า 2557 ิทยาลัิลปากรยศ · lactic acid was 107.10 g/L when using 25 g/L...

การคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพและการหาภาวะทเหมาะสม

สาหรบการผลตกรดแลกตกจากมนเทศ

โดย

นางสาวรววรรณ บญสมปอง

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2557

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

SCREENING OF EFFICENT LACTIC ACID BACTERIA AND OPTIMIZATION OF

LACTIC ACID PRODUCTION FROM SWEET POTATO

By

Miss Raweewan Boonsompong

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Microbiology

Department of Microbiology

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2014

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ


บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพและการหาภาวะทเหมาะสมสาหรบการผลตกรดแลกตกจากมนเทศ ” เสนอโดย นางสาวรววรรณ บญสมปอง เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา ……...........................................................

(รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ) คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ........... อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

ผชวยศาสตราจารย ดร.เชาวรย อรรถลงรอง

คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ

.................................................... ประธานกรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร. ธงชย เตโชวศาล)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(รองศาสตราจารย ดร. วเชยร กจปรชาวนช)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ

(อาจารย ดร. วรญ พลสวสด) (ผชวยศาสตราจารย ดร. เชาวรย อรรถลงรอง)

............/......................../.......... ............/......................../..........

สำนกหอ


ง

55313201 : สาขาวชาจลชววทยา คาสาคญ : กรดแลกตก/ มนเทศ/ Box-Behnken design/ Plackett-Burman design/ Central Composite

design

รววรรณ บญสมปอง : การคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพและการหา ภาวะท เหมาะสมสาหรบการผลตกรดแลกตกจากมน เทศ . อาจารยทป รกษา วทยานพนธ : ผศ.ดร.เชาวรย อรรถลงรอง. 120 หนา. มนเทศมแปงเปนองคประกอบหลก ราคาถก และสามารถหาไดงายตลอดป จงเปนแหลงคารบอนทนาสนใจสาหรบการผลตกรดแลกตก โดยวตถประสงคของงานวจยนคอ เพอคดกรอง สายพนธแบคทเรยกรดแลกตกทมความเหมาะสมในการผลตกรดแลกตก พรอมทงหาภาวะและองคประกอบอาหารทเหมาะสมในการผลตกรดแลกตกโดยใชมนเทศ ดวยกระบวนการเปลยนเปนนาตาลพรอมกบการหมก พบวา Lactobacillus sp. FAG 302 เปนสายพนธแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก เมอใชแผนการทดลองแบบ Box-Behnken design ในการหาภาวะทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตก พบภาวะทเหมาะสม คอ การหมกกรดแลกตกทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 48 ชวโมง ดวยปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร ไดกรดแลกตก 118.67 กรมตอลตร จากนนคดเลอกองคประกอบอาหารทสงผลตอการผลตกรดแลกตกดวยแผนการทดลองแบบ Plackett-

Burman design พบวาม 6 ปจจย ทมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตกจากทงหมด 10 ปจจย

จากนนเลอก 5 ปจจย ซงประกอบดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และปรมาณมนเทศผง เพอใชในการศกษาหาคาทเหมาะสมขององคประกอบอาหารโดยใชวธพนผวตอบสนอง (Response surface methodology) ดวยแผนการทดลองแบบ Central Composite design (CCD) พบวาไดผลผลตกรดแลกตกสงสด 107.10 กรมตอลตร ดวยองคประกอบอาหารดงน ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร สารสกดจากเนอ 6 กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต 1 กรมตอลตร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร เมอทดลองในถงหมกขนาด 5 ลตร โดยใชองคประกอบอาหารและภาวะหมกทเหมาะสมทไดจากระดบขวดเขยา พบวาท 48 ชวโมง ไดกรดแลกตก 102.82 กรมตอลตร จากนนศกษาคา pH ทเหมาะสมในการหมกระดบถงหมกโดยใช 10 นอรมอลโซเดยมไฮดรอกไซด พบวา pH 6 ใหผลผลตกรดแลกตก 109.01

กรมตอลตรท 48 ชวโมง และ 119.29 กรมตอลตรท 72 ชวโมง ภาควชาจลชววทยา บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2557 ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ .........................................

สำนกหอ


จ

55313201: MAJOR: MICROBIOLOGY

KEY WORD: LACTIC ACID/ SWEET POTATO/ BOX-BEHNKEN DESIGN/ PLACKETT-

BURMAN DESIGN/ CENTRAL COMPOSITE DESIGN

RAWEEWAN BOONSOMPONG: SCREENING OF EFFICIENT LACTIC ACID

BACTERIA AND OPTIMIZATION OF LACTIC ACID PRODUCTION FROM SWEET POTATO.

THESIS ADVISOR: ASST. PROF CHAOWAREE ADTHALUNGRONG. 120 pp.

Sweet potato contains starch as a major composition. It is inexpensive and easily available

throughout the year. Therefore, it is an interesting alternative carbon source for the production of lactic acid.

The aims of this research were to screen lactic acid bacteria which were suitable for the production of lactic

acid. Moreover, optimum conditions and suitable medium components for the production of lactic acid from

sweet potato by a simultaneous saccharification and fermentation process were investigated. The results

indicated that Lactobacillus sp. FAG 302 showed high efficiency in the production of lactic acid. Then,

Box-Behnken design was used to determine optimal conditions for lactic acid production. The optimum

conditions were 34 ºC, 48 h with 180 g/L sweet potato powder. From the results, 118.67 g/L lactic acid was

obtained. Then, Plackett-Burman design was applied to select medium components which significantly

affected the efficiency of lactic acid production. The results showed that 6 out of 10 factors contributed

significant effect on the production of lactic acid. Five factors including winery yeast disposal, meat extract,

sodium acetate, potassium hydrogen phosphate and sweet potato powder were selected for medium

optimization by response surface methodology (RSM) with Central Composite Design (CCD). The highest

lactic acid was 107.10 g/L when using 25 g/L winery yeast disposal, 6 g/L meat extract, 1 g/L sodium acetate,

2 g/L potassium hydrogen phosphate and 180 g/L sweet potato powder. Subsequently, lactic acid fermentation

was carried out in a 5-litre fermenter using optimal conditions obtained from shake flask scale. After 48 h of

fermentation, the highest lactic acid at 102.82 g/L was observed. Then, optimal pH was studied by using 10 N

of sodium hydroxide. The results revealed that pH 6.0 was optimal. From the results, 109.01 and 119.29 g/L

of lactic acid were obtained at 48 and 72 h, respectively.

Department of Microbiology Graduate School, Silpakorn University

Student's signature........................................ Academic Year 2014

Thesis Advisor's signature.......................................

สำนกหอ


ฉ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนสามารถสาเรจไดดวยดจากความกรณาอยางยงของ ผชวยศาสตราจารย ดร. เชาวรย อรรถลงรอง อาจารยทปรกษาวทยานพนธทกรณาใหความร คาปรกษา คาแนะนา ขอเสนอแนะ อกทงใหการสนบสนนอปกรณ และสารเคมตางๆในงานวจย ตลอดจนตรวจแกไขวทยานพนธใหมความสมบรณมากยงขน ขอขอบคณคณาจารยภาควชาจลชววทยาทกทานทกรณาใหความรตลอดมา ขอขอบคณเจาหนาทหองปฎบตการภาควชาจลชววทยาทกทาน ทใหความชวยเหลอ และคาแนะนาในการปฎบตงาน ขอบคณรนพ รนนอง และเพอนๆทกคน ทเปนกาลงใจ คอยชวยเหลอ และใหคาปรกษา และสดทายขอขอบคณบดามารดา และครอบครวของผวจย ทสนบสนนดานการศกษา คอยใหกาลงใจ และคาปรกษาตลอดมา จนกระทงวทยานพนธฉบบนสาเรจลลวงไปไดดวยด ขอขอบคณมา ณ ทน

สำนกหอ


ช

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย ............................................................................................................................... ง

บทคดยอภาษาองกฤษ .......................................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ ................................................................................................................................ ฉ

สารบญตาราง ....................................................................................................................................... ฎ สารบญภาพ .......................................................................................................................................... ฑ บทท

1 บทนา ......................................................................................................................................... 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา ............................................................................ 1

