A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrel
1
A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrel Végner László, Málnási-Csizmadia András Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék Célkitűzések •Rekombináns miozin II motordomén termeltetése, preparálása és tisztítása. •A fehérjefragment aktívitásának ellenőrzése, a switch-1 fluoreszcens szenzorának (W239) tesztelése különböző nukleotid, és nukleotid analóg kötött állapotokban. •Fluoreszcens nukleotid analóg kötött állapotban a W239 és a nukleotid közötti távolság mérése, ezáltal a switch-1 konformációjának meghatározása. •A switch-1 nukleotidhoz viszonyított orientációjának meghatározása. •A switch-1 konformációinak és orientációinak vizsgálata aktin jelenlétében. Következtetések •Az eddigi eredmények alátámasztják, hogy az F239W miozin motordomén mutáns és a FRET alkalmazásával közvetlen szerkezeti információkat kaphatunk a switch-1 hurok működéséről. •A módszer az elméleti háttér alapján ideális a miozin konformációs állapotainak detektálására aktin jelenlétében (az aktomiozin komplex nem kristályosítható). •A mért adatok alapján számított Förster- és donor akceptor Bevezetés •A miozin II motorfehérje az ATP hasításából származó energiát mozgási energiává alakítja az aktin filamentum mentén haladva. •A mozgás során ciklikusan változik a fehérje affinitása az aktin sínhez. •Az ATP kötése és hidrolízise, a termékeleresztés lokális, felerősödően továbbadódó konformációváltozásokat indukál. Módszer •A kísérleteket rekombináns D. discoideum miozin II motordoménen végeztük. •Az intakt motordomén működőképes, rendelkezik az ATP- kötő és az aktinkötő hellyel. •A rekombináns fehérje fragmens egy triptofán aminosavmaradékot tartalmaz a switch-1 hurokban (F239W). •A triptofán fluoreszcens szenzor, érzékeny a lokális térszerkezeti változásokra. •A vizsgálatokhoz nukleotid analógokat használtunk (ADPBeF x , mantdADPBeF x , ADPAlF 4 ), ezek a bekötött ATP-t imitálják. Fluoreszcens Rezonancia Energia Transzfer (FRET) •Az energia transzfer a gerjesztett triptofán szenzor (donor) és a mantdADPBeF x fluoreszcens nukleotid analóg (akceptor) között történik. •A transzfer alapja dipól-dipól kölcsönhatás. •Hatékonysága erősen függ a donor-akceptor távolságtól, ezért ideális távolságmérésre a két pont között. •A módszer közvetlen szerkezeti információkat nyújt a molekulán belüli távolságmérésen keresztül. •A FRET módszer kristályszerkezeti információk felhasználásával és in silico számítások mellett alkalmas a switch-1 térbeli orientációjának vizsgálatára. •Lehetőséget nyújt aktin jelenlétében is a konformációs állapotok detektálására, mivel az aktinban lévő triptofánok nem befolyásolják az energia transzfert. •Az ATP-kötő hely körül 3 hurok szenzorként működik (switch-1, switch-2, P- hurok). •Az ATP-vel és a hasított termékekkel kölcsönhatva ezek konformáció- változása közvetítődik az aktinkötőhely és a kilengést biztosító emelőkar felé. •A switch-1 elsősorban a nukleotidkötő hely és az aktinkötő hely közötti kommunikációért felel. Eredmények Transzfer hatékonyság meghatározása Transzfer hatékonyság (E): a gerjesztés során a donor által abszorbeált fotonok azon hányada, amelyek energiája az energia transzferben átadódik az akceptor felé Förster távolság (R 0 ): az a távolság a donor és az akceptor között, ahol a transzfer hatékonyság 50%-os Donor-akceptor távolság (r): a W239 aminosavmaradék indol gyűrűje (donor) és a mantdADPBeF x nukleotid analóg mant gyűrűje (akceptor) közötti távolság Donor fluoreszcencia intenzitás akceptor hiányában (az aktív helyen ADPBeFx) és bekötött akceptor mellett (mantdADPBeFx) (F D , F DA , I D ) Orientációs faktor (κ 2 ): a donor és az akceptor tranzíciós dipóljainak egymáshoz képest vett térbeli helyzetét jellemzi