban is

kimutatható az AVP jelenléte. Nyugalmi körülmények között a parvocelluláris neuronok

AVP termelése rendkívül alacsony, de a patkányoknál a CRH termelő sejtek mintegy fele

AVP-t koexpresszál. Elhelyezkedésük is sajátos a magon belül. A CRH+/AVP+ sejteket

laterálisan és dorzálisan találhatunk, míg a CRH+/AVP- sejtek ventrálisan és mediálisan

helyezkednek el. Megemlítendő az is, hogy a két neuropeptid egyazon szekréciós

granulumban található meg [106]. Az egyes fajok esetében a kolokalizáció mértéke eltérő

lehet, illetve egy fajon belül a CRH+/AVP+ sejtek arányát az állat aktuális stressz állapota

és kortikoszteron szintje dinamikusan befolyásolják. Például a CRH+ axon AVP+ is lesz,

ha az állat mellékveséjét kiirtják (adrenalectomia, ADX) és ez a folyamat visszafordítható,

ha a glükokortikoidot pótoljuk [107]. Akut, illetve krónikus stressz hatására szintén

megváltozik a CRH/AVP kolokalizációjának mértéke [108]. Akut stressz esetében gyors

CRH és AVP ürülés figyelhető meg az axonterminálisokból a hipofízis portális keringésébe

az eminentia mediana külső zónájának a területén. Krónikus stressz esetében azonban a

CRH felszabadulásban nem tapasztalható változás, viszont emelkedik az AVP és az AVP

28

mRNS mennyisége a PVN-ben [109], a CRH/AVP termelődés aránya az AVP javára

tolódik el. Egyes szerzők szerint a parvocelluláris eredetű AVP kevésbé érzékeny a

glükokortikoidok gátló hatására, mint a CRH [30, 32]. Vagyis a megemelkedett AVP szint

funkciója, hogy a HHM tengely működőképességét a krónikus stressz körülményei között

is fenntartsa. Tartósan magas glükokortikoid szintek mellett is létre kell jönnie az egyed

túlélése szempontjából elengedhetetlen hatásoknak [30].

A parvocelluláris mellett a magnocelluláris eredetű AVP is képes lehet az ACTH

felszabadulás kiváltására. Kimutatták, hogy az eminentia mediana belső zónájában az AVP

axonok varikozitásaiból (Herring testek) hormon szabadul fel [110]. A portális vérben

jelentős mennyiségű AVP van jelen akkor is, amikor a parvocelluláris sejtekben az AVP

expresszió nem mutatható ki [111]. Ugyanakkor megemlítendő, hogy a parvocelluláris

CRH és AVP választ kiváltó stresszorok nincsenek hatással a magnocelluláris AVP

sejtekre, az ADX-es állatok esetében a hiányzó negatív glükokortikoid feedback a

magnocelluláris sejtek AVP expresszióját nem befolyásolja. Az is elgondolkodtató adat,

hogy a glükokortikoid receptor szám a parvocelluláris sejtekben magas, míg a

magnocelluláris sejtek esetében elenyésző [112].

Bár számos tanulmány foglalkozik az AVP HHM tengelyre gyakorolt hatásával, de

a fiziológiás szerepéről még nem alakult ki egyértelmű vélemény. Immunneutralizálás

bizonyította a szabályozó szerepét restraint stressz (mozgáskorlátozás), éter belélegzés és

formalin injekció stresszben, a nyugalmi szintekre gyakorolt befolyás nélkül [113, 114]. A

V1b receptor kiütése egerekben az egyik törzs esetén csökkentette az alapszinteket [115],

míg egy másik esetben nem volt hatással a reggeli és esti nyugalmi ACTH és

kortikoszteron szintekre [18]. 30 perc mozgáskorlátozás vagy agresszív kontaktus hatására

kialakult HHM tengely aktiváció nem különbözött a vad és V1b receptor kiütött egerekben,

míg a hipoglikémia, a lipopoliszacharid injekció (LPS, bakteriális infekció modellje),

kényszres úszás (forced swim test, FST) és alkohol intoxikáció hatására szignifikánsan

kisebb emelkedések jöttek létre a génkiütött állatokban [18, 115, 116]. Az akut hatásokkal

ellentétben nem találtak különbséget a krónikus mozgáskorlátozás [18], vagy az ismételt

LPS injekciók hatására aktiválódott HHM tengely működésében a vad és V1b receptor

kiütött állatok között [116]. V1b receptor szelektív antagonista (SSR149415, Sanofi) kb.

29

50%-kal csökkentette a mozgáskorlátozás hatására megemelkedő ACTH szinteket [117] és

gátolta az éter belélegzés hatását. Ugyanakkor az FST hatására aktiválódó HHM tengelyre

hatástalan volt [118]. Természetes mutációval létrejött Brattleboro törzzsel kapcsolatban

is eltérő eredmények láttak napvilágot [119, 120]. Általában normális nyugalmi ACTH és

kortikoszteron szinteket tudtak kimutatni ezen törzs AVP hiányos egyedeiben [84], de a

stresszre adott válaszuk erősen változó volt.

1.5.3. Az AVP jelentősége pszichiátriai betegségekben

Az érzelmi zavarok olyan hangulati változások, amelyek magukba foglalják az

unipoláris depressziót, szorongást, beleértve a generalizált szorongást, poszt-traumás

stressz betegséget, pánikot, fóbiát és az obszesszív-kompulzív megbetegedést. Mindezen

kórképek etiológiájában szerepel a stressz, s valószínűleg az AVP, mint a HHM tengely

egyik fontos szabályozója is „szerepet kap” [121].

Mivel a depresszió humán megbetegedés, ezért elég nehéz megfelelő, új

antidepresszánsok tesztelésére alkalmas állatmodellt találni. Egy jó modellnek a humánhoz

hasonló etiológiával, patofiziológiával és hasonló kezelési profillal kell rendelkeznie [122].

A forszírozott úszás teszt (angol: forced swim test, FST, behavioral despair) az egyik ilyen

elfogadott modell, bár ez elsősorban új gyógyszerek tesztelésére és nem az etiológia vagy a

patofiziológia tisztázására szolgál [123]. A teszt alapja, hogy ha az állatot 15 percre egy

vízzel telt edénybe helyezzük, akkor kezdetben küzd, ki akar szabadulni, majd egy idő után

feladja, és az idő nagy részét lebegő, immobilis pozitúrában tölti. Az antidepresszáns

kezelés csökkenti a lebegés időtartamát. Az FST AVP elválasztást indukál mind az SON,

mind a PVN magokból [124], továbbá a szeptumból [125] és az amigdalából is [126].

Habár a plazma AVP szint emelkedés hiánya a centrális (parvocelluláris) és perifériás

(magnocelluláris) AVP elválasztás disszociációjára utal [124].

Egy másik, széles körben alkalmazott modell, mely depresszió-szerű állapotot hoz

létre, a krónikus váltakozó enyhe stressz, vagy megjósolhatatlan stressz (chronic mild

stress, CMS, chronic unpredictable stress, CUS). A sorozatos stresszorok hatására az állat

anhedóniássá válik, mely csökkent cukorpreferencián mérhető [29, 127]. Egérben a CMS

30

modellben az AVP antagonista SSR149415 (10 and 30 mg/kg, i.p.) csökkentette a fizikai

leromlást, a szorongást, valamint az FST-ben mért depresszió-szerű tüneteket [127].

Saját megfigyelésünk szerint az AVP hiánya a hím Brattleboro patkányokban nem

befolyásolta az állat mozgékonyságát sem az izomerőt mérő függeszkedés (wire

suspension), sem a mozgáskoordináció vizsgálatára szolgáló forgó rúd (rotarod) tesztekben

[128]. Néhány irodalmi adattal [129] ellentétben a mi állataink általános aktivitása sem

különbözött a kontroll állatokétól a nyílt tér tesztben (openfield). Mindezek alkalmassá

teszik a Brattleboro patkányokat az AVP szorongás-depresszió tesztekben való

alkalmazására, mivel ezen tesztek legtöbbje aktív mozgást igényel, s így a mozgékonyság

változásai befolyásolhatják a tesztből levont következtetéseket. Az AVP hiányos állatok a

további tesztek során kevésbé szorongtak és mutattak depresszió-szerű tüneteket és

hedonistábbak voltak, mint a kontroll állatok [128].

Az emelt keresztpalló (elevated plus maze, EPM) teszt a szorongás mérésére

szolgál. Ez a földtől 70cm-re lévő két egymásra merőleges vékony (20cm széles) léc,

melyek közül az egyik lécen a két szemben levő karnak oldalfala is van. A patkányok

szeretik a szűk, sötét járatokat, ugyanakkor szeretik felderíteni a környezetüket is. A

kevésbé szorongó állat bátrabb, több időt tölt a nyílt, kevésbé védett karban. A klinikailag

hatékony szorongásoldók (pl. klórdiazepoxid) növelik a nyílt karban eltöltött időt. Ezen

teszt alapján került elválasztásra a LAB (low anxiety, kevéssé szorongó) és HAB (high

anxiety, nagyon szorongó) patkány-törzs. Feltételezhető, hogy a LAB állatok csökkent

szorongásáért a centrális AVP alacsonyabb szintje lehet a felelős [130]. V1a receptor

antagonista adása csökkentette a HAB állatok szorongás- és depresszió-szerű viselkedését

[131]. Napjainkban eltolódás figyelhető meg a hagyományos állatmodellektől az

endofenotípus vizsgálatok irányába [132]. Ebben a vonatkozásban kimutatták, hogy a HAB

állatokban van egy egyedi nukleotid polimorfizmus (angol: single nucleotide

polymorphism (SPN)), melynek hatására fokozott a PVN-jükben az AVP átírása, ami a

fokozottan szorongó fenotípushoz vezethet [133].

A hím V1a receptor kiütött egerek számos teszt során csökkent szorongást mutattak

vad társaikhoz képest [134, 135]. Másrészről a V1a receptor a laterális szeptumban történő

túltermeltetése (overexpression) fokozta a szorongást [136]. Habár itt nagy különbség volt

31

megfigyelhető a nemek közt. Úgy tűnik, hogy a hímekkel ellentétben a nőstényeknél az

oxitocin (OT) játszik fontosabb szerepet a szorongás szabályozásában [137].

Az AVP érzelmi zavarokban betöltött fontos szerepét támasztják alá a különféle

agyterületek célzott injekciójával végzett kísérletek is. A szeptumba adott V1a mRNS

antisense oligonukleotid [138], illetve V1a antagonista [139] jelentősen csökkentette a

szorongást anélkül, hogy hatott volna a mozgékonyságra. Másrészről Appenrodt és

munkatársai mind az intraszeptális, mind az intraperitoneális AVP injekciót

szorongáscsökkentő hatásúnak találták. Ez arra utal, hogy a szeptumon kívül is lehet az

AVP-nek támadáspontja [140]. A szeptumba vagy az amigdalába adott V1a receptor

antagonista a szorongáscsökkentő hatáson kívül csökkentette a depresszió-szerű tüneteket

is [125, 126].

Érdekes módon a V1b receptorok kiütése nem vezetett kevésbé szorongó vagy

depresszió-szerű magatartás megjelenéséhez [94, 141]. Továbbá a specifikus V1b

antagonista SSR149415 nem volt szorongáscsökkentő hatású az EPM tesztben, ha a

laterális szeptumba [142], csak ha a bazolaterális amigdalába adták [143].

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az AVP fontos szerepet játszik a szorongásos-

depresszió-szerű állapotok kialakulásában. Mivel a tesztek legtöbbje (EPM, FST) akut

változásokat mér, a depresszió pedig egy krónikus állapot, mely csak tartós (legalább 2 hét)

kezeléssel gyógyítható, ezért szükségesnek tűnik az AVP szerepének vizsgálata a CMS

tesztben is, nem csak az ismételt injekciókkal járó AVP antagonistával (ami maga is

krónikus stressz), hanem a génkiütött állatokkal is.

32

2. Célkitűzések Közelebb vihet az AVP HHM tengelyre gyakorolt hatásának megértéséhez, ha

egyetlen modell esetén vizsgáljuk a különféle, intenzitásukban, modalitásukban eltérő

stresszorok hatását. Az intézetünkben tartott és tenyésztett Brattleboro patkányok szolgáltak

állatmodellként vizsgálataink során. A törzs egyedei megfelelő modellnek tekinthetők,

hiszen az AVP hiánya ezen állatokban már a születéstől fogva „természetesen” adott,

vagyis a vazopresszinerg rendszer manipulációja nem igényelt esetünkben semmilyen extra

beavatkozást (pl. immunneutralizáció injekcióval, AVP antagonisták vagy agonisták

bejuttatása szervezetbe injekcióval, agyi léziós műtétek), mely kezelések maguk is

stresszorok. Lehetőségünk nyílt tehát egy átfogó kísérletsorozat elvégzésére, ezek alapján

pedig a célkitűzéseink a következők voltak:

A vazopresszin szerepének vizsgálata akut stresszhelyzetekben

1. Vazopresszin hiányos állatok akut stresszhelyzetekben

mutatott stresszválaszának vizsgálata

2. Vazopresszin hiányos állatok forszírozott úszás tesztben

mutatott stressz reaktivitása AVP retrodialízis kísérletben

3. Vazopresszin hiányos állatok vizsgálata akut morfin

kezelés utáni megvonásos helyzetben

A vazopresszin szerepének vizsgálata krónikus stresszhelyzetekben

1. A vazopresszin szerepének vizsgálata ismételt morfin

kezelés hatására kialakuló tolerancia utáni megvonásos

stresszhelyzetben

2. A vazopresszin szerepének vizsgálata ismételt, 28 napos

mozgáskorlátozás (restraint) kísérletben

3. Krónikus enyhe stressz vizsgálata, magatartási hatások

A vazopresszin szerepének vizsgálata perinatális korban

1. Kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata

2. Különböző nemű kispatkányok stressz reaktivitásának

vizsgálata

33

3. Módszerek

3.1. Kísérleti állatok

3.1.1. A Brattleboro törzs

A kísérleteket az intézetünkben tenyésztett hím ivarú Brattleboro patkányokon

végeztük (a kispatkányok esetén nőstényeket is vizsgáltunk). A Brattleboro törzs a Long

Evans patkánytörzsből alakult ki egy véletlenszerű autoszómás mutáció révén. Az AVP

génje 3 exonból áll. A peptid hormon egy prekurzor protein részeként szintetizálódik. Ez a

prekurzor protein a prepropresszofizin. Az első „A” exon kódolja a prekurzor molekulán

belüli szignál peptidet, az AVP-t, illetve a neurofizin molekula N-terminális részét. A „B”

és „C” exonok a neurofizin molekula középső, illetve C-terminális régióját, illetve a

prepropresszofizin molekula végén található C-terminális glikoproteint kódolják.

Egészséges állatok PVN-jének magno- és parvocelluláris sejtjeiben a prepropresszofizin

molekula már az átíródása során a sejtek endoplazmás retikulumába transzportálódik.

Később a transz-Golgi hálózatban jelenik meg és neuroszekretoros vezikulumok

formájában kezdi meg útját a hipofízis hátsó lebenye felé. A vezikuláris transzport során

vágódik ki a prekurzor molekulából az AVP, a neurofizin és a C-terminális glikoprotein

egy di- és egy monobázikus hasítási helyen történő enzimatikus reakció során [144].

Poliuriás állatokban az AVP gén neurofizint kódoló régiójában, a –G326 –os pozícióban

bekövetkező egyetlen nukleotid deléciója miatt egy úgynevezett -1-es frameshift mutáció

következik be (8.A ábra) [145]. A deléció következtében megváltozik az aminosav sorrend

a neurofizin molekula C-terminális részén, eltűnik a vad típusban jelen lévő neurofizin és

C-terminális glikoprotein közötti hasítási hely és a „stop kodonok” és egy polilizin farok

jelenik meg a prekurzor molekula végén. A megváltozott prepropresszofizin molekula

transzportja zavart szenved, szinte beragad az endoplazmatikus retikulumba. Ennek

következtében sem a AVP, sem a többi részmolekula nem vágódik ki, nem jelennek meg a

keringésben, így funkciójukat sem képesek betölteni (mérhetetlen AVP szint: 8.B ábra;

polidipszia: 8.C ábra) [146].

34

Az állatok hipotalamikus eredetű diabetes insipidusban szenvednek (di/di

genotípus). Ennek következtében jóval nagyobb mennyiségben fogyasztanak vizet, mint a

mutációt nem (+/+), vagy csak heterozigóta (di/+) formában hordozó társaik (8.C ábra).

Szignál peptid AVP Neurofizin II C- terminális peptid

8. ábra

A: A vazopresszin génjében bekövetkezett pontmutáció helye; B: A különböző genotípus állatok

hipofízisében mért vazopresszin szintje; C: A különböző genotípusú állatok vízfogyasztása

A kísérletek során a mutációt homozigóta (di/di) és heterozigóta (di/+) formában hordozó

állatokat hasonlítottuk össze (9. ábra). Noha a di/+-os állatok AVP szintje alacsonyabb,

mint a mutációt semmilyen formában nem hordozó +/+-os állatoké, ez mégis kielégítő

szintet biztosít a vízháztartás szabályozásához, ezért ezek az állatok megfelelő (irodalmilag

is elfogadott) kontrollként szolgálnak [147]. Mivel a Long Evans törzsből több mint 50

évvel ezelőtt alakult ki a Brattleboro törzs, így ezeket az állatokat nem tekinthetjük

megfelelő kontrollnak, hiszen más génekben is történhetett olyan mutáció ez idő alatt, mely

a korrekt összehasonlítást lehetetlenné teszi. Amennyiben nem Brattleboro kontroll

állatokat használtunk, az adott kísérletek leírásánál ez külön jelöltem. A +/+ és di/+

genotípusú egyedek fenotipikusan nem különböznek egymástól, ezen állatok pontos

genotípusát, csak nehézkes genetikai vizsgálatok után állapíthatjuk meg. A tenyésztés során

0

20

40

60

80

100

120

140

di/+ di/di

Vízfogyasztás (ml/nap) Vazopresszin szintek (ng/hipofízis)

B C

0

100

200

300

400

500

600

700

di/+ di/di

–G326 –os

pozíció–G326

–os pozíció A

35

ezért a szülő párok genotípusát úgy választottuk meg (apa „di/di”, míg az anya közel

normális AVP szinttel rendelkező „di/+”), hogy a születendő utódok vagy a di/+ vagy a

di/di fenotípust mutassák. Ezek elkülönítése a vízivás mérésével könnyen kivitelezhető (8.C

ábra). Kérdéses esetben az utólagos hipofizeális AVP szint mérés volt segítségünkre.

Korábbi kísérleteink arra mutatnak, hogy a di/+ genotípusú anyák sikeresebben nevelik fel

utódaikat, mint di/di társaik, így kísérleteink során az ilyen anyáktól származó utódokat

használtuk [148]. Az utóbbi években kitenyésztettünk egy külön +/+ vonalat is, melyeket

megpróbálunk a heterozigóta vonallal közeli rokonságban tartani.

9. ábra

A di/di (kisebb) és di/+ (nagyobb) genotípusú állatok közötti méretbeli különbség Kép saját forrásból

3.1.2. Tartási körülmények

Az állatokat állandó, kontrollált körülmények között tartottuk (22 C ± 1 C; 50-

70% páratartalom, 12 óra világos/12 óra sötét ciklus, világítás kezdete: 07:00 óra), ahol

szabványos rágcsáló táphoz (Charles River; Hungary) és csapvízhez szabadon

hozzáférhettek. Mivel a di/di fenotípussal rendelkező állatok vizeletmennyisége

kiemelkedően magas, így ezen állatokat a szokásos másnaponkénti almozás helyett naponta

almoztuk. A kísérletekhez használt állatok tenyésztése, tartása és kísérletek alatti

felhasználása megfelelt a mind a Munkahelyi Állatvédelmi Bizottság (Kísérleti

Orvostudományi Kutatóintézet, Budapest, Hungary) magyar, mind a European

Communities Council Directive európai előírásainak. Fájdalmas, vagy műtéti beavatkozás

kizárólag mély anesztéziában történt, törekedve a minél gyorsabb és kíméletesebb

beavatkozásokra. A kísérletek során kizárólag a minimálisan szükséges állat mennyiséggel

dolgoztunk.

36

3.2. Mintavétel

3.2.1. Krónikus juguláris kanül beültetése vérminták vétele céljából

Két nappal a kísérletek kezdete előtt az állatokat anesztézia céljából ketamin (50

mg/kg SelBruHa Állatgyógyászati Kft, Hungary)-xylazine (20 mg/kg Spofa, Prague, Czech

Republic)-promethazinum chloratum (0,2 mg/kg, EGIS, Budapest, Hungary) keverék

intraperitoneális alkalmazásával elaltattuk. A teljes anesztézia elérésekor az állatok jobb

juguláris vénájába egy szilikon kanült helyeztünk (medical-grade silicone tubing; ID

0,64mm; OD 1,2 mm Dow Corning; MI; USA). A behelyezés után a kanült az állatok bőre

alatt átvezettük a háti-nyaki régióhoz, majd heparinos fiziológiás sóoldattal feltöltöttük és a

kísérlet kezdetéig lezártuk. A kísérlet napján heparinos fiziológiás sóoldattal átmostuk,

majd egy hosszabb szilikon cső segítségével egy fecskendőt csatlakoztattunk a vénába

vezetett kanülhöz az éber, szabadon mozgó állaton végzett folyamatos vérvétel céljából

(0,4 ml vér/ minta, levétele után fiziológiás sóoldattal visszapótolva).

3.2.2. Vérminta nyerése farokvénából

Az állatokat egy csőbe helyeztük, melyből a farkuk szabadon kilógott. A farokvénát

steril, egyszer használatos szike pengével megvágtuk, majd a kiserkedő vért Eppendorf

csövekbe fogtuk fel (0,3-0,4 ml).

3.2.3. Vér és szövetminták nyerése dekapitálással

A feldolgozás során az állatok csecsemőmirigyét, mindkét oldali mellékveséjét előre

lemért csövekbe, az állatok törzsvérét (kb. 7-10 ml) pedig jégen hűtött, K2-EDTA (150 l

20 w/v % EDTA) tartalmú csövekbe gyűjtöttük. A dekapitálás után a koponyát felnyitottuk,

az agyakat eltávolítottuk és szárazjégen azonnal fagyasztottuk, a CRH és AVP mRNS in

situ hibridizációig -70 C-on tároltuk. A hipofíziseket beágyazó médiumban szárazjég

segítségével azonnal lefagyasztottuk és az agyakhoz hasonlóan a POMC mRNS in situ

hibridizációig tároltuk.

37

3.3. Mérések

3.3.1. Hormonmérések

1. A hormonszintek mérése során a „radioimmuno assay (RIA)” módszerét használtuk.

Az ACTH méréshez szükséges specifikus ellenanyagokat (nyúlban termeltetett h-

ACTH1-39 ellen) intézetünkben fejlesztettük ki [149]. Az ellenanyag magas

specificitással rendelkezik az ACTH-ra. α-MSH-val való keresztreaktivitása 0,2%,

ugyanakkor nem mutat szignifikáns keresztreakciót az γ-MSH, ACTH11-24, ACTH 25-

39; ACTH 1-14; ACTH1-19 peptidekkel. Az egy kísérletből származó plazmamintákat

mindig egy assay-ben mértük. A mérésen belüli szórás 5,8% volt.

2. A kortikoszteron szintek mérése során 10 μl plazmából határoztuk meg a

hormonszinteket szintén RIA módszerrel. A specifikus ellenanyagot nyúlban

termeltettük kortikoszteron-3-karboximetiloxim-bovin serum albumin konjugát

ellen. I125

jelölt karboximetiloxim-tirozin metilésztert használtunk nyomjelzőként

(tracer). A plazma transzkortin reaktivitását alacsony pH alkalmazásával zártuk ki.

A kortikoszteron mérés szenzitivitása 1 pmol, a mérésen belüli szórás 7,5 % volt.

3. AVP hormonmérések esetében a nyúlból származó anit-AVP antitestet Dr.

Vecsernyés Miklós (Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar)

ajánlotta fel számunkra. A mérésen belüli szórás 10,7%, a mérések közötti szórás

17,7% volt. A kispatkányok genotipizálása során az AVP tartalmat a teljes

hipofízisekből határoztuk meg. A dekapitálás után a hipofíziseket eltávolítottuk,

majd 100μl 0,1N sósavban durván homogenizáltuk. Feldolgozásig -20°C-on

tároltuk. Felolvasztás után 5 percig forraltuk a mintákat, majd ultrahangos

homogenizálást végeztünk. 100-szoros hígítás után mértük meg a homogenátumok

AVP tartalmát.

4. Az OT szinteket Münchenben mérték specifikus RIA-val. A plazma OT tartalmat

100μl minta extrahálását követően, a mikrodialízis mintákat liofilizálást követően

határozták meg. A méréshatár 0,1pg/minta, más peptidekkel való keresztreakció

<0,7% volt [145].

38

5. Az immunoreaktív cAMP szinteket Brooker módosított módszerével mértük [150,

151]. Az intézetünkben a 2-o-succinyl-cAMP-HSA ellen kecskében kifejlesztett

antitest (No. 309) 0,00043 % keresztreakciót mutatott cGMP-vel, 0,00005 %-ot

ATP-vel és 0,00034 %-ot AMP-vel, lehetővé téve a cAMP direkt meghatározását

még magas ATP koncentrációk esetén is. Az antitestet 1:8000 végső hígításban

használtuk. 2’0-szukcinil-cAMP tirozin metilésztert a chloramine-T módszerrel

jódoztunk és ezt használtuk radioaktív ligandként. A kötött és szabad frakciók

elkülönítése 1 ml jéghideg etanollal történt. Az assay érzékenysége 0,05 pmol/cső

volt. Az intraassay variáció 7,1%. Egy kísérlet mintáit egy assay-ben mértük meg.

3.3.2. In situ hibridizáció

3.3.2.1. Szövetelőkészítés

Az agyakat, illetve a hipofízisek elülső lebenyét beágyazó médiumban azonnal,

szárazjégen fagyasztottuk, majd a felhasználásig −70°C-on tároltuk. A szövetdarabokat

kriosztátban -17°C-on metszettük. Az agyak koronális metszetei közül minden hatodik

16μm-es metszetet, a hipofízisek esetében a szerv legnagyobb keresztmetszetű részéből 4

párhuzamos sorozatban, lemezenként 6db 16μm-es metszetet szilánozott tárgylemezre

vettünk fel. A hibridizációig a lemezeket −70°C-on tároltuk.

3.3.2.2. Hibridizáció

A lemezeket 4%-os paraformaldehid oldattal posztfixáltuk 60 percig, majd 2x5

percig steril kálium-foszfát pufferben (KPBS) mostuk. Mosás után egy éjszakán át vákuum-

exszikkátorban szárítottuk. Szárítás után proteináz-K-val emésztettük (1 μg/ml 50 mM

Tris-ben, pH 8, és 5 mM EDTA), acetiláltuk (0,25% ecet-anhidrid 0.1 M trietanolaminban

pH 8), majd felszálló alkoholsorban dehidráltuk a szöveteket (50%-70%-96%-abszolút

alkohol). Száradás után a 35

S-UTP-vel jelölt ribopróba (hibridizációs oldat:107

-109

dpm/ml;

50% formamid, 0,3M-os NaCl, 10nM TRIS, 2mM EDTA, 1x Denhardt oldat, 10% dextrán

szulfát, 0,5 mg/ml élesztő tRNS, pH=8) 100 μl-ét a szövetekre pipettáztuk, majd a

lemezeket, vigyázva arra, hogy a fedőlemez alá buborékok ne kerüljenek, lefedtük. A

lemezekhez a fedőlemezt DEPEX segítségével rögzítettük, hogy a kiszáradásukat

elkerüljük (nedves kamra létrehozása). A hibridizáció 58°C-on 12-16 órán keresztül zajlott.

39

A hibridizáció után a metszeteket 4x SSC-ben (saline-sodium citrate puffer) áztattuk

mindaddig, amíg a fedőlemezek maguktól leváltak a tárgylemezről (1x SSC: 0,15M NaCl

és 15mM trinátrium-citrát; pH=7). A nem hibridizálódott egyszálú ribonukleinsavakat

ribonukleáz A-val emésztettük (20 mg/ml; TRIS-EDTA pufferben 0,5M NaCl).

Fokozatosan csökkenő sókoncentrációjú mosások után (2x, 1x, 0,5x SSC) 65°C-on 0,1x

SSC-ben 30 perces inkubáció következett.

A CRH mRNS mennyiségének meghatározás a [35S]UTP jelölt ribopróba

használatával történt. Ez a próba a CRH gén exonszekvenciájával komplementer (a próba

Dr D. Richter, University of Hamburg, Germany nagylelkű ajándéka volt). A hibridizációs

eljárás után az exponálás imaging plate segítségével történt 72 órán keresztül. A plate-ek

leolvasása fluorescens kép analizálóval történt (FLA 000, Fujifilm, a leolvasás felbontása

50 μm). A kapott radiogrammokat az internetről szabadon letölthető Image J szoftverrel

értékeltük ki. A vizsgált régió területét körberajzoltuk, majd az átlagos szürkeséget a háttér

értékével (egy szomszédos hipotalamikus terület átlagos szürkesége) korrigáltuk. A CRH

mRNS-hez összegeztük a PVN (a mag anterior és a dorzális mediális parvocelluláris,

illetve a periventrikuláris területeken) és az amigdala teljes kiterjedését (integrált denzitás=

összegzett (terület * feketedés)) [152].

Az AVP mRNS szinteket [35S]UTP tartalmú ribopróbával határoztuk meg, ami az

AVP exonszekvenciájával volt komplementer (a 1,2kb templát Dr. K. Majo (Northwestern

University, USA) ajándéka volt). AVP mRNS esetében a hibridizált lemezeket Kodak

NTB3 autoradiográfiás emulzióba merítettük, az exponálás ideje 3 nap volt. Az előhívás D-

19-es előhívó (Kodak) oldattal történt. A PVN mikroszkópos képét digitalizáltuk (Sony

CCD kamera), a feldolgozás ezekről a képekről történt. Az ezüst szemcsék által kibocsátott

szignál optikai denzitását minden állat esetében 4-5 lemezen, összesen 50-60 egyedi sejt

esetében határoztuk meg a PVN mediális, parvocelluláris régiója felett (lsd. [145]) Image J

program segítségével. A mért értékeket a háttér értékével korrigáltuk (egy adott keretben a

sejt mellett lévő nem vizsgált terület értéke). A vizsgált sejtek átlagos optikai denzitása

jelezte a PVN parvocelluláris sejtjeinek AVP aktivitását.

A POMC mRNS szinteket a POMC gén exonszekvenciájával komplementer

[35S]UTP-val jelzett ribopróbával vizsgáltuk (az 1,2kb templátot magába foglaló plazmid

40

Dr. J Eberwine ajándéka volt (University of Pennsylvania, USA)). Ehhez az állatok

hipofíziseiből a 6 legnagyobb keresztmetszetű mintát vettük fel tárgylemezre és ezek

esetében végeztük el a hibridizációs eljárást. A minták kiértékelése során a CRH mRNS

esetében leírt metódust használtuk. A hibridizált metszetek digitalizált képén a szignál

átlagos intenzitását határoztuk meg.

Az OT mRNS szint mérése a hipotalamikus PVN dorzális parvocelluláris, mediális

parvocelluláris és posterior magnocelluláris régióiban történt (lsd. 26.ábra). Az agyminták

metszésére és hibridizálására Magdeburgban, a kiértékelésre Magyarországon került sor.

Az OT-ra specifikus DNS szekvenciát tartalmazó vektor Dr. Evita Mohr ajándéka volt

(Institute of Cellular Biochemistry and Clinical Neurobiology, Hamburg-Eppendorf

University, Hamburg, Germany). A metszetek hibridizációja az AVP-nél leírt módszerhez

hasonlóan, emulzióba mártással történt. A kiértékeléshez az ImageJ szoftver “threshold”

funkcióját használtuk, ahol az 5-nél több és 40-nél kevesebb pixelszámú küszöb feletti

foltot tekintettük sejtmagnak. A program automatikusan kiértékeli a megadott területen

előforduló sejtek számát. A mérést 3-3 jobb és baloldali metszeten végeztük el és a 6 mérés

átlaga szolgált az állat jellemzésére.

3.3.3. A mellékvesék szövettani feldolgozása

A paraffinba beágyazott mellékvesékből szánkamikrotómmal 15 μm-es metszeteket

készítettünk, melyeket zselatinos tárgylemezre vettünk fel. A metszés után a lemezeket

differenciáló hematoxilin-eosin festékekkel festettük. A megfestett lemezeket digitalizáltuk,

majd ImageJ-vel határoztuk meg a metszeteken a mellékvesekéreg vastagságát.

Körberajzoltuk a mellékvesék kerületét, majd a velőállományt és a két terület kivonásával

kaptuk meg a kéreg területét.

3.3.4. Statikus inkubálás

A dekapitált állatok hipofízisét és mellékveséjét eltávolítottuk, majd 8 kisebb

darabra vágtuk és 1 ml 37 ºC-os Dulbecco Minimal Essential Medium-ban (DMEM)

(tartalmazott még: 2,5 g bovin serum albumin (BSA)/l, és gázkeveréket vezettünk bele:

95%O2-5%CO2) 2x1 óra időtartamban előinkubáltuk.