วตถประสงคของการศกษา ................................................................................................ 3

สมมตฐานของการศกษา .................................................................................................... 3

ขอบเขตงานวจย ................................................................................................................. 3

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ ................................................................................................ 3

2 วรรณกรรมทเกยวของ ............................................................................................................... 4

กรดแลกตก ........................................................................................................................ 4

ประวตและคณสมบตของกรดแลกตก ....................................................................... 4

การผลตกรดแลกตก ................................................................................................... 5

ประโยชนของกรดแลกตก ......................................................................................... 7

มนเทศ ............................................................................................................................... 8

ความสาคญของมนเทศ .............................................................................................. 8

องคประกอบของมนเทศ ........................................................................................... 9

ประโยชนของมนเทศ ................................................................................................ 10

การผลตกรดแลกตกจากวตถดบประเภทแปง .................................................................... 10

การยอยแปง (starch hydrolysis) ................................................................................ 10

กระบวนการหมก (fermentation) .............................................................................. 10

แบคทเรยกรดแลกตก ......................................................................................................... 13

ประโยชนของแบคทเรยกรดแลกตก .......................................................................... 16

สำนกหอ


ซ

บทท หนา ปจจยทมผลตอการผลตกรดแลกตกโดยเชอจลนทรย ........................................................ 16

สายพนธของเชอจลนทรย .......................................................................................... 16

แหลงคารบอน ........................................................................................................... 17

แหลงไนโตรเจน ........................................................................................................ 18

แรธาต ........................................................................................................................ 19

คา pH ......................................................................................................................... 19

อณหภม ..................................................................................................................... 20

การออกแบบการทดลองแบบ Plackett-Burman design .................................................... 20

การออกแบบการทดลองดวยวธพนผวตอบสนอง (Response Surface Methodology) ...... 22

การออกแบบสวนประสมกลาง (Central Composite Design, CCD) ......................... 23

การออกแบบบอกซเบหนเคน (Box-Behnken Design) .............................................. 24

3 อปกรณและวธการดาเนนงานวจย ............................................................................................. 25

แหลงเชอจลนทรย ............................................................................................................. 25

มนเทศทใชในการทดลอง .................................................................................................. 25

สารเคมและอาหารเลยงเชอ ............................................................................................... 25

อปกรณและเครองมอ ........................................................................................................ 27

วธดาเนนงานวจย ............................................................................................................... 29

การเตรยมมนเทศ ....................................................................................................... 29

การยอยมนเทศเพอใชเปนซบสเตรตในการหมก ....................................................... 29

การเตรยมหวเชอสาหรบการหมกกรดแลกตก ........................................................... 29

การวเคราะหปรมาณกรดแลกตก นาตาลรดวซ และนาตาลกลโคส ........................... 29

การศกษาปรมาณแปงในมนเทศ ................................................................................ 31

การเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก ................... 31

การคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก ........ 32

การศกษาอณหภม เวลา และปรมาณมนเทศทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตก ของเชอทคดกรองไดโดยใช Box-Behnken design............................................. 32

การศกษาองคประกอบของอาหารทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกในระดบ ขวดเขยา ............................................................................................................. 34

สำนกหอ


ฌ

บทท หนา การคดเลอกองคประกอบอาหารทมผลตอการผลตกรดแลกตกของเชอ ทคดกรองไดโดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design ........................... 34

การหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการผลต

กรดแลกตกโดยใชวธพนผวตอบสนอง (Response Surface Methodology) ....... 36

การหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตร ............................................................. 40

การศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตก

ทคดกรองได ....................................................................................................... 40

4 ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง ................................................................................... 44

ผลการเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก ...................... 44

ผลการคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก ............ 47

ผลการศกษาอณหภม เวลา และปรมาณมนเทศทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตก ของเชอทคดกรองไดโดยใช Box-Behnken design ................................................... 50

ผลการศกษาองคประกอบของอาหารทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกระดบขวดเขยา . 58

ผลการคดเลอกองคประกอบอาหารทมผลตอการผลตกรดแลกตกของเชอ ทคดกรองไดโดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design ......................... 58

ผลการหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการผลต กรดแลกตกโดยใชวธพนผวตอบสนอง (Response Surface Methodology) ....... 62

ผลการหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตร ................................................................ 77

ผลการศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตกทคดกรองได 81

5 สรปผลการทดลอง และขอเสนอแนะ ........................................................................................ 83

สรปผลการทดลอง............................................................................................................. 83

ขอเสนอแนะ ...................................................................................................................... 84

รายการอางอง ....................................................................................................................................... 85

ภาคผนวก ............................................................................................................................................. 94

ภาคผนวก ก. อาหารเลยงเชอ ................................................................................................. 96

ภาคผนวก ข. การเตรยมสารเคม ............................................................................................ 98

ภาคผนวก ค. กราฟมาตรฐานและวธการวเคราะห ................................................................. 101

สำนกหอ


ญ

บทท หนา ภาคผนวก ง. ผลการจาแนกเชอ FAG 302 ............................................................................. 109 ภาคผนวก จ. ผลการศกษานาหนกมนเทศหลงการนง ........................................................... 113

ภาคผนวก ฉ. การเตรยมอปกรณและการควบคมถงหมกขนาด 5 ลตร (fermenter)

รน BIOSTAT.B บรษท B.Braum Biotech International สาหรบ การหมกกรดแลกตก ............................................................................................. 116

ประวตผวจย ......................................................................................................................................... 120

สำนกหอ


ฎ

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 คณสมบตทางกายภาพของกรดแลกตก ................................................................................ 5

2 องคประกอบทางเคมของมนเทศนอกเหนอจากแปง ............................................................ 9

3 แรธาตในมนเทศ ................................................................................................................... 9

4 ลกษณะทแตกตางกนระหวางแบคทเรยกรดแลกตกทง สกล .......................................... 15

5 ตวอยางจลนทรยทสามารถผลตกรดแลกตกและปรมาณกรดแลกตกทผลต ......................... 17

6 Initial block สาหรบแผนการทดลองแบบ Plackett-Burman dasign .................................... 21

7 แผนการทดลองแบบ Plackett-Burman design ทม N= ...................................................... 21

8 ระดบของปจจยในการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken Design ................................ 32

9 การวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken Design ชนด ปจจย ........................................ 33

10 ปจจยทสนใจศกษาโดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design

และคาทระดบสงและตาของแตละปจจย ...................................................................... 35

11 การวางแผนการทดลองแบบแฟคทอเรยล โดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design สาหรบ 10 ปจจย และ 5 dummy variable ............................. 36

12 ระดบของตวแปรในการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) .......... 37

13 การวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ชนด ปจจย .................... 37

14 ขนตอนการศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกโดยใชชดทดสอบของบรษท R-Biopharm GmbH ...................................................................................................... 41

15 คา pH นาตาลรดวซทเหลอ นาตาลกลโคสทเหลอ กรดแลกตก และ Productivity เมอหมกดวยกระบวนการ SSF โดย Lactobacillus sp. FAG บมทอณหภม องศาเซลเซยส เขยา รอบตอนาท เกบทเวลา ชวโมง ใชซบสเตรต มนเทศนงทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสท 70 องศาเซลเซยส เปรยบเทยบกบมนเทศผง ทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสท 70 และ 90 องศาเซลเซยส .............................................. 45

16 คา pH นาตาลรดวซทเหลอ นาตาลกลโคสทเหลอ กรดแลกตก คา Yp/s และ Productivity

เมอหมกโดยแบคทเรยกรดแลกตก สายพนธ บมทอณหภม องศาเซลเซยส เขยา รอบตอนาท ปรมาณมนเทศผง 0 กรมตอลตร เปนเวลา และ ชวโมง ........ 48

17 การผลตกรดแลกตกโดย Lactobacillus sp. FAG ในภาวะและปจจยทได จากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design ชนด ปจจย เขยา รอบตอนาท ................................................................................................... 51

สำนกหอ


ฏ

ตารางท หนา 18 การวเคราะหการถดถอยของพนผวตอบสนองสาหรบแผนการทดลอง Box- Behnken design ของการผลตกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG ........................... 52