Refrakciós index (n): azt a közeget jellemzi, amelyben a mérendő minta van; értéke biomolekulákra vizes oldatban 1.4 Donor kvantum hatásfok (Q D ): a donor által emittált és abszorbeált fotonok aránya egy ismert referencia fluorofórhoz viszonyítva Overlap integrál (J(λ)): a donor emissziós spektrumának és az akceptor abszorbciós spektrumának átfedését jellemző érték Referencia fluorofór és donor optikai denzitások (: egy referencia fluorofór (NATA) és a donort tartalmazó fehérje abszorbciói adott hullámhosszon Akceptor (mantdATP) moláris extinkciós koefficiens (•ATP kötése mellett a switch-1 konformációs egyensúlya a zárt állapot felé tolódik. Ennek hatására az aktinkötő hely kinyilik és az aktin disszociál. •ADP kötött állapotban, erős kölcsönhatásban az F-aktinnal a switch-1 nyitott állapota dominál. D. Discoideum miozin II motordomén PDB kód: 1lvk A z F239W m iozin IIm otordom én fluoreszcencia spektrum ai 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 5000000 300 320 340 360 380 400 420 Hullám hossz (nm ) F lu o re s z c e n c ia inte (cps) apo A TP ADP A F239W m otordom én fluoreszcenciájának intenzitásváltozása 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 5000000 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Idő (sec) F lu o re s zc e n c ia in ten (cps) A triptofán szenzor tesztelése Különböző swich-1 konformációs állapotok a nukleotidkötő hely állapota szerint. Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, ATP kötés: 34%- os csökkenés, 9nm kékeltolódás; ADP kötés: 21%-os csökkenés, 7nm kékeltolódás a nukleotid mentes állapothoz képest (apo). A miozin fluoreszcencia intenzitása az idő függvényében. A bazális (aktin nélküli) ATP-áz aktivitás mérés alapján az enzimaktivitás 0,08 1/mp (3μM miozinhoz mérés közben adtunk 15μM ATP-t; gerjesztés 295nm, detektálás 341nm). A preparálási és tisztítási lépések ellenőrzése SDS-PAGE segítségével: protein létra (Invitrogen Benchmark, 1.); a motordomén oszlopra vitelénél a távozó eluens (2.); alacsony ionerejű pufferrel való mosás eluense (3.); magas ionerejű pufferrel való mosás eluense (4.); alacsony ionerejű pufferrel való mosás eluense (5.); 10V/V%-os imidazol melletti mosás eluense (6.); 90V/V% imidazol melletti mosás eluense (a miozin motordomén leszorítása) (7.); pozitív kontroll (8.); CBB R250 festés. A z F239W m utáns fluoreszcencia spektrum ai különböző A DP koncentrációk m ellett 0 50000 100000 150000 200000 250000 300 320 340 360 380 400 420 Hullám hossz (nm ) Fluoreszcencia intenzitás A po 10μM A DP 20μM A DP 50μM A DP 100μM A DP A W 239.m dADPBeFx m utáns spektrum aikülönböző m dA TP koncentrációk m ellett 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 300 340 380 420 460 500 Hullám hossz (nm ) Fluoreszcencia intenzitás apo 5μM m dA D P 10μM m dA D P 20μM m dA D P 100μM m dA D P 200μM m dA D P 500μM m dA D P 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 220000 240000 F lu o re s zc e n c ia in te n zitá s c ADP vagy c m dA D P (uM ) D o n. flu . int.: W 239B e F x titrá lá sa m dA T P -vel(327nm ) A kc. flu. in t.: W 239B eF x titrálá sa m dA T P -vel(441nm ) D o n. flu . int.: W 239.A D P A lF x titrá lása m dA T P -vel(327nm ) A kc. flu. in t.: W 2 39 .A D P A lF x titratio n m dA TP -vel(441nm ) A bszorbancia spektrum ok 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000 240 260 280 300 320 H ullám hossz (nm ) A bszorbancia 13,1μM N ATA 15,6 μM W 239.AD PBeFx A donor fluoreszcencia spektrum a akceptorhiányában (W 239A DP B eFx) 0 50000 100000 150000 200000 250000 300 320 340 360 380 400 420 H ullám hossz (nm ) Fluoreszcencia intenzitá A z akceptor abszorbciós spektrum a (m antA TP ) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 300 320 340 360 380 400 420 H ullám hossz (nm ) A bszorbancia A kvantum