A "programozott sejthalál" (apoptosis)

in vivo körülmények közötti kimutatását

célzó peptid előállítása és jelzése

99mTc-radionukliddal  Szemenyei Erzsébet1, Tóth Géza1, Környei József 2

Őszi Radiokémiai NapokEger 2004

1MTA SZBK, Biokémiai Intézet, Szeged, 2Izotóp Intézet Kft. Budapest

Apoptózis: Programozott sejthalál. A természetes sejthalál egyik formája, a sejtek mindig ugyanazon a helyen és időben genetikailag meghatározott program szerint halnak el. Az elnevezés a régi görög nyelvből származik, ahol falevelek hullását jelentette.

Az elhaló sejtek felszínén, a kettős membrán külső odalán megjelennek ezen sejtek felismerését lehetővé tévő molekulák, pl. a foszfatidil-szerin lipid-molekula.

Bevezetés

BevezetésAnnexin V:          • Ca2+ és foszfolipid kötő fehérjék családjának tagja, antikoaguláns tulajdonságokkal

          • Nagyrészt a plazmamembrán citoszol felőli részén található

         • Az érett annexin V 320 aminosavból áll, 35-36 kDa tömegű

      • A fehérje négy ismétlődő rész, síkban ciklikus elrendeződésével alakul ki,

az ismétlődő részek öt alfa-helikális szegmenst tartalmaznak

Patrick Raynal, Harvey B. Pollard(1994) Biochimica et Biophysica Acta

1197, 63-93.

Annexin V fragmentum szintézise

A szintézis lépései:

1. Kapcsolás: 2 ekv. Boc-Xaa, 2 ekv. HOBt, 2 ekv. DCC, DCM 2. Védőcsoport eltávolítás: 50 % TFA/DCM, 10 % DIEA/DCM 3. A következő aminosav(ak) kapcsolása 4. Hasítás: HF(l), anizol, dimetil-szulfid, 0 ˚C

ANX13:1. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH

/AQVLRGTVTDFPG-OH/2. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2

/AQVLRGTVTDFPG-NH2/

Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis

Alkalmazott gyanták, szintézis módszerek:

1. Merrifield-gyanta, Boc-kémia 2. 4-metil-benzhidril-amin gyanta, Boc-kémia

Analitikai adatok Peptidek Mr MS HPLC

  [M+H+] k`  AQVLRGTVTDFPG -OH 1359,75 1360,75 4,35AQVLRGTVTDFPG -NH2 1358,68 1359,68 3,17

Tiszítás: (RP-HPLC, gradiens elúció) Vydac 218TP1010 (C18) oszlop,

Gradiens:15 %-40 % A /25 percA: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 4 cm3/perc

Analitikai tisztaság vizsgálata:

(RP-HPLC) Vydac 218TP54 (C18) oszlop, Gradiens:15 %-40 % A /25 percA: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 1 cm3/perc

Tömegspektrum adatok: Reflex III MALDI-TOF

Kitermelés: AQVLRGTVTDFPG -OH: 20,4 %AQVLRGTVTDFPG -NH2: 49,6 %

Stabilitás vizsgálatAla-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH, 12 hónap, -18 °C

A vizsgálat kezdete2003. 08. 11.

2003. 11. 14. 2004. 02. 16. 2004. 04. 19.

Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2, 12 hónap, -18 °C

2004. 04. 19. 2003. 11. 14. 2004. 02. 19.

Vydac 218TP54 (250 4.6 mm), 215 nm, gradiens: 15 %-40 % ACN/25 perc, injektálás: 50 μl

A vizsgálat kezdete2003. 08. 11.