19 การวเคราะหความแปรปรวนของแบบจาลองสาหรบแผนการทดลอง Box- Behnken design ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG .......................... 53

0 ผลการทวนสอบการหมกกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG

ในระดบขวดเขยาเมอใชรปแบบท ซงใชอณหภม องศาเซลเซยส

หมกเปนเวลา ชวโมง และใชปรมาณมนเทศผง 0 กรมตอลตร ............................ 57

1 การผลตกรดแลกตกของเชอ Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอสตรตางๆ ทไดจากแผนการทดลอง Plackett-Burman design ชนด ปจจยโดยใช มนเทศผง 0 กรมตอลตร บมท อณหภม องศาเซลเซยส เปนเวลา ชวโมง เขยา รอบตอนาท ................................................................................................... 59

2 ผลการวเคราะหความแปรปรวน สาหรบแผนการทดลอง Plackett-Burman design

ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG ..................................... 60

3 การผลตกรดแลกตกโดย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการ วางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ชนด ปจจย บมทอณหภม องศาเซลเซยส เขยา รอบตอนาท เปนเวลา ชวโมง ................ 64

4 การวเคราะหการถดถอยของพนผวตอบสนองสาหรบแผนการทดลอง Central Composite Design (CCD) ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG .......................................................................................... 66

5 การวเคราะหความแปรปรวนของแบบจาลอง สาหรบแผนการทดลอง Central Composite Design (CCD) ของการผลตกรดแลกตกโดยเชอ

Lactobacillus sp. FAG .......................................................................................... 68

6 ผลการทวนสอบการหมกกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG ในระดบขวดเขยาเมอใชสตรท ซงใชยสตเหลอทงจากการหมกไวน กรมตอลตร สารสกดจากเนอ กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต กรมตอลตร

ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 0 กรมตอลตร หมกเปนระยะเวลา ชวโมง ............................................................ 75

สำนกหอ


ฐ

ตารางท หนา 7 องคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการหมกกรดแลกตกกอนการปรบปรง เปรยบเทยบกบหลงการปรบปรง .................................................................................. 76

8 ผลการหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด ลตรโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG เมอใชสตรท เขยา รอบตอนาท หมกเปนระยะเวลา ชวโมง ......................... 77

9 ผลคา pH จากการหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด ลตรโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG เมอใชสตรท โดยการออกแบบการทดลองแบบ Central Composite Design (CCD) กวน รอบตอนาท ในระยะเวลา ชวโมงแรก หลงจากนนหมกเปนระยะเวลา ชวโมง ............................................ 79

30 กรดแลกตกจากเชอและแหลงคารบอนตาง ๆ ...................................................................... 80 31 คาการดดกลนแสง การคานวณความเขมขนกรดแลกตก การคานวณ content จากการศกษา stereoisomer ของกรดแลกตก โดยใชชดทดสอบของบรษท R-Biopharm GmbH ประเทศ เยอรมน .......................................................................... 82

32 ความสมพนธของความเขมขนนาตาลกลโคสกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน นาโนเมตร ............................................................................................................. 102

33 ความสมพนธของความเขมขนนาตาลกลโคสกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน นาโนเมตร ............................................................................................................. 103

34 ความสมพนธของความเขมขนนาตาลกลโคสกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 560 นาโนเมตร ............................................................................................................. 105

35 กจกรรมเอนไซมแอลฟาอะไมเลส และกจกรรมเอนไซมอะไมโลกลโคซเดสโดยใช 0 กรมตอลตร มนเทศผง ทาปฏกรยา เปนเวลา นาท .............................................. 107

36 ผลการจาแนกเชอ FAG ................................................................................................. 110

37 ลาดบนวคลโอไทดของเชอ FAG .................................................................................. 111

38 ขอมลการเปรยบเทยบความเหมอนของลาดบนวคลโอไทด ................................................. 111

39 ผลการศกษานาหนกมนเทศหลงการนง ............................................................................... 114

40 ปรมาณนาตาลกลโคส และปรมาณแปงในมนเทศนง .......................................................... 115

สำนกหอ


ฑ

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 โครงสรางกรดแลกตก L (+)-lactic acid และ D (-)-lactic acid ............................................ 4

2 กระบวนการผลตกรดแลกตก ............................................................................................... 5

3 กระบวนการหมกกรดแลกตก .............................................................................................. 12

4 วถการหมกกรดแลกตกจากกลโคสของแบคทเรยกรดแลกตก ............................................. 14

5 ภาพ 3 มต ของผลตอบสนองแบบโครงรางพนผว ................................................................ 23

6 ภาพ contour plot ของผลตอบสนองแบบโครงรางพนผว .................................................... 23

7 การออกแบบ Central Composite Design ............................................................................. 24

8 การออกแบบ Box-Behnken Design ..................................................................................... 24

9 คากรดแลกตกเมอหมกโดย Lactobacillus sp. FAG 302 ดวยกระบวนการหมกแบบ SSF

บมท อณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เกบผลทเวลา 72 ชวโมง ใชซบสเตรตมนเทศนงทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสท 70 องศาเซลเซยส เปรยบเทยบ กบมนเทศผง ทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสท 70 และ 90 องศาเซลเซยส ........................ 46

10 ประสทธภาพของแบคทเรยกรดแลกตก สายพนธ ตอการผลตกรดแลกตกเมอเพาะเลยง ในอาหารเลยงเชอทมปรมาณมนเทศผง 0 กรมตอลตร บมทอณหภม องศาเซลเซยส เขยา รอบตอนาท เปนเวลา และ ชวโมง.......................... 49

11 ความสมพนธระหวางคาผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทดลอง และผลผลตกรดแลกตก

ทไดจากการทานายสาหรบแผนการทดลอง Box-Behnken design ............................... 54

12 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางอณหภม และปรมาณมนเทศผง ตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box- Behnken design เขยา รอบตอนาท ................................................................................................... 54

กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางระยะเวลาในการหมกและปรมาณ มนเทศผงตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design เขยา รอบตอนาท ................................................................................................... 55

สำนกหอ


ฒ

ภาพท หนา 14 กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางอณหภม และระยะเวลาในการหมก ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box- Behnken design เขยา รอบตอนาท ................................................................................................... 55

15 ความสมพนธระหวางคาผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทดลอง และผลผลตกรดแลกตก ทไดจากการทานาย สาหรบแผนการทดลอง Central Composite Design (CCD) ......... 68

16 กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และสารสกดจากเนอตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลอง โดย Central Composite Design (CCD) ........................................................................ 69

7 กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และโซเดยมอะซเตต ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผน การทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ...................................................... 69

8 กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต ตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผน การทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ...................................................... 70

กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน

และปรมาณมนเทศผง ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย

Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย

Central Composite Design (CCD) ............................................................................... 70

กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางสารสกดจากเนอและโซเดยมอะซเตต ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอ ทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ..................... 71

กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางสารสกดจากเนอ และไดโพแทสเซยม

ไฮโดรเจนฟอสเฟตตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) .......................................................................................................................... 71

สำนกหอ


ณ

ภาพท หนา 2 กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางสารสกดจากเนอ และปรมาณ มนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)............................................................................................................... 72

กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางโซเดยมอะซเตตและ ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟตตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผน การทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ...................................................... 72

กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางโซเดยมอะซเตตและ

ปรมาณมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG

ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design

(CCD) ........................................................................................................................... 73

กราฟพนผวตอบสนองแสดงความสมพนธระหวางไดโพแทสเซยม ไฮโดรเจนฟอสเฟตและปรมาณมนเทศผง ตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลอง โดย Central Composite Design (CCD) ........................................................................ 73

คากรดแลกตก ระยะเวลาในการหมก และ pH จากการหมกกรดแลกตกในถงหมก

ขนาด ลตรโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG เมอใชสตรท โดยการออกแบบ การทดลองแบบ Central Composite Design (CCD) กวน รอบตอนาท

ในระยะเวลา ชวโมงแรก หลงจากนน กวน รอบตอนาท

หมกเปนระยะเวลา ชวโมง....................................................................................... 80

7 กราฟมาตรฐานนาตาลรดวซทความยาวคลน นาโนเมตร .............................................. 102

8 กราฟมาตรฐานนาตาลกลโคสทความยาวคลน นาโนเมตร ........................................... 103