hatásfok és az overlap integrál meghatározása A Förster távolság meghatározása Az 50%-os transzfer hatékonysághoz tartozó távolságot a fenti egyenlet alapján számítottuk. Az orientációs faktor értékét ⅔-nak vettük (ez a dipólok gyors és szabad rotációját feltételezi), mivel jelenleg nem állnak rendelkezésre megfelelő anizotrópia eredmények és in silico számítások a κ 2 közelítő értékének meghatározására. Az így kapott Förster távolság 4 Angström. A donor kvantum hatásfokának meghatározása (Q D ) Felvettük egy referencia fluorofór (N-acetil-L- triptofán-amid, NATA) és a W239.ADPBeF x abszorbciós spektrumát. A Q R értéke 0,13 280nm- en. Mivel a W239.ADPBeF x és a NATA integrált emissziós fluoreszcencia intenzitásait 295nm-es gerjesztés mellett határoztuk meg (nincsenek feltüntetve), a Q R értékét konvertáltuk a 295nm- es gerjesztéshez tartozó értékre. Az abszorbciós spektrum felvételéhez használt NATA koncentráció 13,1μM (abszorbciós spektrumból, ε NATA =5500 M -1 cm -1 280nm-en). A 295nm-nél mért NATA abszorbancia értéket is korrigáltuk, mivel a fehérje koncentrációja nagyobb volt. A refrakciós indexek négyzetének hányadosát egynek vettük. Ezek alapján a számított donor kvantum hatásfok 0,011- nek adódik. Mérési beállítások: abszorbancia detektálás 240- 320nm, a felvételi sebesség nagyon lassú, rés 1nm, felbontás 1nm, alapvonal korrekció a mérési pufferre. A miozin titrálása ADP-vel A miozin motordomén spektrumai különböző ADPBeF x nukleotid analóg koncentrációk mellett (donor az akceptor hiányában). 20μM ADP (15,6 μM miozin, 200μM BeCl 2 , 5mM NaF mellett) lényegében teljesen telíti az aktív helyeket. Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, emisszió detektálás 300-420nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 3nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 1mp, Raman korrekció. A miozin titrálása mantADP-vel (Inner filter effektus karakterizálása) A miozin titrálása a mantATP fluoreszcens nukleotid analóggal (15,6μM miozin, 200 μM BeCl 2 , 5mM NaF). A mantATP kis feleslegben is fluoreszcens hátteret okoz és torzítja a spektrumokat (inner filter effektus). Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, emisszió detektálás 300-520nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 3nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 1mp, Raman korrekció. A mantADPBeFx telítési pontjának meghatározása A 9. ábrán felvett spektrumok donor-, illetve akceptorcsúcsainak intenzitásértékeit ábrázoltuk a nukleotid analóg koncentrációja szerint. A piros pontsor a donorcsúcsok csökkenését, a zöld az akceptorcsúcsok emelkedését mutatja. A két pontsorra két-két egyenes illeszthető. Az egyes pontsorok egyenesei közel a fehérjével ekvivalens koncentrációnál (15,6μM) metszik egymást. Azaz ekvivalens, vagy közel ekvivalens mantADP hozzáadásával telíthető a fehérje. Ezt alátámasztják az ADPAlF 4 -al (ATP nukleotid analóg) végzett kísérletek, ahol előre komplexáltuk az ADPBeF x nagy feleslegével a miozint, és ezután titráltunk mantADP- vel. A sötétkék pontsor a donorcsúcs intenzitáscsökkenése, a világoskék az akceptorcsúcs intenzitásnövekedése. Mindkét pontsorra egy-egy egyenes illeszthető, amelyek párhuzamosak a mantADPBeF x kötött állapot telítés utáni egyeneseivel. A 9. ábrán minden mérési pont két párhuzamos mérés átlaga. A fentiek miatt az energia transzfer számításához a 20μM ADP és mdADP melletti donorcsúcsokat vettük figyelembe. Ez alapján a számított transzfer hatékonyság 0,48. 2. ábra 5. ábra 6. ábra 7. ábra 8. ábra 9. ábra 10. ábra Az overlap integrál számítása A donor emissziós spektruma az akceptor nélkül (11. ábra) (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200 μM BeCl2, 5mM NaF). Az akceptor abszorbciós spektrumából (12. ábra) elnyelési koefficienseket számítottunk minden hullámhosszon. A fenti összefüggés alapján a számított overlap integrál érték 5,1*10 13 M -1 cm -1 nm -4 (normalizált az F D görbe alatti területre, 11. ábra). A bemért mantATP koncentráció 15,4μM (εNATA=5800 M -1 cm -1 356nm-en). 