41

A 2 órás preinkubációs idő letelte után a hipofízist 20 percig CRH tartalmú DMEM-

ben inkubáltuk. 20 perc után a szervekről a médiumot eltávolítottuk, centrifugáltuk (3000g,

5 perc), majd a felülúszót az ACTH szintek méréséig -20 ºC-on tároltuk. A szervdarabokat

óvatosan összegyűjtöttük, majd 250µl 0,1M sósavban homogenizáltuk, centrifugáltuk

(3000 g, 5 perc), a felülúszót a cAMP szintek méréséig -20 ºC-on tároltuk.

A mellékvesékről a preinkubációs idő után a médiumot 15 percenként

összegyűjtöttük, majd frissre cseréltük összesen 6-szor. A második 15 perces szakaszban a

szerveket ACTH tartalmú DMEM-ben inkubáltuk szintén 15 percig. Az egyes frakciók után

a szervekről a médiumot eltávolítottuk, centrifugáltuk (3000g, 5 perc), majd a felülúszót a

kortikoszteron szintek méréséig -20 ºC-on tároltuk (10. ábra).

10. ábra

A mellékvese inkubálás protokollja

3.3.5. Szuperfúzió

Ács és munkatársai [153] módosított módszerét használtuk [154]. A mellékvese

darabokat perfúziós oszlopokra helyeztük és DMEM-mel mostuk. A előkészítő perfúzió

során a darabokat 1 órán keresztül 100μl/perc sebességgel, majd egy további órán keresztül

200μl/perc sebességgel áramoltattuk át a stabil kortikoszteron szekréció elérése céljából.

Ezután 5 perces frakciókat gyűjtöttünk (1ml/frakció). Az alapszekréciót az első 3 minta

alapján határoztuk meg, majd a médiumhoz 2*10-10

mol/l ACTH-t adtuk 5 percre. 60 perc

kimosást követően újabb, 10-9

mol/l ACTH adására került sor. Mind a szövetmintákat

tartalmazó oszlopok, mind az átáramló folyadék 37 C-on voltak tartva konstans gázáramlás

mellett. A frakciókat jéghideg csövekbe gyűjtöttük és -20 C-on tároltuk a kortikoszteron

szintek meghatározásáig.

15 perces

inkubációs

idők

15 perces inkubáció

10 -12

, 10 -11

és 10 -10

M

ACTH tartalmú DMEM-

ben

2*60 perces

preinkubációs

idő

42

3.4. Kísérleti protokollok

3.4.1. Akut stressz kísérletek

Az 1960-as években az AVP-t tekintették a HHM tengely legfőbb szabályozójának, de

a CRH felfedezése, és az egy neuron=egy neurotranszmitter elv (Dale-elv) alapján kikerült

az érdeklődés középpontjából. Új ismeretek, módszerek birtokában érdekesnek tűnt ismét

felvetni azt a kérdést, milyen helyzetekben, milyen mértékben van szerepe az AVP-nek a

HHM tengely szabályozásában. Ennek vizsgálatára a következő kísérleteket végeztük el

[155]:

3.4.1.1. Újdonság stressz (Novelty)

Az állatokat egy, a tetején nyitott műanyag dobozba (40x36x20 cm) helyeztük 10

percre, mely doboz nagyobb, mint az előzőleg általuk megszokott állattartó ketrecek és

előzetesen már több állat szagnyomaival szennyezett volt. Az egymást követő kísérletek

során a dobozt nem takarítottuk, így azok vizelettel és széklettel szennyezettek voltak (az

erősebb szorongás kiváltása érdekében). A kontroll állatokat a dobozukból kivéve, a

stresszelt állatokat a 10 perces stressz után azonnal dekapitáltuk.

3.4.1.2. Szociális elkerülés (Social avoidance)

Ebben a tesztben a szorongást egy intézetünkben kidolgozott két kompartmentes

módszerrel idéztük elő [156]. A berendezés két, összekötött kamrából áll, amely közül az

egyikben egy ismeretlen Wistar patkány tartózkodik egy perforált plexi dobozba zárva. A

tesztállatot 3 percre az üres térfélre helyezzük, majd a habituáció után kinyitva a két térfél

közötti kaput további 5 percig megengedjük, hogy szabadon bejárja az egész berendezést.

Az 5 perc végén az állatok farkából vért vettünk. A kontroll csoport tagjai az üres dobozba

sem kerültek be.

3.4.1.3. Emelt keresztpalló teszt (Elevated plus maze (EPM))

Az emelt keresztpalló teszt az orvosi, biológiai kutatásokban az egyik

leggyakrabban alkalmazott teszt. A teszt használata során az állatok új helyzetben mutatott

szorongását mérjük. Az állatokat a keresztpalló (karhosszúság 50 cm, karszélesség 20 cm, a

pallók magassága 70 cm) közepére helyeztük orral a zárt kar felé, majd az 5 perces teszt

43

után, a kontroll állatoktól a dobozukból való kivétel után azonnal vért vettünk a farokvéna

megvágásával.

3.4.1.4. Lipopoliszacharid (LPS) injekció

A kísérlet során az állatok steril, fiziológiás só oldatban feloldott Escherichia Coli

bakteriális lipopoliszacharidot (LPS, szerotípus 0111: B4) kaptak intraperitoneálisan (ip)

300μg/2ml/kg koncentrációban az immunrendszer aktivizálása érdekében. A kontroll

állatok ip fiziológiás só injekciót kaptak. Az állatokat az injekció beadása után 1 óra múlva

dekapitáltuk.

3.4.1.5. Éter inhaláció

Az állatokat egy éterrel átitatott, papírvattával bélelt, fedett üvegedénybe helyeztük

1 percre. Az üvegből kivéve őket, az orrukra éterrel átitatott vattát tartalmazó, kónikusan

szűkülő csövet helyeztünk újabb 2 percig anesztéziában tartva az állatokat, majd

visszahelyeztük őket a ketrecükbe. A kontroll állatokat a dobozukból kivéve azonnal, a

stresszelt állatokat a kísérlet kezdetétől számított 10 perc múlva dekapitáltuk.

3.4.1.6. Hipertóniás só oldat injekciója

A krónikus vénás kanüllel felszerelt állatok hasüregébe 1,5 mólos NaCl oldatból

100g testtömegenként 1,5ml-t adtunk ip. Így a stressz tulajdonképpen kombinációja volt az

ozmotikus, a térfogati és a fájdalom stimulusnak. Az állatoktól a hipertóniás só injekció

előtt közvetlenül, majd utána 5, 15, 30, 60, és 120 perc múlva 0,4 ml vért vettünk a

behelyezett juguláris kanülön keresztül. A kontroll állatok esetében fiziológiás só oldatot

alkalmaztunk testtömegtől függő mennyiségben (1,5 ml/100g).

3.4.1.7. Anafilaktoid reakció

A vena jugularisba ültetett kanülön keresztül friss, szűrt, steril fiziológiás só

oldatban feloldott tojásfehérjét (500 ml/1l só oldat) juttattunk be 1 ml/1 ttkg dózisban. A

vérmintákat (0,4 ml/minta) a korábban ismertetett módon a beadás előtti percben, majd

utána 5, 15, 30, 60, 90, 120 perccel vettük. A levett vér mennyiségét fiziológiás sóoldattal

pótoltuk.

44

3.4.1.8. „Foot-shock” stressz (lábra mért áramütés)

A kísérlet során az állatokat egy 30x30x30 cm-es átlátszó dobozba tettük, melynek

az alja rézrudakból áll. 5 percen keresztül minden 30. másodpercben az állatok elektromos

sokkot kaptak (0,8 mA, 50Hz frekvencia, 1 másodpercig). A kontroll állatokat szintén ebbe

a dobozba helyeztük, de elektromos sokkot nem kaptak. A stressz megkezdése előtti

percben, majd utána 5, 15, 30, 60, 90, 120 perc múlva a juguláris vénába helyezett kanülön

keresztül vérmintákat gyűjtöttünk (0,4 ml/minta).

3.4.1.9. Ulcerogén, hidegben történő immobilizáció

Az immobilizációs stressz során egy 4 C-os hideg helységben az állatok mind a

négy végtagját rögzítettük. A vizsgálat során a juguláris vénából a 0., 30., 60., 120., 180., és

240. percben vért gyűjtöttünk (0,4 ml/minta). 4 órával a kísérlet kezdete után az állatok

gyomrát kivettük, felnyitottuk és a kialakult fekélyeket megvizsgáltuk. Ebben a kísérletben

a Brattleboro kontrollok mellett Wistar patkányokat is használtunk, hogy megvizsgáljuk, a

heterozigóták részleges AVP hiányának hatásait is. A kontroll állatokat saját dobozukban

tartottuk.

3.4.1.10. Mozgáskorlátozás (Restraint)

Ez a stressz a teljes immobilizációnál enyhébb mozgáskorlátozási forma. Az

immobilizáció esetén az állat nem képes semmilyen mozgásra. Mozgáskorlátozás esetében

az állatokat egy kónikusan szűkülő műanyag csőbe helyeztük 1 órára. A cső szűk végén az

állat szabadon kapott levegőt, másik végét papírvattával szorosan kitömtük, így az állat

megfordulni ugyan nem tudott, de kisebb mozgásokra képes volt. A stressz megkezdése

előtt, majd a stressz időtartama alatt az 5., 15., 30., 60., és 120. percben a juguláris vénából

vért vettünk (0,4 ml/minta). A kontroll állatokat saját dobozukban tartottuk.

3.4.1.11. Szociális „kudarc” teszt (Social defeat)

A teszt során az állatot egy nála nagyobb tömegű Brattleboro szülőpár (kicsinyek

nélküli) ketrecébe helyezzük 10 percre. A hím állat megtámadta a nála kisebb betolakodót,

azaz a tesztállatunkat. Sérülés esetén a kísérletet azonnal befejeztük, a tesztállatot

eltávolítottuk és ezt az állatot kizártuk az értékelésből. A teszt megkezdése előtt majd, a

45

15., 30., 60., 120. percben a juguláris vénából vért vettünk (0,4 ml/minta). A kontroll

állatokat saját dobozukban tartottuk.

3.4.1.12. Hipoglikémia

18 órás éheztetés után az állatoknál ip Actrapid (gyors hatású inzulin, 3NE/2ml/

ttkg; Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) injekcióval hipoglikémiát idéztünk elő, majd 1

óra múlva dekapitáltuk őket. A részleges AVP hiány befolyásoló hatását ebben a

kísérletben +/+ állatok felhasználásával teszteltük. Az állatok vércukorszintjét egy

kereskedelmi forgalomban kapható vércukorszint-mérő készülékkel mértük (D-Cont

Personal, 77 Elektronika Kft., Budapest). A kontroll állatok éhezést követően ip fiziológiás

sóoldatot kaptak.

3.4.1.13. Forszírozott úszás stressz (forced swim test (FST))

Egy 50 cm magas, 30 cm átmérőjű üveghengert 35 cm magasságig 24 C ± 1C

hőmérsékletű csapvízzel töltöttünk meg, majd az állatokat 10 percre a hengerbe helyeztük

és a 0., 5., 15., 30., 60., 90. percben vérmintákat gyűjtöttünk. Ebben a kísérletben egy

további kontroll csoportot is alkalmaztunk, hogy kizárjuk a perifériás AVP hiány hatásait.

10 nappal a kísérlet megkezdése előtt a di/di genotípusú állatok felének bőre alá

dezmopresszinnel (DDAVP, V2 receptor agonista, Ferring Lieciva) feltöltött (200 µl; 1

mg/ml) Alzet ozmotikus minipumpát (1 μl/óra, 14 nap) helyeztünk. Az állatok másik fele

(di/di és di/+ genotípus) áloperáción esett át. 8 nappal később az állatok jobb juguláris

vénájába kanült helyeztünk, majd 2 nappal később elvégeztük az FST-t.

3.4.1.14. A CRH érzékenység vizsgálata

3.4.1.14.1. In vivo tesztelés

40 ng/kg CRH-t (Sigma) adtunk be vénásan a juguláris kanülön keresztül felnőtt

hím Brattleboro patkányoknak és vérmintákat vettünk 0, 10, 20, 30, 45 és 60 perckor.

3.4.1.14.2. In vitro tesztelés: statikus inkubálás

Az adenohipofízis kivétele és feldarabolása utána a 3.3.4.-es pontban leírtaknak

megfelelően jártunk el. 20 perc 5x10-8

M, illetve 5x10-11

M CRH stimulálás után a

médiumból ACTH, míg a szövetdarabokból cAMP-t szinteket mértünk.

46

3.4.1.15. Mellékvese inkubálás

A mellékveséket a 3.3.4. pontban említett módon dolgoztuk fel. Az inkubálások

során 10-12,

10-11

és 10-10

M ACTH tartalmú DMEM-et alkalmaztunk.

3.4.1.16 AVP retrodialízis a PVN-be [157]

Ezen kísérletek során a di/di állatainkat +/+ kontrollokhoz hasonlítottuk. A

mikrodialízis módszere a félig áteresztő membránon való anyagáramlás (diffúzió) elvén

alapul. A membránon keresztül történő diffúziót a membrán pórusnagysága, a két oldala

közötti koncentráció gradiens, a hőmérséklet, és az áramoltatott mikrodialízis folyadék

sebessége határozza meg. Abban az esetben, ha az extracelluláris térben egy anyag

koncentrációja nagyobb, mint a dializáló folyadékban, akkor az adott anyag az

extracelluláris tér felől a dializáló folyadék felé áramlik. Ha a koncentráció viszonyok

fordítottak, akkor természetesen az agyagáramlás iránya is megfordul. Mivel a szöveti,

extracelluláris terekben lévő anyagok koncentrációját dinamikus egyensúly jellemzi, melyet

számtalan faktor befolyásol, így a koncentrációk megválasztása sarkalatos pontja a

kísérletek megtervezésének [158]. A speciális U-alakú mikrodialízis mintavevők [158]

beültetése a Brattleboro patkányok agyába mély anesztéziában történt, betartva a sterilitás

szabályait. A patkányok fejéről a szőrt a célzott területen leborotváltuk, fertőtlenítettük,

majd a koponyát sztereotaxiás készülékbe fogtuk (David Kopf Instruments; Tujunga CA).

A fejbőr felnyitása után a területet a koponyacsontig megtisztítottuk, majd a célzott terület

közelében egy-egy acél csavart rögzítettünk a falcsontban és a homlokcsontban. A két

acélcsavar között egy elliptikus lyukat fúrtunk a koponyába a következő koordináták

szerint: a bregmá-tól hátra 1,5 mm, a középvonaltól (sutura saggitalis) laterálisan 1,6 mm

(jobb oldalra). Ezek után a mikrodialízis mintavevőt 10º szögben jobb oldalra megdöntve

lassan, de folyamatosan (hogy a sinus saggitalis sérülését elkerüljük) a koponya felszínétől

számított 8,8 mm mélyre süllyesztettük. A mikrodialízis mintavevőt a két acélcsavarhoz,

valamint a koponyacsonthoz rögzítettük fényre keményedő fogászati cement segítségével

(Vivadent Dual Cement, Schaan, Lichtenstein).

A jobb vena jugularisba a korábbiakban ismertetett módon kanült helyeztünk vérminták

gyűjtése céljából. A kanült a behelyezés után heparinos, gentamicines (30.000 IU)

fiziológiás só oldattal töltöttük fel.

47

A műtét után három nappal az állatokat előkészítettük a kísérlethez. A jugurális vénába

ültetett kanült egy hosszú cső segítségével fecskendőhöz kapcsoltuk. A mikrodialízis

mintavevőt pedig összekapcsoltuk a mintavételi Eppendorf csővel, illetve a mikrodializáló

folyadékot áramoltató pumpával (11. ábra).

Az első kísérlet során vér és mikrodialízis mintákat gyűjtöttünk a 10 perces FST

előtt, alatt és után a 11.A ábrának megfelelő időpontokban (vérminták), illetve

időintervallumokban (a 100μl-es mikrodialízis mintákat 30 perc alatt gyűjtöttük). A

második kísérletsorozat során vérminták gyűjtésére került sor a 11.B ábrán jelölt

időpontokban, miközben az állatokba AVP (10 μg/ml; [deamino-Cys-Val-D-

Arg]vasopressin; Sigma, Taufkirchen, Germany) vagy Ringer oldatot jutattunk

retrodialízissel.

A

B

11. ábra

Forszírozott úszás tesztek és mintavételi protokoll

A. FST mintavételek. A nyilak a mikrodializátum és vérminták gyűjtésének időpontját jelölik,

B. AVP retrodialízis. A nyilak a vérminták gyűjtésének időpontját jelölik

3.4.1.17 Egyszeri morfin kezelés hatása [159]

Az állatokat a korábban említett módon a juguláris vénába helyezett kanüllel láttuk

el a kísérlet megkezdése előtt 2 nappal. A kísérlet napján az állatok 10mg/kg/ 2 ml dózisban

Vérminták:

30. perc 2 perccel a

FST kezdete után

15 perccel a

FST kezdete

után

105 perccel a

FST kezdete

után

1. 30 perces 2. 30 perces 3. 30 perces 4. 30 perces 6. 30 perces 5. 30 perces

FST 10 perc

2/AVP 1. 2.

3. /AVP 4. AVP

6. AVP

5. AVP

FST 10 perc

Vérminták:

30. perc 2 perccel a

FST kezdete

után

15 perccel a

FST kezdete

után

105 perccel a

FST kezdete

után

48

egyszeri szubkután (sc) morfin injekciót kaptak. Az injekció előtt közvetlenül, majd az 5.,

15., 30., 60., 90. percben az állatoktól vért vettünk (0,4 ml/minta).

3.4.2. Krónikus stressz kísérletek

3.4.2.1. Krónikus morfin kezelés utáni morfin megvonás hatása [159]

Korábbi tanulmányokat alapul véve [160, 161] az állatokat naponta kétszer, reggel

hét és este hét órakor 16 egymást követő napon szubkután morfinnal oltottuk a következő

séma szerint:

1. táblázat

A krónikus morfin kezelés protokollja

Az állatok az első 10 napban, naponta 10 mg/kg-mal emelkedő dózisban kapták a morfint

elérve így a 10. napra a 100 mg/kg-os dózist. A 11.-16. napig az állatok a megszokott

időpontokban 100 mg/kg dózisban kaptak sc injekciót. A 17. napon, vagyis a dekapitáció

reggelén az állatoktól a farokvénából (a lehető legkisebb stresszt okozva) vérmintát

vettünk. Minden csoportban az állatokat az utolsó injekciót követő négy óra múlva, délelőtt

11 órakor dekapitáltuk. Utolsó injekcióként a morfin kezelt állatok fele reggel 7-kor a

megszokott morfin helyett fiziológiás sóoldatot kapott (vagyis a morfin elvonás 16 órás;

MK csoport), míg a csoport másik fele a szokott időben 100 mg/kg dózisban ismét morfint

kapott (itt 4 órás a morfin elvonás; MM csoport).

3.4.2.2. 28 napos ismételt mozgáskorlátozás (repeated restraint) [162]

Az állatokat 28 egymást követő napon, naponta 1 órára egy kónikusan szűkülő

műanyag csőbe helyeztük, az akut mozgáskorlátozás stressznél leírtak szerint. A stressz a

di/+ vagy di/di

Kontroll (KK) Morfin (MK) Morfin (MM)

7 óra 19 óra 7 óra 19 óra 7 óra 19 óra

1. nap fiz. só. fiz. só 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg

2. nap fiz. só. fiz. só 20 20 20 20

3. nap fiz. só. fiz. só 30 30 30 30

4.-9. nap fiz. só. fiz. só …+10 mg/kg/nap …+10 mg/kg/nap

10.-16. nap fiz. só. fiz. só 100 100 100 100

Dekapitáció 17. nap

fiz. só dekapitálás

11 órakor

fiz. só dekapitálás

11 órakor

100 mg dekapitálás

11 órakor

49

kísérlet időtartama alatt minden nap ugyan abban az időben következett be délelőtt 9 és 12

óra között. A 29. napon az állatok egyik felét kb. 24 órával az utolsó mozgáskorlátozás után

dekapitáltuk, amihez kontrollként stresszeletlen állatok szolgáltak. Az akut reaktivitás

vizsgálatához előzetesen stresszeletlen kontroll állatokat, illetve 28 mozgáskorlátozáson

átesett állatokat a 29. napon egy 1 órás mozgáskorlátozás stressznek tettük ki és az 1 óra

végén azonnal dekapitáltuk őket (29R).

Az akut stressznek ki nem tett állatokból a mellékveséket eltávolítottuk. Az egyik

mellékvesét fixáltuk a mellékvese kéreg területének meghatározása céljából (lsd. 3.3.3.). A

másikat feldaraboltuk, és in vitro szuperfúziós rendszerben megmértük az ACTH

érzékenységét (3.3.5.).

3.4.2.3. Krónikus váltakozó, enyhe stressz [163]

A kísérlet 6 hete alatt naponta 2 alkalommal a felnőtt, hím Brattleboro patkányokat

a következő enyhe stressz stimulusoknak tettük ki: vízmegvonás, éheztetés, az izomerő

mérésére használt „wire suspension”; a motoros koordinációt vizsgáló „rotarod”; emelt

keresztpalló teszt, 30 illetve 60 perces mozgáskorlátozás farokvágással, forszírozott úszás,

nedves, vagy megdöntött doboz, egerektől származó alom, a megszokottól elértő

fényviszonyok alkalmazása, túlzsúfolás (3 állat egy dobozban) vagy egyedüli elhelyezés 2-

48 órán keresztül. Az utolsó héten követtük az állat magatartását (EPM, FST teszt). Az

állatokat minimum 24 órával az utolsó stimulust követően dekapitáltuk. A szervsúlyok

vizsgálata mellett vérmintákat gyűjtöttünk hormonszint mérés céljából, a hipofíziseken

POMC mRNS szint meghatározást végeztünk.

3.4.2.4. Magatartás az emelt keresztpallón

Az akut stressznél leírt módon végeztük a vizsgálatot. Az állatokat 5 percre az

EPM-re helyeztük, a viselkedésüket videóra rögzítettük és a magatartásukat a H77,

di/+ di/di

Krónikus kezelés kontroll 28R kontroll 28R

Akut kezelés kontroll R kontroll R kontroll R kontroll R

2. táblázat

A 28 napos mozgáskorlátozásos kísérlet csoportjai

50

intézetünkben Haller József által fejlesztett elemző program segítségével később egy, a

kezeléseket nem ismerő személy elemezte. A vizsgált paraméterek voltak: nyílt karban

töltött idő (%), zárt kari belépések száma (mennyiség), mint a mozgékonyság mértéke, és a

nyílt kari aktivitás (nyílt/(nyílt+zárt) kari belépések száma *100 (%)), ami a szorongás

mozgékonyság független paramétere. Etológiailag fontos paraméterek közül a mosakodást

(öngondozás az első mancsok segítségével, vagy a hátsó lábakkal vakarózás); a

kockázatfelmérő magatartást (stretched attend postures, SAP; felderítő mozdulat, mikor az

állat kinyúlik, majd visszahúzódik anélkül, hogy a végén valójában elmozdulna, a hátsó

lába mindvégig a helyén marad) és a vertikális mozgás ágaskodó paraméterét elemeztük ki.

3.4.2.5. Magatartás az FST alatt

Az akut stressznél leírt módon folyt a vizsgálat. Az első nap az állatokat 15 percre

helyeztük a vízzel telt hengerbe (depresszió-szerű állapot előidézése), de csak a másnapi, 5

perces úszást vettük videóra. Vizsgált paraméterek: lebegés (floating): nincs érzékelhető

mozgás az egyensúlyozáson kívül; úszás (swimming): az állat mellső lábaival úszó

mozdulatokat végez, de ez nem töri át a vízfelszínt; küzdés (struggling): az állat mellső

lábaival áttöri a vízfelszínt; búvárkodás (diving): az állat feje a víz alá kerül.

3.4.3. Perinatális kor vizsgálata

3.4.3.1. Kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata [164]

A szülőpárok kiválasztásakor a következő elveket alkalmaztuk: az anya mindig di/+,

míg az apa di/di genotípusú. A megszülető utódok ezért vagy a di/+, vagy a di/di genotípust

mutatták. Mivel az állatok vízfogyasztásának tesztelése csak az anyától való elválasztás (21

napos életkor) után lehetséges, e kor előtt csak az utólagos AVP szintmérés után

sorolhattuk be a kölyköket a két genotípus valamelyikébe. Megjegyzendő még, hogy az

almokban nagyobb számmal születtek di/+, mint di/di genotípusú állatok. A szülőket és a

kölyköket specifikus patogén mentes (specific pathogen free, SPF) környezetben tartottuk

kontrollált körülmények között (12 óra világos/12 óra sötét periódus, világos periódus

kezdete reggel 7 óra; 23ºC± 1Cº; relatív páratartalom 50-70%). A kísérletek során az egy

51

alomban született összes kölyköt felhasználtuk, a nemek között különbséget nem tettünk. A

következő vizsgálatokat végeztük:

a) Az egy alomba született kispatkányok felét 9 napos korukban 24 órára

elválasztottuk az anyjuktól. A kispatkányok egy új, tiszta almot tartalmazó dobozba

kerültek extra élelem, víz vagy melegítés nélkül. A kispatkányokat az elválasztási

periódus után dekapitáltuk, a törzsvért K2-EDTA tartalmú csövekbe fogtuk fel.

b) A 9 napos kispatkányokat az a) pontban leírtak szerint választottuk el az anyától,

de a dekapitálás az elválasztás után 1, 4, 12 illetve 24 óra múlva történt.

c) 4, 9, 19 napos kispatkányokat választottunk el a fentebb leírt módon az anyjuktól és

24 óra múlva, vagyis 5, 10, 20 napos korukban dekapitáltuk őket.

d) A kísérlet során a kispatkányok stresszre adott válaszait vizsgáltuk. 10 napos

korukban a kölyköket sc 1µl/ttg fentanil-fluanizon kombinációval kezeltük

(Hypnorm, Janssen Pharmaceuticals, Grove, Oxford, UK; a fentanil, mint µ-ópiát

receptor agonista gyakran alkalmazott szer a gyermeksebészetben). A kontroll

állatok hasonló dózisban fiziológiás só oldatot kaptak. Az injekció után a kölykök

visszakerültek az anya mellé, majd 60 perc elteltével az állatokat dekapitáltuk és a

törzsvért csövekbe gyűjtöttük, az agyakat szárazjégen azonnal fagyasztottuk [165].

e) 5, 10, 20 napos korukban a kispatkányokat sc 1µl/ttg fentanil-fluanizon

kombinációval kezeltük a d) pontban leírtak szerint. A kontroll állatok hasonló

dózisban fiziológiás só oldatot kaptak. Az injekció után a kölykök visszakerültek az

anya mellé, majd 30 perc elteltével az állatokat dekapitáltuk és a törzsvért csövekbe

gyűjtöttük, az agyakat szárazjégen azonnal fagyasztottuk.

f) 10 napos kölykök mellékveséjét a 3.3.4. pontban leírtaknak megfelelően kezeltük.

10-13

M, 10

-12 M és 10

-11 M ACTH adására került sor (lsd. még 3.4.1.14. és

3.4.1.15.).

g) A 10 napos kispatkányoknál egyszeri 250 ng/ttg dózisú β1-24-kortikotropin

(Synacthen, CIBA, Baden, Switzerland) sc injekciót alkalmaztunk. Az injekció

után a kispatkányokat visszahelyeztük az anyjuk alá, majd 60 perc elteltével

dekapitáltuk őket, a törzsvért hormonmérés céljából összegyűjtöttük. A kísérlet

során használt dózis beállítása előzetes kísérleteink alapján történt. 2, 10, 50 ng/ttg

52

dózisú Synacthen nem okozott szignifikáns változást a kispatkányok ACTH

szintjében 15 perc elteltével az injekció után. Ugyanakkor a 250 ng/ttg dózis után

15 perccel 2,5-szeres, 30 perccel később 2-szeres eltérés tapasztalható, majd 60

perc után az ACTH szint az alap értékekre csökken vissza. Hasonló változásokat

figyelhettünk meg a kortikoszteron szintek esetén, ahol 15 perc után 1,6-szeres, 30

perc után 2,3-szeres, míg 60 perccel az injekció után 3-szoros különbség

mutatkozik az alap állapotban mért kortikoszteron értékekhez képest.

3.4.3.2. Perinatális kor: Nemek közötti különbségek [166]

a) 9 napos kispatkányokat a korábbiakban ismertetett módon elválasztottunk az

anyjuktól, majd 24 órával később 10 napos korukban dekapitáltuk őket. A hím és

nőstény kispatkányokból származó mintákat külön kezeltük.

b) 10 napos kispatkányokat éter stressznek tettünk ki a következők szerint: A kontroll

csoport állatait (mindkét nemből) az anyától való elvétel után rögtön dekapitáltuk.

Az egyszeres éter stresszelt csoport kölykeit éterrel átitatott vattát tartalmazó

50ml-es centrifuga csőbe helyeztük 3 percre, majd 10 perccel a kísérlet kezdete

után dekapitáltuk őket (3 perc stressz + 7 perc várakozás). A kétszeres éter

stresszelt csoport állatait az első 3 perces stressz után az anyától elválasztva

tartottuk, majd 60 perccel az első éter stressz megkezdése után újból 3 percre a

csőbe kerültek. A kísérlet kezdetétől számított 70. percben dekapitáltuk őket.

53

3.5. Statisztika

Az eredményeinket az átlag ± SEM feltüntetésével ábrázoltuk. Adatainkat az

Statistica programcsomag (Tulsa, OK, USA) ANOVA/MANOVA moduljával értékeltük

ki. Azoknál az eseteknél, ahol időpontok szerinti ismételt vérvétel történt „repeated

measure” ANOVA analízist végeztünk (az idő hatása). Azoknál a kísérleteknél ahol

egyetlen szempont szerinti összehasonlítás történt (pl. genotípus) az „egyutas” („one-way”)

ANOVA-t használtunk. Több szempont szerinti összehasonlítás esetén a megfelelő

ANOVA modul került kiválasztásra. Azokban az esetekben ahol elvégezhetőek voltak a

„post-hoc” tesztek a Newman-Keuls módszert használtuk. (Ettől elérő eseteket a megfelelő

kísérlet eredményeinél külön jelöltem.) A szignifikancia szintjét p=0,05-nél állapítottuk

meg. A szövegben a fő hatások kerültek feltüntetésre, míg az ábrákon a „post-hoc”

összehasonlítások eredménye szerepel (eltérő esetben az ábra-aláírásban jeleztük).

54

4. Eredmények

4.1. A felnőtt Brattleboro patkányok akut stresszreaktivitása

4.1.1. Újdonság stressz (Novelty stress)

Nyugalmi állapotban a hormonszintek között nincsen különbég a két genotípusban

(12. ábra). AVP jelenlétében (di/+) mind az ACTH mind a kortikoszteron plazmaszintek

megemelkednek a 10 perces újdonság stressz hatására (stressz hatás mindkét hormonra:

p<0,01). Ezzel ellentétesen AVP hiányában („di/di”) elmarad az ACTH szintek emelkedése

(stressz és genotípus interakció: p<0,05). A stressz indukálta kortikoszteron szint

emelkedés mindkét genotípusban azonos (nincs interakció).

4.1.2. Szociális elkerülés (Social avoidence)

A 8 perces szociális elkerülés stressz hatására megemelkedő ACTH és kortikoszteron

szintek nem különböztek a két genotípus között (3. Táblázat; stressz hatás: p<0,05).

4.1.3. Emelt keresztpalló teszt (EPM)

Az EPM kiváltotta ACTH szint emelkedés szignifikánsan alacsonyabb volt a

„di/di”-s állatok esetében (3. Táblázat; stressz hatás: p<0,05; stressz és genotípus

interakció: p<0,05). A kortikoszetron szintek esetén a genotípusnak nem volt hatása (stressz

hatás: p<0,05).

12. ábra

Újdonság stressz. K=Kontroll, S=Stresszelt; ** p< 0,01 eltérés a kontrollhoz

képest, ## p<0,01 eltérés a di/+-hoz képest

di/+ di/di

K S K S0

25

50

75

100

AC

TH

(fm

ol/m

l)

**

##

di/+ di/di

K S K S0

25

50

75

100

AC

TH

(fm

ol/m

l)

**

##

di/+ di/di

K S K S0

250

500

750

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

****

di/+ di/di

K S K S0

250

500

750

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

****

55

4.1.4. Lipopoliszacharid (LPS) injekció

Egy órával az ip LPS injekció után szignifikáns ACTH és kortikoszteron szint

emelkedést tapasztaltunk a di/+-os állatok esetében (stressz hatás mindkét hormonra:

p<0,01). A di/di-s állatok esetében az ACTH szintje nem emelkedett (3. Táblázat; stressz és

genotípus interakciója az ACTH esetén: p<0,05).

4.1.5. Éter inhaláció

10 perccel a stressz kezdte után mindkét genotípusban szignifikáns ACTH és a

kortikoszteron szint emelkedést mértünk (3. Táblázat; stressz hatás: p<0,01; nincs

genotípus hatás és interakció sem).

3. Táblázat

Az ACTH és kortikoszteron szintek a stressz utáni egyetlen időpontban.