9 กราฟมาตรฐานกรดแลกตกทความยาวคลน 560 นาโนเมตร................................................ 105

30 ความสมพนธทางววฒนาการระหวาง FAG 302 กบสายพนธใกลเคยง ................................ 112

สำนกหอ


1

บทท 1

บทนา

1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา กรดแลกตกเปนกรดอนทรยทผลตไดจากกระบวนการสงเคราะหทางเคมหรอกระบวนการหมกโดยเชอจลนทรย สามารถนาไปใชประโยชนไดอยางแพรหลายทงใน อตสาหกรรมอาหาร ชวยในการถนอมอาหาร เปนสารเพมกลนและรสชาต หรอในอตสาหกรรมทไมใชอาหาร เชน ยา เครองหนง สงทอ และเครองสาอาง นอกจากนนยงใชในอตสาหกรรมการผลตสารสงเคราะหโพลเมอร ซงใชเปนว สดเรมตนในการผลตพลาสตกยอยสลายทางชวภาพ (Eiteman and Ramalingam, ; John, et al., ; Li, et al., ) กรดแลกตกสามารถผลตไดจากทงกระบวนการสงเคราะหทางเคม และกระบวนการหมกโดยเชอจลนทรย ซงพบวาประมาณ 90 เปอรเซนต ของกรดแลกตกถกผลตโดยกระบวนการหมกโดยเชอจลนทรย (Hofvendahl and

Hahn-Hagerdal, ) แหลงคารบอนสาคญสาหรบกระบวนการหมกกรดแลกตก คอ นาตาลซโครส และนาตาลกลโคส ซงเปนวตถดบทมราคาสง ดงนนการประยกตใชวตถดบทางการเกษตร และของเสยจากกระบวนการทางชวภาพ เชน กากนาตาล หรอเวย จงเปนทางเลอกในการ ลดคาใชจายของวตถดบในการหมก (Anuradha, et al., ; John, et al., ) การใชแหลงคารบอนราคาถกเปนแนวทางทมประสทธภาพในการผลตกรดแลกตกดงนนวตถดบทนามาใชในการหมกกรดแลกตกจะตองมราคาถก มการปนเปอนจากจลนทรยนอย ใหอตราการผลตกรดแลกตกเรว ใหคาอตราการผลตสง สรางผลผลตอน ๆ ทไมตองการนอย และใหผลผลตทคงท (Silveira, et al., ) มนเทศเปนวตถดบทางการเกษตรทมความสาคญเปนอนดบ 7 ของโลก แหลงเพาะปลกทสาคญมากกวา 80 เปอรเซนต อยในทวปเอเชย เชน ประเทศจน และประเทศอนเดย (Ray

and Ravi, ; Van Hal, ) มนเทศอดมไปดวยแหลงคารโบไฮเดรต และสารอาหารอนๆ เชน วตามน แคลเซยม และโพแทสเซยม เปนตน ซงสามารถนามาใชเปนแหลงอาหารในการหมกเพอผลตเอทานอล กรดอนทรย และกรดแลกตก เปนตน (Panda and Ray, ; Ray and Ravi, )

สำนกหอ


2

การผลตกรดแลกตกจากมนเทศโดยกระบวนการหมกดวยเชอจลนทรย จงเปนอกหนงแนวทางทนาสนใจ โดยการใชมนเทศซงเปนพชเศรษฐกจ สามารถหาไดงาย ราคาไมสง และมผลผลตเกบเกยวไดตลอดป มาใชเปนวตถดบในการผลตกรดแลกตก นอกจากนในประเทศไทยยงมการศกษาการผลตกรดแลกตกจากมนเทศอยนอยมาก โดยในงานวจยครงนเลอกศกษากระบวนการหมกโดยการเปลยนเปนนาตาลพรอมกบการหมก หรอ Simultaneous saccharification and

fermentation (SSF) เนองจากเปนกระบวนการทมประสทธภาพสง เหมาะกบการใชวตถดบทางการเกษตรมาผลตกรดแลกตกโดยใชเชอจลนทรย ลดขนตอนในการผลต ลดคาใชจาย เนองจากรวมขนตอนการยอยและหมกเขาดวยกน ผลผลตตอระยะเวลาสงขน และนอกจากนนยงลดปญหาการใชนาตาลเรมตนสงอกดวย (Sreenath, et al., ) ดงนนในการวจยนจงไดศกษาและพฒนาการหมกกรดแลกตกโดยใชมนเทศเปนวตถดบ เพอเปนแนวทางสาหรบการพฒนาในระดบอตสาหกรรม โดยศกษาภาวะ และองคประกอบของอาหารทเหมาะสมตอกระบวนการหมกกรดแลกตก เชน สายพนธจลนทรย อณหภม และระยะเวลาในการหมก เปนตน นอกจากนนยงนายสตเหลอทงจากการหมกไวน ซงเปนของเหลอทงจากอตสาหกรรมมาประยกตใชแทนแหลงไนโตรเจนทมราคาสง เพอเปนการลดตนทนในการผลต

สำนกหอ


3

2. วตถประสงคของการศกษา 2.1 เพอคดกรองสายพนธแบคทเรยทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก

2.2 เพอหาภาวะการหมกและองคประกอบอาหารเลยงเชอทเหมาะสมในการผลตกรดแลกตกโดยใช Plackett-Burman design และ Response surface methodology (RSM)

3. สมมตฐานของการศกษา 3.1 สายพนธแบคทเรยทคดกรองไดสามารถผลตกรดแลกตกจากมนเทศไดดเมอใชกระบวนการ Simultaneous saccharification and fermentation (SSF)

3.2 เมอใชภาวะการหมก องคประกอบอาหารเลยงเชอทเหมาะสม และสายพนธแบคทเรยทคดกรองไดจะสามารถผลตกรดแลกตกไดสงกวา 100 กรมตอลตร เมอใชมนเทศเปนวตถดบและใชกระบวนการ SSF

4. ขอบเขตงานวจย

4.1 คดกรองสายพนธแบคทเรยทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก

4.2 ศกษาภาวะการหมก เชน อณหภม และระยะเวลาในการหมก ตอการผลต กรดแลกตกของสายพนธแบคทเรยทคดกรองได

4.3 หาคาทเหมาะสมขององคประกอบอาหารเลยงเชอ ทสงผลตอการผลตกรด แลกตกของสายพนธแบคทเรยทคดกรองได

4.4 ทดสอบการผลตกรดแลกตกของสายพนธแบคทเรยทคดกรองได โดยใชภาวะ และองคประกอบอาหารทเหมาะสมมาหมกในถงหมกขนาด 5 ลตร

5. ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

5.1 ไดสายพนธแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก

5.2 ทราบภาวะในการหมก และองคประกอบอาหารเลยงเชอทเหมาะสมในการผลตกรดแลกตกจากมนเทศโดยกระบวนการ SSF

สำนกหอ


4

บทท 2

วรรณกรรมทเกยวของ

1. กรดแลกตก

1.1 ประวตและคณสมบตของกรดแลกตก กรดแลกตกถกพบครงแรกในสวนประกอบของนมเปรยวโดย Carl Wilhelm Scheele นกวทยาศาสตรชาวสวเดน ในป ค.ศ.1780 และตอมาใน ป ค.ศ.1789 Lavoisier ตงชอสวนประกอบของนมเปรยวนนวา “acid lactique” ซงกลายเปนจดเรมตนของคาวา Lactic acid หรอ กรดแลกตก ในปจจบน นอกจากนนใน ป ค.ศ.1857 Pasteur คนพบวากรดแลกตกไมเพยงพบแตในนมเปรยว แตสามารถพบไดจากกระบวนการหมกโดยเชอจลนทรยอกดวย และในป ค.ศ.1881 Fermi พบวากรดแลกตกโดยกระบวนการหมกสามารถผลตในระดบอตสาหกรรมได (Martinez, et al., ; Wee,

et al., ) กรดแลกตกมชอทางเคมวา 2-hydroxypropanoic acid หรอ 2-hydroxypropinoic acid