11. ábra 12. ábra 13. ábra Donor-akceptor távolság meghatározás A Förster távolság és a transzfer hatékonyság ismeretében a triptofán donor (W239) indol gyűrűje és a mant akceptor közötti számított távolság 4,1 Angström. Anizotrópia mérések W 239.AD P B eFx fluoreszcencia spektrum ai különböző polarizátorállások m ellett 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 300 320 340 360 380 400 420 H ullám hossz (nm ) Fluoreszcencia intenzitás W 239A D P B eFx Ex./em .0/0 W 239A D P B eFx Ex./em .0/90 W 239A D P B eFx Ex./em .90/0 W 239A D P B eFx Ex./em .90/90 A W 239.m dAD P B eFx fluoreszcencia spektrum ai különböző polarizátorállások m ellett 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 300 340 380 420 460 500 540 H ullám hossz (nm ) Fluoreszcencia intenzitás W 239m dA D P B eFx E x./em .0/0 W 239m dA D P B eFx E x./em .0/90 W 239m dA D P B eFx E x./em .90/0 W 239m dA D P B eFx E x./em .90/90 W 239A D P B eFx:G faktorés rérték 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 300 320 340 360 380 400 420 Hullám hossz (nm ) G fakto r,r érték G faktor W 239A D P B eFx rérték W 239A D P B eFx W 239.m dADPB eFx:G faktor, rérték -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 300 340 380 420 460 500 540 Hullám hossz (nm ) G fakto r,rérték G faktor W 239m dA D P B eFx rérték W 239m dA D P B eFx 14. ábra 15. ábra 16. ábra 17. ábra 1. ábra Hogyan tovább? •Az eddigi mérések reprodukálhatóságának vizsgálata •A donor és az akceptor rigiditásának és relatív térbeli helyzetének meghatározása •A switch-1 hurok működésének vizsgálata aktin mellett 3. ábra 4. ábra A donor fluoreszcens spektumai horizontálisan (90°) vagy vertikálisan (0°) irányított gerjesztő és emittált fény mellett (az akceptor nincs jelen). Két polarizátor (a gerjesztési és detektálási oldalon) és azok két lehetséges iránya mellett négy spektrum adódik (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200μM BeCl 2 , 5mM NaF). Műszer beállítások: gerjesztés 295nm, emisszió detektálás 300-420nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 1nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 0.2mp, Raman korrekció. A donor spektumai négyféle a polarizátor kombináció mellett az akceptor jelenlétében (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200μM BeCl2, 5mM NaF). A műszer beállításai megfelelnek az előzőeknek (detektálás 300-540nm). A G faktor és az r értékek meghatározása a 14. és 15. ábrák spektrumaiból. A G faktor a műszert jellemző érték, a 90°/0° és a 90°/90° (rendre a gerjesztési és emissziós oldal) polarizátor állások mellett felvett spektrumok hányadosa. Az r érték (a fluoreszcens életidő és a rotációs korrelációs idő ismeretében) jellemzi a donor és az akceptor rigiditását, egymáshoz viszonyított térbeli orientációját. Az r érték a 0°/0° 0°/90° spektrumokból számítható.
description
A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrel. Végner László, Málnási-Csizmadia András. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék. Bevezetés - PowerPoint PPT Presentation
Transcript of A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrel
A switch-1 hurok konformációjának és orientációjának vizsgálata FRET módszerrelVégner László, Málnási-Csizmadia András
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék
Célkitűzések
•Rekombináns miozin II motordomén termeltetése, preparálása és tisztítása.•A fehérjefragment aktívitásának ellenőrzése, a switch-1 fluoreszcens szenzorának (W239) tesztelése különböző nukleotid, és nukleotid analóg kötött állapotokban.