*p<0.05; **p<0.01 szignifikáns eltérés a kontroll csoporthoz képest; #p<0.05 szignifikáns

eltérés a di/+ patkányokhoz képest

ACTH

(fmol/ml)

Alap

hormonszintek

Szociális

elkerülés

Emelt

keresztpalló

teszt

LPS

stressz

Éter

stressz

di/+

23,9 ± 3,0 110,5 ±

17,6 209,2 ± 31,4 295,2 ± 106,1*

1027,6 ± 75,8**

(n=136) (n=18) (n=6) (n=10) (n=19)

di/di

21,0 ± 1,5 83,5 ± 22,7 121,6 ± 20,4# 192,9 ± 98,7

999,8 ± 89,3**

(n=135) (n=9) (n=14) (n=10) (n=16)

Kortiko-

szteron

(pmol/ml)

Alap

hormonszintek

Szociális

elkerülés

Emelt

keresztpalló

teszt

LPS

stressz

Éter

stressz

di/+

137,4 ± 17,6 339,5 ± 76,5 499,2 ± 61,4 962,9 ± 201,4**

721,1 ± 64,1**

(n=142) (n=7) (n=6) (n=10) (n=19)

di/di

175,2 ± 13,7 326,0 ± 50,4 534,7 ± 35,6 864,8 ± 270,5** 791,8± 73,8**

(n=140) (n=5) (n=14) (n=10) (n=16)

56

4.1.6. Hipertóniás só oldat injekciója

Az ip injekcióban alkalmazott hipertóniás só oldat mindkét genotípusban ACTH

szint emelkedést váltott ki (13.A ábra; stressz hatás: p<0,01). Ha megfigyeljük a

hormonszintek változásának időbeli lefutását láthatjuk, hogy mindkét genotípusban gyors

ACTH válasz alakult ki az injekció hatására és emelkedett hormonszinteket figyelhettünk

meg 2 órával az injekció után is (idő hatás: p<0,01). AVP hiányos állatokban a „60 perces”

minta mutat csak eltérést a di/+ csoporthoz képest (genotípus hatás és stressz, idő,

genotípus interakció: p<0,05). A kortikoszteron szintek esetében fokozatos szintbeli

emelkedést figyeltünk meg (0. perctől a 30. percig), és ez az emelkedett szint marad meg a

kísérlet végéig (stressz és idő hatás: p<0,01). A kortikoszteron választ az állatok genotípusa

nem befolyásolta.

4.1.7. Anafilaktoid reakció

A vena jugularisba injektált tojásfehérje mindkét genotípusban igen erőteljes ACTH

és kortikoszteron szint emelkedést váltott ki (14. ábra; stressz és idő hatás: p<0,01). Az

ACTH csúcs a 15. és 30. perc között alakult ki. Ezt követően a di/+ állatoknál a 90. perc

környékén, a „di/di” állatoknál már a 60. percre a hormon szintje az alapszint közelébe

csökkent. AVP hiányában szignifikánsan kisebb az ACTH szint emelkedése (genotípus és

interakciói hatása: p<0,05). Mindkét csoportban gyors kortikoszteron szint emelkedést

figyeltünk meg (stressz és idő hatás: p<0,01). A kortikoszteron szintek esetében nincs

genotípus hatás.

Idő (perc)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 15 30 45 60 75 90 105 120

Kort

ikosz

tero

n (

pm

ol/m

l) inj.

++

++ ++

++**++**

Idő (perc)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 15 30 45 60 75 90 105 120

Kort

ikosz

tero

n (

pm

ol/m

l) inj.

++

++ ++

++**++**

0

100

200

300

400

500

600

700

0 15 30 45 60 75 90 105 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+ K di/+NaCl

di/di K di/diNaCl

###

inj.

* **

**

**

++**

++**++**

++**

++**

++**

++** ++**

++**++**#

0

100

200

300

400

500

600

700

0 15 30 45 60 75 90 105 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+ K di/+NaCl

di/di K di/diNaCl

###

inj.

* **

**

**

++**

++**++**

++**

++**

++**

++** ++**

++**++**#

13. ábra

Hipertóniás só oldat

++ p< 0,01 eltérés a 0. perctől, * p<0,05 ** p<0,01 eltérés a kontroll csoporttól,

# p< 0,05 ## p< 0,01 eltérés a di/+-hoz képest

57

4.1.8. „Foot-shock” stressz

Az állatok behelyezése a „foot-shock” dobozba szignifikánsan, de genotípustól

független módon emelte mind az ACTH, mind a kortikoszteron szinteket (di/+ K és di/di K

csoport) (15. ábra; idő hatás: p<0,01). Egyszeri elektromos sokk képes volt tovább emelni

az ACTH szintjét (stressz hatás: p<0,05), míg a kortikoszteron szintek esetén csak erre

utaló tendenciát láthattunk (stressz hatás: p=0,08). Egyik hormon esetén se volt hatása a

genotípusnak.

15. ábra

Foot-shock

+p<0,05 ++ p< 0,01 eltérés a 0. perctől, ** p<0,01 eltérés a kontroll csoporttól

14. ábra

Anafilaktoid reakció

++ p< 0,01 eltérés a 0. perctől, **p<0,01 eltérés a kontroll csoporttól,

## p< 0,01 eltérés a di/+-hoz képest

Idő (perc)

0

250

500

750

0 15 30 45 60 75 90 105 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+K

di/+FS

di/diK

di/diFS

++

+

++

+

++**

++

+ +++++

++

++**

+

++

++

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 15 30 45 60 75 90 105 120

Ko

rtik

oszte

ron

(p

mo

l/m

)l

++

++ ++

++++

Idő (perc)

58

4.1.9. Ulcerogén, hidegben történő immobilizáció

A kísérletben di/+ és di/di állatok mellett Wistar kontrollokat is használtunk (16.

ábra). A stressz mindhárom csoportban erőteljes ACTH és kortikoszteron szint emelkedést

váltott ki (idő hatás: p<0,01). A di/+ genotípusú állatokban és a Wistar patkányok esetében

hasonló volt az emelkedés mértéke, míg a di/di állatok csökkent ACTH szint emelkedést

mutattak a 60. percben (idő és csoport interakció: p<0,01). A kortikoszteron szintek esetén

nem volt különbség a csoportok között.

4.1.10. Mozgáskorlátozás (Restraint)

A mozgáskorlátozás kiváltotta ACTH szint emelkedés a csúcsát 15 percen belül érte

el és a hormonszint a csúcs közelében maradt a stressz végéig, majd a kísérlet végére (120.

perc) az alapszint közelébe esett vissza (17. ábra; idő hatás: p<0,01). A kortikoszteron

szintek esetében fokozatos emelkedést figyeltük meg a stressz 60 perce alatt (idő hatás:

p<0,01). A kortikoszteron csúcs hozzávetőlegesen a stressz 30. percére alakult ki, majd a

kísérlet végéig tartósan magas szinten maradt. AVP hiányában a stressz által kiváltott

ACTH és kortikoszteron szint emelkedés is csökkent mértékű volt (genotípus hatás és idő-

genotípus interakció: p<0,01).

16. ábra

Ulcerogén hideg immobilizációs stressz

++ p <0,01 eltérés a 0. perchez képest, # p<0,05 eltérés a di/+ csoporthoz képest

59

4.1.11. Szociális „kudarc” teszt (Social defeat)

A 10 perces agresszív interakció elég erős stimulus volt ahhoz, hogy szignifikánsan

emelkedett és hosszan tartó ACTH és kortikoszteron szint változásokat produkáljon (18.

ábra; idő hatás: p<0,01). AVP hiányában csökkent mértékű a két hormon szintjének

emelkedése (idő-genotípus interakció: p<0,01).

17. ábra

Restrain teszt

+ p< 0,05 ++ p< 0,01 eltérés a 0. perchez képest;

# p< 0,05 ## p< 0,01 eltérés a di/+ csoporthoz képest

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 20 40 60 80 100 120

Ko

rtik

oszte

ron

(p

mo

l/m

l)

++ ++#++

++ ++++

++

++

++#

++

++

Restraint

0

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

++

++ ++

++++

++

++##

+

Restraint

++##++##

++##

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 20 40 60 80 100 120

Ko

rtik

oszte

ron

(p

mo

l/m

l)

++ ++#++

++ ++++

++

++

++#

++

++

Restraint

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 20 40 60 80 100 120

Ko

rtik

oszte

ron

(p

mo

l/m

l)

++ ++#++

++ ++++

++

++

++#

++

++

Restraint

0

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

++

++ ++

++++

++

++##

+

Restraint

++##++##

++##

Idő (perc) Idő (perc)

di/+ di/di

18. ábra

Szociális kudarc teszt

Agr- az agresszív kontaktus 10 perce; + p< 0,05 ++ p< 0,01 eltérés a 0. perchez képest; #

p< 0,05 ## p< 0,01 eltérés a di/+ csoporthoz képest

Idő (perc) Idő (perc)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 30 60 90 120

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

++++ ++

++

++

++

++

++#++##

++

Agr0

200

400

600

0 30 60 90 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+ di/di

++

Agr

++++

++ ++

+#

++

++

++

#

0

200

400

600

800

1000

1200

0 30 60 90 120

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

++++ ++

++

++

++

++

++#++##

++

Agr0

200

400

600

0 30 60 90 120

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+ di/di

++

Agr

++++

++ ++

+#

++

++

++

#

60

4.1.12. Hipoglikémia

A 18 órás éhezést követően mindhárom genotípusban hasonlóak voltak a

vércukorszintek (+/+: 4,67±0,1 mmol/l; di/+: 4,62±0,2 mmol/l; di/di: 4,45±0,2 mmol/l; 19.

ábra). Intraperitoneálisan alkalmazott Actrapid injekció szignifikánsan csökkentette

mindhárom genotípusban a vércukorszintet (+/+: 2,48±0,05 mmol/l; di/+: 2,29±0,05

mmol/l; di/di: 2,00±0,1 mmol/l). Legnagyobb mértékű változást a di/di csoportban

figyeltünk meg (genotípus hatása: p<0,05). A vércukorszint ilyen erőteljes csökkenése

hatalmas ACTH és kortikoszteron szint emelkedést váltott ki (19. ábra; stressz hatás:

p<0,01). AVP hiányában az ACTH szint emelkedése kevésbé kifejezett a +/+ és di/+

genotípusokhoz képest, ugyanakkor utóbbi két csoport között eltérést nem tapasztaltunk

(genotípus hatás és stessz-genotípus interakció: p<0,01). A kortikoszteron szintek

vonatkozásában nem tapasztaltunk genotípusok közötti különbséget.

19. ábra

Hipoglikémia stressz

** p< 0,01 eltérés a kontroll csoporthoz képest;

## p< 0,01 eltérés a +/+ és a di/+ csoporthoz képest, K=kontroll, A= Actrapid kezelt

4.1.13. Forszírozott úszás stressz (FST)

Az ozmotikus minipumpa útján visszapótolt AVP (DDAVP, dezmopresszin)

szignifikánsan csökkentette a di/di genotípusú állatok vízfelvételét (di/di: 103,9±8,3 ml/

nap; di/di DDAVP: 32,6±1,9 ml/ nap). Az FST szignifikáns ACTH és kortikoszteron szint

emelkedést váltott ki mindhárom csoportban (20. ábra; idő hatás: p<0,01). A centrális AVP

0

250

500

750

1000

+/+K +/+A di/+K di/+A di/diK di/diA

AC

TH

(fm

ol/m

l) ** **

**##

0

250

500

750

1000

+/+K +/+A di/+K di/+A di/diK di/diA

AC

TH

(fm

ol/m

l) ** **

**##

Figure 1

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

+/+K +/+A di/+K di/+A di/diKdi/diA

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

****

**

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

+/+K +/+A di/+K di/+A di/diKdi/diA

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

****

**

61

szerepét látszik bizonyítani az, hogy hiányában az ACTH szintje alacsonyabb emelkedést

mutatott, illetve a perifériás AVP visszahelyezés a csökkent ACTH választ nem volt képes

a normális szintre emelni (csoport hatás és idő-csoport interakció: p<0,05). A

kortikoszteron szintek esetében szignifikáns különbséget nem figyeltünk meg a csoportok

között.

4.1.14. A hipofízis elülső lebeny CRH érzékenység vizsgálata

4.1.14.1. In vivo tesztelés

A in vivo CRH stimulus (40 ng/kg iv) szignifikáns ACTH és kortikoszteron

szekréciót okozott (21. ábra; stimulus hatás: p<0,01). A di/di állatok ACTH termelése

alacsonyabb, mint di/+-os társaiké (genotípus hatás: p<0,01), ugyanakkor a kortikoszteron

szintek között eltérést nem tapasztalatunk.

21. ábra

CRH érzékenység in vivo vizsgálata Brattleboro patkányokban

+p<0,05, ++p<0,01 a 0 perchez képest; ##p<0,01 a di/+-hoz képest

0

50

100

150

200

0 10 20 30 40 50 60

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+

di/di

CRH

++

++

++##

#### ##

CRH

60

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50

Kort

ikosz

tero

n(p

mol/m

l)

+

+++ +

+ +

++

0

50

100

150

200

0 10 20 30 40 50 60

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+

di/di

CRH

++

++

++##

#### ##

0

50

100

150

200

0 10 20 30 40 50 60

AC

TH

(fm

ol/m

l)

di/+

di/di

CRH

++

++

++##

#### ##

CRH

60

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50

Kort

ikosz

tero

n(p

mol/m

l)

+

+++ +

+ +

CRH

60

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50

Kort

ikosz

tero

n(p

mol/m

l)

+

+++ +

+ +

60

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40 50

Kort

ikosz

tero

n(p

mol/m

l)

+

+++ +

+ +

++

Idő (perc) Idő (perc)

20. ábra

FST hatása. + p< 0,05 ++ p< 0,01 eltérés a 0. perchez képest;

# p< 0,05 eltérés a di/+ csoporthoz képest; DDAVP: dezmopresszin kezelt; FS: az úszás 10 perce

62

4.1.14.2. In vitro tesztelés: statikus inkubálás

Amikor az adenohipofíziseket CRH tartalmú médiumban in vitro rendszerben

inkubáltuk, szignifikánsan megemelkedett a szervdarabok cAMP és ACTH termelődése

(22. ábra; stimulus hatás: p<0,01). AVP hiányában (di/di) az adenohipofízisek ACTH

termelése szignifikánsan alacsonyabb volt (genotípus hatás: p<0,01), míg hasonló

különbséget a cAMP szintek esetén ne figyelhettünk meg.

4.1.15. Mellékvese inkubálás

A mellékvesék kortikoszteron termelését az ACTH dózisfüggő mértékben emelte

(23. ábra; dózis hatás: p<0,01). AVP hiányában a di/di genotípusú állatok mellékveséinek

ACTH érzékenysége szignifikánsan alacsonyabb volt, mint di/+ genotípusú társaiké, amit a

vizsgált teljes periódus alatt kibocsájtott összes ACTH mennyiségével jellemezhettünk

(AUC; 23.A ábra; genotípus hatás: p<0,01).

.

23. ábra

A mellékvese inkubálás eredményei

A: ** p< 0,01 * p<0,05 szignifikáns eltérés az 10-12 M ACTH-hoz képest; ## p< 0,01 szignifikáns eltérés

a di/+ csoporthoz képest;

B: ++ p< 0,01 szignifikáns eltérés az első 15 perces frakcióhoz képest; ## p< 0,01 szignifikáns eltérés

a di/+ csoporthoz képest

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

10-12

ACTH koncentráció (M)

Ne

ttó

ko

rtik

oszte

ron

fe

lsza

badu

lás

az a

lap

%-b

an

kife

jezve

(AU

C) di/+

di/di**

**##

*

10-11 10-10

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

10-12

ACTH koncentráció (M)

Ne

ttó

ko

rtik

oszte

ron

fe

lsza

badu

lás

az a

lap

%-b

an

kife

jezve

(AU

C) di/+

di/di**

**##

*

10-11 10-10

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1 2 3 4 5 6

A 15 perces fraciók száma

Ko

rtik

oszte

ron (

az a

lap %

-ban

kife

jezve

)

di/+

di/di

++

++

++

++##

## ##

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1 2 3 4 5 6

A 15 perces fraciók száma

Ko

rtik

oszte

ron (

az a

lap %

-ban

kife

jezve

)

di/+

di/di

++

++

++

++##

## ##

B A

di/+ di/di

0

2

4

6

8

K CRH K CRH

cA

MP

(fm

ol/m

l) **

**

di/+ di/di

0

2

4

6

8

K CRH K CRH

cA

MP

(fm

ol/m

l) **

**

di/+ di/di

0

1000

2000

3000

4000

K CRH K CRH

AC

TH

(fm

ol/m

l)

**

**##

di/+ di/di

0

1000

2000

3000

4000

K CRH K CRH

AC

TH

(fm

ol/m

l)

**

**##

22. ábra

CRH érzékenység in vitro vizsgálata cAMP és ACTH méréssel adenohipofízis darabkákon

**p<0,01 a kontroll kezeléshez képest; ##p<0,01 a di/+-hoz képest

63

10-12

M ACTH tartalmú médium jelenlétében történő inkubálás időfüggő módon emeli a

szervdarabok kortikoszteron termelését (idő hatás: p<0,01), de AVP hiányában

szignifikánsan alacsonyabb mértékű ez az emelkedés (23. B ábra; genotípus hatás és idő-

genotípus interakció: p<0,01).

4.1.16. A vazopresszin hiányos állatok forszírozott úszástesztben mutatott

stressz reaktivitása AVP retrodialízises kísérletben

4.1.16.1. ACTH és kortikoszteron szintek változása

FST stressz hatására mindkét genotípusban megfigyelhető az ACTH és

kortikoszteron szintek megemelkedése (24. ábra; stressz és idő valamint interakciójuk

hatása: p<0,01). ACTH esetében már a második vérminta ACTH tartalma magasabb volt,

és a harmadik vérvételre az ACTH szintje tovább emelkedett, de a genotípusnak nem volt

az emelkedésre hatása. Ugyanakkor a kortikoszteron esetében csak a 3. vérminta esetében

volt emelkedett a hormonszint, majd a negyedik minta hormontartalma már csökkent és

ekkor a két genotípus között szignifikáns eltérés volt megfigyelhető (genotípus hatás:

p=0,01).

24. ábra

FST hatása a plazma ACTH és kortikoszteron szintjére ** p<0,01 szignifikáns eltérés az első mintától; ## p<0,01 eltérés a +/+ genotípushoz képest.

1. minta 30 perccel a tesz előtt, 2. minta 2 perccel a 10 perces FST kezdete után,

3. minta 15 perccel a teszt megkezdése után, 4. minta 105 perccel a teszt megkezdése után lett véve

64

4.1.16.2. Oxitocin

A plazma OT szintjei hasonló változásokat mutattak a +/+ és di/di állatokban a 10

perces FST hatására (25. ábra; stressz és idő hatása: p<0,01). Azonban a 105. percben

szignifikáns eltérést tapasztalhattunk a két genotípus között, a di/di állatok esetén magasabb

OT szintekkel (stressz-idő-genotípus interakció: p=0,01).

4.1.16.3. Oxitocin és CRH mRNS in situ hibridizáció a PVN-ben

A PVN egész területének vizsgálata során az AVP hiányos állatokban emelkedett

OT mRNS szinteket mértünk (26. ábra; genotípus hatás: p<0,05). Ha az elemzést

lebontottuk a PVN alrégióira, akkor kiderült, hogy a különbség a mediális parvocelluláris

területnek volt köszönhető, míg a PVN többi vizsgált területén szignifikáns eltéréseket nem

tapasztaltunk, bár tendencia volt megfigyelhető az emelkedett OT mRNS szintre a hátsó

(posterior) magnocelluláris területeken is (26.D ábra; p=0,08). CRH mRNS esetében

különbségeket nem mértünk a két genotípus között (+/+: 78,7±11,4 pixel/sejt; di/di:

89,9±2,7 pixel/sejt).

25. ábra

A plazma oxitocin szintjének változása 10 perc FST hatására.*p<0,05 **p<0,01 szignifikáns eltérés az

első mintától. 1. minta 30 perccel a tesz előtt, 2. minta 2 perccel a 10 perces FST kezdete után,

3. minta 15 perccel a teszt megkezdése után, 4. minta 105 perccel a teszt megkezdése után lett véve

65

pm

0

mp

*

dppm0

500

1000

1500

2000

2500

C D

A B

2500

5000

7500

+/+

terü

let (

pix

el/le

me

z) *

di/di

III III

terü

let (

pix

el/le

me

z)

pmdp

mp

pmdp

mp

4.1.16.4. Az FST során a PVN-ből nyert mikrodialízis minták elemzése

Az FST előtt 60-30, 30-0 perccel, illetve közvetlenül a teszt megkezdése után (3.

minta: 0-30 perc), majd 30-60, 60-90, 90-120 percekben gyűjtöttünk mikrodialízis

mintákat, mindegyiket 30 percen keresztül (27.A ábra és 3.4.1.16.). Az AVP hiányos

állatok mikrodializátumaiban szignifikánsan magasabb OT szinteket lehetett kimutatni egy

időintervallum kivételével (genotípus hatás: p<0,01). Az AVP szintek vizsgálata során

megfigyelhettük, hogy az FST hatására (3. minta) az AVP szintje emelkedik a kontroll +/+

állatokban (27.B ábra). Várakozásainknak megfelelően, a di/di genotípusú állatok

mintáiban az AVP mennyisége a detektálhatósági határ alatt volt.

26. ábra

Oxitocin mRNS in situ hibridzáció a PVN ben

A: Oxitocin mRNS tartalmú sejtek a +/+ genotípusú állatokban; B: Oxitocin mRNS tartalmú sejtek a di/di

genotípusú állatokban; C: Az oxitocin szignál összértéke a PVN-ben; D: A PVN egyes területein mért

oxitocin szignál mértéke. pm: posterior magnocelluláris terület, dp: dorzális parvocelluláris terület, mp:

mediális parvocelluláris terület. *p<0,05 eltérés a +/+ genotípushoz képest

66

4.1.16.5. Szintetikus AVP retrodialízis hatásának vizsgálata FST alatt

27. ábra

Az FST során gyűjtött mikrodialízis minták OT és AVP tartalma

**p<0,01 eltérés a +/+ genotípushoz képest; Fisher’s LSD post hoc test

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

0

100

200

300

400

500

600

700

1 2 3 4

AC

TH

(f

mol/m

lpla

zm

a)

# vérminták

**

*

**

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

0

100

200

300

400

500

600

700

1 2 3 4

AC

TH

(f

mol/m

lpla

zm

a)

# vérminták

**

*

**

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4

Kort

ikoszte

ron (

pm

ol/m

lpla

zm

a)

# vérminták

****

*

*

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4

Kort

ikoszte

ron (

pm

ol/m

lpla

zm

a)

# vérminták

****

*

*

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

# vérminták

0

5

10

15

20

1 2 3 4

Oxitocin

(pg/m

inta

) **di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

# vérminták

0

5

10

15

20

1 2 3 4

Oxitocin

(pg/m

inta

) **di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

0

5

10

15

20

1 2 3 4

Oxitocin

(pg/m

inta

) **di/di + Ringer oldat

di/di + AVP

di/di + Ringer oldat

di/di + AVP 28. ábra

Hormonszintek változása AVP

retrodialízise mellett a 10 perces

FST során

*p<0,05, **p<0,01 az első

vérmintához (-30perc) képest

67

Azon állatokhoz képest, amelyek csak Ringer oldatot kaptak (AVP vivőanyaga, az

intracerebroventrikuláris folyadék összetételének megfelelő oldat) a PVN-be az AVP

kezelés jelentősen csökkentette az FST hatására kialakuló ACTH és kortikoszteron szint

emelkedéseket (28. ábra; kezelés és idő hatás: p=0,01). Ezen túlmenően az AVP kezelés a

105. percben mérhető plazma OT szinteket is jelentősen csökkenteni volt képes (kezelés

hatás és kezelés-idő interakció: p<0,05).

4.1.17. Vazopresszin hiányos állatok vizsgálata akut morfin kezelés után

Egyszeri, akut morfin injekció jellegzetes bifázisos módon befolyásolta mind az

ACTH, mind a kortikoszteron szintek változását (29. ábra; kezelés hatás és kezelés-idő

interakció: p<0,01). ACTH esetében már az injekció utáni 5. percben szignifikáns

emelkedés volt megfigyelhető mindkét genotípusban. A gyors emelkedést gyors csökkenés

követte (15. perc), majd a hormon szintje újra (a 60. percig) folyamatosan emelkedő

tendenciát mutatott. A kortikoszteron szintek változása követte az ACTH szinteket, bár

kisebb fluktuációkat mutatott. AVP hiányában a di/di-s állatokban mindkét hormon szintje

kis mértékben ugyan, mégis szignifikánsan alacsonyabb volt (genotípus hatás p=0,05).

29. ábra

Egyszeri morfin kezelés hatása az ACTH és kortikoszteron szintekre

+p<0,05 ++p<0,01 eltérés a 0. perchez képest; **p<0,01 eltérés a fiziológiás sóval kezelt állatokhoz képest;

#p<0,05 ##p<0,01 eltérés a di/+ csoporthoz képest

68

4.2. A vazopresszin hiányos állatok krónikus stresszhelyzetekben

mutatott stresszválaszának vizsgálata

4.2.1. Krónikus morfin kezelés utáni drogmegvonás hatása

4.2.1.1. Szomatikus változások

30. ábra

A krónikus morfin kezelés kiváltotta szomatikus változások

n=18-41; ++p<0,01 eltérés a kezdő testsúlyhoz képest; *p<0,05 **p<0,01 eltérés a fiziológiás sóval kezelt

ugyanolyan genotípusú állatokhoz képest; #p<0,05 ##p<0,01 eltérés a di/+ csoporthoz képest.

A.=testsúlyváltozások, B= csecsemőmirigysúly változások, C=mellékvesesúly változások

Bár a di/di genotípusú állatok kiindulási testsúlya alacsonyabb volt, a fiziológiás

sóoldatot kapott kontroll állatok természetesen elvárt testsúly emelkedése mindkét

genotípus esetén kialakult (30.A ábra; idő hatás: p<0,01). A krónikus morfin kezelést

69

kapott állatok testsúlya - függetlenül az állat genotípusától - a kísérlet alatt csökkent

(kezelés-idő interakció: p<0,01). Mindkét genotípusban a krónikus morfin kezelés hatására

a relatív csecsemőmirigy (timusz) súlyok csökkentek (30.B ábra; kezelés hatása: p<0,01),

míg a mellékvesék relatív súlya pedig nőtt (30.C ábra; kezelés hatása: p<0,01). A

vazopresszin hiányos állatokban a relatív timusz súly csökkenése kifejezettebb volt.

4.2.1.2. AVP mRNS szintek változása a PVN-ben

A morfinnal krónikusan kezelt di/+-os állatok esetében szignifikáns AVP mRNS

szint emelkedést figyeltünk meg 4 órával az utolsó morfin injekció után (MM; 4 órás

elvonás; 31. ábra). Hosszabb elvonási idő esetén az mRNS szint emelkedés eltűnik (MK;

16 órás elvonás: 16 órával az utolsó morfin és 4 órával az utolsó fiziológiás só injekció

után). Várakozásunknak megfelelően az AVP hiányos állatokban a különféle kezelések

nem befolyásolták az AVP mRNS mennyiségét, bár az alapszintek összemérhetően voltak a

di/+ állatokban tapasztaltakkal (valószínűleg a mRNS próba felismeri a később

funkcionálisan inaktív, de szekvenciájában nem sérült AVP részeket; genotípus hatás és

kezelés-genotípus interakció: p<0,05).

31. ábra

A PVN parvocelluláris sejtjeiben mért AVP mRNS szint változás krónikus morfin kezelés hatására.

*p< 0,05 szignifikáns eltérés a fiziológiás sóval kezelt csoporthoz képest,

## p< 0,01 szignifikáns eltérés a di/+ csoporthoz képest

70

4.2.1.3. CRH mRNS szintek változása

A kontroll állatok PVN-jében a CRH mRNS szintje fokozatosan emelkedett a

krónikus morfin kezelés hatására (32.A ábra). A 4 órás elvonás (MM) hatására

marginálisan, míg a 16 órás elvonás (MK) hatására erőteljes szignifikáns emelkedést

figyelhettünk meg. Az AVP hiánya önmagában képes volt a CRH mRNS szintjét emelni és

ezekben az állatokban a morfin kezelés, illetve a morfin elvonás már nem okozott további

változásokat (genotípus hatás: p<0,05).

Az amigdala esetében a 16 órás elvonás (MK) hatására egy emelkedő tendencia volt

megfigyelhető a di/+-os állatokban (32.B ábra). Ugyanakkor a CRH mRNS szintje alap

állapotban (krónikus fiziológiás só kezelés, KK) szignifikánsan magasabb volt az AVP

hiányos állatokban, mint di/+-os társaikban, és a morfin kezelés mind 4 (MM), mind 16

órával (MK) az utolsó injekció után a di/+ genotípusú kontroll állatokban mérhető szintre

csökkentette azt (genotípus hatás és kezelés-genotípus interakció: p<0,05).

4.2.1.4. POMC mRNS szintek változása az adenohipofízisben

A krónikus morfin kezelés szignifikánsan emelte a POMC mRNS mennyiségét a

hipofízis elülső lebenyében nemcsak 4, hanem 16 órával az utolsó morfin injekció után is

32. ábra

CRH mRNS szintek változása a PVN-ben és az amigdalában krónikus morfin kezelés hatására

*p<0,05 eltérés a fiziológiás sóval kezelt állatoktól; #p<0,05 eltérés a di/+ csoporttól

71

(33. ábra; kezelés hatás: p<0,01). Mindkét genotípusban azonosak voltak a POMC mRNS

alap és a stressz után mért értékei.

4.2.1.5. Nyugalmi kortikoszteron szintek változása

Az AVP hiánya önmagában is emelkedett nyugalmi kortikoszteron szinteket

okozott (34. ábra; genotípus hatás: p<0,01). A krónikus morfin kezelés mindkét

genotípusban ugyanolyan mértékben emelte a kortikoszteron szinteket (kezelés hatása:

p<0,01).

4.2.1.6. Krónikus morfin kezelést követő akut elvonás okozta hormonváltozások

A 4 órás morfin elvonás hatása egyik genotípusban sem okozott szignifikáns ACTH

szint emelkedést, bár bizonyos mértékű emelkedő tendencia megfigyelhető volt (35. ábra).

33. ábra

POMC mRNS szintek változása az

adenohipofízisben krónikus morfin

kezelés hatására

**p<0,01szignifikáns eltérés a

fiziológiás sóval kezelt csoporttól

0

100

200

300

400

500

600

Kontrol Morfin 16nap

Kort

ikoszte

ron (

pm

ol/m

l)

*#

**#

0

100

200

300

400

500

600

Kontrol Morfin 16nap

Kort

ikoszte

ron (

pm

ol/m

l)

*#

**#

34. ábra

Nyugalmi kortikoszteron szintek, *p<0,05 **p<0,01 eltérés a fiziológiás sóval kezelt csoporthoz képest;

#p<0,05 eltérés a di/+ csoporthoz képest

72

A 16 órás elvonás számottevő, igen erőteljes hormonszint emelkedést okozott, ami kisebb

értékű volt az AVP-hiányos állatokban (kezelés-genotípus interakció:p=0,05).

A 4 órás elvonás a di/+ csoportban szignifikánsan emelte a kortikoszteron szintet, de

AVP hiányában a di/di csoportban ez az emelkedés nem volt megfigyelhető. A 16 órás

elvonás már hatással volt a di/di csoportra is, de itt az emelkedés szignifikánsan kisebb volt,

mint kontroll, di/+ társaikban (genotípus hatás és kezelés-genotípus interakció: p<0,01).

4.2.2. A vazopresszin szerepének vizsgálata a krónikus, 28 napos

mozgáskorlátozás kísérletben

4.2.2.1. Testsúly és egyes szervsúlyok változásai

A di/di genotípusú állatok kiindulási testsúlya alacsonyabb volt, mint normál AVP

szintű társaiké (di/+: 337±13g, di/di: 296±8g; n=39; p<0.01; 36. A ábra). A kontroll állatok

testsúlya a kísérlet alatt folyamatos ütemben növekedett attól függetlenül, hogy melyik

genotípusba tartoztak (időhatás: p<0,01). A krónikus stressz hatására elmaradt a

testsúlygyarapodás (stressz hatás: p<0,01). A 28 nap mozgáskorlátozás testsúlycsökkentő

hatása mindkét genotípusban megfigyelhető, de a di/+ állatoknál kifejezettebb (krónikus

stressz-genotípus interakció: p<0,01).

35. ábra

A krónikus morfin kezelést követő akut elvonás okozta hormon változások

**p< 0,01 szignifikáns eltérés a fiziológiás sóval kezelt csoporthoz képest; #p<0,05 szignifikáns

eltérés a di/+ csoporthoz képest; +p<0,05 ++p<0,01 eltérés az 4 órás elvonáshoz képest

73

A csecsemőmirigyek súlya mindkét genotípusban hasonló módon csökkent (36.B

ábra; krónikus stressz hatása: p<0.05), annak ellenére, hogy a di/di genotípusú kontroll

állatok esetén alacsonyabb volt a szervek kiindulási súlya (genotípus hatása: p<0.01).

4.2.2.2. Változások a mellékvesében

Az ismételt 28 napos mozgáskorlátozás stressz hatására a heterozigóta állatokban

emelkedett a mellékvesék súlya (37.A ábra; krónikus stressz hatás: p<0,05). Annak

ellenére, hogy a di/di genotípusú állatok kiindulási szervsúlya alacsonyabb volt, a változás

ebben a genotípusban is megfigyelhető (nincs genotípus hatás, vagy interakció).

A 28 napos stressz hatására emelkedett a mellékvesekéreg keresztmetszeti

területének nagysága is (37.B ábra; krónikus stressz hatás: p<0,05). AVP hiányában

azonban az emelkedés kisebb mértékű volt (genotípus hatás: p<0,05).