เปนกรดอนทรยทม hydroxyl group (-OH) และ carboxyl group (-COOH) อยดวย มสตรโมเลกล คอ CH3CH(OH)COOH มโครงสราง 2 รปแบบ ซงเปน optical isomer ซงกนและกน คอ L(+)-lactic

acid และ D(-)-lactic acid (Eldeleklioglu, et al., 2013; Wee and Ryu, 2009) ดงภาพท 1

ภาพท 1 โครงสรางกรดแลกตก L (+)-lactic acid และ D (-)-lactic acid (Martinez, et al., ) กรดแลกตกไมมส ไมมกลน ระเหยไดยาก สามารถละลายไดในนา แอลกอฮอร (alcohol) อะซโตน (acetone) อเทอร (ether) เฟอฟรอล (furfurol) ปโตรเลยมอเทอร (petroleum

ether) คลอโรฟอรม (chloroform) และคารบอนไดซลไฟด (carbon disulfide) (Okafor, 2007) และมคณสมบตทางกายภาพดงตารางท 1

L (+) Lactic acid D (-) Lactic acid

สำนกหอ


5

ตารางท 1 คณสมบตทางกายภาพของกรดแลกตก คณสมบต คาทวดได

มวลโมเลกล 90.08

จดหลอมเหลว 16.8 องศาเซลเซยส

จดเดอด 82 องศาเซลเซยส ทความดน 0.5 มลลเมตรปรอท

122 องศาเซลเซยส ทความดน 14 มลลเมตรปรอท คาคงทการแตกตว (Ka ท 25 องศาเซลเซยส) 1.37×10-4

คาความรอนของการเผาไหม (∆Hc) 1361 กโลจลตอโมล คาความรอนจาเพาะ (Cp ท 20 องศาเซลเซยส) 190 จลตอโมลตอองศาเซลเซยส

(ทมา: Narayanan, et al., 2004)

1.2 การผลตกรดแลกตก

กรดแลกตกสามารถผลตได 2 วธ คอ กระบวนการสงเคราะหทางเคม และกระบวนการหมกโดยเชอจลนทรย (John, et al., ; Wee, et al., ) แสดงดงภาพท 2

ภาพท 2 กระบวนการผลตกรดแลกตก (a) กระบวนการสงเคราะหทางเคม (b) กระบวนการ หมกโดยเชอจลนทรย (Wee, et al., )

สำนกหอ


6

1.2.1 การสงเคราะหทางเคม

กระบวนการสงเคราะหทางเคมเรมตนจากการทาปฏกรยากนระหวาง ไฮโดรเจนไซยาไนด (HCN) กบ อะซตอลดไฮด (CH3CHO) ภายใตความรอนสง ไดเปน แลคโตไนไตร (lactonitrile)

CH3CHO + HCN CH3CHOHCN (lactonitrile)

นาแลคโตไนไตร (lactonitrile) ทไดมาทาปฏกรยากบกรดซลฟรก (H2SO4) หรอ ไฮโดรคลอรก (HCl) ไดเปนกรดแลกตกและเกลอแอมโมเนยม (Narayanan, et al., )

CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4 CH3CH(OH)COOH + ½(NH4)2SO4

หรอ CH3CHOHCN + 2H2O + HCl CH3CH(OH)COOH + NH4Cl

หลงจากนนนากรดแลกตกทไดมาทาใหบรสทธโดยกระบวนการ esterification และกระบวนการไฮโดรไลซสโดยนา

CH3CH(OH)COOH + CH3OH CH3CHOHCOOCH3 + H2O

CH3CHOHCOOCH3 + H2O CH3CH(OH)COOH + CH3OH

กระบวนการสงเคราะหทางเคมทาใหไดกรดแลกตกในรป racemic D/L-lactic acid ทไมทราบสดสวนทแนนอน นอกจากนนวตถดบตงตนทไดมาจากกระบวนการปโตรเคม นามน และกาซ มขอจากดดานปรมาณ อกทงในกระบวนการผลตมการใชพลงงานสง และเกดมลภาวะตอโลก (Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, ) 1.2.2 การหมกโดยเชอจลนทรย

การหมกกรดแลกตกโดยเชอจลนทรยทาใหไดกรดแลกตกในรป D-lactic acid,

L-lactic acid หรอ D/L-lactic acid ขนอยกบสายพนธของจลนทรยทใช นอกจากนนยงสามารถนาแหลงพลงงานทางเลอก คอวตถดบทางการเกษตร หรอวตถดบทเหลอทงจากโรงงานอตสาหกรรมมาใชเปนซบสเตรตในการผลตได เชน นาตาลซโครส นาตาลกลโคส เวย กากนาตาล แปงมนฝรง หรอแปงขาวโพด เปนตน จงทาใหการหมกกรดแลกตกโดยเชอจลนทรยมตนทนการผลตทไมสง ใชพลงงานและอณหภมในการผลตตา ทงนยงไมทาใหเกดกาซคารบอนไดออกไซด ซงเปนการชวย

catalyst

สำนกหอ


7

ในการอนรกษสงแวดลอมอกทางหนง (John, et al., ; Moon, et al., ) กระบวนการหมกกรดแลกตกโดยเชอจลนทรย และการทาบรสทธ แสดงดงสมการ (Narayanan, et al., )

กระบวนการหมก และ neutralization

C6H12O6 + Ca (OH) 2 2(CH3CHOHCOO-) Ca2+ + 2H2O

กระบวนการไฮโดรไลซสโดยกรดซลฟวรก 2(CH3CHOHCOO-) Ca2+ + H2SO4 2CH3CHOHCOOH + CaSO4

กระบวนการ esterification

2CH3CHOHCOOH + CH3OH CH3CHOHCOOCH3 + H2O

กระบวนการไฮโดรไลซสโดยนา CH3CHOHCOOCH3 + H2O CH3CH(OH)COOH + CH3OH

1.3 ประโยชนของกรดแลกตก

1.3.1 ใชในอตสาหกรรมอาหาร กรดแลกตกทผลตไดทงหมดประมาณ 85 เปอรเซนต ถกนามาใชในอตสาหกรรมอาหาร โดยใชเปนสารเพมความเปนกรดในอาหาร (acidulant) เปนสารเพมกลนและรสชาต (flavor enhancer) ชวยใหเนอสมผสอาหารมสภาพดขน ใชเปนตวจบสารชนดอน (chelating agent)

และ ชวยในการถนอมอาหาร เชน ขนมปง ผลตภณฑเบเกอร เครองดม ผลตภณฑจากนม เบยร แยม และผลตภณฑไขแปรรป (John, et al., ) 1.3.2 ใชในอตสาหกรรมทไมใชอาหาร

มการนากรดแลกตกมาใชในอตสาหกรรมการผลตเครองสาอาง และเภสชภณฑ เชน โลชน สารใหความชมชน สารตานสว ยาตานการอกเสบ ใชในรปแคลเซยมแลกเตทผสมในยาสฟนเปนสารตานทานฟนผ และใชในการรกษาการขาดแคลเซยม เปนตน และนอกจากนนยงนากรดแลกตกมาใชเปนสารเพมความเปนกรดในอตสาหกรรมการฟอกหนง และสงทอ ทาใหมราคาถกและยงเปนมตรกบสงแวดลอม (John, et al., ; Naveena, et al., )

สำนกหอ


8

1.3.3 ใชในอตสาหกรรมการผลตสารสงเคราะหโพลเมอร

ประโยชนของกรดแลกตกอกดานทกาลงเปนทสนใจ คอ โพลเมอรทอยในรปของโพลแลกตก (polylactic acid, polylactide) เนองจากเปนผลตภณฑทยอยสลายไดทางชวภาพ และเปนมตรตอสงแวดลอม จงถกนามาใชในการผลตพลาสตกทยอยสลายไดทเรยกวา biodegradable

plastics เชน เครองอปโภคจาพวกภาชนะ และสามารถนามาใชทางดานการแพทย เชน ใชในการผลตเสนใยในการเยบแผล ใชโพลแลกตกในการผลตแคปซลเปนตวควบคมการหลงของยาในผปวย เปนตน (Ghaffar, et al., ; Vijayakumar, et al., )