•Fluoreszcens nukleotid analóg kötött állapotban a W239 és a nukleotid közötti távolság mérése, ezáltal a switch-1 konformációjának meghatározása.
•A switch-1 nukleotidhoz viszonyított orientációjának meghatározása.•A switch-1 konformációinak és orientációinak vizsgálata aktin jelenlétében.
Következtetések•Az eddigi eredmények alátámasztják, hogy az F239W miozin motordomén mutáns és a FRET alkalmazásával közvetlen szerkezeti információkat kaphatunk a switch-1 hurok működéséről.
•A módszer az elméleti háttér alapján ideális a miozin konformációs állapotainak detektálására aktin jelenlétében (az aktomiozin komplex nem kristályosítható).
•A mért adatok alapján számított Förster- és donor akceptor távolság további megfontolást igényel.
Bevezetés
•A miozin II motorfehérje az ATP hasításából származó energiát mozgási energiává alakítja az aktin filamentum mentén haladva.
•A mozgás során ciklikusan változik a fehérje affinitása az aktin sínhez.
•Az ATP kötése és hidrolízise, a
termékeleresztés lokális, felerősödően továbbadódó konformációváltozásokat indukál.
Módszer
•A kísérleteket rekombináns D. discoideum miozin II motordoménen végeztük.•Az intakt motordomén működőképes, rendelkezik az ATP-kötő és az aktinkötő hellyel.
•A rekombináns fehérje fragmens egy triptofán aminosavmaradékot tartalmaz a switch-1 hurokban (F239W).
•A triptofán fluoreszcens szenzor, érzékeny a lokális térszerkezeti változásokra.•A vizsgálatokhoz nukleotid analógokat használtunk (ADPBeFx, mantdADPBeFx, ADPAlF4), ezek a bekötött ATP-t imitálják.
Fluoreszcens Rezonancia Energia Transzfer (FRET)•Az energia transzfer a gerjesztett triptofán szenzor (donor) és a mantdADPBeFx fluoreszcens nukleotid analóg (akceptor) között történik.
•A transzfer alapja dipól-dipól kölcsönhatás.•Hatékonysága erősen függ a donor-akceptor távolságtól, ezért ideális távolságmérésre a két pont között.
•A módszer közvetlen szerkezeti információkat nyújt a molekulán belüli távolságmérésen keresztül.
•A FRET módszer kristályszerkezeti információk felhasználásával és in silico számítások mellett alkalmas a switch-1 térbeli orientációjának vizsgálatára.
•Lehetőséget nyújt aktin jelenlétében is a konformációs állapotok detektálására, mivel az aktinban lévő triptofánok nem befolyásolják az energia transzfert.
•Az ATP-kötő hely körül 3 hurok szenzorként működik (switch-1, switch-2, P-hurok).
•Az ATP-vel és a hasított termékekkel kölcsönhatva ezek konformáció-változása közvetítődik az aktinkötőhely és a kilengést biztosító emelőkar felé.
•A switch-1 elsősorban a nukleotidkötő hely és az aktinkötő hely közötti kommunikációért felel.
Eredmények Transzfer hatékonyság meghatározása
Transzfer hatékonyság (E): a gerjesztés során a donor által abszorbeált fotonok azon hányada, amelyek energiája az energia transzferben átadódik az akceptor felé Förster távolság (R0): az a távolság a donor és az akceptor között, ahol a transzfer hatékonyság 50%-osDonor-akceptor távolság (r): a W239 aminosavmaradék indol gyűrűje (donor) és a mantdADPBeFx nukleotid analóg mant gyűrűje (akceptor) közötti távolságDonor fluoreszcencia intenzitás akceptor hiányában (az aktív helyen ADPBeFx) és bekötött akceptor mellett (mantdADPBeFx) (FD, FDA, ID) Orientációs faktor (κ2): a donor és az akceptor tranzíciós dipóljainak egymáshoz képest vett térbeli helyzetét jellemziRefrakciós index (n): azt a közeget jellemzi, amelyben a mérendő minta van; értéke biomolekulákra vizes oldatban 1.4Donor kvantum hatásfok (QD): a donor által emittált és abszorbeált fotonok aránya egy ismert referencia fluorofórhoz viszonyítvaOverlap integrál (J(λ)): a donor emissziós spektrumának és az akceptor abszorbciós spektrumának átfedését jellemző értékReferencia fluorofór és donor optikai denzitások (ODR, ODD): egy referencia fluorofór (NATA) és a donort tartalmazó fehérje abszorbciói adott hullámhosszonAkceptor (mantdATP) moláris extinkciós koefficiens (εA)
•ATP kötése mellett a switch-1 konformációs egyensúlya a zárt állapot felé tolódik. Ennek hatására az aktinkötő hely kinyilik és az aktin disszociál.