36. ábra

A testsúly változása 28 napos

mozgáskorlátozás stressz hatására;

*p<0,05 a 0. héthez képest; #p<0,05 a di/+-

hoz képest; +p<0,05 a kontrollhoz képest;

A csecsemőmirigy (thymus) súlyának

változása 28 napos mozgáskorlátozás stressz

hatására;

*p<0,05 a di/+-hoz képest

74

A kortikoszteron alapszintű in vitro szekréciója a 28 napos mozgáskorlátozás után

csökkent mértéket mutatott (37.C ábra; krónikus stressz hatás: p<0,01). Az előzetesen

krónikusan stresszelt állatokban mind az első mind pedig a második ACTH stimulus kisebb

kortikoszteron szekréciót indukált (idő-stressz interakció: p<0,05). A di/di genotípusú

állatok esetében az ACTH indukálta kortikoszteron válasz magasabb volt, bár a különbség

37. ábra

A=A mellékvesék súlyának változása 28 napos mozgáskorlátozásos stressz esetén. *p<0,01 di/+ K-tól

B=A mellékvesekéreg területének változása. #p<0,05 eltérés a di/+ 28R csoporttól

C=Különböző dózisú ACTH stimulusok hatása a naiv és a korábban krónikusan stresszelt állatok

kortikoszteron elválasztására in vitro szuperfúziós teszt során *p<0,05 az alapszekréciótól, #p<0,05 a

krónikus stressz hatása

A B

C

75

a két genotípus között nem szignifikáns. Ugyanakkor a második stimulus hatására

bekövetkező válasz időgörbéje már szignifikánsan eltérő a két genotípusban (idő-genotípus

interakció: p=0,02).

4.2.2.3. Változások az mRNS szintekben

38. ábra

CRH mRNS és AVP mRNS szintjeinek változása 28 napos mozgáskorlátozást követően Brattleboro

patkányok PVN-jében

**p<0.0, *p<0.05 eltérés a kontroll csoporthoz képest, #p<0.05 eltérés di/+28R-tól

A naiv állatok esetében nem tapasztaltunk különbséget a két genotípus között a

PVN CRH mRNS tartalmának vizsgálata során (38. ábra). A 28 napos mozgáskorlátozás

stressz mindkét genotípusban a CRH mRNS szintjének emelkedését váltotta ki, AVP

hiányos állatokban azonban az emelkedés kisebb mértékű volt (krónikus stressz-genotípus

interakció: p<0,01).

Annak ellenére, hogy feltételezhető bizonyos eltérés az mRNS-ek eltérő bázissorrendje

miatt (az AVP génjében végbement mutáció miatt), a PVN parvocelluláris neuronjaiban

mért alapszintű AVP mRNS szintek vizsgálata során nem tapasztaltunk különbéget a di/+

és di/di genotípusú állatok között (lsd. 31. ábra is). 28 napos mozgáskorlátozás

szignifikánsan megemelte ezen sejtekben az AVP mRNS mennyiségét, de ez az emelkedés

csak a di/+ genotípus esetén figyelhető meg (krónikus stressz-genotípus interakció:

p<0,01).

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

di/+ K di/+ 28R di/di K di/di 28R

CR

H m

RN

S d

enzitás

a P

VN

-ben *

#

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

di/+ K di/+ 28R di/di K di/di 28R

CR

H m

RN

S d

enzitás

a P

VN

-ben *

#

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

di/+ K di/+ 28R di/di K di/di 28RA

VP

mR

NS

(t

erü

let/sejt) *

#

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

di/+ K di/+ 28R di/di K di/di 28RA

VP

mR

NS

(t

erü

let/sejt) *

#

76

39. ábra

A POMC mRNS szintje a hipofízis első lebenyében 28 napos ismételt mozgáskorlátozást követően

*p<0,05 a di/+-hoz képest

A hipofízis elülső lebenyében a POMC mRNS szintje a kontroll di/di állatokban

magasabb volt, mint di/+ genotípusú társaikban (39. ábra). A krónikus stressz hatására a

POMC mRNS szintje a di/+ állatokban szignifikánsan emelkedett, míg a di/di állatokban a

stressz nem eredményezett további mRNS szint emelkedést (krónikus stressz-genotípus

interakció: p<0,01). Habár az 1 óra mozgáskorlátozás nem optimális a POMC mRNS

változásainak vizsgálata szempontjából, de mégis megfigyelhető volt, hogy az AVP hiánya

az akut POMC mRNS emelkedést is kivédte (4. Táblázat; akut stressz-genotípus interakció:

p<0,05).

4. Táblázat

POMC mRNS szintje a hipofízis elülső lebenyében

0

50

100

di/+ K di/+ 28R di/di K di/di 28RP

OM

C m

RN

A (

arb

itra

ry u

nit)

**

0

50

100

di/+ K di/+ 28R di/di K di/di 28RP

OM

C m

RN

A (

arb

itra

ry u

nit)

**

POMC mRNS szintje a hipifízis elülső lebenyében (arbitrary unit)

di/+ di/di Krónikus

kezelés kontroll 28R kontroll 28R

Akut

kezelés kontroll R kontroll R kontroll R kontroll R

89,2±2,1 99,6±2,7 99,4±2,2 103,4±3,6 106,6±3,3 101,2±4,7 98,7±2,7 99,4±2,0

77

4.2.2.4. Változások a hormonszintekben

A nyugalmi ACTH szintek vizsgálata során magasabb hormonszinteket mértünk a

di/di genotípusú állatokban (40. ábra). Egyszeri 1 órás mozgáskorlátozás stressz (R)

mindkét genotípusban ACTH szint emelkedést okozott (akut stressz hatás: p<0,01), de

AVP hiányában az emelkedés kisebb mértékű volt (akut stressz-genotípus interakció:

p<0,01). 28 napos mozgáskorlátozás (28R) után ismételten megmértük az ACTH szintjét.

A krónikus stressz nem volt szignifikáns hatással a hormonszintekre, bár - hasonlóan az

akut stresszhez - a két genotípus között különbség fedezhető fel (genotípus hatás: p<0,01).

40. ábra

Plazma ACTH szintek a 28 nap mozgáskorlátozásos kísérlet 8 csoportjában

*p<0,05; **p<0,01 a kontroll, akut stresszen át nem esett csoportokhoz képest; #p<0,05 a di/+ csoporthoz

képest

Az AVP hiányos állatokban a kortikoszteron alapszintje magasabb volt (41. ábra).

A 28 napos mozgáskorlátozás (28R) hatására a hormon alapszintje a di/+ csoportban

megemelkedett, ugyanakkor a di/di csoportban a krónikus stressz további hormonszint

emelkedést nem váltott ki (krónikus stressz hatása: p=0,05). Egyszeres, egy órás

mozgáskorlátozás (R) hatására mindkét genotípusban megemelkedett a kortikoszteron

szintje (akut stressz hatás: p<0,01), és AVP hiányában az emelkedés kisebb mértékű volt

(genotípus hatás és akut stressz-genotípus interakció: p<0,01). Hozzászokás ebben az

esetben sem volt megfigyelhető, a krónikus stresszelés után bekövetkezett újabb

mozgáskorlátozás hatására erőteljes kortikoszteron szint emelkedés következett be.

78

4.2.3. Krónikus váltakozó enyhe stressz vizsgálata

4.2.3.1. Szomatikus paraméterek változásai

A di/di genotípusú állatok kiindulási testsúlya alacsonyabb volt, mint di/+-os

társaiké (di/+: 288±11g; di/di: 261±13g, 42.A ábra). A CMS gátolta a testsúlynövekedést

mindkét genotípusban (maximális hatás a 2. és a 3. hét között; CMS hatás és idő-CMS

interakció: p<0,01). A kiindulási csecsemőmirigy és mellékvese súlyok esetében is

megfigyelhető volt, hogy AVP hiányában azok kisebbek voltak (csecsemőmirigy: di/+

341,6+/-21mg; di/di 299,8+/-23mg; mellékvese: di/+ 38,3+/-1,8mg; di/di 31,3+/-2,4mg).

Ezért a krónikus hatások vizsgálatánál a relatív súlyokat vettük figyelembe. A krónikus

stressz a csecsemőmirigy relatív súlyát képes volt csökkenteni (42.B ábra; CMS hatás:

p=0,05), azonban a krónikus hatások esetében általában megfigyelt mellékvesesúly

emelkedés nem volt látható (42.C ábra). A lép relatív súlya nemcsak a CMS hatására, de az

AVP hiány miatt is magasabbnak mutatkozott (42.D ábra; genotípus és CMS hatás:

p<0,01).

41. ábra

Plazma kortikoszteron szintek a 28 nap mozgáskorlátozásos kísérlet 8 csoportjában

*p<0,05; **p<0,01 a kontroll, akut stresszen át nem esett csoportokhoz képest; #p<0,05 a di/+ csoporthoz képest

79

42. ábra

CMS hatására bekövetkező szomatikus változások $ p<0,05 és $$p <0,01 az 1 héthez képest *p <0.05 a di/+-

hoz képest; #p <0,05 a nem stresszelt csoportokhoz képest, +p<0,05 és ++p<0,01 a CMS hatása; ††p<0,01 a

genotípus hatása

4.2.3.2. Változások a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyen

A hipofízis elülső lebenyében mért POMC mRNS szint a CMS hatására

megemelkedett (43.A ábra; CMS hatás: p<0,01). Az AVP hiánya nem befolyásolta sem a

nyugalmi szinteket, sem a stressz indukálta mRNS szint emelkedést.

Az ACTH nyugalmi szintje a 6 hetes krónikus stresszelés hatására szignifikánsan

emelkedett mindkét genotípusban (43.B ábra; CMS hatás: p<0,05). A stressz indukálta

hormonszintek között különbséget nem tapasztaltunk, a változás AVP hiányában és

jelenlétében is azonos mértékű volt.

A kísérlet végén dekapitált vérmintákból meghatározott konrtikoszteron értékek

esetén (43.C ábra) az alap kortikoszteron szint a di/di-s állatokban marginálisan magasabb

volt, mint heterozigóta társaikban (genotípus hatás: p=0,07; lsd. 41. ábra is). A CMS után a

80

di/+ állatok nyugalmi kortikoszteron szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a kiinduló

érték (CMS hatás: p<0,01), míg a di/di állatok értékei nem változtak (CMS-genotípus

interakció: p<0,05). Ezt alátámasztottuk azzal is, hogy ha ugyanazon állatok farokvér

mintáinak kortikoszteron tartalmát a kísérlet első és utolsó hetében hasonlítottuk össze

(43.D ábra), akkor a változás szignifikánsan alacsonyabb volt a di/di állatok esetén.

4.2.3.3. Emelt keresztpalló teszt a szorongás mérésére

A szorongás fő paraméterét tekintve (nyílt karban töltött idő) csak egy tendencia

volt megfigyelhető: a CMS hatására kicsit kevesebb időt töltöttek az állatok a nyílt karban

(CMS hatás: p=0,09; 44.A ábra).

43. ábra

CMS hatása a HHM tengely paraméterekre

A= POMC mRNS az adenohipofízisben, B=plazma ACTH szint, C= Kortikoszteron szint a plazmában a

29. napon, D= Kortikoszteron szint változás a vizsgálati periódus alatt (farokvérből)

**p<0.01 a kontrollhoz képest, ++p<0.01 és +p<0.05 a CMS fő hatása, #p<0.01 di/+ -hoz képest

81

Mivel a stresszelt állatok mozgékonyabbak voltak (44.C ábra; fokozott zárt kari

belépés: p<0,05), érdemesnek tűnt megvizsgálni a nyílt kari aktivitást (nyílt/(nyílt+zárt)

kari belépések száma; 44.B ábra). Ebben az esetben a CMS szignifikánsan csökkentette a

szorongás mozgékonyság független paraméterét (CSM hatás: p<0,01), de ezt a hatást a

genotípus nem befolyásolta.

44. ábra

Az emelt keresztpallón mutatott viselkedés CMS hatására kontroll (di/+) és AVP hiányos (di/di)

állatokban.

+p<0,05, ++p<0,01 a kontroll, nem stresszelt csoporthoz; †p<0,05 a di/+ genotípushoz (fő hatás)

Az etológiai szempontból fontos viselkedésmintákat tekintve a di/di állatok

kevesebbet mosakodtak (44.D ábra; genotípus hatás: p=0,05). Az úgynevezett

kockázatfelmérő magatartás (stretched attend postures, SAP) nem mutatott különbséget a

csoportok közt (44.E ábra). Csak a vertikális, ágaskodó mozgásban tapasztalhattunk

szignifikánsan fokozott aktivitást a di/di állatok részéről (44.F ábra; genotípus hatás:

p<0,05).

82

4.2.3.4. Forszírozott úszás, a depresszió-szerű magatartás mérője

Az FST az antidepresszánsok preklinikai vizsgálatára kiterjedten alkalmazott

módszer. Esetünkben a CMS növelte a lebegéssel töltött idő mennyiségét (45. ábra; CMS

hatás: p=0,01), de erre a genotípus nem volt hatással. A többi paraméter (úszás, küzdés,

búvárkodás) nem mutatott változást sem a CMS, sem az AVP hiány hatására (nem ábrázolt

adatok).

45. ábra

FST során megfigyelhető lebegési magatartás mennyisége a 2. napi 5 perces tesztperiódus során.

++p<0,01 fő hatás a kontroll, nem stresszelthez képest.

4.3. A vazopresszin szerepének vizsgálata perinatális korban

4.3.1. Kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata

Mivel a kispatkányok genotípusát csak az elválasztás után lehet a vízfogyasztás

mérésével meghatározni, kísérleteinkben indirekt módon, a hipofízisek AVP tartalma

alapján utólagosan határoztuk meg az egyes kölykök genotípusát (5. Táblázat). Így a

kezeléseket teljesen random végeztük, a felmerülő beosztási bizonytalanság miatt az egyes

csoportok elemszámát túlméreteztük. Abban az esetben, ha az AVP tartalom a

kimutathatósági szint alatt maradt, vagy ahhoz közel volt, a di/di genotípusba soroltuk a

kölyköt.

A hipofízis AVP tartalma 5-10-20 napos Brattleboro kispatkányban, ** p<0,01 eltérés az 5 napos kortól

##p<0,01 eltérés a di/+-tól

5. Táblázat

AVP ( ng/szerv) di/+ di

életkor kontroll szeparált kontroll szeparált

5 nap 16,1±0,8 16,4±2 0,2±0,02## 0,2±0,02##

10 nap 42,5±3 ** 39,9±3** 0,3±0,05## 0,4±0,13##

20 nap 41,4±4** 44,9±4** 0,4±0,04## 0,9±0,05##

83

4.3.1.1. HHM tengely aktiváció 24 órás anyai depriváció hatására 10 napos korban

Az anyjukkal maradó, kontroll kölykök nyugalmi ACTH szintjében nem volt

különbég a két genotípus között (46.A ábra). A di/+-os kölykökben a 24 órás elválasztás

közel kétszeresére emelte az ACTH szinteket a nyugalmi állapothoz képest (szeparáció

hatása: p<0,01), ugyanakkor a di/di-s kölykökben ez az emelkedés elmaradt (genotípus

hatás és szeparáció-genotípus interakció: p<0,01).

A kortikoszteron szintek esetében jelentősebbek a különbségek (46.B ábra). A

kontroll állatok nyugalmi hormonszintjeit vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az AVP hiányos

állatokban szignifikánsan magasabbak a hormonszintek, mint di/+-os társaik esetében

(genotípus hatás: p<0,01). A 24 órás szeparáció mintegy 5-6-szoros emelkedést okozott

mindkét genotípusban, de az emelkedés nem különbözött a genotípusokban (szeparáció

hatása: p<0,01).

4.3.1.2. HHM tengely aktiváció 1, 4, 12, 24 órás anyai deprivációra 10 napos korban

A di/+ genotípusú kölykök esetében mindegyik időtartamú anyai szeparáció ha csak

kis mértékben is, de szignifikánsan emelte az ACTH szinteket (47.A ábra; szeparáció

hatása: p<0,01), a maximális hatást, megközelítőleg kétszeres emelkedést a 24 órás

szeparáció váltotta ki (idő hatás: p<0,05). Ezzel ellentétben az AVP hiányos állatokban

nem volt kimutatható ACTH szint emelkedés, sőt a 24 órás szeparáció hatására csökkenést

detektáltunk az anyjuk alatt tartott kontroll testvérekben mérhető értékhez képest

(szeparáció-genotípus interakció: p<0,01).

46. ábra

Az ACTH és kortikoszteron szintek változása 24 órás szeparáció hatására 10 napos patkányokban

** p<0,01 eltérés a kontroll csoporthoz képest, ## p<0,01 eltérés a di/+ genotípushoz képest.

84

47. ábra

HHM tengely válasz 1, 4, 12, 24 órás anyai depriváció hatására 10 napos korban

Az értékek a kontroll csoport állatokhoz viszonyított változásokat jelzik (lsd. 46. ábra)

*p<0,05 **p<0,01 eltérés a kontroll kölykökhöz képest, ##p<0,01 eltérés a di/+ csoporthoz képest

A kortikoszteron szintek esetén az elválasztás növekvő időtartama egyre nagyobb és

nagyobb hormon-válaszokat váltott ki (47.B ábra; idő hatás: p<0,01). A legmagasabb

emelkedés a 24 órás elválasztás esetén volt megfigyelhető. Az AVP hiányos állatok

magasabb alapértékei voltak (lsd. 46. ábra) és bennük az 1 órás szeparáció még nem váltott

ki szignifikáns emelkedést. A további időpontokban az emelkedés mértéke viszont nemcsak

a kontroll, anyjuk alatt maradó kispatkányokhoz képest, hanem a di/+-os állatokban

megfigyelhető szintekhez képest is magasabb volt (genotípus hatás, idő-genotípus és

szeparáció-genotípus interakció: p<0,01).

85

4.3.1.3. A HHM tengely aktiváció fejlődése a perinatális korban

48. ábra

24 órás elválasztás kiváltotta ACTH szint változások különböző perinatális életkorokban

**p<0,01 eltérés a kontroll kölykökhöz képest; ##p<0,01 eltérés a di/+ kölykökhöz képest

K: Kontroll, Sz: Szeparált

A 24 órás anyai depriváció szignifikáns ACTH szint emelkedést váltott ki a

posztnatális ötödik, tizedik, és huszadik napon is a di/+ genotípusú kispatkányokban (48.

ábra; szeparáció hatása: p<0,01). A legkisebb mértékű emelkedés a születés után ötödik

napon volt megfigyelhető (korhatás: p<0,01). Azonban az AVP hiányos kispatkányokban

hasonló változásokat egyik életkorban sem tapasztaltunk (genotípus hatás: p<0,01).

49. ábra

24 órás elválasztás kiváltotta kortikoszteron szint változások különböző perinatális életkorokban

*p<0,05, **p<0,01 eltérés a kontroll kölykökhöz képest; #p<0,05, ##p<0,01 eltérés a di/+ kölykökhöz

képest

86

A nyugalmi kortikoszteron szintek az életkor előrehaladtával fokozatosan

emelkedtek (49. ábra; korhatás: p<0,01). Az AVP hiányos kölykökben minden életkorban

magasabb volt a szint, mint heterozigóta társaik esetében (nyugalmi értékekre genotípus

hatás: p<0,01). A 24 órás anyai szeparáció mindkét genotípusban emelte a kortikoszteron

szinteket (szeparáció hatás: p<0,01), a legnagyobb mértékű változást a 10 napos állatok

esetében tapasztaltuk (kor-szeparáció interakció: p<0,01). Az anyai elválasztás hatására

ugyanolyan mérvű kortikoszteron szekréció jött létre mindkét genotípusban.

4.3.1.4. Hypnorm kezelés hatása 10 napos korban

Az előző kísérletekkel összhangban az AVP hiánya nem befolyásolta az ACTH

nyugalmi szintjét (50.A ábra). A Hypnorm kezelés hatására a di/+ genotípusú kölykökben

az ACTH szintje 60 perc alatt közel a 6-szorosára emelkedett (kezelés hatása: p<0,01).

AVP hiányában az ACTH szint emelkedése azonban elmaradt (kezelés-genotípus

interakció: p<0,01).

A nyugalmi kortikoszteron szintek – szintén az előzőekben megfigyeltekkel

összhangban – az AVP hiányos állatokban szignifikánsan magasabbak voltak (genotípus

hatás: p<0,01). AVP jelenlétében 60 perc alatt a kortikoszteron szint emelkedés

hozzávetőlegesen 2,4-szeres volt (kezelés hatás: p<0,01). AVP hiányában azonban a

kortikoszteron emelkedés nem volt nagyobb, mint a di/+-ban tapasztalható változás (nincs

interakció a kezelés és a genotípus között), ellentétben az anyai elválasztás okozta

hormonszint változásokkal (lsd. 4.3.1.2.) .

50. ábra

Hypnorm kezelés hatása 10 napos kispatkányokban

**p<0,01 eltérés a fiziológiás sót kapott kontrollokhoz képest, ##p<0,01 eltérés a di/+

kölykökhöz képest

87

4.3.1.5. A Hypnorm kezelés hatása 5, 10, és 20 napos kispatkányokban

A Hypnorm injekció 5 napos korban közel 10-szeres ACTH szint emelkedést váltott

ki a di/+-os kölykökben (51.A ábra). A 10 és 20 napos patkányokban az emelkedés mértéke

már megközelítőleg 50-szeres (korhatás és kezelés-kor interakció: p<0,01). Az AVP

hiányos állatokban az ACTH szint változások szignifikánsan alacsonyabbak voltak

mindegyik életkorban (genotípus hatás és minden interakciója: p<0,01).

A plazma kortikoszteron szintje a Hypnorm injekció hatására 5 és 10 napos korban

közel a duplájára, 20 napos korban már a 3-szorosára emelkedett (51.B ábra; kezelés, kor és

interakciójuk: p<0,01). Ebben az esetben az AVP hiánya nem befolyásolta a

hormonszinteket.

4.3.1.6. A mellékvesék ACTH érzékenységének vizsgálata

Az ACTH dózisfüggően emelte a mellékvesék kortikoszteron termelését (52. ábra,

lsd. felnőttben 23. ábra; kezelés hatása: p<0,01). Az emelkedés AVP hiányában nagyobb

mértékű volt (genotípus hatása: p<0,01). A legalacsonyabb ACTH dózis (10-13

M)

alkalmazása a kezelés után 15 perccel váltja ki a legnagyobb kortikoszteron szekréciót.

Nem csak az összegzett hormonelválasztás (AUC, area under the curve), hanem a 3.

frakcióban, azaz az 15 perces ACTH kezelést követően is szignifikáns különbség

mutatkozott a genotípusok között, a di/di állatok fokozott hormonszekréciót mutattak (idő-

genotípus interakció: p<0,05).

51. ábra

A Hypnorm kezelés hatása az ACTH és kortikoszteron szintekre 5, 10, és 20 napos kispatkányokban

*p<0,05, **p<0,01 eltérés a fiziológiás sót kapott saját genotípushoz képest;

#p<0,05, ##p<0,01 eltérés a di/+ csoporthoz képest

88

52. ábra

In vitro mérhető mellékvese érzékenység 10 napos kispatkányokban.

A= A vizsgáltat ideje alatt mérhető összes hormonelválasztás (AUC= area under the curve, görbe alatti

terület); B= A 10-13M ACTH stimulus hatására bekövetkező kortikoszteron elválasztás

*p<0,05; **p<0,01 az alap frakcióhoz képest,#p<0,05 eltérés a di/+ csoporthoz képest

4.3.1.7. Exogén ACTH iránti érzékenység: Synacten kezelés 10 napos patkányban

Szintetikus ACTH (Synacten 250ng/ttg) sc adását követően 60 perccel jelentős

kortikoszteron emelkedés volt kimutatható a di/+ állatokban (53. ábra, kezelés hatása:

p<0,01). Mint előző kísérleteink során, itt is emelkedett nyugalmi kortikoszteron szinteket

mértünk az AVP hiányos kispatkányokban (genotípus hatás: p<0,01). A különféle

stresszekkel (anyai szeparáció, Hypnorm) összhangban az AVP hiányos állatok stimulus

utáni kortikoszteron szint értékei magasabbak voltak, mint a di/+-os testvéreikben mérhető

szintek, de az emelkedés mértéke hasonló volt a két genotípusban (di/+: 153±20%; di/di:

162±12%).

53. ábra

Kortikoszteron plazma szintek 60 perccel 250ng/g Synacten beadását követően.

**p<0,01 a kontroll, fiziológiás só injekciót kapott állatokhoz képest; ##p<0,01 a di/+ állatokhoz viszonyítva

Kor

tikos

zter

on( a

z al

ap %

-ban

)

di/+

di/di

0

50

100

150

200

250

300

350

1 2 3 4 5 6A 15 perces frakció száma

**

**

**#

**

*

ACTH

Kor

tikos

zter

on( a

z al

ap %

-ban

)

di/+

di/di

0

50

100

150

200

250

300

350

1 2 3 4 5 6A 15 perces frakció száma

**

**

**#

**

*

ACTH

0

50

100

150

200

250

300

350

1 2 3 4 5 6A 15 perces frakció száma

**

**

**#

**

*

ACTH

ACTH koncentráció

10-13M 10-12M 10-11M

di/+

di/di

0

5000

10000

15000

20000

25000K

ort

iko

szte

ron

vá

lasz (

AU

C)

10-13M 10-12M 10-11M

di/+

di/di

di/+

di/di

0

5000

10000

15000

20000

25000K

ort

iko

szte

ron

vá

lasz (

AU

C)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

di/+ K di/+ Syn di/di K di/di Syn

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

**

**##

##

0

50

100

150

200

250

300

350

400

di/+ K di/+ Syn di/di K di/di Syn

Ko

rtik

oszte

ron

(pm

ol/m

l)

****

**##

##

89

4.3.2. Különböző nemű kispatkányok stressz reaktivitásának vizsgálata

4.3.2.1. 24 órás anyai szeparáció

A 24 órás anyai szeparáció hatására 10 napos kispatkányokban az ACTH szintje

igen erőteljesen megemelkedett AVP jelenlétében (54. ábra, lsd. 46.A ábra is; szeparáció

hatsáa: p<0,01). AVP hiányos állatokban ez az emelkedés nem volt megfigyelhető

(genotípus hatás és szeparáció-genotípus interakció: p<0,01). Nőstény kölykök esetében a

hormonszint emelkedés magasabb volt, mint hímekben (ivar hatása: p= 0,05).

A kortikoszteron szintek vizsgálata során megfigyelhettük, hogy stressz hatására

mindkét genotípusban emelkedett a hormonszint (55. ábra, lsd. még 46.B ábra; szeparáció

hatása: p<0,01). Mind a nyugalmi szintek, mind pedig a stressz indukálta hormonszint

emelkedés magasabb volt AVP hiányos állatokban (genotípus és szeparáció-genotípus

interakció: p<0,01). A nőstények kortikoszteron értékei magasabbak voltak (ivar hatás:

p<0,01).

54. ábra

24 órás anyai szeparáció hatása különböző nemű kispatkányok ACTH és kortikoszteron szintjeire

** p< 0,01 eltérés a kontroll kölykökhöz képest, # p= 0,057 ## p< 0,01 eltérés a di/+ genotípushoz képest

, + p< 0,05 eltérés a hímekhez képest.

90

91

55. ábra

ACTH szintek változása egyszeres és ismételt éter

stressz hatására *p<0,05 **p<0,01 eltérés a kontroll

csoporthoz képest; ##p<0,01 eltérés a di/+ csoporttól;

+p<0,05 eltérés a hímektől

K=kontroll

E= egyszeri éter belélegzés,

EE= kétszeri éter belélegzés

4.3.2.2. Ismételt éter stressz

Éter stressz alkalmazása során

mintegy kétszeresére emelkedett a

plazma ACTH szintje a di/+ állatokban

és ismételt éter stressz további

emelkedést váltott ki (56. ábra; stressz

hatás: p<0,01). AVP hiányában a

stressz indukálta ACTH szint

emelkedés szignifikánsan kisebb

mértékű volt (genotípus hatás és

stressz-genotípus interakció: p<0,01).

A nőstény állatok esetében a

hormonszintek magasabb voltak, mint

a hímek esetében (ivar hatása p<0,01).

A plazma kortikoszteron szintje nyugalmi állapotban a di/di genotípusú állatokban

magasabb volt (57. ábra; genotípus hatás és stressz-genotípus interakció: p<0,01).

Egyszeres éter stressz kizárólag az AVP hiányos nőstények esetében okozott szignifikáns

hormonszint emelkedést (stressz-genotípus-ivar interakció: p=0,05). Az ismételt stressz

esetében már mindkét genotípusban

megfigyelhetőek voltak a stressz

indukálta változások.

56. ábra

A kortikoszteron szintek változása

egyszeri (E) és kétszeri (EE) éter

belélegzés hatására 10 napos

kispatkányokban. *p<0,05 **p<0,05

eltérés a kontroll csoporthoz képest;

##p<0,01 eltérés a di/+ csoporttól

92

5. Megbeszélés

5.1. A vazopresszin szerepének vizsgálata akut stresszhelyzetekben

5.1.1. Különféle akut stresszhelyzetek hatása

Akut stresszhelyzetekben az AVP-nek fontos, stresszorspecifikus szerep jut az

ACTH szekréciójának szabályozásában.

3 különböző stresszválasz típust figyeltünk meg az AVP hiányos állatokban:

a) Csökkent ACTH és kortikoszteron válasz (morfin injekció, agresszió teszt,

mozgáskorlátozás), vagyis az AVP mindkettő szabályozásában részt vesz.

b) Csökkent ACTH válasz, a kortikoszteron válasz szignifikánsan nem különbözik a két

genotípusban (újdonság stressz, hipoglikémia, EPM), vagyis az AVP csak az ACTH

szintek szabályozására van hatással.

c) Az AVP hiányának nincsen hatása sem az ACTH sem pedig a kortikoszteron

szintjének szabályozására (szociális elkerülés, foot-shock, éter belélegzés stressz).

Feltételezhető, hogy a különböző stresszorok kiváltotta stresszválaszok különböző

neuronális útvonalakon keresztül valósulnak meg, melyek közül egyesek AVP tartalmú

idegsejteket is érintenek, míg mások nem [167]. A bevezető részben már tárgyalásra került

a stresszorok csoportosításának problémája. Jelen esetben az általunk felvázolt 3

stresszválasz-lehetőség nem illeszthető tökéletesen az ott említett egyik csoportosításhoz

sem. Így azt mondhatjuk, hogy az AVP az egyes stresszorok vonatkozásában (esetleg azok

só-víz háztartást befolyásoló szerepével némileg összefüggésben) eltérő fajsúllyal vesz

részt a HHM tengely aktivációjában az esetleges kategóriáktól függetlenül.

Jelentős megfigyelésünk az is, hogy a kortikoszteron szintek változása a vérben nem

mindig tükrözi az ACTH szintjének változását (6. táblázat). Az összefoglaló táblázatból

kiolvasható, hogy a stresszorok mintegy 70%-a esetén (18-ból 13 stresszor) megfigyelhető

a di/di genotípusú állatok csökkent ACTH válasza. Ebből a 13 esetből, azonban csak 4

esetében figyeltünk meg csökkent kortikoszteron elválasztást. Ez a jelenség nem

magyarázható pusztán azzal, hogy az ACTH csúcs korában jelentkezik, mint a

kortikoszteron csúcs (lsd. időgörbék). Esetlegesen magyarázható lenne a jelenség a

93

mellékvesék fokozott ACTH érzékenységével, de felnőtt AVP hiányos állatokban az

ACTH érzékenység csökkenését figyeltük meg (23. ábra; további hasonló tapasztalatok: in

vitro vizsgálatok: [168], in vivo vizsgálatok: [169]), így ez sem ad magyarázatot az ACTH

és kortikoszteron válaszok disszociációjára. Az ACTH és kortikoszteron stresszválasz

közötti disszociáció megfigyelhető volt V1b receptor antagonistákkal kezelt Sprague–

Dawley patkányokban [170], illetve a V1b receptor kiütött egerekben is [171]. Ez rávilágít

arra, hogy a jelenség nem jellemző kizárólagosan egyetlen fajra, illetve törzsre, esetünkben

a Brattleboro patkányokra. Létezhetnek olyan közvetítő molekulák a szervezetben, melyek

közvetlenül a mellékvesén hatva befolyásolják a glükokortikoidok elválasztását (58. ábra).

Valóban, Bornstein és munkatársai számos ilyen lehetséges molekulát foglaltak össze és a

splanchnikus beidegzésnek tulajdonították a legnagyobb jelentőséget [172].

Eredményeink is alátámasztják az úgynevezett paraadenohipofízeális neuroendokrin

szabályozás elméletét [173], ugyanakkor további vizsgálatok elvégzését teszik szükségessé.

6. Táblázat

Különféle akut stresszorok ACTH és kortikoszteron emelő hatásának összefoglalása

Stressz

Vérvétel

módja

ACTH változás

di/di-ben

Kort. Változás di/di-

ben

1 Újdonság dekapitálás

#: szignifikánsan

alacsonyabb, mint

di/+-ban nincs változás

2 Szociális elkerülés farokvágás nincs változás nincs változás

3 EPM farokvágás # nincs változás

4 LPS dekapitálás (#) nincs változás

5 Éter stressz iv nincs változás nincs változás

6 Térfogati stressz iv # # 15 percnél

7 Hipertóniás só iv # nincs változás

8 Anafilaktoid reakció iv # nincs változás

9 Foot-shock doboz iv nincs változás nincs változás

10 Foot-shock iv nincs változás nincs változás

11 Mozgáskorlátozás iv # #

12 Szociális kudarc iv # #

13 Ulcerogén hideg

stressz iv # 60 percnél nincs változás

14 Hipoglikémia dekapitálás # nincs változás

15 FST iv # 5 percnél nincs változás

16 Morfin kezelés iv # #

17 NMDA kezelés iv nincs változás nincs változás

18 Kainát kezelés iv # 5 percnél nincs változás

94

57. ábra

A mellékvese glükokortikoid elválasztásának lehetséges fokozói

Trends in Endocrinology and Metabolism

A magnocelluláris eredetű AVP-nek rendkívül fontos szerep jut a szervezet

vízháztartásának szabályozásában. Ugyanakkor ozmotikus stimulusok hatására a

parvocelluláris neuronokban is gyorsan változik az AVP mRNS szintje [174].