2. มนเทศ

2.1 ความสาคญของมนเทศ มนเทศ (Sweet potato) มชอวทยาศาสตรวา Ipomoea batatas (L.) เปนพชเถาเลอย ใบเลยงค อยในตระกล Convolvulaceae เปนพชอาหารสาคญเปนอนดบ 7 ของโลก รองจากขาวสาล ขาว ขาวโพด มนฝรง ขาวบารเลยและมนสาปะหลง และจดเปนพชอาหารทสาคญเปนอนดบ 5 ของประเทศกาลงพฒนา มนเทศมถนกาเนดในเขตรอนแถบอเมรกากลาง มความสามารถปรบตวใหเขากบสภาพแวดลอมไดหลาย ๆ พนท ปจจบนมการปลกมนเทศอยทวไปทงเขตรอนและเขตอบอน ผลผลตมนเทศทวโลกสวนใหญมาจากประเทศทกาลงพฒนา ประมาณรอยละ 90 อยในทวปเอเชย รอยละ 5 ผลตในแอฟรกาและทเหลออกรอยละ 5 มาจากสวนอน ๆ ของโลก ประเทศทมการปลกมนเทศในปรมาณมาก ไดแก จน อนโดนเซย อกนดา เวยดนาม อนเดย ญปน เกาหล และฟลปปนสมนเทศมหลายสายพนธแตกตางกนจงทาใหมความแตกตางกนในดานสของผวหวมนเทศ เนอ ขนาด รปรางของรากและใบ ความลกของการเกดราก ระยะเวลาในการเจรญเตมท ความตานทานตอโรคและลกษณะเนอสมผสของหวทปรงสกแลว (Woolfe, 1992) มนเทศถกนาไปใชประโยชน อยางมากมาย ทงในรปของอาหารมนษย และอาหารสตว โดยใชไดทงหว ใบ และยอดออน นาไปแปรรปเพอผลตเปนแปง ขนมขบเคยว และสรา (Martin, ) สาหรบประเทศไทยมการปลกมนเทศทวทกภาค เนองจากปลกงาย ปลกไดในดนทกชนด เงนลงทนตา เปนพชทมความทนทานตอความแหงแลง (สารานกรมไทยสาหรบเยาวชนฯ) และจากสถตการปลกมนเทศของกรมสงเสรมการเกษตรในป 2548 พบวาพนทปลกมนเทศทวทกภาคของประเทศไทยมประมาณ 35,905 ไร และมผลผลต 83,945 ตน

สำนกหอ


9

2.2 องคประกอบของมนเทศ

มนเทศมแปงเปนองคประกอบหลกซงอาจมปรมาณแปงไมเทากนในแตละสายพนธ มรายงานวจยทรายงานปรมาณแปงในมนเทศดงน กลมทมปรมาณแปง 12-17 เปอรเซนต ( Panda, et al., ; Thao and Noomhorm, ) ก ลมป รม าณแ ป ง 18-27 เ ปอ ร เ ซนต (Panda, et al., ) และกลมปรมาณแปง 28-30 เปอรเซนต (Zhang and Oates, 1999) นอกจากนนยงมองคประกอบอน ๆ แสดงดงตารางท 2 และแรธาตตาง ๆ แสดงดงตารางท 3

ตารางท องคประกอบทางเคมของมนเทศนอกเหนอจากแปง องคประกอบของมนเทศ คาทวดได (รอยละของนาหนกมนเทศ)

ความชน 63.19

โปรตน 1.86

เสนใย 0.73

เถา 2.52

(ทมา: Oluwole, et al., )

ตารางท 3 แรธาตในมนเทศ

แรธาต คาทวดได (มลลกรมตอ 100 กรมมนเทศ)

แคลเซยม 35.00

ธาตเหลก 0.58

แมกนเซยม 26.00

ฟอสฟอรส 51.00

โพแทสเซยม 283.00

โซเดยม 38.00

วตามนซ 2.00

(ทมา: Panda, et al., )

สำนกหอ


10

โครงสรางทางเคมของแปงประกอบดวยโพลเมอรของกลโคส 2 ชนด คอ โพลเมอรเชงเสน หรอ อะไมโลส (amylose) เปนโครงสรางทเชอมตอกนดวยพนธะ (1-4) α-glycosidic

linkage และโพลเมอรเชงกง หรออะไมโลเพกตน (amylopectin) ทโครงสรางเชอมตอกนดวยพนธะ (1-4) α-glycosidic linkage และพนธะ (1-6) α-glycosidic linkage ซงแปงจากแหลงทแตกตางกนจะมอตราสวนของอะไมโลสและอะไมโลเพกตนแตกตางกน (Okafor, 2007)

2.3 ประโยชนของมนเทศ

มนเทศถกนามาใชประโยชนมากมายทงใชเปนอาหารเลยงสตว และเปนอาหารของคนมนเทศสามารถนามาประกอบอาหารไดทงคาวและหวานไมวาจะเปนการทอด การตม หรอแมแตแปรรปเปนขนมขบเคยว (Zuraida, ) และมนเทศยงสามารถแปรรปเปนแปงใชในการผลต เสนกวยเตยว เบเกอร และนาตาล (Abegunde, et al., ) นอกจากนนยงมรายงานวจยทนามนเทศมาใชในการผลตกรดแลกตก (Nguyen, et al., 2013; Panda, et al., 2009; Panda, et al., 2007; Panda

and Ray, 2008) และการผลตเอทานอลอกดวย (Chu, et al., 2012; Swain, 2013) 3. การผลตกรดแลกตกจากวตถดบประเภทแปง

วตถดบประเภทแปง ไดแก ขาวโพด มนสาปะหลง มนฝรง และมนเทศ เปนตน ซงในการผลตกรดแลกตก แปงในวตถดบจะตองถกยอยใหไดนาตาลกลโคสกอน เชอจลนทรยจงจะสามารถเปลยนนาตาลเปนกรดแลกตกได ซงการผลตกรดแลกตกจากแปงประกอบดวย 2 ขนตอน (กรมสงเสรมอตสาหกรรม, 2552) คอ 3.1 การยอยแปง (starch hydrolysis)

กระบวนการยอยแปงประกอบดวย 2 ขนตอนคอ กระบวนการ liquefaction และ กระบวนการ saccharification (Anuradha, et al., ) 3.1.1 กระบวนการ liquefaction คอกระบวนการยอยแปงดวย เอนไซมก ลม แอลฟาอะไมเลส (alpha-amylase) เรงปฏกรยาไฮโดรไลซโมเลกลแปงทผานการทาใหสกแลว

(gelatinized starch) โดยการตดพนธะแบบสมทาใหเ กดนาตาลสายสนลง คอ dextrins และ oligosaccharides ซงโมเลกลของอะไมโลสและอะไมโลเพกตนบางสวนถกยอยใหมขนาดเลกลงทาใหแปงมความหนดลดลง (Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, 1997) 3.1.2 กระบวนการ saccharification คอกระบวนการยอยสลายนาตาล dextrins ใหไดเปนนาตาลโมเลกลชนดตาง ๆ ตามชนดของเอนไซมทใช เชน อะไมโลกลโคซเดส ยอยไดนาตาลกลโคส

สำนกหอ


11

3.2 กระบวนการหมก (fermentation)

เปนกระบวนการหมกนาตาลกลโคสเปนกรดแลกตกโดยเชอจลนทรย ซงกระบวนการผลตกรดแลกตกโดยการหมกดวยเชอจลนทรยมหลายวธ สามารถสรปได 4 วธ คอ Simultaneous

liquefaction, saccharification and fermentation (SLSF), Two-step fermentation (TSF),

Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) และ Clarifying solution fermentation in SSF

(CSF) (Wang, et al., 2010) แสดงดงภาพท 3

3.2.1 Simultaneous liquefaction, saccharification and fermentation (SLSF)

เปนกระบวนการทรวมขนตอนทงหมดเขาดวยกน ประกอบดวยขนตอน liquefaction,

saccharification และ fermentation โดยยอยวตถดบดวยเอนไซมพรอมกบหมกดวยเชอจลนทรย ไดผลตภณฑสดทายเปนกรดแลกตก ซงเปนกระบวนการทใชระยะเวลานอย (Chindaruska and Pin,

) 3.2.2 Two-step fermentation (TSF)

เปนกระบวนการหมกททาแยกทกขนตอนโดยยอยวตถดบดวยแอลฟาอะไมเลสในขนตอน liquefaction และยอยตอดวยกลโคอะไมเลสในขน saccharification จนไดนาตาลกลโคส จากนนจงนามาหมกดวยเชอจลนทรย