•ADP kötött állapotban, erős kölcsönhatásban az F-aktinnal a switch-1 nyitott állapota dominál.
D. Discoideum miozin II motordoménPDB kód: 1lvk
Az F239W miozin II motordomén fluoreszcencia spektrumai
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
300 320 340 360 380 400 420
Hullámhossz (nm)
Flu
ore
szcen
cia
in
ten
zit
ás
(cp
s) apo
ATP
ADP
A F239W motordomén fluoreszcenciájának intenzitásváltozása
0
5000001000000
15000002000000
2500000
30000003500000
40000004500000
5000000
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Idő (sec)
Flu
ore
szcen
cia
in
ten
zit
ás
(cp
s)
A triptofán szenzor teszteléseKülönböző swich-1 konformációs állapotok a nukleotidkötő hely állapota szerint. Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, ATP kötés: 34%-os csökkenés, 9nm kékeltolódás; ADP kötés: 21%-os csökkenés, 7nm kékeltolódás a nukleotid mentes állapothoz képest (apo).
A miozin fluoreszcencia intenzitása az idő függvényében. A bazális (aktin nélküli) ATP-áz aktivitás mérés alapján az enzimaktivitás 0,08 1/mp (3μM miozinhoz mérés közben adtunk 15μM ATP-t; gerjesztés 295nm, detektálás 341nm).
A preparálási és tisztítási lépések ellenőrzése SDS-PAGE segítségével:protein létra (Invitrogen Benchmark, 1.); a motordomén oszlopra vitelénél a távozó eluens (2.); alacsony ionerejű pufferrel való mosás eluense (3.); magas ionerejű pufferrel való mosás eluense (4.); alacsony ionerejű pufferrel való mosás eluense (5.); 10V/V%-os imidazol melletti mosás eluense (6.); 90V/V% imidazol melletti mosás eluense (a miozin motordomén leszorítása) (7.); pozitív kontroll (8.); CBB R250 festés.
Az F239W mutáns fluoreszcencia spektrumai különböző ADP koncentrációk mellett
0
50000
100000
150000
200000
250000
300 320 340 360 380 400 420
Hullámhossz (nm)
Fluo
resz
cenc
ia in
tenz
itás
Apo
10μM ADP
20μM ADP
50μM ADP
100μM ADP
A W239.mdADPBeFx mutáns spektrumai különböző mdATP koncentrációk mellett
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
300 340 380 420 460 500
Hullámhossz (nm)
Fluo
resz
cenc
ia in
tenz
itás
apo
5μM mdADP
10μM mdADP
20μM mdADP
100μM mdADP
200μM mdADP
500μM mdADP
0 25 50 75 100 125 150 175 200 2250
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
240000
Flu
ore
szce
ncia
in
ten
zitá
s
cADP vagy cmdADP (uM)
Don. flu. int.: W239BeFx titrálása mdATP-vel (327nm) Akc. flu. int.: W239BeFx titrálása mdATP-vel (441nm) Don. flu. int.: W239.ADPAlFx titrálása mdATP-vel (327nm) Akc. flu. int.: W239.ADPAlFx titration mdATP-vel (441nm)
Abszorbancia spektrumok
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
240 260 280 300 320Hullámhossz (nm)
Ab
szo
rban
cia
13,1μM NATA
15,6 μM W239.ADPBeFx
A donor fluoreszcencia spektruma akceptor hiányában (W239ADPBeFx)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300 320 340 360 380 400 420
Hullámhossz (nm)
Flu
ore
szcen
cia
in
ten
zit
ás
Az akceptor abszorbciós spektruma (mantATP)
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
300 320 340 360 380 400 420
Hullámhossz (nm)
Ab
szo
rban
cia
A kvantum hatásfok és az overlap integrál meghatározása A Förster távolság meghatározása
Az 50%-os transzfer hatékonysághoz tartozó távolságot a fenti egyenlet alapján számítottuk. Az orientációs faktor értékét ⅔-nak vettük (ez a dipólok gyors és szabad rotációját feltételezi), mivel jelenleg nem állnak rendelkezésre megfelelő anizotrópia eredmények és in silico számítások a κ2 közelítő értékének meghatározására. Az így kapott Förster távolság 4 Angström.