Kísérleteinkben azt vártuk, hogy az AVP-nek erőteljes szerepe lesz a HHM tengely

szabályozásában ozmotikus stimulust jelentő stresszhelyzetekben. A vizsgálatok eredménye

azonban nem erősítette meg a feltételezéseinket és Brattleboro patkányok esetében a

korábbi vízmegvonásos kísérletek hasonló eredményeket hoztak [175]. Az egyik lehetséges

magyarázat az lehet, hogy az OT az, amely AVP hiányában az ozmotikus rendszert érintő

változások, stresszhelyzetek során átveszi a szabályozást [176]. Valóban, a dialízis

vizsgálatok során emelkedett OT szinteket sikerült kimutatnunk a di/di állatok PVN-jében

(lsd. 4.2.3.; 26. és 27. ábra) és ismert, hogy az OT képes az AVP receptorokhoz kötődni

[176]. Megfigyeléseink szerint a „térfogati” terhelésre (1,5ml/100g az i.p. hipertóniás só

oldat kísérlet kontroll kezelést kapott állatai) a HHM tengely aktivációja jelentősen kisebb

volt az AVP hiányos állatoknál (csak kontroll állatoknál genotípus hatás: p=0,01). Ez az

95

eredmény egybehangzik azzal, hogy a „ térfogati” változások (pl. vérveszteség) AVP szint

emelkedést okoz [177, 178].

Az alkalmazott stresszorok közül az immunrendszer aktiválása és a hipoglikémiás

stimulus esetén figyelhettük meg az AVP ACTH elválasztás szabályozásában betöltött

jelentős szerepét a kortikoszteron szintekre gyakorolt hatás nélkül. Előbbiek esetében

erőteljes aktiváció figyelhető meg a PVN-ben, különösen az AVP tartalmú neuronok

esetében [179], bár az aktiváció nem kizárólagosan a parvocelluláris neuronokra

korlátozódik. A tojásfehérje stressz esetében igen erőteljes volt a genotípusok közötti

különbség, míg az enyhébb ACTH emelkedést okozó LPS stimulusnál csak a di/+

állatokban volt megfigyelhető ACTH emelkedés, a di/di állatoknál nem. Ezen eredmények

összecsengenek V1b receptor kiütött egereken [18], és V1b antagonistákkal végzett

vizsgálatok eredményeivel [170] és alátámasztják az AVP szerepét az immunrendszert (is)

aktiváló stresszorokra adott válaszok esetében.

Az inzulin indukálta hipoglikémia esetében az AVP felszabadulás a hipofízis portális

keringésébe meghaladta a CRH felszabadulását [180]. Az AVP szerepét a V1b receptor

kiütött egerek tanulmányozásával is sikerült bizonyítani, nemcsak a vércukorszint

szabályozás [181], hanem a HHM tengely aktiváció tekintetében is [18, 181]. Saját

kísérleteink eredményeiből arra következtettünk, hogy az AVP-nek erőteljes, bár nem

kizárólagos szerep jut az ACTH elválasztás szabályozásában az inzulin indukálta

hipoglikémia során. A V1b receptor génkiütött állatokkal végzett kísérlet eredményeivel

szemben a Brattleboro patkányokban az ACTH szint csökkenést nem követte változás a

kortikoszteron szintekben.

Az AVP szerepe a HHM tengely alapszintű aktivitásának fenntartásában (az

ACTH és a kortikoszteron elválasztásában) nem kellően támogatott sem saját vizsgálataink

[159, 182, 183], sem diabetes insipidusban szenvedő páciensekkel végzett vizsgálatok

eredményei alapján [184]. Mind in vivo, mind pedig in vitro vizsgálatok rámutattak arra,

hogy a CRH kezelés hatására bekövetkező ACTH elválasztás kisebb mértékű AVP

hiányos állatokban [185]. Ezen eredmények alátámasztják, hogy az AVP elsősorban a

CRH ACTH szekretagóg hatását erősítheti [114, 174, 186].

96

Magától adódik az a feltételezés, hogy a Brattleboro patkányokban néhány

molekula, mint „AVP hiányt kompenzáló anyag” lehet jelen. Nyugalmi körülmények

között a CRH mRNS szintje magasabb di/di genotípusú állatainkban [128] (lsd. 32. ábra,

bár az emelkedés nem nagyon markáns, csak az egész magra vonatkoztaott integrált

denzitás értékekben jelenik meg; 4.1.16.3. esetén nincs lsd. később). Ennek

ellentmondanak Krajer és munkatársainak vizsgálatai [187]. Megfigyeléseik szerint sem a

hipotalamuszban sem pedig a portális vérben nem változik a CRH szintje az AVP hiányos

Brattleboro patkányokban. Amennyiben a kompenzáló anyagokról beszélünk egyértelmű,

hogy az AVP-vel nagy szerkezeti hasonlóságot mutató OT-ról is beszélnünk kell (lsd.

fentebb). Saját megfigyeléseink szerint bár a PVN-ben megfigyelhető és mérhető az OT

mRNS mennyiségének emelkedése, ugyanakkor funkcionálisan a helyettesítés nem

tökéletes (egyébként soha nem látnánk csökkent ACTH és/vagy kortikoszteron szinteket)

[157]. Brattleboro patkányok esetében a stresszválaszok szabályozásban szintén nagyon

fontos szimpato-adrenomedullaris tengely aktivitása magasabb az AVP hiányos, di/di

genotípusú állatokban [188]. Az OT mellett számos más, eddig ismeretlen, vagy ismert, de

kevésbé kutatott anyag létezhet, amelyek az AVP hiányos állatokban átvehetik a hiányzó

AVP HHM tengely szabályozó szerepét. Így tanulmányok mutatnak rá, hogy a atriális

nátriuretikus peptid szintje di/di állatokban emelkedett [189], és összefüggést találtak a

hipotalamikus hisztaminerg és AVP rendszer között is [190].

A kísérletek során felvetődhet az a kérdés, hogy vajon a heterozigóta állatok

megfelelő kontrollként szolgálnak-e. A kérdés megválaszolására egyes stressz kísérleteink

során a megszokott heterozigóta kontrollok mellett további kontroll csoportokat (Wistar

patkányok, +/+ genotípusú Brattleboro patkányok) használtunk [147, 148]. Vizsgálataink

alátámasztották korábbi megfigyelésinket. Már egyetlen tökéletesen funkcionáló allél elég

ahhoz, hogy az AVP termelés normál szintet érjen el és a HHM tengely aktivációja (pl.

ulcerogén-hideg stressz) ne szenvedjen zavart. A perifériás AVP hiányában kialakuló

diabetes insipidus már önmagában krónikus stressz állapotot eredményezhet, ennek

következtében csökkent stresszreaktivitás alakulhat ki további stresszorokkal szemben

[30]. Hogy kísérleteink során kizárjuk a perifériás AVP hatását egy kísérletünkben (FST)

97

DDAVP tartalmú ozmotikus minipumpát alkalmaztunk, s bizonyítottuk, hogy a

bekövetkezett változások esetében a centrális AVP hiánynak volt szerepe.

Az AVP hiánya elsősorban az ACTH szinteket befolyásolta, sokkal kevésbé volt

hatással a kortikoszteron szint emelkedésekre. Alapvetően elfogadott tény, hogy a HHM

tengely „végterméke” a kortikoszteron, ez felelős a hatásokért. Ugyanakkor az ACTH és

kortikoszteron elválasztás nem feltétlenül mutat kapcsoltságot. Mi lehet tehát az „értelme”

az ACTH szintek szabályozásának? Amellett, hogy jól ismert módon a glükokortikoidok

felszabadítását serkenti a mellékvese kéregből, nem elhanyagolható más mellékvese kérgi

sejtekre gyakorolt hatása sem. Többek között befolyásolja ezen sejtek koleszterin

felvételét. Hatással van a szteroidok szintézisében résztvevő enzimeket kódoló gének

működésére, így a mineralokortikoidok révén közvetve részt vesz a só-vízháztartás

szabályozásban. A szexuálszteroidok elválasztásának befolyásolásával pedig a nemi

érésben is fontos szerepet játszik [191]. ACTH receptorok jelenléte egyértelmű a

mellékvese kérgi sejtjeiben [192], ugyanakkor megtalálhatóak még a zsírsejteken [193],

bőrsejteken [194], illetve megtalálták még őket a szimpatikus ganglionokban is [195].

Egyes vizsgálatok az ACTH-t mint lehetséges immunmodulátort tartják számon [196].

5.1.2. Mikrodialízis vizsgálatok

Az ehhez a sorozathoz tartozó kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a

veleszületett AVP hiány nem csökkentette a 10 perces FST hatására bekövetkező ACTH és

kortikoszteron elválasztást a kezdeti időpontokban. Viszont míg a +/+ genotípusú

állatokban 105 perccel az úszás teszt megkezdése után a plazma OT és kortikoszteron

szintjei az alap értékekhez tértek vissza, a di/di állatokban ezen hormonok szintje

emelkedett maradt. Amennyiben a PVN-ben megvizsgáljuk az OT mRNS, illetve az

extracelluláris folyadék OT szintjét, szintén magasabb értékeket mértünk a di/di állatokban

a stressz előtt, alatt és után, mint a normál AVP szintű állatokban.

Szintetikus AVP retrodialízis során az FST hatására mind az ACTH, mind pedig a

kortikoszteron esetében hasonló szekréciós mintázatot figyelhettünk meg a kontroll és AVP

kezelt di/di állatokban, bár a kezelés hatására jelentősen csökkent az összes szekréció. A

kezelés elősegítette a plazma OT szintjének hamarabbi lecsengését is.

98

Korábbi tanulmányok arról számolnak be, hogy 10 perces FST már röviddel a teszt

után csökkenti a vérplazma fagyáspontját [124]. A vérplazma laktát szintjének és

ionösszetételének német kutatópartnerünk által végzett vizsgálatai alapján azt

feltételezhetjük, hogy a plazma fagyáspont csökkenése nem a plazma megemelkedett

ozmolalitásának az egyértelmű eredménye. A csökkent fagyáspont inkább magyarázható a

magas laktát szintekkel, mint az ionösszetétel (Na+

és K+ ion szint) változásával, amelyek

korábbi, nem publikált adatok szerint nem emelkednek meg a FST hatására. Jelen

kísérletben tapasztalt eredmények nem magyarázhatóak tehát egyszerűen a +/+ és di/di

genotípusú állatok vérplazmáinak eltérő ozmolalitásával. Ezt az is alátámasztja, hogy az

alap hormonszintek nem különböztek a két genotípus közt, annak ellenére hogy a plazmák

ozmolalitásában (+/+: 307.2±4 mOsm/kgH2O; di/di: 330.8±3 mOsm/kgH2O; genotípus

hatása: p<0.01) és Na+

ion koncentrációjukban (+/+: 136.8±2.1mmol/l; di/di:

148.3±0.9mmol/l; genotípus hatása: p<0,01) különbségek figyelhetők meg [197].

Némileg meglepő volt, hogy ebben a kísérletben az FST alatt, illetve röviddel utána

az ACTH és kortikoszteron szintekben nem volt különbség a két genotípus között. Az

előző kísérletsorozatban alkalmazott FST esetén a víz hőmérséklete és mélysége is eltérő

volt (24±1 C, a jelenlegi 21±1 C-szal szemben), illetve az előző kísérletben 5 perces

mintavétel történt, míg itt 2. és 15. perckor vettünk mintákat. Valamint ott di/+, itt +/+ (agyi

műtéten is átesett) állatok szolgáltak kontrollként. Az anya genotípusának befolyásoló

hatását kizárhatjuk [148], mivel mindkét kísérletben a di/di tesztállatok di/+ anyáktól

származtak. Az előző fejezetben részletesen tárgyaltuk a lehetséges kompenzáló faktorokat.

Ebben a kísérletben a CRH mRNS szintekben nem találtunk változásokat. Ez egy

módszertani finomítás következménye is lehet, mivel az előző sorozatban (Budapesten

végzett vizsgálatok, MTA-KOKI) az integrált denzitást, míg ebben a kísérletben az

emulziós előhívást követő legnagyobb keresztmetszeten történő elemzést alkalmaztuk

(német kutatópartnerünknél végzett vizsgálatok, Otto von Güricke Universität Magdeburg).

Az integrált denzitás érzékenyebb módszer, mert a jel erősségében és kiterjedésben

bekövetkező változásokat összegzi, ugyanakkor alaposabb (minden meghatározott számú

metszetet fel kell venni) és több munkát (állatonként 1 lemez helyett 4-5 lemez) igényel. A

másik kézenfekvő kompenzációs molekula az OT. Ennek vonatkozásában már egyértelmű

99

eredményt kaptunk nemcsak az mRNS szintjén tekintve, hanem az extracelluláris térbe az

idegsejtek szómájából és a dendtritekből ürülő (mikrodialízis segítségével mérhető)

peptidre vonatkoztatva is [198, 199].

A centrális és perifériás hormonszintek disszociációját ebben a kísérletben is

megfigyelhettük [124]: a di/di állatokban a magasabb centrális OT szintek ellenére a

plazma szintek nem különböztek sem nyugalmi állapotban, sem a stressz után közvetlenül.

Ellenben 105 perccel a 10 perces FST kezdete után mérhető OT értékek az AVP hiányos

állatokban nem „csengtek le”, hasonlóan a kortikoszteron szintekhez. Ez az új adat még

árnyaltabbá teszi a HHM tengely szabályozásáról kialakult képet, bár továbbra is nehéz

magyarázatot találni az elnyújtott OT válaszra. Korábbi tanulmányok arra világítanak rá,

hogy az FST gyors (2 percen belüli) és átmeneti, gyorsan lecsengő AVP felszabadulást

vált ki a plazmába [124, 200]. A két eredmény összegzése alapján nem mondhatjuk azt,

hogy az elhúzódóan magas OT szint csupán az AVP hiányt kompenzáló mechanizmus

(hiszen ekkor gyors OT felszabadulást és gyors hormonszint csökkenést várnánk). Itt

érdemes megjegyezni, hogy a különböző stresszorok hatására szekretálódó OT fő forrása a

PVN magnocelluláris sejtjei [201]. Véleményünk szerint az FST során a PVN

intracelluláris terébe jutó AVP lehet a kulcs az OT plazma-szintek gyorsabb

„lecsengésében”. Úgy tűnik, hogy a felnőtt Brattleboro állatokban nem kompenzálódik

teljes mértékig az AVP hiánya, s ez vezet a 105. percben megfigyelhető magas OT

szintekhez. Ez a magas plazma OT szint lehet a felelős az ugyanazon vérmintában mérhető

magasabb kortikoszteron-szintekért. Bár van néhány adat arra vonatkozóan, hogy az OT-

nak közvetlen hatása van a mellékvesék kortikoszteron termelésére [202], további

vizsgálatok szükségesek annak bizonyítására, hogy ezek az útvonalak a Brattleboro

patkányokban is működnek, azaz kielégítően magyarázzák a kapott eredményeket.

Az a hipotézisünk, hogy a PVN-ben helyileg felszabaduló AVP gátló hatású lenne

az OT plazmába történő ürítésére, magyarázza a mikrodialízis kísérletekben kapott

eredményeinket is. Nevezetesen a di/di állatok extracelluláris terében mérhető magasabb

OT szinteket. Az in situ hibridizációs vizsgálataink is emelkedett OT mRNS szinteket

mutattak, de nemcsak a PVN magno-, hanem a parvocelluláris részében is. Mivel ez a

parvocelluláris rész beékelődött magnocelluláris sejteket is tartalmaz [203], az is

100

elképzelhető, hogy elsősorban ezek a sejtek járultak hozzá az mRNS szint emelkedéséhez

[204]. Fontos megemlítenünk, hogy az AVP hiányos állatok magasabb extracelluláris OT

koncentrációja nemcsak nyugalmi állapotban, de akut FST stressz alkalmazása esetén is

megfigyelhető volt. Mint korábban említettük, ez a stressz nemcsak az OT, hanem az AVP

intra-PVN elválasztásának emelkedését is okozza [124]. Előző vizsgálatok arra utaltak,

hogy a stressz hatására a PVN-ben felszabaduló AVP nemcsak autokrin, hanem parakrin

szabályozó faktor is lehet. Feltehetőleg a parvocelluláris sejtek CRH termelését

szabályozza, s ezáltal a HHM tengely centrális komponensét befolyásolja [205].

Feltételezhetjük, hogy a di/di állatok PVN-jének extracelluláris terében mérhető magasabb

OT szint az AVP parakrin szerepének kompenzálására alakul ki. Valóban, a hipotalamusz

szintjén az OT gátolja a HHM tengely működését [206, 207]. Továbbá nagy koncentrációjú

OT a PVN-ben megtalálható V1a [208] és V1b receptorokhoz [209] is képes kötődni,

legalábbis in vitro körülmények között. Azaz a PVN megemelkedett extracelluláris OT

szintje hozzájárulhat ahhoz, hogy jelen kísérletben nem találtunk különbséget az FST

hatására megemelkedő ACTH és kortikoszteron szintekben.

A retrodialízis kísérlet során kapott ACTH, kortikoszteron és OT plazma szintek

lefutása a kontroll, Ringer oldatot kapott állatokban nagyon hasonló volt a mikrodialízis

kísérletben tapasztalathoz. Az AVP inverz mikrodialízissel történő beadásának

következtében (amivel megpróbáltuk modellezni az AVP stresszre bekövetkező endogén

elválasztását) kisebb ACTH (2. perckor) és kortikoszteron (15. és 105. perckor) szint

emelkedések jöttek létre a 10 perc FST hatására. Több, mint 10 éve feltételezték, hogy az

akut stresszorok hatására a PVN-ben termelődő és az extracelluláris térbe jutó AVP gátló

hatással bír a HHM tengely működését tekintve [205]. Ezt jelen eredményeink is

alátámasztják. A HHM tengelyen való hatáson túl az AVP retrodialízis hatására az OT

plazma szintjének lefutása is normalizálódott (105 perces érték). Ezek az eredmények azért

is különösen érdekesek, mert a retrodialízis csak az egyik oldali PVN-be történt, így

feltételezhetjük, hogy a kétoldali kezelésnek még nagyobb hatása lett volna. Retrodialízis

kísérleteink eredményei igazolják előzetes feltevésünket és kiterjesztik azzal a

megállapítással, hogy az AVP a PVN-ben nemcsak a CRH termelő parvocelluláris, hanem

az OT termelő magnocelluláris sejtek működését is befolyásolja.

101

Összegzésként megállapíthatjuk, hogy a PVN-ben felszabaduló AVP parakrin

szignálként elősegíti a plazma OT- és kortikoszteron-szintek normalizálódását akut stresszt

követően. Az AVP hiányos állatokban a magasabb OT szintek részben kompenzálhatják az

AVP HHM tengelyre gyakorolt hatását (legalábbis az FST vonatkozásában).

5.1.3. A vazopresszin hiányos állatok vizsgálata akut morfin kezelés után

Rágcsálókkal végzett kísérletek alapján ismert, hogy egyetlen morfin kezelés is a

HHM tengely aktivációját okozza (pl.[210]). A morfin megvonás együtt jár a HHM tengely

stimulálásával és fokozza a HHM tengely mindhárom szintjén a hormonok elválasztását

[161, 211]. Kísérletünk során egyetlen, 10 mg/kg dózisú sc morfin injekció kétfázisú

ACTH és kortikoszteron szint emelkedést váltott ki a patkányokban. Feltételezhetően az

első hormonszint emelkedés a morfin injekció által kiváltott fájdalom miatt következett be.

A második fázis már a morfin fiziológiás hatásával magyarázható. A kísérlet

eredményeiből látszik, hogy már az egyszeri morfin injekció is elnyújtott változásokat

eredményez, amennyiben a plazma ACTH- és kortikoszteron-szintjeit vizsgáljuk,

összehasonlítva a fiziológiás só oldatot kapott kontroll állatokkal. A morfin injekció által

kiváltott ACTH emelkedés első fázisban az 5. percben, majd második fázisban a 60.

percben éri el a csúcsot mindkét genotípusban.

Az AVP hatása az egész kísérleti periódus alatt felfedezhető, hiszen annak

hiányában a morfin indukálta hormonszint emelkedések kisebb mértékűek. Ez rávilágít

arra, hogy az AVP szükséges ugyan, de nem kizárólagos szerepű a morfin indukálta HHM

tengely aktivációban. Itt említenénk meg azt is, hogy a di/di állatok esetében tapasztalt OT

szint emelkedés részben kompenzálhatta a centrális AVP hiányt.

5.2. Vazopresszin szerepe krónikus stresszben

5.2.1. Krónikus morfin kezelés utáni megvonás

Az általunk is alkalmazott tartós morfin kezelés (valószínűleg az ismételt rövid

morfin megvonások hatására) krónikusan aktiválja a HHM tengelyt [160, 161]. Annak

ellenére, hogy az AVP-nek jelentős szerepet tulajdonítottak a krónikus stressz által kiváltott

102

HHM tengely aktivációban [30, 32], előzetes kísérleteink már utaltak rá, hogy az AVP

hiányos Brattleboro patkányokban a krónikus stressz (2 hét ismételt mozgáskorlátozás

[183], vagy streptozotocin indukálta cukorbetegség [182]) által kiváltott változások nem

maradnak el. Valóban, jelen kísérletünkben sem láttuk, hogy az AVP hiánya befolyásolta

volna a krónikus stresszre létrejövő szomatikus változásokat. Ugyanakkor hormonszintek

tekintetében mi a morfin elvonás okozta változásokra helyeztük a hangsúlyt, ellentétben

korábbi tanulmányokkal, melyek az ismételt morfin kezelés hatásaira koncentrálnak [160,

161]. AVP hiányában a drogmegvonás kiváltotta hormonszint emelkedések kisebb

mértékűek voltak.

Ellentmondásosnak tűnhet, hogy a di/di genotípusú állatokban mérhető az AVP

mRNS szintje a PVN parvocelluláris neuronjaiban. Jól ismert, hogy a homozigóta „beteg”

állatok pontmutáció révén hibás AVP génjéről történik átírás mRNS-re, de az mRNS

„beragad” az endoplazmatikus retikulumba [146], valamint a génexpresszió mértéke az

életkor előrehaladtával csökken [146]. Az in situ hibridizáció során felhasznált AVP

ribopróba szekvenciája olyan, hogy képes a mutáns AVP mRNS-hez is kötődni. Így a di/di

állatok PVN-jének parvocelluláris sejtjeiben az AVP mRNS szintje normálisnak mérhető,

bár nem szabályozódik. Nincs adat arra vonatkozóan, hogy ez egy állandó "készlet"-e vagy

némileg szabályozott a szintje.

A di/+ genotípusú, kontroll állatokban az AVP mRNS szintje igen hamar, már 4 órával az

utolsó morfin injekció után emelkedik. Érdekes, hogy a hosszabb időtartamú, 16 órás

elvonás esetében már nem tapasztalunk mRNS szint emelkedést, a folyamat a periódus

végére „lecseng”. Ez a megfigyelés alátámasztja korábbi feltevésünket, miszerint az AVP-

nek inkább a rövid, mint a hosszú távú HHM tengely aktivációban, illetve annak

szabályozásában lehet szerepe. Houshyard és munkatársai [211] cikkükben arról számolnak

be, hogy hosszabb időn keresztül végzett morfin adagolás nem volt hatással a PVN-ben

mért AVP mRNS szintjére, illetve Zhou és munkatársai [212] tanulmányában láthatjuk,

hogy az amigdalában mért AVP mRNS szint emelkedés csak a heroin elvonás korai

szakaszában volt figyelhető meg.

Az általános vélekedéssel [30] összhangban, a krónikus morfin kezelés hatására

saját kísérletünkben is megemelkedett a PVN-ben a CRH mRNS szintje. Igen fontos

103

megfigyelés, hogy a CRH mRNS szintjének változásai mintegy ellentétét képezték az AVP

mRNS szintekben megfigyelteknek. A 4 órás elvonás nem [174], de a 16 órás már képes

volt emelni az mRNS szintjét, ez pedig azt sejteti, hogy az AVP-vel ellentétben a CRH

inkább a HHM tengely hosszabb távú változásainak szabályozásában vesz részt. Az AVP

hiányos állatokban emelkedett a CRH mRNS bazális szintje - ez feltehetően egy a

lehetséges kompenzatórikus mechanizmusok közül - azt azonban nem tudjuk egyértelműen

megmagyarázni, hogy a 16 órás elvonás miért nem vált ki további CRH mRNS szint

emelkedést. Lehetséges, hogy a di/di állatok emelkedett nyugalmi CRH mRNS szintje már

egy maximális szintet képvisel és további emelkedés nem lehetséges.

Az ópiátok kiváltotta hatások kialakításában nem kizárólag a HHM tengely elemei,

hanem extrahipotalamikus területek, illetve mediátorok is részt vehetnek [213]. Ilyen agyi

terület lehet például az opioid elvonás esetén a centrális amigdala (CeA) amely gazdag

endogén opioid vegyületeket termelő sejtekben. Továbbá korábbi tanulmányokból ismert,

hogy az opioid, AVP és CRH rendszer között funkcionális kapcsolat áll fenn [212, 214].

Ennek ellenére nem tapasztaltunk szignifikáns CRH mRNS szint emelkedést a morfin

kezelt állatok CeA-jában, amit Houshyard és munkatársai [211] is alátámasztottak.

Másfelől azonban az opioid elvonás gátolta az amigdala CRH expresszióját az AVP

hiányos állatokban [215].

Az ACTH prekurzor POMC mRNS-nek a szintje lassan emelkedett az elszenvedett

kezelések hatására, azaz ez is a hosszútávú hatásokat tükrözi, ahogyan már mások is

megállapították morfin [216] és heroin [212] függő patkányokban. Kísérleteinkben mind a

rövid, mind pedig a hosszabb időtartamú morfin elvonás hatására mérhetően emelkedett a

POMC mRNS szintje a hipofízis első lebenyében, de ez az emelkedés nem függött a

genotípustól. Tehát esetünkben az AVP hiány nem befolyásolta sem az alap, sem pedig a

stressz által indukált emelkedést.

A stressz krónikussá válását jelzik a testsúlyok csökkenése, a mellékvese

hipertrófiája, a csecsemőmirigy beolvadása, valamint az emelkedett kortikoszteron

alapszintek [217]. Mindezen elváltozások megfigyelhetők a morfin-függő állatainknál,

vagyis az általunk is alkalmazott kezelési protokoll valóban krónikus stressz-szerű állapotot

hozott létre [211, 217]. Habár a kiinduló hipotézisünket kénytelenek vagyunk elvetni, mivel

104

az AVP hiánya egyik felsorolt paraméter változását sem befolyásolta. A di/di állatok

kisebbek, állandó ivási kényszerük van, így feltehető, hogy „nyugalmi” körülmények

között is krónikus stressz állapotban vannak. Ezt alátámasztja a magasabb „nyugalmi”

kortikoszteron szintjük is. Ennek megfelelően feltehetjük, hogy bennük további, krónikus

stresszre utaló elváltozások nem képesek kifejlődni. Ennek ellentmond, hogy az AVP

hiányában még fokozottabb csecsemőmirigy beolvadás jött létre.

Eredményeink alapján azt mondhatjuk, hogy az AVP-nek fontos szerepe van a

morfin elvonás által kiváltott hormonális változások szabályozásában, ugyanakkor nem

tulajdonítható neki szerep a HHM tengely krónikus hiperaktivitásának a kialakulásában.

5.2.2. Mozgáskorlátozás 28 napig

Eltérő időtartamú mozgáskorlátozásos kísérleteink rávilágítottak arra, hogy már

akár 8 nap, napi egy órás mozgáskorlátozás hatására is kialakulnak a krónikus stresszt jelző

szomatikus paraméterváltozások [183]. Az AVP hiánya nem befolyásolta sem a szomatikus

változásokat, sem pedig a hipofízis elülső lebenyében mért POMC mRNS szint emelkedést,

akárcsak a kortikoszteron alapszintjének enyhe emelkedését. Felmerült ugyanakkor, hogy

akár 14 nap is kellően krónikusnak tekinthető-e (lsd. 1.2.). Ezért ebben a kísérletben 28

napos, napi egy órás mozgáskorlátozást alkalmaztunk.

Az összes eddigi vizsgálatunk arra utalt, hogy a nyugalmi hormonszintek

fenntartásában nincs szerepe az AVP-nek. Több vizsgálat is beszámol arról hogy az AVP

önmagában is képes az ACTH szekrécióját stimulálni [218], ezáltal a kortikoszteron

alapszintjének szabályozásában is részt vehet. Amennyiben ez a hatás érvényesül, a di/di

genotípusú állatokban inkább alacsonyabb, mint magasabb ACTH és kortikoszteron

szinteket kellett volna mérnünk. Laulin és munkatársainak [219] eredményei is kérdésessé

teszik az AVP nyugalmi stressz-hormon szekréciót fenntartó szerepét, bár az irodalomban

több ellentmondó adatot is találunk. Az ellentmondások magyarázata lehet a nem megfelelő

kontrollok használata [147], vagy az anya genotípusának hibás megválasztása [148].

Ahhoz, hogy ennek a faktornak a szerepét minimalizáljuk a kísérleteinkben di/+ és di/di

genotípusú állatokat használtunk, melyek di/+ genotípusú anyától és di/di genotípusú apától

származtak. Lehetséges magyarázat az is, hogy az AVP hiánya a cirkadián ritmus eltolódást

105

eredményezi, vagyis egy adott vizsgálati időpontban a két genotípusban azonosak vagy

eltérőek is lehetnek a hormonszintek. Az élő szervezetek „endogén órájának” vizsgálata

régóta kedvelt témája a neurobiológiának. A kutatások eredményeiből tudjuk, hogy ez az

„endogén óra” az SCN, ahol nagy mennyiségben találhatóak vazopresszinerg sejtek [220].

Ezek alapján feltételezhető, hogy az AVP hiánya befolyásolhatja az egész SCN működését

vagyis a melatonin termelés ritmikussága is esetleg zavart szenved [221]. Bár a di/di állatok

ACTH termelésének ritmikussága hasonlónak bizonyult más fajokhoz, ugyanakkor a

fluktuáció amplitúdója nagyobb volt [222].

A krónikus stressz egyik alapkérdése, hogy milyen szabályozási folyamatoknak

köszönhető a HHM tengely aktivitásának fennmaradása a tartósan magas plazma

glükokortikoid szintek ellenére. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy ilyen

körülmények között emelkedett AVP elválasztás figyelhető meg [30, 32]. Összehasonlítva

a 14 és 28 napos mozgáskorlátozás stressz eredményeit azt láttuk, hogy a hosszabb

időtartamú stresszelés alatt hozzászokás alakult ki az állatokban. A di/+ és di/di genotípusú

kontroll állatokban a testsúly növekedése egyenletes volt, a növekedési görbék

párhuzamosan futnak. Ezzel ellentétesen a stresszelt társaikban az első két hétben a

súlynövekedés elmarad, ám genotípustól függetlenül a 3. héten ismét megindul, majd a

kísérlet befejezéséig egyenletes növekedés volt megfigyelhető. A HHM tengely

hipotalamikus komponensét vizsgálva Ma és munkatársai [223] vizsgálataikban nem

tapasztalták a CRH mRNS szint emelkedést 14 napi mozgáskorlátozás hatására, ellentétben

Makino és csoportja [224] igen. A 28 nap mozgáskorlátozás emelte a CRH mRNS

mennyiségét a PVN-ben. A CRH és AVP mRNS alapszintekben a két genotípus között

nem volt különbség. A 28 napos stressz okozta mRNS emelkedések a di/di állatokban nem

voltak kimutathatóak. Bár a krónikus stressz hatására létrejövő CRH mRNS szint

emelkedés nem volt nagyon erőteljes, de már a mérsékelten emelkedett CRH elválasztás is

képes hatékonyan serkenteni a POMC termelődését [30]. Ebben a kísérletben a hipofízis

elülső lebenyében mért POMC mRNS alapszintje magasabb volt a di/di állatokban, mint a

di/+-os testvéreikben. A krónikus morfin kezeléses kísérletnél a kontroll állatok is kaptak

sorozatos injekciókat, amik befolyásolhatták a mért „nyugalmi” és stresszelt szinteket. A

di/+ genotípusban a 28 nap stressz POMC mRNS szint emelkedést kiváltott ki, de nem

106

növelte tovább a di/di állatokban mért értékeket. Feltételezhető, hogy a di/di állatokban a

magasabb POMC mRNS szint már maximális, ezt pedig a stressz nem képes tovább

emelni. A kortikoszteron alapszintjének vizsgálata során az eredményeink hasonlóak

voltak.

28 nap mozgáskorlátozás hatására kialakult testsúly és a HHM tengely mindhárom

szintjének (CRH mRNS, POMC mRNS, kortikoszteron) változásai kisebb mértékűek

voltak az AVP hiányos állatokban, ezért arra következtethetünk, hogy elnyújtott stressz

során az AVP szerepe válik fontossá a HHM tengely aktivitásának fenntartásában, különös

tekintettel a krónikus stressz állapotok késői fázisának kialakulására. Aguilera cikkében bár

elismeri a CRH lehetséges szerepét, krónikus stresszben inkább a PVN parvocelluláris

sejtjei által termelt AVP-t tekinti elsődlegesnek a stresszre adott válaszok kialakításával

kapcsolatban. Megfigyeléseink alátámasztják véleményét, hiszen az AVP mRNS esetében

nagyobb mértékű emelkedést tapasztaltunk, mint CRH mRNS esetében (112±17% és

74±16% emelkedés).