3.2.3 Simultaneous saccharification and fermentation (SSF)

เปนกระบวนการหมกทรวมขนตอน saccharification และ fermentation เขาดวยกน โดยนาวตถดบมายอยดวยแอลฟาอะไมเลสในขนตอน liquefaction กอน จากนนยอยตอดวยกลโคอะไมเลสในขน saccharification พรอมกบหมกดวยเชอจลนทรย กระบวนการหมกแบบ SSF

จงชวยลดขนตอนในการผลต และชวยลดปญหาการใชนาตาลเรมตนสง เนองจากเปนวธทรวมขนตอน saccharification และ fermentation เขาดวยกน ดงนนในระหวางขนตอน saccharification

กจะเกดการยอยเดกซทรนเปนนาตาลกลโคสอยางตอเนองดวย กลโคอะไมเลส พรอมกบเกดการหมกโดยเชอจลนทรย(Chindaruska and Pin, 2008; Eiteman and Ramalingam, 2015)

3.2.4 Clarifying solution fermentation in SSF (CSF)

กระบวนการนจะคลายกบกระบวนการหมกแบบ SSF ตางกนตรงทเมอยอยดวยแอลฟาอะไมเลสในขนตอน liquefaction เสรจแลวนาไปปนเหวยงเพอแยกเอาสวนตะกอนออกกอน จากนนนาไปยอยดวยกลโคอะไมเลสพรอมกบหมกดวยเชอจลนทรย เชนเดยวกบกระบวนการหมกแบบ SSF (Wang, et al., 2010)

สำนกหอ


12

ภาพท 3 กระบวนการหมกกรดแลกตก (ทมา: Wang, et al., )

สำนกหอ


13

4. แบคทเรยกรดแลกตก

แบคทเรยกรดแลกตก หมายถงกลมแบคทเรยทมความสามารถในการหมกนาตาลกลโคส และใหกรดแลกตกเปนผลตภณฑหลกในการหมก เปนแบคทเรยแกรมบวก ไมสรางสปอร ไมสรางเอนไซม catalase ทนตอความเปนกรด ลกษณะทางสณฐานวทยาพบวามรปรางทงกลมและแทง สามารถเจรญไดในททไมมอากาศ บางชนดตองการอากาศเพยงเลกนอยในการเจรญ (Reddy, et al., ) แบคทเรยกรดแลกตกมความตองการธาตอาหารซบซอนเพอใชในการเจรญ ดงนนจงสามารถพบแบคทเรยกรดแลกตกไดในอาหารหมกดอง ผลตภณฑจากนม ภายในรางกายมนษย เชน ชองปาก และระบบทางเดนอาหาร รวมไปถงในเลอดสตว (Hofvendahl and Hahn-

Hagerdal, ) การศกษาอนกรมวธานของแบคทเรยกรดแลกตกโดยอาศยลกษณะทางกายภาพ สมบตทางชวเคม ลกษณะสณฐาน องคประกอบผนงเซลล ทาใหพบลกษณะทแตกตางกนของแบคทเรยกรดแลกตกแตละสกล ซงสามารถจาแนกไดทงหมด 12 สกล คอ Aerococcus, Carnobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Weissella และ Vagococcus (Axelsson, 1998) แสดงดงตารางท 4

แบคทเรยกรดแลกตกสามารถแบงออกเปน 2 กลม ตามความสามารถในการหมก คอ ก า รห มก แ บบ Homofermentation แ ล ะ ก า ร หมก แ บ บ Heterofermentation ( Eiteman and

Ramalingam, ) กระบวนการหมกแบบ Homofermentation เปนการหมกนาตาลกลโคส หรอนาตาลทมคารบอน 6 อะตอม ผานวถไกลโคไลซส (Glycolysis) หรอ Embden-Meyerhof-Parnas pathway

(EMP pathway) โดยการเปลยนนาตาลกลโคสไปเปนไพรเวท (pyruvate) จากนนเอนไซม lactate

dehydrogenase (LDH) จะเปลยนไพรเวทไปเปนกรดแลกตก ซงนาตาลกลโคส 1 โมลเมอผานกระบวนการหมกแลวจะไดกรดแลกตก 2 โมล (Reddy, et al., 2008) แสดงดงภาพท 4 A.

กระบวนการหมกแบบ Heterofermentation เปนการหมกนาตาลกลโคส หรอนาตาลอนผานวถ Phosphoketolase (PK pathway) หรอ 6-phosphogluconate pathway (6-PG pathway) โดยการเปลยนนาตาลกลโคสไปเปนนาตาลทมคารบอน 5 อะตอม จากนนเอนไซม Phosphoketolase จะแตกนาตาลทมคารบอน 5 อะตอม เปน Acetyl-phosphate และ Glyceraldehyde-3-phosphate

ตอมา Glyceraldehyde-3-phosphate จะถกเปลยนไปเปนไพรเวท และไดกรดแลกตกเชนเดยวกนกบวถไกลโคไลซส (Glycolysis) สวน Acetyl-phosphate จะถกเปลยนไปเปนเอทานอลหรอกรด อะซตกซงนาตาลกลโคส 1 โมลเมอผานกระบวนการหมกแลวจะไดกรดแลกตก 1 โมล

สำนกหอ


14

เอทานอลหรอกรดอะซตก 1 โมล และ กาสคารบอนไดออกไซด 1 โมล (Martinez, et al., ;

Reddy, et al., ) แสดงดงภาพ 4 B.

ภาพท 4 วถการหมกกรดแลกตกจากกลโคสของแบคทเรยกรดแลกตก

A. กระบวนการหมกแบบ Homofermentation

B. กระบวนการหมกแบบ Heterofermentation

(ทมา: Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, )

สำนกหอ


15

ตารางท 4 ลกษณะทแตกตางกนระหวางแบคทเรยกรดแลกตกทง 12 สกล

คณสมบต

สกล

รปรางทอน รปรางกลม

Carnobacterium Lactobacillus Aerococcus Enterococcus Lactococcus

Vagococcus

Leuconostoc

Oenococcus Pediococcus Streptococcus Tetragenococcus Weissella

เซลลตดกน 4 เซลล - - + - - - + - + -

สราง CO2 จากการหมกกลโคส - ± - - - + - - - +

เจรญท 10 องศาเซลเซยส + ± + + + + ± - + +

เจรญท 45 องศาเซลเซยส - ± - + - - ± ± - -

เจรญใน 6.5 เปอรเซนต NaCl ND ± + + - ± ± - + ±

เจรญใน 18 เปอรเซนต NaCl - - - - - - - - + -

เจรญท pH 4.4 ND ± - + ± ± + - - ±

เจรญท pH 9.6 - - + + - - - - + -

ไอโซเมอรของกรดแลกตก L D, L, DL L L L D L, DL L L D, DL

เครองหมาย + คอ ใช, - คอ ไมใช, ± คอ ผลขนกบสายพนธ และ ND คอ ไมระบ

(ทมา: Axelsson, )

สำนกหอ


16

4.1 ประโยชนของแบคทเรยกรดแลกตก

4.1.1 การใชแบคทเรยกรดแลกตกเปนโปรไบโอตก (Probiotic)

โปรไบโอตก คอ จลนทรยทมประโยชนตอรางกายของสงมชวตทอาศยอย ซงแบคทเรยกรดแลกตกจดเปนโปรไบโอตก ทสามารถผลตแบคทรโอซน (bacteriosin) ซงชวยยบยงการเจรญของแบคทเรยททาใหเกดโรคในลาไสใหญ (Roberfroid, ) 4.1.2 การใชแบคทเรยกรดแลกตกในอตสาหกรรมอาหาร

แบคทเรยกรดแลกตกนามาใชเพอการผลตอาหารหมกหลายชนด เชน ผลตภณฑนม โยเกรต นมเปรยว เนยแขง ผลตภณฑหมกจากเนอสตว แหนม ไสกรอก ผลตภณฑหมกจากผกและผลไม ผลตภณฑหมกจากถวเหลอง ซอว เตาเจยว การใชแบคทเรยกรดแลกตกรวมกบยสตเพอผลตนาผลไม รวมไปถงเครองดมไวน และการผลตยาปฏชวนะ (Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, )