CCANX13 szintézise, stabilitás vizsgálataCCANX13:Cys-Cys-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH

/CCAQVLRGTVTDFPG-OH/

Alkalmazott szintézis módszer, gyanta: Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis, Boc-kémia, Merrifield-gyanta

Analitikai adatok: Peptid Mr MS HPLC

  [M+H+] k` CCAQVLRGTVTDFPG -OH 1565,92 1566,92 7,46Kitermelés = 59,1 %

Hővel szembeni stabilitás vizsgálata: 100 °C-on, fiziológiás sóoldatban

hőkezelés nélküli 20 perc 1 óra

„Nitrido-jelzés”1. N99mTc -intermedier előállítása

SnCl2

TcO4-

szobahőmérséklet keverés

-komplex előállítása

P

N

NN

trisz-(2-cianoetil)-foszfin (PCN)

(Oldás: hidroxpropil--cikodextrin jelenlétében)

S SCH2

NH2

O O

CH2

NH

Tc

P

N

NN

N

ANX13

99mTc-ANX13-PCN-komplex

CH2 CH2

C O

NH NH2

CO

NHNH2

borostyánkõsav-dihidrazid (SDH)

+

+ CCANX13

Tc N int.

Tc N int.

+ 100 °C

1 óra

15 perc

99mTc-ANX132.

Analitikai vizsgálatok

99mTc-ANX13-PCN-komplexET-31aceton

99mTc-ANX13-PCN-komplexKieselgel 60, F254

EtOH:víz 1:1

Vékonyréteg-kromatográfia

Rf érték: 0,03 100% Rf értékek: 0,02 4,22% 0,66 95,78%

Analitikai vizsgálatok

99mTc-ANX13-PCN-komplexKieselgel 60, F254

EtOH:víz 1:1

99mTcN-intermedierKieselgel 60, F254

EtOH:víz 1:1

99mTc-PCN-komplexKieselgel 60, F254

EtOH:víz 1:1

Rf érték:(3) 0,15 100%

Rf értékek:(4) 0,15 12,97% 0,71 87,03%

Rf értékek:(5) 0,15 8,72% 0,73 91,28%

4

5

3

Analitikai vizsgálatok

99mTcN-intermedierITLC-SA

0,3 M-os HCl-valtelített BuOH

99mTc-ANX13-PCN-komplexITLC-SA

0,3 M-os HCl-valtelített BuOH

99mTc-PCN-komplexITLC-SA

0,3 M-os HCl-valtelített BuOH

Rf értékek:(8) 0,14 11,81% 0,49 41,72% 0,52 31,73% 0,55 14,74%

Rf értékek:(7) 0,15 13,99% 0,38 19,91% 0,50 4,84% 0,61 14,22% 0,67 47,05%

Rf értékek:(6) 0,15 27,53% 0,22 48,59% 0,49 4,71% 0,66 19,17%

6 7

8

ÖsszefoglalásSikeresen előállítottuk a Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH

és Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2 peptideket.A stabiltás vizsgálatból kiderült, hogy az –OH végű forma stabilabb, ezért a további vizsgálatokat ezzel végeztük.

Elkészítettük a nitrido-jelzéshez szükséges, két ciszteinnel kiegészített ANX13-at, ennekhővel szembeni stabilitás eredménye azt mutatja, hogy a jelzésnél alkalmazhatjuk

az 1 órás reakcióidőt.

A jelzési reakció után vékonyréteg-kromatográfiával kimutattuk, hogy nincs szabad 99mTcO4-

a rendszerben. (ET-31, aceton)

A további vizsgálatok azt mutatták, hogy intermedier sincs jelen. (Kieselgel 60, EtOH: víz 1:1)Ugyanakkor, ebben a rendszerben nem válik el egyértelműen a 99mTc-PCN-komplexés a 99mTc-ANX13-PCN-komplex.

Egy újabb futtatórendszeren és lapon elvégzett vizsgálatokból egyértelműen látszik, hogy a jelzés sikeres volt. (ITLC-SA, 0,3 M HCl-val telített BuOH)

Célunkat elértük, sikerült előállítanunk a 99mTc-ANX13-komplexet, amely jelentős előrelépés egy tervezett radiogyógyszer kifejlesztésének következő fázisához, a preklinikai vizsgálatok megtervezéséhez.

Köszönetnyilvánítás

Köszönöm a figyelmüket!

Szeretnék köszönetet mondani munkatársaimnak:Tóthné Papp Évának és Papp Jánosné, Andreának

valamintRupert Anikónak és Paál Margitnak a hatékony segítségért.

Köszönjük a Nemzetközi Atomenergia Ügynökség

támogatását.