A kifejezett HHM tengely változásokkal ellentétben a szomatikus paraméterek

(csecsemőmirigy beolvadás, mellékvese megnagyobbodás) nem mutattak ilyen egyértelmű

hatásokat. A két genotípus közti különbségek nagyrészt elhanyagolhatóak voltak, bár a

testsúlyok esetén láttunk némi különbséget, és a mellékvese kéreg vastagságának

megnövekedése egyértelműen hiányzott az AVP hiányos állatokból. Feltételezhetően a

krónikus stresszre jellemző szomatikus paraméterváltozások nem kizárólagosan egyetlen,

hanem egy komplex rendszer szabályozása alatt állnak. Bár alapvetően ezeknek a

változásoknak a kialakításában a glükokortikoidoknak tulajdonítanak szerepet [225], ám

számos más faktor hatását is számításba kell vennünk.

Feltételezhető lenne, hogy egy adott stresszor hosszabb időn keresztüli alkalmazása

habituációt eredményez [30], de esetünkben a 28 napos krónikus stressz állapotban akut

stresszre bekövetkező hormonszint emelkedések nem különböztek az egyszeri akut stressz

hatásától. Igaz, mindkét esetben jelentősnek mutatkozott az AVP hiány hatása: mind az

ACTH-, mind a kortikoszteron szint emelkedése kisebb volt a di/di patkányokban. A

habituáció jeleként a 28 napos krónikus mozgáskorlátozás stressz után végzett mellékvese

szuperfúziós kísérleteink eredménye azt mutatta, hogy krónikus stressz hatására a szervek

107

ACTH érzékenysége csökkent. Ez az eredmény szükségessé teszi további vizsgálatok

elvégzését annak megválaszolására, hogy a csökkent ACTH érzékenység ellenére miért

nem tapasztalunk habituációt a plazmaszintekben. Továbbá, munkánk azt mutatja, hogy az

AVP hiányos állatok mellékveséinek ACTH érzékenysége valamivel magasabb volt, mint

di/+-os testvéreiké (hasonlóan a 10 napos állatokhoz; lsd. 52. ábra). Ez ellentmond Wiley

és munkatársai megfigyelésének, akik csökkent érzékenységet tapasztaltak a Brattleboro

patkányokban [168], illetve saját korábbi tapasztalatainknak is (lsd. 23. ábra). A

módszertani különbségen túl (statikus inkubálás és szuperfúzió) az alkalmazott ACTH

dózisa a második, emelkedett érzékenységet mutató felnőtt állatokon végzett

kísérleteinkben nagyobb volt. Ezen ellentmondás rávilágít az irodalmi és saját adataink

megerősítésének fontosságára. A statikus inkubálás kétségtelen előnyein túl (egyszerűbb

kivitelezni, kevesebb mintát generál) talán a szuperfúziós módszer jobban modellezi a

szervezetünkben a mirigyekhez áramlás révén jutó molekulák hatását.

Az AVP mRNS szintek vizsgálata megmutatja azt, hogy a di/di genotípusú állatok

esetében az mRNS szint normális a parvocelluláris sejtekben a PVN-ben, ugyanakkor a

szint szabályozása nem valósul meg. A magnocelluláris vazopresszin részvétele a

stresszfolyamatok szabályozásában a mai napig vitatott, csoportunk nem tudta megerősíteni

ennek szerepét. Az irodalomban azonban fellelhető olyan cikk, mely beszámol arról, hogy

ismételt mozgáskorlátozás hatására egyfajta strukturális átalakulás figyelhető meg a

magnocelluláris sejtekben [226]. Krónikusan stresszelt állatokban a hipofízis középső

lebenyének AVP tartalma csökkent, ugyanakkor a magnocelluláris sejtek mRNS tartalma

változatlan maradt. Magyarázhatjuk ezt azzal, hogy a hormonszekréció ugyan fokozódik,

de a szintézis nem tud lépést tartani a fokozott ürüléssel.

Összefoglalva az AVP nem játszik szerepet az alapszintű ACTH és kortikoszteron

szekréció fenntartásában, de az elnyújtott (28 napos) krónikus stresszre jellemző állapot

kialakításában már fontos. Két hetes stressz esetében nem mutatkoztak az AVP szerepének

jelei. Feltételezhető, hogy az AVP szerepe a stresszreaktivitás fenntartásában a stressz

időtartamának megnyúlásával változik, és ezek a változások több mint két hét alatt

alakulnak ki.

108

5.2.3. Krónikus váltakozó enyhe stressz (CMS) vizsgálata

Hogy korábbi eredményeinket más kísérleti felépítésben is igazoljuk, a korábbiaktól

eltérő és időben is hosszabb kísérletsorozatot terveztünk. A CMS nemcsak stressz, de a

depresszió modellezésére is széles körben használt, így a HHM tengellyel párhuzamosan az

állatok depresszió-szerű magatartás mintáit is tudtuk tanulmányozni. A 6 hetes

kísérletsorozat eredményei igazolták (szomatikus paraméterek változása és a HHM tengely

változásai: POMC mRNS az adenohipofízisben, nyugalmi ACTH és kortikoszteron szint

emelkedések), hogy a stressz krónikus volt. A szorongás (megnőtt zárt kari aktivitás az

EPM-en) és depresszió-szerű (több lebegéssel töltött idő az FST-ben) magatartás is

megfigyelhető volt a di/+ állatokban a 6 hetes CMS hatására. Az AVP hiányos állatokban

megfigyelt változások nagyon hasonlóak voltak a di/+ genotípusú kontrollokban

megfigyeltekkel (kivéve a hiányzó nyugalmi kortikoszteron emelkedést és némi tendenciát

a táplálékfelvétel és a szorongás befolyásolására), mely arra enged következtetni, hogy a

CMS indukálta változások kialakulása független az AVP-től.

Korábbi 2 hetes krónikus stressz vizsgálataink során nem sikerült igazolnunk az

AVP szerepét a krónikus stressz állapot kialakításában [159, 182, 183], de 28 nap során a

szerepe sokkal fontosabbá vált. Éppen ezért volt meglepő a jelen eredményünk. Bár azt is

mondhatjuk, hogy a HHM tengely „végrehajtó” molekulája, a kortikoszteron érzékeny az

AVP jelenlétére. Gyakran látható megemelkedett „nyugalmi” kortikoszteron szint a

következő stimulus várható időpontjában. A CMS esetünkben is létrehozta ezt a „nyugalmi

emelkedést”, de AVP hiányában ez nem jött létre. Már említettük, hogy az ACTH szintek

nem feltétlenül futnak párhuzamosan a kortikoszteron-szintekkel. Kísérletünkben a

látszólagos különbség ellenére az ACTH és kortikoszteron szintek közötti korreláció erősen

szignifikáns volt. Továbbá a mellékvesék fokozott kortikoszteron elválasztásának

következtében kialakuló tünetek (pl. csecsemőmirigy beolvadás) mindkét genotípus

esetében hasonló mértékben voltak megfigyelhetőek. Meglepő módon a fokozott

elválasztás mellett sem tapasztaltunk mellékvese hipertrófiát, mely a krónikus stressz egyik

jellemző tünete és háttérül szolgálhat az emelkedett nyugalmi kortikoszteron elválasztáshoz

is. Feltehetőleg az általunk alkalmazott stresszorok nem voltak elég erősek ahhoz, hogy

mérhető változásokat indukáljanak a mellékvesékben, annak ellenére, hogy a

109

hiperkorticizmus fennállt (a plazma vizsgálatok alapján), ami pedig erőteljes változásokat

indokolt volna. Lehetséges, hogy a mellékvese szerkezetének sajátos átrendeződése áll a

jelenség hátterében: a zona fasciculata esetleges kiszélesedése a többi réteg beolvadása

mellett. Az is elképzelhető, hogy ugyan a “nyugalmi” kortikoszteron szint kisebb a di/di

állatban, de a stresszreakció lecsengése elhúzódóbb (lsd. Mikrodialízis kísérlet) így az

átlagos kortikoszteron kínálat ugyanolyan lesz a di/di, mint a di/+ állatban.

Ismert, hogy a stressznek, a stressz hormonoknak és különösen a

glükokortikoidoknak fontos szerepe van az állatok viselkedésének szabályozásában [227,

228]. Mivel az AVP hiány, valamint a CMS procedúra nem befolyásolta az izomerőt vagy a

mozgáskoordinációt, ezért további, az állatok valamilyen mozgását feltételező vizsgálatok

értelmezhetőek voltak. A szorongás klasszikus mércéjéül szolgáló nyíltkari aktivitás CMS

hatására erőteljesen lecsökkent az EPM-en, alátámasztva egy szorongóbb fenotípus

kialakulását. Számos korábbi vizsgálat utalt az AVP lehetséges szorongáscsökkentő

szerepére (pl. [134, 138, 229]). Ezért azt gondoltuk, hogy a di/di állatokban fokozott

nyíltkari aktivitást tudunk majd megfigyelni. Ezzel ellentétben sem alap állapotban, sem

CMS után nem sikerült az AVP szerepét bizonyítani a fő paraméterek vonatkozásában.

Habár a részletes vizsgálat szerint a CMS csak a di/+ állatokban eredményezett kevesebb

nyílt karban töltött időt, arra utalva, hogy az AVP-nek mégis lehet szorongáscsökkentő

szerepe. Griebel és munkatársai [127] bizonyították egérben, hogy a CMS hatására

csökkent a nyílt kari belépések száma, és ezt a csökkenést V1b receptor antagonistával

sikerült kivédeniük. Arra gondolhatunk, hogy az AVP élethosszig tartó hiánya a

Brattleboro patkányokban befolyásolhatja az AVP szorongáscsökkentő szerepét

(másodlagos elváltozások pl. a dopamin rendszerben [230]). A fokozott mozgékonyság,

amit a fokozott zárt kari belépéssel mértünk, szintén a CMS szorongásfokozó hatására

utalhat [231], bár számos kísérletben nem találtak hasonló változást krónikus stresszelések

után [232]. Mindenesetre az AVP erre a paraméterre sem hatott. A mosakodási magatartás

csökkent előfordulása a Brattleboro patkányokban azonban egyértelműen a csökkent

szorongást jelzi. A mosakodás egy stressz-csökkentő sztereotíp viselkedés [233, 234].

Korábban azt találták, hogy a fokozott mosakodás erősen összefügg a nyílt kar csökkent

110

felderítésével és szorongáscsökkentő kezelés csökkenti [233, 235-237]. Az AVP hatással

ellentétben a CMS esetünkben nem befolyásolta ezt a paramétert.

A depresszió-szerű viselkedés vizsgálatához az FST-t alkalmaztuk. A depresszió a

HHM tengely krónikus hiperaktivitásával jár együtt [238] és egyes agyterületeken

emelkedett AVP szintek figyelhetőek meg [239]. Várakozásunknak megfelelően a CMS

hatására megnőtt a lebegéssel töltött idő. Sajnálatos módon nem sikerült bizonyítanunk az

AVP védő szerepét sem alap, sem stressz utáni állapotban, bár egy előzetes

kísérletsorozatunk nem stresszelt állatok esetében pozitív eredményre vezetett [128].

Irodalmi adatok is arra utalnak, hogy a V1b antagonista kezelés csökkenti az egerek

lebegéssel töltött idejét [127]. Úgy tűnik, hogy az AVP érzékeny a környezeti faktorokra,

mivel előző, pozitív kísérletünkben 30cm, míg ebben a kísérletben 45cm-es vízmélységet

használtunk.

Összefoglalva, jelen, AVP hiányos Brattleboro patkányokkal végzett vizsgálataink

azt mutatják, hogy az AVP hiánya nem véd a CMS hatására kialakuló HHM tengely és

magatartási változásoktól. Elképzelhető, hogy az élethosszú AVP hiány kompenzálódik, de

ebben a kísérletben a PVN CRH mRNS szintek a di/di állatokban inkább alacsonyabban,

mint magasabbak voltak (legnagyobb átmérő; di/+: 60,5 1,4 illetve di/di: 54,1 1,01

arbitrary unit). Feltehető, hogy krónikus stressz során a stressz szabályozásában fontos

három neuropeptid (CRH, AVP, OT) egyensúlyának felbomlása az, mely végül a kimenet

(HHM tengely vagy magatartás) megváltozásához vezet [240]. Valószínűnek tűnik, hogy

az egyes tényezők kölcsönhatása és nem egyetlen faktor az, ami befolyásolja a magatartást,

illetve a betegségek patogenezisét. A kezelés tervezésénél az egész komplex rendszert

figyelembe kell vennünk.

5.3. Stressz reaktivitás a perinatális korban

5.3.1. A vazopresszin hatása a kispatkányok stresszreaktivitására

Kísérleteinkben a HHM tengely aktivitását vizsgáltuk az SHRP alatt [66, 241].

Legfőbb megfigyelésünk, hogy az AVP hiányában a di/di állatokban a stressz kiváltotta

ACTH válasz csökken, az esetek nagy részében egyáltalán nem jelenik meg. Ezek alapján a

111

perinatális korban az AVP lehet a kulcs szignál az ACTH elválasztás szabályozásában,

legalábbis patkányokban. Ezzel ellentétben az AVP hiánya a kortikoszteron választ nem

befolyásolta. Ez nem magyarázható meg egyértelműen azzal, hogy az ACTH és a

kortikoszteron elválasztásának időgörbéje eltérő, illetve azzal is csak részben oldható fel az

ellentmondás, hogy a di/di kispatkányok mellékveséjének ACTH érzékenysége fokozott

volt.

Eredményeink azt mutatják, hogy a kortikoszteron szintje meglehetősen alacsony,

bár mérhető szinten van a neonatális periódusban, ugyanakkor közel háromszorosára

emelkedett a születés utáni 20. napra [66, 242]. 24 órás anyai depriváció és Hypnorm

injekció hatására a plazma ACTH és kortikoszteron szintje megemelkedett mindegyik

vizsgált életkorban. A di/+ genotípusú állatokban az életkor előrehaladtával a

stresszválaszok egyre erőteljesebbek lettek, ami szintén a HHM tengely érését mutathatja.

Felnőtt állatokban egyszeri akut stressz 4 órával a stressz alkalmazása után CRH mRNS

szint emelkedést vált ki és ez az szint közel 24 órán keresztül fennmarad [243]. A 10 napos

kispatkányokban az anyai depriváció nem váltott ki CRH mRNS szint emelkedést, mely

alátámasztja azt a feltételezést miszerint a CRH szekréció szabályozása éretlen és az AVP

szabályozó szerepe kerül előtérbe.

Ellentétben a felnőtt egyedekkel, akikben a CRH a fő ACTH szekretagóg hormon

[244], addig a fiatal állatokban az AVP számottevően nagyobb mennyiségben termelődik,

mint a CRH [72, 245]. Ugyanakkor az AVP szerepe korlátozottnak is tűnik, hiszen jelenléte

vagy hiánya az ACTH alapszintjét nem befolyásolta. Korábbi eredmények is ezt

támaszthatják alá: az ACTH alapszintjének szabályozása független a hipotalamuszba

beérkező ingerektől [246]. A stressz-indukált hormonszint emelkedések tekintetében

azonban az AVP szerepének fontosságát támasztja alá a 8 napos kispatkányok passzív AVP

elleni immunizálása, amikor az AVP hiányában a hipoglikémia indukálta ACTH szint

emelkedés elmaradt [72]. Ezzel ellentétben a CRH elleni immunizálás hatástalan volt. Bár a

passzív CRH immunizálás hatására eltűnt a hideg-stressz indukálta kortikoszteron válasz az

SHRP idején [247] és hasonló kezelés az uretán indukálta ACTH szint emelkedést is

csökkentette [65]. Ez alapján az AVP szerepe stresszorspecifikusnak tűnik [73, 248] (és lsd.

felnőtt állatok akut stresszválasza). Eredményeink részben támogatják ezen feltételezéseket,

112

mivel az anyai depriváció hatására az ACTH válasz az AVP hiányos állatokban teljes

mértékben elmaradt, de a Hypnorm injekció hatására ugyanezen genotípusú állatokban

enyhe ACTH aktiváció még megfigyelhető volt.

A legérdekesebb és egyben talán legmegdöbbentőbb tapasztalat az ACTH és a

kortikoszteron szekréciójának teljes elkülönülése az AVP hiányos kisállatokban.

Normális esetben az ACTH szekréciója megelőzi a kortikoszteron elválasztását és utóbbi

szekréciója szoros korrelációban van az előbbiével. Ezzel az általános képpel szemben az

anyai depriváció hatására bekövetkező változások közül az ACTH válasz hiányzik az AVP

hiányos állatokban míg a kortikoszteron elválasztása sokkal erőteljesebb. Eredményeink

kizárják annak a lehetőségét, hogy a jelenség oka a két esemény időbeli eltolódása lenne.

Hiszen míg az egyre hosszabb szeparációs idők esetén a di/di genotípusú állatokban az

anyai depriváció a plazma kortikoszteron szintjét fokozatosan emelte, addig az ACTH

válaszok teljes egészében elmaradtak. Hasonló (bár nem magyarázott) jelenséget

olvashatunk Walker és munkatársai cikkeiben [73, 248], ahol 10 napos Sprague Dawley

kispatkányoknál az anyai deprivációt követő 8 és 12 órában erőteljes kortikoszteron

elválasztás mellett csak kismértékű ACTH szint emelkedés tapasztaltak. Korábbi

vizsgálatok szerint a mellékvesék glükokortikoid szekrécióját befolyásolhatja a táplálás

elmaradása, ami pedig az anyai depriváció értelemszerű velejárója [73, 248]. Éppen ezért

volt fontos egy másik stimulus (Hypnorm injekció) alkalmazása, ahol szintén disszociált

ACTH és kortikoszteron választ tapasztaltunk. Az ebben az esetben alkalmazott 30, illetve

60 perces szünet a táplálásban nem befolyásolhatta az eredményeket, ez természetes

esemény. Szükséges megjegyeznünk, hogy az injekció beadása után mindegyik kispatkány

vissza lett helyezve az anyaállat mellé (bár kétségtelen, hogy az anya gondozó-tápláló

magatartását megzavartuk).

A szakirodalom egyes feltételezései szerint az ACTH és a kortikoszteron

szekréciójának disszociációja a mellékvesék emelkedett ACTH érzékenységével

magyarázhatóak. Mivel az AVP gátolhatja az ACTH/kortikoszteron szignáltranszdukciót

[249], az emelkedett mellékvese érzékenység annak lehet a következménye, hogy az AVP

gátló hatása hiányzik a di/di kispatkányokban. Ez a jelenség feltehetően csak egy azok

közül, amelyek a mellékvesék ACTH érzékenységét fokozzák a di/di állatokban. Az előbb

113

említetteknek megfelelően ezekben az állatokban már kismértékű ACTH szint emelkedés is

magas kortikoszteron szekréciót eredményezne. Összhangban ezzel a feltételezéssel, az in

vitro kísérletekben mért mellékvese ACTH érzékenység 87,9 %-kal nagyobb, amennyiben

10-13

M, 62,2 %-kal nagyobb, ha 10-12

M és 57,6%-kal ha 10-11

M koncentrációjú ACTH-

val kezeltük a szerveket (a di/+ és a di/di állatokban mért értékek egymáshoz viszonyított

százalékos aránya). Amennyiben az alap kortikoszteron szintekhez viszonyítottuk az

emelkedéseket a következő eredményeket kaptuk (7.táblázat):

7. táblázat

ACTH érzékenység vizsgálata

A di/di genotípusban a mellékvesék érzékenysége emelkedett volt minden koncentráció

esetében. Az ACTH válasz teljes hiánya az anyai depriváció esetében irrelevánssá teszi

jelen helyzetben a mellékvesék érzékenységének kérdését. Habár a Hypnorm injekció

alkalmazása során kismértékű ACTH választ kialakult a di/di kölykökben, a mellékvesék

érzékenységének kisfokú növekedése nem lehet magyarázat arra hatalmas ellentmondásra,

mely az ACTH és a kortikoszteron elválasztás mintázatában tapasztalható. 10 napos di/+-os

kölykök esetében az Hypnorm kezelés megemelte az ACTH és a kortikoszteron szinteket is

(236,8 fmol/ml és 132,7 pmol/ml) vagyis egy fmol ACTH szekrécióhoz 0,56 pmol

kortikoszteron köthető. Amennyiben a számokat a di/di genotípusban vizsgáljuk akkor a

következő eredményekre jutunk: Az ACTH szint az injekció után 28,2 fmol/ml volt, míg a

kortikoszteron szint a kezelés után 109,1 pmol/ml volt. Vagyis ebben az esetben az arány

lényegesen eltér, hiszen egyetlen fmol ACTH szekréciója 3,87 pmol kortikoszteron

elválasztását eredményezi. Vagyis hasonló mennyiségű ACTH a di/di genotípusban közel

Genotípus ACTH

koncentráció di/+ di/di

10-13

M 85,5% 158,9%

10-12

M 206,5% 335,2%

10-11

M 212,4% 334,9%

114

7-szer nagyobb kortikoszteron szekréciót vált ki, míg az érzékenység növekedés kb.

másfélszeres volt.

Mivel az in vitro kísérleti modellekben a természetes környezetből érkező külső és belső

ingerek hiányoznak [250], így kísérletünket in vivo modellben is megismételtük. Ebben az

esetben az in vitro tapasztalt emelkedett mellékvese érzékenységet nem tudtuk bemutatni

(ugyanolyan mértékű kortikoszteron emelkedés jött létre a di/+, mint a di/di állatokban).

Az vitro és in vivo kísérletek együttesen arra mutatnak rá, hogy a mellékvesék ACTH

érzékenysége nem lehet kizárólagos magyarázata a disszociált ACTH és kortikoszteron

szekréciónak.

A két hormon közötti disszociáció korábban már számos tanulmány tárgya volt.

Walker és munkatársai munkájában [248] Sprague Dawley patkányok esetében mutatták

be, hogy az anyai depriváció és a hipoxia kiváltotta kortikoszteron válasszal párhuzamosan

nem volt megfigyelhető az ACTH szint emelkedése. Birkák esetében a magzati korban

alkalmazott hipoxia szintén erőteljes kortikoszteron szint emelkedést váltott ki, de az

ACTH szint változása elmaradt [251]. Ezekben az állatokban a kortikoszteron szint

emelkedése a mellékvesék nervus splanchnicus általi beidegzésétől függ. Összességében

arra következtethetünk, hogy a kortikoszteron elválasztása nem vagy csak gyengén függ az

ACTH-tól az egyedfejlődés korai szakaszában. Ugyanakkor Bornstein cikkében [252] arról

olvashatunk, hogy felnőtt egyedekben is létezik a kortikoszteron elválasztásának ACTH

független módja.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az AVP szükséges ugyan az ACTH

stresszválaszok érési folyamatában, de sem az AVP sem pedig az ACTH nem szükséges a

kortikoszteron stressz válaszok kialakulásában. A neonatális korban induló érési

folyamatok és a stresszválaszok szabályozásának tanulmányozása további kísérletek

elvégzését igénylik.

5.3.2. Különböző nemű kispatkányok stresszreaktivitásának vizsgálata

Bár a perinatális korban a szexuális hormonok szintje nem tér el a két nemben,

kíváncsiak voltuk, hogy a stressztengely szabályozásban sincs-e különbség. Ehhez az

115

előzőekben is alkalmazott 24 órás anyai szeparációt, valamint egy további új stresszort, az

éter belélegzést alkalmaztuk.

Korábbi tanulmányok beszámolnak arról, hogy a születést követő időben

bekövetkező események különbözőképpen befolyásolja a hím és a nőstény serdülő, illetve

felnőtt egyedek stresszreaktivitását. Mozgáskorlátozás stressz hatására a HHM tengely

aktivitása hímekben csökkent, míg a nőstényekben emelkedett a perinatális manipuláció

késői következményeként [253]. Bár a késői következmények merőben mások lehetnek, a

saját kísérleteinkben a perinatális stimulusra ugyanolyan irányú, csak fokozott amplitúdójú

stresszválaszt figyelhettünk meg a nőstényekben a hímekkel összehasonlítva. Hasonló

eredményeket tapasztaltak abban az esetben is, amikor endotoxin indukálta változásokat

vizsgáltak: nőstény kölykökben emelkedett volt a HHM tengely aktivitása [254]. Az

ivarszervek eltávolítását követően ezen szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a nemi

különbségek alapja valamilyen gonadális hatás lehet, ami hímekben gátló, nőstényekben

pedig serkentő. Arra következtethetünk, hogy a HHM tengely szabályozásának fő

mechanizmusai azonosak a két nemben, az alkalmazott stresszorok hatékony ACTH és

kortikoszteron emelőnek bizonyultak és az AVP hiány is mind a hímeknél, mind a

nőstényeknél csökkentette az ACTH elválasztást. Habár a rendszer érzékenysége másképp

van beállítva, ami a nőstények magasabb stresszhormon emelkedésében nyilvánul meg.

Mint másodlagos szignál, a magasabb glükokortikoid szintek befolyásolhatják a későbbi

fejlődést.

Ebben a kísérletsorozatban is sikerült bizonyítanunk (ráadásul két, merőben eltérő

stressz alkalmazásával) az AVP ACTH szabályozásban elfoglalt kitüntetett helyét a

neonatális időszak alatt. Tulajdonképp AVP hiányában nem jött létre mérhető ACTH

emelkedés sem az előzőleg már alkalmazott 24 órás anyai szeparáció, sem az éter (egyszeri,

vagy kétszeri) belégzés hatására. AVP kötőhelyek már a prenatális 20. naptól kimutathatók

mind a szeptumban, mind a laterális retikuláris magban. A perinatális 20. és a posztnatális

15. nap között az AVP kötőhelyek mindazon agyterületeken megjelennek, ahol felnőttben

is megtalálhatók. Jelen kísérleteink is megerősítik, hogy perinatálisan az AVP tekinthető az

ACTH elválasztás fő szabályozójának. Az előzőekkel összhangban ez a szabályozó szerep

azonban csak a stressz okozta emelkedésekre, és nem az alapaktivitás fenntartására

116

vonatkozik. Muret és munkatársai [72] inzulin hipoglikémiás, valamint Levine [73] és

Avishai-Eliner [74] anyai szeparációs munkái szintén alátámasztják az AVP szabályozó

szerepét. Érdemes megemlíteni, hogy a 10 napos CRH-R1 génkiütött egerekben a 24 órás

anyai szeparáció okozta ACTH emelkedés nem változott, habár a kortikoszteron válasz

fokozott volt, ami a CRH perinatális gátló szerepére utalhat (valószínűleg az előagyi és

limbikus területekről) csökkent CRH mRNS és emelkedett AVP mRNS szinteket

eredményezve az állat PVN-jében [255]. Néhány vizsgálat a CRH perinatális szabályozó

szerepét is alátámasztja. Újszülöttekben a hideg stressz hatására megemelkedett a CRH

mRNS szintje a PVN-ben és mind a hideg [247], mind az uretán belégzés [68] hatására

létrejövő kortikoszteron választ a CRH elleni immunizálás kivédte. Ugyan kézenfekvő

magyarázat lenne a stresszorspecifikus hatás, de a disszertációban három, egymástól

alapjaiban különböző stresszor esetében (anyai elválasztás, Hypnorm injekció, éter

belégzés) is sikerült bizonyítani az AVP ACTH szabályozásban betöltött szerepét.

Elképzelhető, hogy az AVP hiányos állatok hipotalamusza több CRH-t tartalmaz, mint

ahogy ezt a felnőtt állatok esetén bizonyítottuk. Ezzel összhangban az AVP toxikus kiirtása

az újszülöttek PVN-jében CRH mRNS emelkedést okozott [246], habár ez inkább fokozott,

mint csökkent ACTH válaszokat okozna.

Az előző kísérletekkel összhangban itt is ACTH nélküli kortikoszteron választ

tapasztaltunk. Egy lehetséges magyarázat lehet az is, hogy az AVP a mellékvesék szintjén

gátolja a kortikoszteron elválasztást, azaz hiányban kis ACTH is hatalmas kortikoszteron

választ képes kiváltani. Habár ez a magyarázat nem tűnik kézenfekvőnek, mivel az anyai

szeparáció esetén semminemű ACTH szint emelkedés nem volt kimutatható. Az is

lehetséges lenne, hogy a di/di állatok megemelkedett „nyugalmi” kortikoszteron szintjei

gátolják a további stresszre létrejövő ACTH elválasztást. Ez a kérdés még további

vizsgálatokat igényel.

117

6. Következtetések A vazopresszin szerepe akut stresszben

1. Akut stresszhelyzetekben az AVP-nek stresszorspecifikus szerep jut a HHM tengely

szabályozásában, mely szerepe nem köthető egyértelműen egyik előzőleg felállított

kategóriához sem.

2. Az ACTH és kortikoszteron szekréció disszociál, az AVP szerepe fontos az ACTH, de

kevésbé jelentős a glükokortikoid elválasztás szabályozásában.

3. A PVN-ben helyileg felszabaduló AVP gátló hatása segíti az OT plazmaszintek stressz

(FST stressz) utáni normalizálódását. A plazma OT szintjének változása befolyásolhatja

a mellékvese kortikoszteron elválasztását is.

4. Az AVP fontos, de nem kizárólagos a morfin injekció hatására létrejött HHM tengely

aktivációban, mind az ACTH, mind a kortikoszteron vonatkozásában.

A vazopresszin szerepének vizsgálata krónikus stresszhelyzetekben

1. Az AVP-nek fontos szerepe van a morfin elvonás által kiváltott hormonális változások

szabályozásában, ugyanakkor nem tulajdonítható neki szerep a HHM tengely krónikus

hiperaktivitásának, azaz a morfin-függőségnek a kialakulásában (2 hetes vizsgálat).

2. A krónikus stressz 14 napról 28 napra való kiterjesztése során felszínre került az AVP

HHM tengely alapaktivitásának fenntartásában betöltött szerepe.

3. Az AVP elnyújtott stresszben betöltött szerepe azonban nem általános, inkább az azonos

stimulus ismétlődésére vonatkozik, mivel az AVP hiánya nem véd a 6 hetes CMS

hatására kialakuló HHM tengely és magatartási változásoktól.

A HHM tengely szabályozása a perinatális korban

1. A perinatális korban az AVP lehet a kulcs szignál az ACTH elválasztás szabályozásában,

legalábbis patkányokban.

2. A kortikoszteron elválasztása nem, vagy csak gyengén függ az ACTH-tól az

egyedfejlődés korai szakaszában.

3. Bár a korai fejlődés során jelentős hormonális eltérés nincs a nemek között, és a HHM

tengelyük működésének szabályozó mechanizmusai is hasonlóak, de a nőstények már

ekkor is stressz-érzékenyebbek.

118

7. Összefoglalás A vazopresszin fontos szerepet játszik a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese (stressz)

tengely szabályozásában. Kísérleteink elvégzése előtt az volt az általános vélekedés, hogy a

krónikus stresszfolyamatok során nő meg a molekula szerepe. Természetes mutáció révén

vazopresszin hiányos állatokban vizsgáltuk a hormon szerepét. Az állattörzs lehetőséget

teremtett arra, hogy a stresszorok modalitásbeli és intenzitásbeli sokféleségét vizsgálhassuk

anélkül, hogy a különféle beavatkozások (pl. antagonista kezelés, agyi léziók stb.) extra

stresszének tennénk ki az állatokat. Kísérleteink során az akut és krónikus stressz szerepét

vizsgáltuk felnőtt és perinatális korban. Eredményeink rávilágítanak arra, hogy a

vazopresszinnek az akut stresszorok esetében az eddig ismert stresszkategóriáktó független

stresszorspecifikus szerepe van. A krónikus stressz kísérleteink eredményei alapján arra

következtethetünk, hogy a vazopresszinnek inkább az akut, mint a krónikus stressz során

lezajló változásokban lehet szerepe. Perinatális korban a stressz által kiváltott

adrenokortikotropin (ACTH, a stressztengely hipofizeális komponense) és a kortikoszteron

(a tengely mellékvese komponense) stresszválasz teljes disszociációját figyeltük meg:

vazopresszin hiányában elmarad az ACTH stresszválasz, de a kortikoszteron válasz

jelentős. Arra következtettünk, hogy perinatális korban a vazopresszin az az anyag, amely

az ACTH elválasztását szabályozza, a kortikoszteron elválasztásában pedig az ACTH-n

kívül más anyagok is nagy szerepet kaphatnak. További kutatások tárgya, hogy a

vazopresszinnek a szervezeten belüli modulációja miképpen lehet segítségünkre a tartós

stressz kiváltotta szomatikus és mentális betegségek kezelésében.

119

7. Summary Vasopressin plays an important role in the hypothalamo-pituitary-adrenal axis

regulation as well as in stress-related disorders. A common view suggested that the role of

vasopressin is especially important during chronic stress. We used the naturally vasopressin

mutant Brattleboro rat as a model organism. This strain is a good choice for stress studies

as we could examined the role of vasopressin without any extra, stressful treatment. The

role of vasopressin was studies in the hypothalamo-pitutary-adrenocortical axis regulation

after different acute and chronic stimuli as well as during the perinatal period. After a big

experiment with 18 acute stressors we concluded that vasopressin has a stressor specific

role in acute changes of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical (stress) axis. The chronic

stress studies lead to the conclusion that vasopressin may play a role in acute rather than

chronic stress changes. We observed that stress-induced adrenocorticotropin (ACTH, the

hypophyseal level of the stress axis) and corticosterone (the adrenal component) stress

response completely dissociated during the perinatal period. In vasopressin deficient

Brattleboro pups the ACTH stress response was missing but significant corticosterone

response was visible. Based on our results we concluded that during the perinatal period

vasopressin is the main hypothalamic secretagogue of the ACTH secretion and

corticosterone secretion could be regulated by other substances. Further studies required on

the modulation of the vasopressinerg system, which might bring us closer to the treatment

of stress-related somatic and mental diseases.