A donor kvantum hatásfokának meghatározása (QD)Felvettük egy referencia fluorofór (N-acetil-L-triptofán-amid, NATA) és a W239.ADPBeFx abszorbciós spektrumát. A QR értéke 0,13 280nm-en. Mivel a W239.ADPBeFx és a NATA integrált emissziós fluoreszcencia intenzitásait 295nm-es gerjesztés mellett határoztuk meg (nincsenek feltüntetve), a QR értékét konvertáltuk a 295nm-es gerjesztéshez tartozó értékre. Az abszorbciós spektrum felvételéhez használt NATA koncentráció 13,1μM (abszorbciós spektrumból, εNATA=5500 M-1cm-1 280nm-en). A 295nm-nél mért NATA abszorbancia értéket is korrigáltuk, mivel a fehérje koncentrációja nagyobb volt. A refrakciós indexek négyzetének hányadosát egynek vettük. Ezek alapján a
számított donor kvantum hatásfok 0,011-nek adódik. Mérési beállítások: abszorbancia detektálás 240-320nm, a felvételi sebesség nagyon lassú, rés
1nm, felbontás 1nm, alapvonal korrekció a mérési pufferre.
A miozin titrálása ADP-velA miozin motordomén spektrumai különböző ADPBeFx nukleotid analóg koncentrációk mellett (donor az akceptor hiányában). 20μM ADP (15,6 μM miozin, 200μM BeCl2, 5mM NaF mellett) lényegében teljesen telíti az aktív helyeket. Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, emisszió detektálás 300-420nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 3nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 1mp, Raman korrekció.
A miozin titrálása mantADP-vel (Inner filter effektus karakterizálása)A miozin titrálása a mantATP fluoreszcens nukleotid analóggal (15,6μM miozin, 200 μM BeCl2, 5mM NaF). A mantATP kis feleslegben is fluoreszcens hátteret okoz és torzítja a spektrumokat (inner filter effektus). Mérési beállítások: gerjesztés 295nm-en, emisszió detektálás 300-520nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 3nm, adott hullámhosszhoz tartozó
detektálási idő 1mp, Raman korrekció.
A mantADPBeFx telítési pontjának meghatározásaA 9. ábrán felvett spektrumok donor-, illetve akceptorcsúcsainak intenzitásértékeit ábrázoltuk a nukleotid analóg koncentrációja szerint. A piros pontsor a donorcsúcsok csökkenését, a zöld az akceptorcsúcsok emelkedését mutatja. A két pontsorra két-két egyenes illeszthető. Az egyes pontsorok egyenesei közel a fehérjével ekvivalens koncentrációnál (15,6μM) metszik egymást. Azaz ekvivalens, vagy közel ekvivalens mantADP hozzáadásával telíthető a fehérje. Ezt alátámasztják az ADPAlF4-al (ATP nukleotid analóg) végzett kísérletek, ahol előre komplexáltuk az ADPBeFx nagy feleslegével a miozint, és ezután titráltunk mantADP-vel. A sötétkék pontsor a donorcsúcs intenzitáscsökkenése, a világoskék az akceptorcsúcs intenzitásnövekedése. Mindkét pontsorra egy-egy egyenes illeszthető, amelyek párhuzamosak a mantADPBeFx kötött állapot telítés utáni egyeneseivel. A 9. ábrán minden mérési pont két párhuzamos mérés átlaga. A fentiek miatt az energia transzfer számításához a 20μM ADP és mdADP melletti donorcsúcsokat vettük figyelembe. Ez alapján a számított transzfer hatékonyság 0,48.