120

8. Irodalomjegyzék 1. Simonton, O.C., Matthews-Simonton S. (1981) Cancer and stress: counselling the

cancer patient. Med J Aust, 1(13): p. 679, 682-3.

2. Lam SK, Hui WM, Shiu LP, Ng MM. (1995) Society stress and peptic ulcer

perforation. J Gastroenterol Hepatol 10(5): p. 570-6.

3. Sparrenberger F, Cichelero FT, Ascoli AM, Fonseca FP, Weiss G, Berwanger O,

Fuchs SC, Moreira LB, Fuchs FD. (2009) Does psychosocial stress cause

hypertension? A systematic review of observational studies. J Hum Hypertens,.

23(1): p. 12-9.

4. Lehman CD, Rodin J, McEwen B, Brinton R. (1991) Impact of environmental stress

on the expression of insulin-dependent diabetes mellitus. Behav Neurosci,. 105(2):

p. 241-5.

5. Demyttenaere K, Nijs P, Evers-Kiebooms G, Koninckx PR. (1991) Coping,

ineffectiveness of coping and the psychoendocrinological stress responses during

in-vitro fertilization. J Psychosom Res,. 35(2-3): p. 231-43.

6. Checkley S. (1996) The neuroendocrinology of depression and chronic stress. Br

Med Bull, 52(3): p. 597-617.

7. Bradley AJ, Dinan TG. (2010) A systematic review of hypothalamic-pituitary-

adrenal axis function in schizophrenia: implications for mortality. J

Psychopharmacol, 24(4 Suppl): p. 91-118.

8. Cohen CI. (1993) Poverty and the course of schizophrenia: implications for research

and policy. Hosp Community Psychiatry, 44(10): p. 951-8.

9. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs369/en/.

10. Ambrus, Z. and Varsányi T. (2011) Az egészség és az életmód regionális

különbségei. Területi Statisztika, 0018-7828.,. 14/3: p. 227-244. .

11. Selye H. (1985) The nature of stress. Basal Facts, 7(1): p. 3-11.

12. Munck, A, Guyre PM. (1986) Glucocorticoid physiology, pharmacology and stress.

Adv Exp Med Biol, 196: p. 81-96.

13. McEwen BS. (1998) Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load.

Ann N Y Acad Sci, 840: p. 33-44.

14. Huether G. (1996) The central adaptation syndrome: psychosocial stress as a trigger

for adaptive modifications of brain structure and brain function. Prog Neurobiol,

48(6): p. 569-612.

15. Oitzl MS, Champagne DL, van der Veen R, de Kloet ER. (2010) Brain development

under stress: Hypotheses of glucocorticoid actions revisited. Neurosci Biobehav

Rev, 34(6):853-66

16. Dayas CV, Buller KM, Crane JW, Xu Y, Day TA. (2001) Stressor categorization:

acute physical and psychological stressors elicit distinctive recruitment patterns in

the amygdala and in medullary noradrenergic cell groups. Eur J Neurosci, 14(7): p.

1143-52.

17. Carrasco, G.A., Van de Kar L.D.( 2003) Neuroendocrine pharmacology of stress.

Eur J Pharmacol 463(1-3): p. 235-72.

121

18. Lolait SJ, Stewart LQ, Jessop DS, Young WS 3rd, O'Carroll AM. (2007) The

hypothalamic-pituitary-adrenal axis response to stress in mice lacking functional

vasopressin V1b receptors. Endocrinology, 148(2): p. 849-56.

19. Sawchenko PE, Li HY, Ericsson A. (2000) Circuits and mechanisms governing

hypothalamic responses to stress: a tale of two paradigms. Prog Brain Res, 122: p.

61-78.

20. Williams G, Bing C, Cai XJ, Harrold JA, King PJ, Liu XH. (2001) The

hypothalamus and the control of energy homeostasis: different circuits, different

purposes. Physiol Behav, 74(4-5): p. 683-701.

21. Brunton PJ, Russell JA. (2008) Attenuated hypothalamo-pituitary-adrenal axis

responses to immune challenge during pregnancy: the neurosteroid opioid

connection. J Physiol, 586(2): p. 369-75.

22. Harding JW, Jensen LL, Hanesworth JM, Roberts KA, Page TA, Wright JW. (1992)

Release of angiotensins in paraventricular nucleus of rat in response to

physiological and chemical stimuli. Am J Physiol, 262(1 Pt 2): p. F17-23.

23. Morimoto A, Murakami N, Sakata Y. (1988) Changes in hypothalamic temperature

modulate the neuronal response of the ventral thalamus to skin warming in rats. J

Physiol, 398: p. 97-108.

24. Chaouloff F, Hémar A, Manzoni O. (2007)Acute stress facilitates hippocampal CA1

metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression. J Neurosci,.

27(27): p. 7130-5.

25. Chen JX, Tang YT, Yang JX. (2008) Changes of glucocorticoid receptor and levels

of CRF mRNA, POMC mRNA in brain of chronic immobilization stress rats. Cell

Mol Neurobiol, 28(2): p. 237-44.

26. Hunter RG, Bellani R, Bloss E, Costa A, Romeo RD, McEwen BS. (2007)

Regulation of CART mRNA by stress and corticosteroids in the hippocampus and

amygdala. Brain Res,. 1152: p. 234-40.

27. McLaughlin KJ, Gomez JL, Baran SE, Conrad CD. (2007) The effects of chronic

stress on hippocampal morphology and function: an evaluation of chronic restraint

paradigms. Brain Res, 1161: p. 56-64.

28. Scribner KA, Walker CD, Cascio CS, Dallman MF. ( 1991) Chronic streptozotocin

diabetes in rats facilitates the acute stress response without altering pituitary or

adrenal responsiveness to secretagogues. Endocrinology, 129(1): p. 99-108.

29. Willner P, Towell A, Sampson D, Sophokleous S, Muscat R. (1987) Reduction of

sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a

tricyclic antidepressant. Psychopharmacology (Berl), 93(3): p. 358-64.

30. Aguilera G. (1994) Regulation of pituitary ACTH secretion during chronic stress.

Front Neuroendocrinol,. 15(4): p. 321-50.

31. Aguilera G, Rabadan-Diehl C. (2000) Regulation of vasopressin V1b receptors in

the anterior pituitary gland of the rat. Exp Physiol, 85 Spec No: p. 19S-26S.

32. Dallman, M.F. (1993) Stress update Adaptation of the hypothalamic-pituitary-

adrenal axis to chronic stress. Trends Endocrinol Metab, 4(2): p. 62-9.

33. Mezey E, Kiss JZ. (1991) Coexpression of vasopressin and oxytocin in

hypothalamic supraoptic neurons of lactating rats. Endocrinology,. 129(4): p. 1814-

20.

122

34. Ceccatelli S, Eriksson M, Hokfelt T. (1989) Distribution and coexistence of

corticotropin-releasing factor-, neurotensin-, enkephalin-, cholecystokinin-, galanin-

and vasoactive intestinal polypeptide/peptide histidine isoleucine-like peptides in

the parvocellular part of the paraventricular nucleus. Neuroendocrinology, 49(3): p.

309-23.

35. Antoni, FA. (1986) Hypothalamic control of adrenocorticotropin secretion:

advances since the discovery of 41-residue corticotropin-releasing factor. Endocr

Rev, 7(4): p. 351-78.

36. Nagashima H, Asakura M, Hishinuma T, Tanaka D, Fujii S. (2003) Reduction and

sensitization of CRH neuron in rat hypothalamic and extrahypothalamic regions

after chronic variable stress. Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi, 23(1): p.

21-8.

37. Zoumakis E, Makrigiannakis A, Margioris A, Stournaras C, Gravanis A. (1996)

Corticotropin releasing hormone (CRH) in normal and pregnant uterus:

physiological implications. Front Biosci, 1: p. e1-8.

38. Lee KH, Bishop GA, Tian JB, Jang YJ, Bui BC, Nguyen Tle X, Ahn JY, King JS.

(2007) Cellular localization of the full-length isoform of the type 2 corticotropin

releasing factor receptor in the postnatal mouse cerebellar cortex. J Neurosci Res,

85(9): p. 1996-2005.

39. Fekete EM, Zhao Y, Li C, Sabino V, Vale WW, Zorrilla EP. (2009) Social defeat

stress activates medial amygdala cells that express type 2 corticotropin-releasing

factor receptor mRNA. Neuroscience, 162(1): p. 5-13.

40. Behan DP, Grigoriadis DE, Lovenberg T, Chalmers D, Heinrichs S, Liaw C, De

Souza EB. (1996) Neurobiology of corticotropin releasing factor (CRF) receptors

and CRF-binding protein: implications for the treatment of CNS disorders. Mol

Psychiatry, 1(4): p. 265-77.

41. Wong ML, al-Shekhlee A, Bongiorno PB, Esposito A, Khatri P, Sternberg EM,

Gold PW, Licinio J. (1996) Localization of urocortin messenger RNA in rat brain

and pituitary. Mol Psychiatry, 1(4): p. 307-12.

42. Müller MB, Landgraf R, Preil J, Sillaber I, Kresse AE, Keck ME, Zimmermann S,

Holsboer F, Wurst W. (2000) Selective activation of the hypothalamic

vasopressinergic system in mice deficient for the corticotropin-releasing hormone

receptor 1 is dependent on glucocorticoids. Endocrinology, 141(11): p. 4262-9.

43. Müller MB, Zimmermann S, Sillaber I, Hagemeyer TP, Deussing JM, Timpl P,

Kormann MS, Droste SK, Kühn R, Reul JM, Holsboer F, Wurst W. (2003) Limbic

corticotropin-releasing hormone receptor 1 mediates anxiety-related behavior and

hormonal adaptation to stress. Nat Neurosci,. 6(10): p. 1100-7.

44. Preil J, Müller MB, Gesing A, Reul JM, Sillaber I, van Gaalen MM, Landgrebe J,

Holsboer F, Stenzel-Poore M, Wurst W. (2001) Regulation of the hypothalamic-

pituitary-adrenocortical system in mice deficient for CRH receptors 1 and 2.

Endocrinology, 142(11): p. 4946-55.

45. Chida D, Nakagawa S, Nagai S, Sagara H, Katsumata H, Imaki T, Suzuki H, Mitani

F, Ogishima T, Shimizu C, Kotaki H, Kakuta S, Sudo K, Koike T, Kubo M,

Iwakura Y. (2007) Melanocortin 2 receptor is required for adrenal gland

123

development, steroidogenesis, and neonatal gluconeogenesis. Proc Natl Acad Sci U

S A, 104(46): p. 18205-10.

46. Gláz, E., Klinikai Endokrinologia I-II.1981, Budapest: Medicina Könyvkiadó.

47. Patel PD, Lopez JF, Lyons DM, Burke S, Wallace M, Schatzberg AF. (2000)

Glucocorticoid and mineralocorticoid receptor mRNA expression in squirrel

monkey brain. J Psychiatr Res, 34(6): p. 383-92.

48. Charles Groves, D.B., Nicholas J. Marshall, Essential endocrinology 2001: p. 11-

34.

49. Haller J., Mikics E., Makara GB. (2008) The effects of non-genomic glucocorticoid

mechanisms on bodily functions and the central neural system. A critical evaluation

of findings. Front Neuroendocrinol, 29(2): p. 273-91.

50. Mikics, E., Barsy B., Haller J. (2007) The effect glucocorticoids on aggressiveness

in established colonies of rats. Psychoneuroendocrinology, 32(2): p. 160-70.

51. Dallman MF, Akana SF, Cascio CS, Darlington DN, Jacobson L, Levin N. (1987)

Regulation of ACTH secretion: variations on a theme of B. Recent Prog Horm Res,

43: p. 113-73.

52. McEwen BS. (1977) Adrenal steroid feedback on neuroendocrine tissues. Ann N Y

Acad Sci, 297: p. 568-79.

53. Reul JM, Sutanto W, van Eekelen JA, Rothuizen J, de Kloet ER. (1990) Central

action of adrenal steroids during stress and adaptation. Adv Exp Med Biol, 274: p.

243-56.

54. Ratka A, Sutanto W, Bloemers M, de Kloet ER. (1989) On the role of brain

mineralocorticoid (type I) and glucocorticoid (type II) receptors in neuroendocrine

regulation. Neuroendocrinology, 50(2): p. 117-23.

55. Hillhouse EW, Jones MT. (1976) Effect of bilateral adrenalectomy and

corticosteroid therapy on the secretion of corticotrophin-releasing factor activity

from the hypothalamus of the rat in vitro. J Endocrinol, 71(1): p. 21-30.

56. Kovács K, Kiss JZ, Makara GB. (1986) Glucocorticoid implants around the

hypothalamic paraventricular nucleus prevent the increase of corticotropin-releasing

factor and arginine vasopressin immunostaining induced by adrenalectomy.

Neuroendocrinology, 44(2): p. 229-34.

57. Kovacs KJ, Mezey E. (1987) Dexamethasone inhibits corticotropin-releasing factor

gene expression in the rat paraventricular nucleus. Neuroendocrinology, 46(4): p.

365-8.

58. Tornello S, Orti E, De Nicola AF, Rainbow TC, McEwen BS. (1982) Regulation of

glucocorticoid receptors in brain by corticosterone treatment of adrenalectomized

rats. Neuroendocrinology, 35(6): p. 411-7.

59. Herman JP, Cullinan WE, Young EA, Akil H, Watson SJ. (1992) Selective

forebrain fiber tract lesions implicate ventral hippocampal structures in tonic

regulation of paraventricular nucleus corticotropin-releasing hormone (CRH) and

arginine vasopressin (AVP) mRNA expression. Brain Res. 592(1-2): p. 228-38.

60. Sapolsky RM, Armanini MP, Sutton SW, Plotsky PM. (1989) Elevation of

hypophysial portal concentrations of adrenocorticotropin secretagogues after fornix

transection. Endocrinology, 125(6): p. 2881-7.

124

61. Lajtha, A., ed. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology:

Behavioral neurochemistry and neuroendocrinology. 3rd Edition ed., ed. J.D.B.

Abel Lajtha 2007, Springer: New York. 520-522.

62. Scott, LV, Dinan TG. (1998) Vasopressin and the regulation of hypothalamic-

pituitary-adrenal axis function: implications for the pathophysiology of depression.

Life Sci, 62(22): p. 1985-98.

63. de Kloet, ER. (2003) Hormones, brain and stress. Endocr Regul, 37(2): p. 51-68.

64. Martin CE, Cake MH, Hartmann PE, Cook IF. (1977) Relationship between foetal

corticosteroids, maternal progesterone and parturition in the rat. Acta Endocrinol

(Copenh), 84(1): p. 167-76.

65. Walker CD, Perrin M, Vale W, Rivier C. (1986) Ontogeny of the stress response in

the rat: role of the pituitary and the hypothalamus. Endocrinology, 118(4): p. 1445-

51.

66. Sapolsky RM, Meaney MJ. (1986) Maturation of the adrenocortical stress response:

neuroendocrine control mechanisms and the stress hyporesponsive period. Brain

Res, 396(1): p. 64-76.

67. Gunnar, MR, Donzella B. (2002) Social regulation of the cortisol levels in early

human development. Psychoneuroendocrinology, 27(1-2): p. 199-220.

68. Walker CD, Sapolsky RM, Meaney MJ, Vale WW, Rivier CL. (1986) Increased

pituitary sensitivity to glucocorticoid feedback during the stress nonresponsive

period in the neonatal rat. Endocrinology, 119(4): p. 1816-21.

69. Henning, SJ. (1978) Plasma concentrations of total and free corticosterone during

development in the rat. Am J Physiol, 235(5): p. E451-6.

70. Suchecki D, Mozaffarian D, Gross G, Rosenfeld P, Levine S. (1993) Effects of

maternal deprivation on the ACTH stress response in the infant rat.

Neuroendocrinology, 57(2): p. 204-12.

71. Grino M, Burgunder JM, Eskay RL, Eiden LE. (1989) Onset of glucocorticoid

responsiveness of anterior pituitary corticotrophs during development is scheduled

by corticotropin-releasing factor. Endocrinology, 124(6): p. 2686-92.

72. Muret L, Priou A, Oliver C, Grino M. (1992) Stimulation of adrenocorticotropin

secretion by insulin-induced hypoglycemia in the developing rat involves arginine

vasopressin but not corticotropin-releasing factor. Endocrinology, 130(5): p. 2725-

32.

73. Levine, S. (2002) Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the

neonatal rat: the role of maternal behavior. Neurotox Res, 4(5-6): p. 557-564.

74. Avishai-Eliner S, Yi SJ, Newth CJ, Baram TZ. (1995) Effects of maternal and

sibling deprivation on basal and stress induced hypothalamic-pituitary-adrenal

components in the infant rat. Neurosci Lett, 192(1): p. 49-52.

75. Buijs RM. (1978) Intra- and extrahypothalamic vasopressin and oxytocin pathways

in the rat. Pathways to the limbic system, medulla oblongata and spinal cord. Cell

Tissue Res,. 192(3): p. 423-35.

76. Dogterom J, Snijdewint FG, Buijs RM. (1978) The distribution of vasopressin and

oxytocin in the rat brain. Neurosci Lett,. 9(4): p. 341-6.

125

77. Johnson AE, Audigier S, Rossi F, Jard S, Tribollet E, Barberis C. (1993)

Localization and characterization of vasopressin binding sites in the rat brain using

an iodinated linear AVP antagonist. Brain Res, 622(1-2): p. 9-16.

78. Antoni FA, Holmes MC, Makara GB, Kárteszi M, László FA. (1984) Evidence that

the effects of arginine-8-vasopressin (AVP) on pituitary corticotropin (ACTH)

release are mediated by a novel type of receptor. Peptides, 5(3): p. 519-22.

79. Young WS, Li J, Wersinger SR, Palkovits M. (2006) The vasopressin 1b receptor is

prominent in the hippocampal area CA2 where it is unaffected by restraint stress or

adrenalectomy. Neuroscience, 143(4): p. 1031-9.

80. Saito M, Tahara A, Sugimoto T, Abe K, Furuichi K. (2000) Evidence that atypical

vasopressin V(2) receptor in inner medulla of kidney is V(1B) receptor. Eur J

Pharmacol, 401(3): p. 289-96.

81. Michell RH, Kirk CJ, Billah MM. (1979) Hormonal stimulation of

phosphatidylinositol breakdown with particular reference to the hepatic effects of

vasopressin. Biochem Soc Trans, 7(5): p. 861-5.

82. Jard S, Barberis C, Audigier S, Tribollet E. (1987) Neurohypophyseal hormone

receptor systems in brain and periphery. Prog Brain Res, 72: p. 173-87.

83. Kato Y, Igarashi N, Hirasawa A, Tsujimoto G, Kobayashi M. (1995) Distribution

and developmental changes in vasopressin V2 receptor mRNA in rat brain.

Differentiation, 59(3): p. 163-9.

84. Zelena, D. (2008) The Role of Vasopressin in Affective Disorders: Possible Targets

of Intervention. Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry, 8: p. 275-

285.

85. Serradeil-Le Gal C, Bourrié B, Raufaste D, Carayon P, Garcia C, Maffrand JP, Le

Fur G, Casellas P. (1994) Effect of a new, potent, non-peptide V1a vasopressin

antagonist, SR 49059, on the binding and the mitogenic activity of vasopressin on

Swiss 3T3 cells. Biochem Pharmacol, 47(4): p. 633-41.

86. Montero S, Mendoza H, Valles V, Lemus M, Alvarez-Buylla R, de Alvarez-Buylla

ER. (2006) Arginine-vasopressin mediates central and peripheral glucose regulation

in response to carotid body receptor stimulation with Na-cyanide. J Appl Physiol,

100(6): p. 1902-9.

87. Richmond, CA. (2003) The role of arginine vasopressin in thermoregulation during

fever. J Neurosci Nurs, 35(5): p. 281-6.

88. Caldwell HK, Lee HJ, Macbeth AH, Young WS 3rd. (2008) Vasopressin:

behavioral roles of an "original" neuropeptide. Prog Neurobiol, 84(1): p. 1-24.

89. Buijs RM, van Eden CG, Goncharuk VD, Kalsbeek A. (2003) The biological clock

tunes the organs of the body: timing by hormones and the autonomic nervous

system. J Endocrinol, 177(1): p. 17-26.

90. Yang J, Yang Y, Chen JM, Xu HT, Liu WY, Wang CH, Lin BC. (2007) Arginine

vasopressin is an important regulator in antinociceptive modulation of hypothalamic

paraventricular nucleus in the rat. Neuropeptides, 41(3): p. 165-76.

91. Yang J, Chen JM, Liu WY, Song CY, Lin BC. (2006) Through V2, not V1 receptor

relating to endogenous opiate peptides, arginine vasopressin in periaqueductal gray

regulates antinociception in the rat. Regul Pept, 137(3): p. 156-61.

126

92. Ferris CF, Potegal M. (1988) Vasopressin receptor blockade in the anterior

hypothalamus suppresses aggression in hamsters. Physiol Behav, 44(2): p. 235-9.

93. Blanchard RJ, Griebel G, Farrokhi C, Markham C, Yang M, Blanchard DC. (2005)

AVP V1b selective antagonist SSR149415 blocks aggressive behaviors in hamsters.

Pharmacol Biochem Behav, 80(1): p. 189-94.

94. Wersinger SR, Caldwell HK, Christiansen M, Young WS 3rd. (2007) Disruption of

the vasopressin 1b receptor gene impairs the attack component of aggressive

behavior in mice. Genes Brain Behav, 6(7): p. 653-60.

95. Wersinger SR, Caldwell HK, Christiansen M, Young WS 3rd. (2007) Vasopressin

1a receptor knockout mice have a subtle olfactory deficit but normal aggression.

Genes Brain Behav, 6(6): p. 540-51.

96. Insel TR, Wang ZX, Ferris CF. (1994) Patterns of brain vasopressin receptor

distribution associated with social organization in microtine rodents. J Neurosci,.

14(9): p. 5381-92.

97. Wang Z, Ferris CF, De Vries GJ. (1994) Role of septal vasopressin innervation in

paternal behavior in prairie voles (Microtus ochrogaster). Proc Natl Acad Sci U S

A, 91(1): p. 400-4.

98. Tobin VA, Hashimoto H, Wacker DW, Takayanagi Y, Langnaese K, Caquineau C,

Noack J, Landgraf R, Onaka T, Leng G, Meddle SL, Engelmann M, Ludwig M.

(2010) An intrinsic vasopressin system in the olfactory bulb is involved in social

recognition. Nature, 464(7287): p. 413-7.

99. Engelmann M, Landgraf R. (1994) Microdialysis administration of vasopressin into

the septum improves social recognition in Brattleboro rats. Physiol Behav, 55(1): p.

145-9.

100. Wersinger SR, Kelliher KR, Zufall F, Lolait SJ, O'Carroll AM, Young WS 3rd.

(2004) Social motivation is reduced in vasopressin 1b receptor null mice despite

normal performance in an olfactory discrimination task. Horm Behav, 46(5): p. 638-

45.

101. De Wied D. (1965) The influence of the posterior and intermediate lobe of the

pituitary and pituitary peptides on the maintenance of a conditioned avoidance

response in rats. Int J Neuropharmacol, 4: p. 157-67.

102. Alescio-Lautier B, Rao H, Paban V, Devigne C, Soumireu-Mourat B. (1995)

Inhibition of the vasopressin-enhancing effect on memory retrieval and relearning

by a vasopressin V1 receptor antagonist in mice. Eur J Pharmacol,. 294(2-3): p.

763-70.

103. Aarde SM, Jentsch JD. (2006) Haploinsufficiency of the arginine-vasopressin gene

is associated with poor spatial working memory performance in rats. Horm Behav,

49(4): p. 501-8.

104. Turkelson CM, Thomas CR, Arimura A, Chang D, Chang JK, Shimizu M. (1982) In

vitro potentiation of the activity of synthetic ovine corticotropin-releasing factor by

arginine vasopressin. Peptides, 3(2): p. 111-3.

105. Abou-Samra AB, Harwood JP, Catt KJ, Aguilera G. (1987) Mechanisms of action

of CRF and other regulators of ACTH release in pituitary corticotrophs. Ann N Y

Acad Sci,. 512: p. 67-84.

127

106. Hisano S, Tsuruo Y, Katoh S, Daikoku S, Yanaihara N, Shibasaki T. (1987)

Intragranular colocalization of arginine vasopressin and methionine-enkephalin-

octapeptide in CRF-axons in the rat median eminence. Cell Tissue Res, 249(3): p.

497-507.

107. Whitnall MH, Key S, Gainer H. (1987) Vasopressin-containing and vasopressin-

deficient subpopulations of corticotropin-releasing factor axons are differentially

affected by adrenalectomy. Endocrinology, 120(5): p. 2180-2.

108. Ma XM, Levy A, Lightman SL. (1997) Rapid changes in heteronuclear RNA for

corticotrophin-releasing hormone and arginine vasopressin in response to acute

stress. J Endocrinol, 152(1): p. 81-9.

109. Bartanusz V, Jezova D, Bertini LT, Tilders FJ, Aubry JM, Kiss JZ. (1993) Stress-

induced increase in vasopressin and corticotropin-releasing factor expression in

hypophysiotrophic paraventricular neurons. Endocrinology, 132(2): p. 895-902.

110. Holmes MC, Antoni FA, Aguilera G, Catt KJ. (1986) Magnocellular axons in

passage through the median eminence release vasopressin. Nature, 319(6051): p.

326-9.

111. Whitnall MH, Smyth D, Gainer H. (1987) Vasopressin coexists in half of the

corticotropin-releasing factor axons present in the external zone of the median

eminence in normal rats. Neuroendocrinology, 45(5): p. 420-4.

112. Laguna-Abreu MT, Margatho L, Germano CM, Antunes-Rodrigues J, Elias LL, de

Castro M. (2007) The effect of adrenalectomy on Fos expression in

vasopressinergic and oxytocinergic neurons in response to stress in the rat. Stress,

10(4): p. 332-41.

113. Tilders FJ, Berkenbosch F, Vermes I, Linton EA, Smelik PG. (1985) Role of

epinephrine and vasopressin in the control of the pituitary-adrenal response to

stress. Fed Proc, 44(1 Pt 2): p. 155-60.

114. Ono N, Bedran de Castro J, Khorram O, McCann SM. (1985) Role of arginine

vasopressin in control of ACTH and LH release during stress. Life Sci, 36(18): p.

1779-86.

115. Tanoue A, Ito S, Honda K, Oshikawa S, Kitagawa Y, Koshimizu TA, Mori T,

Tsujimoto G. (2004) The vasopressin V1b receptor critically regulates

hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity under both stress and resting

conditions. J Clin Invest, 113(2): p. 302-9.

116. Lolait SJ, Stewart LQ, Roper JA, Harrison G, Jessop DS, Young WS 3rd, O'Carroll

AM. (2007) Attenuated stress response to acute lipopolysaccharide challenge and

ethanol administration in vasopressin V1b receptor knockout mice. J

Neuroendocrinol, 19(7): p. 543-51.

117. Serradeil-Le Gal C, Wagnon J, Simiand J, Griebel G, Lacour C, Guillon G, Barberis

C, Brossard G, Soubrié P, Nisato D, Pascal M, Pruss R, Scatton B, Maffrand JP, Le

Fur G. (2002) Characterization of (2S,4R)-1-[5-chloro-1-[(2,4-

dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-methoxy-phenyl)-2-oxo- 2,3-dihydro-1H-indol-3-

yl]-4-hydroxy-N,N-dimethyl-2-pyrrolidine carboxamide (SSR149415), a selective

and orally active vasopressin V1b receptor antagonist. J Pharmacol Exp Ther,

300(3): p. 1122-30.

128

118. Ramos AT, Troncone LR, Tufik S. (2006) Suppression of adrenocorticotrophic

hormone secretion by simultaneous antagonism of vasopressin 1b and CRH-1

receptors on three different stress models. Neuroendocrinology, 84(5): p. 309-16.

119. Valtin H, Schroeder HA. (1964) Familiar hypothalamic diabetes insipidus in rats

(Brattleboro strain). Am J Physiol, 206: p. 425-30.

120. Lolait SJ, Markwick AJ, McNally M, Abraham J, Smith AI, Funder JW. (1986)

Anterior pituitary cells from Brattleboro (di/di), Long-Evans and Sprague-Dawley

rats contain immunoreactive arginine vasopressin. Neuroendocrinology, 43(5): p.

577-83.

121. Surget A, Belzung C. (2008) Involvement of vasopressin in affective disorders. Eur

J Pharmacol, 583(2-3): p. 340-9.

122. El Yacoubi M, Vaugeois JM. (2007) Genetic rodent models of depression. Curr

Opin Pharmacol, 7(1): p. 3-7.

123. Porsolt RD, Anton G, Blavet N, Jalfre M. (1978) Behavioural despair in rats: a new

model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol, 47(4): p. 379-91.

124. Wotjak CT, Ganster J, Kohl G, Holsboer F, Landgraf R, Engelmann M. (1998)

Dissociated central and peripheral release of vasopressin, but not oxytocin, in

response to repeated swim stress: new insights into the secretory capacities of

peptidergic neurons. Neuroscience, 85(4): p. 1209-22.

125. Ebner K, Wotjak CT, Holsboer F, Landgraf R, Engelmann M. (1999) Vasopressin

released within the septal brain area during swim stress modulates the behavioural

stress response in rats. Eur J Neurosci, 11(3): p. 997-1002.

126. Ebner K, Wotjak CT, Landgraf R, Engelmann M. (2002) Forced swimming triggers

vasopressin release within the amygdala to modulate stress-coping strategies in rats.

Eur J Neurosci, 15(2): p. 384-8.

127. Griebel G, Simiand J, Serradeil-Le Gal C, Wagnon J, Pascal M, Scatton B,

Maffrand JP, Soubrie P. (2002) Anxiolytic- and antidepressant-like effects of the

non-peptide vasopressin V1b receptor antagonist, SSR149415, suggest an

innovative approach for the treatment of stress-related disorders. Proc Natl Acad Sci

U S A, 99(9): p. 6370-5.

128. Mlynarik M, Zelena D, Bagdy G, Makara GB, Jezova D. (2007) Signs of attenuated

depression-like behavior in vasopressin deficient Brattleboro rats. Horm Behav,

51(3): p. 395-405.

129. Schank, JC. (2009) Early locomotor and social effects in vasopressin deficient

neonatal rats. Behav Brain Res, 197(1): p. 166-77.

130. Keck ME, Welt T, Müller MB, Uhr M, Ohl F, Wigger A, Toschi N, Holsboer F,

Landgraf R. (2003) Reduction of hypothalamic vasopressinergic hyperdrive

contributes to clinically relevant behavioral and neuroendocrine effects of chronic

paroxetine treatment in a psychopathological rat model.

Neuropsychopharmacology, 28(2): p. 235-43.

131. Wigger A, Sánchez MM, Mathys KC, Ebner K, Frank E, Liu D, Kresse A,

Neumann ID, Holsboer F, Plotsky PM, Landgraf R. (2004) Alterations in central

neuropeptide expression, release, and receptor binding in rats bred for high anxiety:

critical role of vasopressin. Neuropsychopharmacology, 29(1): p. 1-14.

129

132. Cryan JF, Slattery DA. (2007) Animal models of mood disorders: Recent

developments. Curr Opin Psychiatry, 20(1): p. 1-7.

133. Landgraf R, Kessler MS, Bunck M, Murgatroyd C, Spengler D, Zimbelmann M,

Nussbaumer M, Czibere L, Turck CW, Singewald N, Rujescu D, Frank E. (2007)

Candidate genes of anxiety-related behavior in HAB/LAB rats and mice: focus on

vasopressin and glyoxalase-I. Neurosci Biobehav Rev, 31(1): p. 89-102.

134. Bielsky IF, Hu SB, Szegda KL, Westphal H, Young LJ. (2004) Profound

impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in

vasopressin V1a receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology, 29(3): p.

483-93.

135. Egashira N, Tanoue A, Matsuda T, Koushi E, Harada S, Takano Y, Tsujimoto G,

Mishima K, Iwasaki K, Fujiwara M. (2007) Impaired social interaction and reduced

anxiety-related behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice. Behav Brain

Res, 178(1): p. 123-7.

136. Bielsky IF, Hu SB, Ren X, Terwilliger EF, Young LJ. (2005) The V1a vasopressin

receptor is necessary and sufficient for normal social recognition: a gene

replacement study. Neuron, 47(4): p. 503-13.

137. Amico JA, Vollmer RR, Karam JR, Lee PR, Li X, Koenig JI, McCarthy MM.

(2004) Centrally administered oxytocin elicits exaggerated grooming in oxytocin

null mice. Pharmacol Biochem Behav, 78(2): p. 333-9.

138. Landgraf R, Gerstberger R, Montkowski A, Probst JC, Wotjak CT, Holsboer F,

Engelmann M. (1995) V1 vasopressin receptor antisense oligodeoxynucleotide into

septum reduces vasopressin binding, social discrimination abilities, and anxiety-

related behavior in rats. J Neurosci, 15(6): p. 4250-8.