2. ábra
5. ábra
6. ábra
7. ábra
8. ábra 9. ábra 10. ábra
Az overlap integrál számításaA donor emissziós spektruma az akceptor nélkül (11. ábra) (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200 μM BeCl2, 5mM NaF). Az akceptor abszorbciós spektrumából (12. ábra) elnyelési koefficienseket számítottunk minden hullámhosszon. A fenti összefüggés alapján a számított overlap integrál érték 5,1*1013 M-1cm-1nm-4 (normalizált az FD görbe alatti területre, 11. ábra). A bemért mantATP koncentráció 15,4μM (εNATA=5800 M-1cm-1 356nm-en).
11. ábra
12. ábra13. ábra
Donor-akceptor távolság meghatározás
A Förster távolság és a transzfer hatékonyság ismeretében a triptofán donor (W239) indol gyűrűje és a mant akceptor közötti számított távolság 4,1 Angström.
Anizotrópia mérésekW239.ADPBeFx fluoreszcencia spektrumai
különböző polarizátor állások mellett
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
300 320 340 360 380 400 420
Hullámhossz (nm)
Flu
ore
szcen
cia
in
ten
zit
ás
W239ADPBeFxEx./em. 0/0
W239ADPBeFxEx./em. 0/90
W239ADPBeFxEx./em. 90/0
W239ADPBeFxEx./em. 90/90
A W239.mdADPBeFx fluoreszcencia spektrumai különböző polarizátor állások mellett
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
300 340 380 420 460 500 540
Hullámhossz (nm)
Flu
ore
szcen
cia
in
ten
zit
ás
W239mdADPBeFxEx./em.0/0
W239mdADPBeFxEx./em. 0/90
W239mdADPBeFxEx./em. 90/0
W239mdADPBeFxEx./em. 90/90
W239ADPBeFx: G faktor és r érték
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
300 320 340 360 380 400 420
Hullámhossz (nm)
G f
akto
r, r
ért
ék
G faktorW239ADPBeFx
r érték W239ADPBeFx
W239.mdADPBeFx: G faktor, r érték
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
300 340 380 420 460 500 540
Hullámhossz (nm)
G f
akto
r, r
ért
ék
G faktorW239mdADPBeFx
r értékW239mdADPBeFx
14. ábra 15. ábra
16. ábra 17. ábra
1. ábra
Hogyan tovább?•Az eddigi mérések reprodukálhatóságának vizsgálata•A donor és az akceptor rigiditásának és relatív térbeli helyzetének meghatározása
•A switch-1 hurok működésének vizsgálata aktin mellett
3. ábra 4. ábra
A donor fluoreszcens spektumai horizontálisan (90°) vagy vertikálisan (0°) irányított gerjesztő és emittált fény mellett (az akceptor nincs jelen). Két polarizátor (a gerjesztési és detektálási oldalon) és azok két lehetséges iránya mellett négy spektrum adódik (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200μM BeCl2, 5mM NaF). Műszer beállítások: gerjesztés 295nm, emisszió
detektálás 300-420nm között, rések a gerjesztási/emissziós oldalon 1/1nm, emisszió felbontás 1nm, adott hullámhosszhoz tartozó detektálási idő 0.2mp, Raman korrekció.
A donor spektumai négyféle a polarizátor kombináció mellett az akceptor jelenlétében (15,6μM miozin, 20μM ADP, 200μM BeCl2, 5mM NaF). A műszer beállításai megfelelnek az előzőeknek (detektálás 300-540nm).
A G faktor és az r értékek meghatározása a 14. és 15. ábrák spektrumaiból. A G faktor a műszert jellemző érték, a 90°/0° és a 90°/90° (rendre a gerjesztési és emissziós oldal) polarizátor állások mellett felvett spektrumok hányadosa. Az r érték (a fluoreszcens életidő és a rotációs korrelációs idő ismeretében) jellemzi a donor és az akceptor rigiditását, egymáshoz viszonyított térbeli orientációját. Az r érték a 0°/0° 0°/90° spektrumokból számítható.