139. Liebsch G, Wotjak CT, Landgraf R, Engelmann M. (1996) Septal vasopressin

modulates anxiety-related behaviour in rats. Neurosci Lett, 217(2-3): p. 101-4.

140. Appenrodt E, Schnabel R, Schwarzberg H. (1998) Vasopressin administration

modulates anxiety-related behavior in rats. Physiol Behav, 64(4): p. 543-7.

141. Caldwell HK, Stewart J, Wiedholz LM, Millstein RA, Iacangelo A, Holmes A,

Young WS 3rd, Wersinger SR. (2006) The acute intoxicating effects of ethanol are

not dependent on the vasopressin 1a or 1b receptors. Neuropeptides, 40(5): p. 325-

37.

142. Stemmelin J, Lukovic L, Salome N, Griebel G. (2005) Evidence that the lateral

septum is involved in the antidepressant-like effects of the vasopressin V1b receptor

antagonist, SSR149415. Neuropsychopharmacology, 30(1): p. 35-42.

143. Salomé N, Stemmelin J, Cohen C, Griebel G. (2006) Differential roles of

amygdaloid nuclei in the anxiolytic- and antidepressant-like effects of the V1b

receptor antagonist, SSR149415, in rats. Psychopharmacology (Berl), 187(2): p.

237-44.

144. de Bree FM, Burbach JP. (1998) Structure-function relationships of the vasopressin

prohormone domains. Cell Mol Neurobiol, 18(2): p. 173-91.

145. Schmale H, Richter D. (1984) Single base deletion in the vasopressin gene is the

cause of diabetes insipidus in Brattleboro rats. Nature, 308(5961): p. 705-9.

130

146. Schmale H, Borowiak B, Holtgreve-Grez H, Richter D. (1989) Impact of altered

protein structures on the intracellular traffic of a mutated vasopressin precursor

from Brattleboro rats. Eur J Biochem, 182(3): p. 621-7.

147. Bohus B, de Wied D. (1998) The vasopressin deficient Brattleboro rats: a natural

knockout model used in the search for CNS effects of vasopressin. Prog Brain Res,

119: p. 555-73.

148. Zelena D, Mergl Z, Makara GB. (2003) Maternal genotype influences stress

reactivity of vasopressin-deficient brattleboro rats. J Neuroendocrinol, 15(12): p.

1105-10.

149. Zelena D, Kiem DT, Barna I, Makara GB. (1999) Alpha 2-adrenoreceptor subtypes

regulate ACTH and beta-endorphin secretions during stress in the rat.

Psychoneuroendocrinology, 24(3): p. 333-43.

150. Brooker G, Harper JF, Terasaki WL, Moylan RD. (1979) Radioimmunoassay of

cyclic AMP and cyclic GMP. Advances in cyclic nucleotide research, 10: p. 1-33.

151. Mergl Z, Acs Z, Makara GB. (1995) Growth hormone secretion and activation of

cyclic AMP by growth hormone releasing hormone and gamma-aminobutyric acid

in the neonatal rat pituitary. Life Sci, 56(8): p. 579-85.

152. Barna I, Bálint E, Baranyi J, Bakos N, Makara GB, Haller J. (2003) Gender-specific

effect of maternal deprivation on anxiety and corticotropin-releasing hormone

mRNA expression in rats. Brain Res Bull, 62(2): p. 85-91.

153. Acs Z, Szabó B, Kapócs G, Makara GB. (1987) gamma-Aminobutyric acid

stimulates pituitary growth hormone secretion in the neonatal rat. A superfusion

study. Endocrinology, 120(5): p. 1790-8.

154. Barna I, Zelena D, Arszovszki AC, Ledent C. (2004) The role of endogenous

cannabinoids in the hypothalamo-pituitary-adrenal axis regulation: in vivo and in

vitro studies in CB1 receptor knockout mice. Life Sci, 75(24): p. 2959-70.

155. Zelena D, Domokos A, Jain SK, Jankord R, Filaretova L. (2009) The stimuli-

specific role of vasopressin in the hypothalamus-pituitary-adrenal axis response to

stress. J Endocrinol, 202(2): p. 263-78.

156. Haller J, Leveleki C, Baranyi J, Mikics E, Bakos N. (2003) Stress, social avoidance

and anxiolytics: a potential model of stress-induced anxiety. Behav Pharmacol,

14(5-6): p. 439-46.

157. Zelena D, Langnaese K, Domokos A, Pintér O, Landgraf R, Makara GB,

Engelmann M. (2009) Vasopressin administration into the paraventricular nucleus

normalizes plasma oxytocin and corticosterone levels in Brattleboro rats.

Endocrinology, 150(6): p. 2791-8.

158. Horn TF, Engelmann M. (2001) In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain-

-a practical guide. Methods,. 23(1): p. 41-53.

159. Domokos A, Mergl Z, Barna I, Makara GB, Zelena D. (2008) Congenital

vasopressin deficiency and acute and chronic opiate effects on hypothalamo-

pituitary-adrenal axis activity in Brattleboro rats. J Endocrinol, 196(1): p. 113-21.

160. Houshyar H, Cooper ZD, Woods JH. (2001) Paradoxical effects of chronic

morphine treatment on the temperature and pituitary-adrenal responses to acute

restraint stress: a chronic stress paradigm. J Neuroendocrinol, 13(10): p. 862-74.

131

161. Houshyar H, Galigniana MD, Pratt WB, Woods JH. (2001) Differential responsivity

of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis to glucocorticoid negative-feedback and

corticotropin releasing hormone in rats undergoing morphine withdrawal: possible

mechanisms involved in facilitated and attenuated stress responses. J

Neuroendocrinol, 13(10): p. 875-86.

162. Zelena, D., A. Domokos,Z. Mergl, The Role of Vasopressin in Chronic Stress-

induced Hypothalamo-Pituitary-Adrenal Axis Hyperactivity: Studies on Brattleboro

Rats with repeated restraint. . in Neuropeptide Research Trends, Nova Publishers,

2007. Chapter VII.: p. 189-212.

163. Varga J, Domokos A, Barna I, Jankord R, Bagdy G, Zelena D. (2011) Lack of

vasopressin does not prevent the behavioural and endocrine changes induced by

chronic unpredictable stress. Brain Res Bull, 84(1): p. 45-52.

164. Zelena D, Domokos A, Barna I, Mergl Z, Haller J, Makara GB. (2008) Control of

the hypothalamo-pituitary-adrenal axis in the neonatal period: adrenocorticotropin

and corticosterone stress responses dissociate in vasopressin-deficient brattleboro

rats. Endocrinology, 149(5): p. 2576-83.

165. Barna I, Acs Z, Koenig JI. (1993) Effects of Hypnorm (fentanyl) on ACTH/beta-

endorphin levels in plasma, pituitary and brain of 10-day old rats. Life Sci, 52(17):

p. 1417-24.

166. Makara GB, Domokos A, Mergl Z, Csabai K, Barna I, Zelena D. (2008) Gender-

specific regulation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the role of

vasopressin during the neonatal period. Ann N Y Acad Sci, 1148: p. 439-45.

167. Herman JP, Prewitt CM, Cullinan WE. (1996) Neuronal circuit regulation of the

hypothalamo-pituitary-adrenocortical stress axis. Crit Rev Neurobiol,. 10(3-4): p.

371-94.

168. Wiley MK, Pearlmutter AF, Miller RE. (1974) Decreased adrenal sensitivity to

ACTH in the vasopressin-deficient (Brattleboro) rat. Neuroendocrinology, 14(5): p.

257-70.

169. Brudieux R, Krifi MN, Laulin JP. (1986) Release of aldosterone and corticosterone

from the adrenal cortex of the Brattleboro rat in response to administration of

ACTH. J Endocrinol, 111(3): p. 375-81.

170. Spiga F, Harrison LR, Wood S, Knight DM, MacSweeney CP, Thomson F,

Craighead M, Lightman SL. (2009) Blockade of the V(1b) receptor reduces ACTH,

but not corticosterone secretion induced by stress without affecting basal

hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity. J Endocrinol, 200(3): p. 273-83.

171. Stewart LQ, Roper JA, Young WS 3rd, O'Carroll AM, Lolait SJ. (2008)Pituitary-

adrenal response to acute and repeated mild restraint, forced swim and change in

environment stress in arginine vasopressin receptor 1b knockout mice. J

Neuroendocrinol, 20(5): p. 597-605.

172. Bornstein SR, Engeland WC, Ehrhart-Bornstein M, Herman JP. (2008) Dissociation

of ACTH and glucocorticoids. Trends Endocrinol Metab, 19(5): p. 175-80.

173. Elifanov AV, Polenov AL, Belen'kiĭ MA, Kuzik VV. (1988) Morphofunctional

research on the interrenal gland of the frog Rana temporaria following arginine

vasotocin administration. Zh Evol Biokhim Fiziol, 24(5): p. 740-4.

132

174. Lightman SL, Young WS 3rd. (1988) Corticotrophin-releasing factor, vasopressin

and pro-opiomelanocortin mRNA responses to stress and opiates in the rat. J

Physiol, 403: p. 511-23.

175. Popova NK, Naumenko KS, Maslova LN, Amstislavskaya TG, Melidi NN,

Bulygina VV, Ivanova LN. (2002) Hypothalamic tryptophan hydroxylase and the

hypothalamic-pituitary-adrenocortical response to water deprivation and hydration

in vasopressin-deficient and normal rats. Pflugers Arch, 444(3): p. 372-7.

176. Schlosser SF, Almeida OF, Patchev VK, Yassouridis A, Elands J. (1994) Oxytocin-

stimulated release of adrenocorticotropin from the rat pituitary is mediated by

arginine vasopressin receptors of the V1b type. Endocrinology,135(5): p. 2058-63.

177. Lewandowska A, Głowacka A, Guzek JW. (1992) The vasopressin and oxytocin

neurohypophysial content as influenced by bleeding or dehydration: effect of

cholecystokinin octapeptide. J Physiol Pharmacol, 43(2): p. 153-63.

178. Lipińska S, Foryś S, Lipińska J. (2004) The post-haemorrhagic vasopressin release

into the blood. J Physiol Pharmacol, 55(1 Pt 1): p. 73-83.

179. Földes A, Némethy Z, Szalay O, Kovács KJ. (2000) Anaphylactoid reactions

activate hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis: comparison with endotoxic

reactions. Brain Res Bull, 52(6): p. 573-9.

180. Plotsky PM, Bruhn TO, Otto S. (1985) Central modulation of immunoreactive

arginine vasopressin and oxytocin secretion into the hypophysial-portal circulation

by corticotropin-releasing factor. Endocrinology, 116(4): p. 1669-71.

181. Fujiwara Y, Hiroyama M, Sanbe A, Aoyagi T, Birumachi J, Yamauchi J, Tsujimoto

G, Tanoue A. (2007) Insulin hypersensitivity in mice lacking the V1b vasopressin

receptor. J Physiol, 584(Pt 1): p. 235-44.

182. Zelena D, Filaretova L, Mergl Z, Barna I, Tóth ZE, Makara GB. (2006)

Hypothalamic paraventricular nucleus, but not vasopressin, participates in chronic

hyperactivity of the HPA axis in diabetic rats. Am J Physiol Endocrinol Metab,

290(2): p. E243-50.

183. Zelena D, Földes A, Mergl Z, Barna I, Kovács KJ, Makara GB. (2004) Effects of

repeated restraint stress on hypothalamo-pituitary-adrenocortical function in

vasopressin deficient Brattleboro rats. Brain Res Bull, 63(6): p. 521-30.

184. Itagaki E, Ozawa S, Yamaguchi S, Ushikawa K, Tashiro T, Katahira H, Takizawa

M, Yoshimoto K, Murakawa S, Ishida H. (2001) Increases in plasma ACTH and

cortisol after hypertonic saline infusion in patients with central diabetes insipidus. J

Clin Endocrinol Metab, 86(12): p. 5749-54.

185. Buckingham JC. (1981) The influence of vasopressin on hypothalamic

corticotrophin releasing activity in rats with inherited diabetes insipidus. J Physiol,

312: p. 9-16.

186. Buckingham JC, Leach JH. (1980) Hypothalamo-pituitary-adrenocortical function

in rats with inherited diabetes insipidus. J Physiol, 305: p. 397-404.

187. Kjaer A, Knigge U, Bach FW, Warberg J. (1993) Impaired histamine- and stress-

induced secretion of ACTH and beta-endorphin in vasopressin-deficient Brattleboro

rats. Neuroendocrinology, 57(6): p. 1035-41.

188. Kvetnansky R, Mikulaj L. (1970) Adrenal and urinary catecholamines in rats during

adaptation to repeated immobilization stress. Endocrinology, 87(4): p. 738-43.

133

189. Burgess LH, Handa RJ. (1992) Chronic estrogen-induced alterations in

adrenocorticotropin and corticosterone secretion, and glucocorticoid receptor-

mediated functions in female rats. Endocrinology, 131(3): p. 1261-9.

190. Correa FM, Saavedra JM. (1983) High histamine levels in specific hypothalamic

nuclei of Brattleboro rats lacking vasopressin. Brain Res, 276(2): p. 247-52.

191. Saez JM, Begeot M, Durand P. (1989) [ACTH receptors]. Ann Endocrinol (Paris),

50(5): p. 409-17.

192. Voisey J, Carroll L, van Daal A. (2003) Melanocortins and their receptors and

antagonists. Curr Drug Targets, 4(7): p. 586-97.

193. Boston BA, Cone RD. (1996) Characterization of melanocortin receptor subtype

expression in murine adipose tissues and in the 3T3-L1 cell line. Endocrinology,

137(5): p. 2043-50.

194. Kapas S, Hagi-Pavli E, Brown DW, Chhajlani V, Farthing PM. (1998) Direct

effects of corticotrophin on oral keratinocyte cell proliferation. Eur J Biochem,

256(1): p. 75-9.

195. Nankova B, Kvetnansky R, Hiremagalur B, Sabban B, Rusnak M, Sabban EL.

(1996) Immobilization stress elevates gene expression for catecholamine

biosynthetic enzymes and some neuropeptides in rat sympathetic ganglia: effects of

adrenocorticotropin and glucocorticoids. Endocrinology, 137(12): p. 5597-604.

196. Weigent DA, Blalock JE. (1987) Interactions between the neuroendocrine and

immune systems: common hormones and receptors. Immunol Rev, 100: p. 79-108.

197. Murphy HM, Wideman CH. (1982) Basic alterations in serum levels of several

chemical substances in Brattleboro rats. Ann N Y Acad Sci, 394: p. 270-4.

198. Horn AM, Robinson IC, Fink G. (1985) Oxytocin and vasopressin in rat

hypophysial portal blood: experimental studies in normal and Brattleboro rats. J

Endocrinol, 104(2): p. 211-24.

199. Edwards BR, LaRochelle FT Jr. (1984) Antidiuretic effect of endogenous oxytocin

in dehydrated Brattleboro homozygous rats. Am J Physiol, 247(3 Pt 2): p. F453-65.

200. Engelmann M, Ludwig M. (2004) The activity of the hypothalamo-

neurohypophysial system in response to acute stressor exposure: neuroendocrine

and electrophysiological observations. Stress,. 7(2): p. 91-6.

201. Jezová D, Michajlovskij N, Kvetnanský R, Makara GB. (1993) Paraventricular and

supraoptic nuclei of the hypothalamus are not equally important for oxytocin release

during stress. Neuroendocrinology, 57(5): p. 776-81.

202. Stachowiak A, Macchi C, Nussdorfer GG, Malendowicz LK. (1995) Effects of

oxytocin on the function and morphology of the rat adrenal cortex: in vitro and in

vivo investigations. Res Exp Med (Berl), 195(5): p. 265-74.

203. Swanson LW, Kuypers HG. (1980) The paraventricular nucleus of the

hypothalamus: cytoarchitectonic subdivisions and organization of projections to the

pituitary, dorsal vagal complex, and spinal cord as demonstrated by retrograde

fluorescence double-labeling methods. J Comp Neurol, 194(3): p. 555-70.

204. Wotjak CT, Naruo T, Muraoka S, Simchen R, Landgraf R, Engelmann M. (2001)

Forced swimming stimulates the expression of vasopressin and oxytocin in

magnocellular neurons of the rat hypothalamic paraventricular nucleus. Eur J

Neurosci,. 13(12): p. 2273-81.

134

205. Wotjak CT, Kubota M, Liebsch G, Montkowski A, Holsboer F, Neumann I,

Landgraf R. (1996) Release of vasopressin within the rat paraventricular nucleus in

response to emotional stress: a novel mechanism of regulating adrenocorticotropic

hormone secretion? J Neurosci, 16(23): p. 7725-32.

206. Neumann ID, Krömer SA, Toschi N, Ebner K. (2000) Brain oxytocin inhibits the

(re)activity of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis in male rats: involvement of

hypothalamic and limbic brain regions. Regul Pept, 96(1-2): p. 31-8.

207. Neumann ID, Wigger A, Torner L, Holsboer F, Landgraf R. (2000) Brain oxytocin

inhibits basal and stress-induced activity of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis

in male and female rats: partial action within the paraventricular nucleus. J

Neuroendocrinol, 12(3): p. 235-43.

208. Loichot C, Krieger JP, De Jong W, Nisato D, Imbs JL, Barthelmebs M. (2001) High

concentrations of oxytocin cause vasoconstriction by activating vasopressin V1A

receptors in the isolated perfused rat kidney. Naunyn Schmiedebergs Arch

Pharmacol, 363(4): p. 369-75.

209. Vaccari C, Lolait SJ, Ostrowski NL. (1998) Comparative distribution of vasopressin

V1b and oxytocin receptor messenger ribonucleic acids in brain. Endocrinology,

139(12): p. 5015-33.

210. Buckingham JC, Cooper TA. (1984) Differences in hypothalamo-pituitary-

adrenocortical activity in the rat after acute and prolonged treatment with morphine.

Neuroendocrinology, 38(5): p. 411-7.

211. Houshyar H, Gomez F, Manalo S, Bhargava A, Dallman MF. (2003) Intermittent

morphine administration induces dependence and is a chronic stressor in rats.

Neuropsychopharmacology, 28(11): p. 1960-72.

212. Zhou Y, Leri F, Cummins E, Hoeschele M, Kreek MJ. 2008 Involvement of

arginine vasopressin and V1b receptor in heroin withdrawal and heroin seeking

precipitated by stress and by heroin. Neuropsychopharmacology,. 33(2): p. 226-36.

213. Coventry TL, Jessop DS, Finn DP, Crabb MD, Kinoshita H, Harbuz MS. (2001)

Endomorphins and activation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. J

Endocrinol, 169(1): p. 185-93.

214. Maldonado R, Stinus L, Gold LH, Koob GF. (1992) Role of different brain

structures in the expression of the physical morphine withdrawal syndrome. J

Pharmacol Exp Ther, 261(2): p. 669-77.

215. McNally GP, Akil H. (2002) Role of corticotropin-releasing hormone in the

amygdala and bed nucleus of the stria terminalis in the behavioral, pain modulatory,

and endocrine consequences of opiate withdrawal. Neuroscience, 112(3): p. 605-17.

216. Höllt V, Haarmann I. (1985) Differential alterations by chronic treatment with

morphine of pro-opiomelanocortin mRNA levels in anterior as compared to

intermediate pituitary lobes of rats. Neuropeptides, 5(4-6): p. 481-4.

217. Zelena D, Mergl Z, Makara GB. (2005) Glutamate agonists activate the

hypothalamic-pituitary-adrenal axis through hypothalamic paraventricular nucleus

but not through vasopressinerg neurons. Brain Res, 1031(2): p. 185-93.

218. Buckingham JC. (1987) Vasopressin receptors influencing the secretion of ACTH

by the rat adenohypophysis. J Endocrinol, 113(3): p. 389-96.

135

219. Laulin JP, Ezzarani EA, Brudieux R. (1985) Production of corticosterone in male

homozygous Brattleboro rats. Horm Metab Res, 17(7): p. 342-5.

220. Reghunandanan V, Reghunandanan R, Marya RK. (1991) Vasopressin: its possible

role in circadian time keeping. Chronobiologia, 18(1): p. 39-47.

221. Schröder H, Stehle J, Henschel M. (1988) Twenty-four-hour pineal melatonin

synthesis in the vasopressin-deficient Brattleboro rat. Brain Res, 459(2): p. 328-32.

222. Tankosic P, Burlet A, Jegou S, Chateau M, Vaudry H, Burlet C, Boulangé M.

(1982) Fetal and postnatal maturation of corticotrope function in the vasopressin-

deficient rat (Brattleboro strain): a radioimmunological, immunocytochemical, and

morphometric study. Ann N Y Acad Sci, 394: p. 560-73.

223. Ma XM, Lightman SL, Aguilera G. (1999) Vasopressin and corticotropin-releasing

hormone gene responses to novel stress in rats adapted to repeated restraint.

Endocrinology, 140(8): p. 3623-32.

224. Makino S, Smith MA, Gold PW. (1995) Increased expression of corticotropin-

releasing hormone and vasopressin messenger ribonucleic acid (mRNA) in the

hypothalamic paraventricular nucleus during repeated stress: association with

reduction in glucocorticoid receptor mRNA levels. Endocrinology, 136(8): p. 3299-

309.

225. Reul JM, Labeur MS, Wiegers GJ, Linthorst AC. (1998) Altered

neuroimmunoendocrine communication during a condition of chronically increased

brain corticotropin-releasing hormone drive. Ann N Y Acad Sci,. 840: p. 444-55.

226. Miyata S, Itoh T, Matsushima O, Nakashima T, Kiyohara T. (1994) Not only

osmotic stress but also repeated restraint stress causes structural plasticity in the

supraoptic nucleus of the rat hypothalamus. Brain Res Bull, 33(6): p. 669-75.

227. Gregus A, Wintink AJ, Davis AC, Kalynchuk LE. (2005) Effect of repeated

corticosterone injections and restraint stress on anxiety and depression-like behavior

in male rats. Behav Brain Res, 156(1): p. 105-14.

228. Korte SM. (2001) Corticosteroids in relation to fear, anxiety and psychopathology.

Neurosci Biobehav Rev,. 25(2): p. 117-42.

229. Serradeil-Le Gal C, Wagnon J, Valette G, Garcia G, Pascal M, Maffrand JP, Le Fur

G. (2002) Nonpeptide vasopressin receptor antagonists: development of selective

and orally active V1a, V2 and V1b receptor ligands. Prog Brain Res, 139: p. 197-

210.

230. Cilia J, Gartlon JE, Shilliam C, Dawson LA, Moore SH, Jones DN. (2010) Further

neurochemical and behavioural investigation of Brattleboro rats as a putative model

of schizophrenia. J Psychopharmacol, 24(3): p. 407-19.

231. McCormick CM, Smith C, Mathews IZ. (2008) Effects of chronic social stress in

adolescence on anxiety and neuroendocrine response to mild stress in male and

female rats. Behav Brain Res, 187(2): p. 228-38.

232. Gameiro GH, Gameiro PH, Andrade Ada S, Pereira LF, Arthuri MT, Marcondes

FK, Veiga MC. (2006) Nociception- and anxiety-like behavior in rats submitted to

different periods of restraint stress. Physiol Behav, 87(4): p. 643-9.

233. Homberg JR, van den Akker M, Raasø HS, Wardeh G, Binnekade R, Schoffelmeer

AN, de Vries TJ. (2002) Enhanced motivation to self-administer cocaine is

136

predicted by self-grooming behaviour and relates to dopamine release in the rat

medial prefrontal cortex and amygdala. Eur J Neurosci, 15(9): p. 1542-50.

234. van Erp AM, Kruk MR, Meelis W, Willekens-Bramer DC. (1994) Effect of

environmental stressors on time course, variability and form of self-grooming in the

rat: handling, social contact, defeat, novelty, restraint and fur moistening. Behav

Brain Res, 65(1): p. 47-55.

235. Bagdy G, Graf M, Anheuer ZE, Modos EA, Kantor S. (2001) Anxiety-like effects

induced by acute fluoxetine, sertraline or m-CPP treatment are reversed by

pretreatment with the 5-HT2C receptor antagonist SB-242084 but not the 5-HT1A

receptor antagonist WAY-100635. Int J Neuropsychopharmacol, 4(4): p. 399-408.

236. Homberg JR, Arends B, Wardeh G, Raasø HS, Schoffelmeer AN, de Vries TJ.,

(2004) Individual differences in the effects of serotonergic anxiolytic drugs on the

motivation to self-administer cocaine. Neuroscience,. 128(1): p. 121-30.

237. Moody TW, Merali Z, Crawley JN. (1988) The effects of anxiolytics and other

agents on rat grooming behavior. Ann N Y Acad Sci, 525: p. 281-90.

238. Scott LV, Dinan TG. (2002) Vasopressin as a target for antidepressant

development: an assessment of the available evidence. J Affect Disord, 72(2): p.

113-24.

239. Landgraf R, Wigger A. (2003) Born to be anxious: neuroendocrine and genetic

correlates of trait anxiety in HAB rats. Stress, 6(2): p. 111-9.

240. Zelena, D. (2009) Yin-Yang Neuropeptides In Depression. Frontiers in

Neuroscience, 3: p. 250-251.

241. Schapiro S. (1962) Pituitary ACTH and compensatory adrenal hypertrophy in

stress-non-responsive infant rats. Endocrinology, 71: p. 986-9.

242. Walker CD, Dallman MF. (1993) Neonatal facilitation of stress-induced

adrenocorticotropin secretion by prior stress: evidence for increased central drive to

the pituitary. Endocrinology, 132(3): p. 1101-7.

243. Drolet G, Rivest S. (2001) Corticotropin-releasing hormone and its receptors; an

evaluation at the transcription level in vivo. Peptides, 22(5): p. 761-7.

244. Antoni FA. (1993) Vasopressinergic control of pituitary adrenocorticotropin

secretion comes of age. Front Neuroendocrinol, 14(2): p. 76-122.

245. Levine S. (2001) Primary social relationships influence the development of the

hypothalamic--pituitary--adrenal axis in the rat. Physiol Behav, 73(3): p. 255-60.

246. Walker CD, Tankosic P, Tilders FJ, Burlet A. (1997) Immunotargeted lesions of

paraventricular CRF and AVP neurons in developing rats reveal the pattern of

maturation of these systems and their functional importance. J Neuroendocrinol,

9(1): p. 25-41.

247. Yi SJ, Baram TZ. (1994) Corticotropin-releasing hormone mediates the response to

cold stress in the neonatal rat without compensatory enhancement of the peptide's

gene expression. Endocrinology, 135(6): p. 2364-8.

248. Walker CD, Scribner KA, Cascio CS, Dallman MF. (1991) The pituitary-

adrenocortical system of neonatal rats is responsive to stress throughout

development in a time-dependent and stressor-specific fashion. Endocrinology,

128(3): p. 1385-95.

137

249. Payet N, Lehoux JG. (1982) Aldosterone and corticosterone stimulation by ACTH

in isolated rat adrenal glomerulosa cells: interaction with vasopressin. J Physiol

(Paris), 78(3): p. 317-21.

250. Ulrich-Lai YM, Engeland WC. (2002) Adrenal splanchnic innervation modulates

adrenal cortical responses to dehydration stress in rats. Neuroendocrinology, 76(2):

p. 79-92.

251. McDonald TJ, Nathanielsz PW. (1998) The involvement of innervation in the

regulation of fetal adrenal steroidogenesis. Horm Metab Res, 30(6-7): p. 297-302.

252. Bornstein SR, Chrousos GP. (1999) Clinical review 104: Adrenocorticotropin

(ACTH)- and non-ACTH-mediated regulation of the adrenal cortex: neural and

immune inputs. J Clin Endocrinol Metab, 84(5): p. 1729-36.

253. Park MK, Hoang TA, Belluzzi JD, Leslie FM. (2003) Gender specific effect of

neonatal handling on stress reactivity of adolescent rats. J Neuroendocrinol, 15(3):

p. 289-95.

254. Shanks N, McCormick CM, Meaney MJ. (1994) Sex differences in hypothalamic-

pituitary-adrenal responding to endotoxin challenge in the neonate: reversal by

gonadectomy. Brain Res Dev Brain Res, 79(2): p. 260-6.

255. Schmidt MV, Deussing JM, Oitzl MS, Ohl F, Levine S, Wurst W, Holsboer F,

Müller MB, de Kloet ER. (2006) Differential disinhibition of the neonatal

hypothalamic- pituitary-adrenal axis in brain-specific CRH receptor 1-knockout

mice. Eur J Neurosci, 24(8): p. 2291-8.

138

9. Saját publikációk jegyzéke

9.1 A disszertácó alapjául szolgáló közlemények, könyvfejezet

1: Zelena D, Domokos A, Barna I, Csabai K, Bagdy Gy, Makara GB. (2007) The role of

vasopressin in chronic stress studied in a chronic mild stress model of depression.

Ideggyogy Sz. 30;60(3-4):196-200.

2: Domokos A, Mergl Z, Barna I, Makara GB, Zelena D. (2008),Congenital vasopressin

deficiency and acute and chronic opiate effects on hypothalamo-pituitary-adrenal axis

activity in Brattleboro rats. J Endocrinol. 196(1):113-21.

3: Zelena D, Domokos A, Barna I, Mergl Z, Haller J, Makara GB. (2008) Control of the

hypothalamo-pituitary-adrenal axis in the neonatal period: adrenocorticotropin and

corticosterone stress responses dissociate in vasopressin-deficient brattleboro rats.

Endocrinology. 149(5):2576-83.

4: Makara GB, Domokos A, Mergl Z, Csabai K, Barna I, Zelena D. (2008) Gender-specific

regulation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the role of vasopressin during the

neonatal period. Ann N Y Acad Sci. 1148:439-45.

5: Zelena D, Langnaese K, Domokos A, Pintér O, Landgraf R, Makara GB, Engelmann M.

(2009) Vasopressin administration into the paraventricular nucleus normalizes plasma

oxytocin and corticosterone levels in Brattleboro rats. Endocrinology 150(6):2791-8.

6: Zelena D, Domokos A, Jain SK, Jankord R, Filaretova L. (2009) The stimuli-specific

role of vasopressin in the hypothalamus-pituitary-adrenal axis response to stress. J

Endocrinol. 202(2):263-78.

7: Varga J, Domokos A, Barna I, Jankord R, Bagdy Gy, Zelena D. (2011) Lack of

vasopressin does not prevent the behavioural and endocrine changes induced by chronic

unpredictable stress. Brain Res Bull. 15;84(1):45-52.

Könyvfejezet:

1: Zelena D., Domokos A., Mergl Zs., The Role of Vasopressin in Chronic Stress-induced

Hypothalamo-Pituitary-Adrenal Axis Hyperactivity: Studies on Brattleboro Rats with

repeated restraint. in Neuropeptide Research Trends, Nova Publishers, (2007) Chapter VII.

pp. 189-212

139

9.2 . Egyéb- nem az értekezés témájában megjelent- közlemények:

1: Pákáski M, Hugyecz M, Sántha P, Jancsó G, Bjelik A, Domokos A, Janka Z, Kálmán J.

(2009) Capsaicin promotes the amyloidogenic route of brain amyloid precursor protein

processing. Neurochem Int. 54(7):426-30.

2: Ádori C, Zelena D, Tímár J, Gyarmati Zs, Domokos Á, Sobor M, Fürst Zs, Makara G,

Bagdy Gy. (2010) Intermittent prenatal MDMA exposure alters physiological but not mood

related parameters in adult rat offspring. Behav Brain Res. 20;206(2):299-309.

3: Kálmán S, Pákáski M, Szücs S, Garab D, Domokos Á, Zvara A, Puskás L, Bagdy Gy,

Zelena D, Kálmán J. (2009) The transcription of the amyloid precursor protein and

tryptophan 2,3-dioxygenase genes are increased by aging in the rat brain. Ideggyogy Sz.

30;62(9-10):326-32. Hungarian.

4: Szücs S, Pákáski M, Domokos Á, Kálmán J Jr, Kálmán S, Garab D, Penke B, Szabó G,

Janka Z, Kálmán J. (2010) The effects of duloxetine on beta-actin stress response in rat

brain. Neuropsychopharmacol Hung. 12(1):301-7. Hungarian.

5: Pintér O, Domokos Á, Mergl Z, Mikics É, Zelena D. (2011) Do stress hormones connect

environmental effects with behavior in the forced swim test? Endocr J.;58(5):395-407.

140

10. Köszönetnyilvánítás Őszinte hálával tartozom Makara Gábor Tanár Úrnak, aki munkám kezdetén

megismertetett a természettudományos kutatás iránti mély és alázatos tisztelettel.

Tisztelet és mérhetetlen köszönet illeti témavezetőmet Zelena Dórát, hiszen a türelme és

oktató szavai nélkül ma ez a dolgozat nem létezhetne. Köszönöm, hogy hitt bennem és intő

szavaival visszaterelt ehhez a dolgozathoz.

Mergl Zsuzsa és Bekóné Hajni bátorító és oktató szavai is sok nehéz pillanaton lendítettek

keresztül. Köszönöm a sok apró ötletet és segítségüket, mellyel munkámat könnyebbé

tették.

Köszönet illeti Barna Istvánt az in situ hibridizációk során nyújtott segítségéért.

Sokat köszönhetek a Magatartásélettan és Stressz kutatócsoport minden tagjának, hiszen

egy olyan közegben dolgozhattam velük, ami szakmailag inspiráló, emberileg támogató

volt.

Köszönet illeti Édesanyámat, Kislányomat és Nővéremet, akik a legnehezebb időszakban is

kitartottak mellettem és sok terhet vettek le a vállamról, hogy a dolgozatom nyugodt

körülmények között megszülethessen.