5. ปจจยทมผลตอการผลตกรดแลกตกโดยเชอจลนทรย

5.1 สายพนธของจลนทรย

กรดแลกตกสามารถผลตไดจากจลนทรย 2 กลม คอ แบคทเรย และรา (Zhang, et al.,

) ราสามารถเจรญไดในอาหารทไมซบซอน แตตองการอากาศอยางเพยงพอ ราสามารถผลตกรดแลกตกและผลผลตอยางอน คอ เอทานอล และกรดฟมารก รวมดวย นอกจากนนยงใหอตราการผลตตอระยะเวลาทตาเนองจากราอาจสราง pellets ซงสงผลตออตราการถายเทสารภายใน หรอสรางเสนใยทาใหเกดความหนดของอาหาร และลดการถายเทอากาศ (Tay and Yang, ) สวนแบคทเรยมอตราการเจรญเรวและใหผลผลตกรดแลกตกสงทาใหแบคทเรยเปนทนาสนใจในการผลตกรดแลกตก แตมความตองการอาหารทซบซอน แบคทเรยกรดแลกตกทสาคญทางการคาคอแบคทเรยกลม Homofermentative ซงสามารถผลตกรดแลกตกไดในปรมาณสง และมความสมาเสมอในการผลต (Wee, et al., 2006)

สำนกหอ


17

ตารางท 5 ตวอยางจลนทรยทสามารถผลตกรดแลกตกและปรมาณกรดแลกตกทผลต

จลนทรย กรดแลกตก

(กรมตอลตร)

Yield, Y p/s

(กรมตอกรม)

Productivity

(กรมตอลตรตอชวโมง)

Rhizopus oryzae ATCC 52311 83.0 0.88 2.6

Rhizopus oryzae NRRL 395 104.6 0.87 1.8

Enterococcus faecalis RKY1 144.0 0.96 5.1

Lactobacillus rhamnosus ATCC 10863 67.0 0.84 2.5

Lactobacillus helveticus ATCC 15009 65.5 0.66 2.7

Lactobacillus casei NRRL B-441 82.0 0.91 5.6

Lactobacillus amylophilus GV6 76.2 0.70 0.8

Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130 90.0 0.97 3.8

Lactobacillus lactis spp. lactis IFO 12007 90.0 0.76 1.6

(ทมา: Wee, et al., 2006 )

Linko และ Javanainen ( ) ศกษาการหมกกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus casei

NRRL B-441 โดยกระบวนการ SSF พบวาสามารถหมกกรดแลคตกไดสงสด 162 กรมตอลตร จากแปงขาวบารเลย 170 กรมตอลตร ภายใน 47 ชวโมง

Wang และคณะ (2010) ศกษาการผลตกรดแลกตกจากแปงมนสาปะหลงโดยเชอ Lactobacillus rhamnosus พบวาไดกรดแลกตก 175.4 กรมตอลตร จากแปงมนสาปะหลง 275 กรมตอลตร โดยกระบวนการ SSF

5.2 แหลงคารบอน

การศกษาเกยวกบการผลตกรดแลกตกโดยใชเชอจลนทรยสวนมากเนนศกษาเกยวกบแหลงคารบอนตาง ๆ ทใหผลผลตกรดแลกตกและคากรดแลกตกตอระยะเวลาทสง (Dey, et al.,

) เนองจากในการผลตกรดแลกตกคาใชจายหลกคอแหลงคารบอน (Xu and Xu, ) แตแหลงคารบอนบรสทธในการหมก เชน นาตาลกลโคส หรอนาตาลซโคส นนมราคาสง ดงนนของเหลอทงจากการเกษตรและอตสาหกรรมจงเปนแหลงคารบอนทนาสนใจ เนองจากมราคาถกจงสงผลใหตนทนในการผลตกรดแลกตกลดลง เชน กากนาตาล แปงขาวโพด แปงสาล ซงขาวโพด เวย และราขาวสาล เปนตน ซงในการเลอกใชของเหลอทงจากการเกษตรและอตสาหกรรม เพอนามาผลตกรดแลกตกมขอคานง คอ มราคาถก มการปนเปอนนอย ใหอตราการผลตสง

สำนกหอ


18

ใหผลผลตสง เกดผลผลตอนนอย มกระบวนการปรบสภาพกอนนาไปใชงานนอยหรอไมม และสามารถหาไดตลอดทงป (Bulut, et al., ; Wee, et al., ; Zhang, et al., ) Sreenath และคณะ (2001) ศกษาการผลตกรดแลกตกจากของเหลอทงทางการเกษตร ซงประกอบดวย กากอลฟลฟา ราขาวสาล ซงขาวโพด ฟางขาวสาล และกากถวเหลอง โดยการอบแห งแลวบดให ม ขนาด เล ก แลว ใช ในกระบวนการหมกแบบ SSF หมกดวย เ ช อ Lactobacillus delbrueckii และ Lactobacillus plantarum พบวา เชอ Lactobacillus delbrueckii ไดผลผลตกรดแลกตกสงสดจากกากถวเหลองท 44 กรมตอ 100 กรมกากถวเหลอง สวนเชอ Lactobacillus plantarum ไดผลผลตกรดแลกตกสงสดจากกากอลฟลฟา คอ 46 กรมตอ 100 กรมกากอลฟลฟา ไชยวฒน นพเกา (2553) ศกษาการหมกกรดแลกตกดวยนาตาลแลกโตสจากเวย โดยเชอแบคทเรยกรดแลกตกทคดแยกจากไสกรอกอสานรหส SAG 303 พบวาไดกรดแลกตก 84.37

กรมตอลตร ดวยนาตาลแลกโตสจากเวย 120.52 กรมตอลตร เมอหมกเปนเวลา 72 ชวโมง 5.3 แหลงไนโตรเจน

ไนโตรเจนเปนสงจาเปนสาหรบการสงเคราะหกรดอะมโน เพยวรน ไพรมดน คารโบไฮเดรต และไขมน ไนโตรเจนสามารถพบไดทงในเกลออนนทรย เชน แอมโมเนยมซลเฟต และแอมโมเนยมไนเตรต และในสารอนทรย เชน เปปโทน และสารสกดจากยสต (Zhang, et al.,

2007) แตทวาแหลงไนโตรเจนจากเกลออนนทรย และสารอนทรยนนมราคาสงสงผลตอตนทนในการผลต ดงนนแหลงไนโตรเจนทดแทน เชน จากของเสยทางการเกษตรหรออตสาหกรรมจงเปนสงจาเปนในการนามาใชทดแทนหรอใชรวมกบสารสกดจากยสต เชน นาแชขาวโพด (corn steep

liquor) (Altaf, et al., ) Yu และคณะ (2008) ศกษาผลผลตกรดแลกตกโดยใชนาแชขาวโพดเปนแหลงไนโตรเจน เนองจากนาแชขาวโพดสามารถเปนแหลงไนโตรเจนทสาคญใหเชอจลนทรยได เพราะมปรมาณกรดอะมโนและโพลเปปไทดคอนขางสง จากการศกษาพบวาสามารถใชนาแชขาวโพดเปนแหลงไนโตรเจนได และสามารถหมกกรดแลกตกไดสงสด 113.05 กรมตอลตร โดยใชนาตาลกลโคส 118.20 กรมตอลตร เปนแหลงคารบอน Hujanen และ Linko (1996) ศกษาผลของแหลงไนโตรเจนตางๆตอการผลตกรด แลคตกโดยเชอ Lactobacillus casei จากการศกษาแหลงไนโตรเจนทงหมด 11 แหลง โดยใชนาตาลกลโคส 100 กรมตอลตร เปนแหลงคารบอน พบวามอลตงอก (malt sprouts) และสารสกดจากหญา (grass extract) ใหการหมกกรดแลกตกสง คอ 88 และ 74 กรมตอลตร ท 66 ชวโมง ตามลาดบ ซง

สำนกหอ


19

สารสกดจากยสตไดกรดแลกตก 92 กรมตอลตร ท 66 ชวโมงเชนกน เมอเทยบกนแลวพบวา มอลตงอก และสารสกดจากหญา สามารถใชเปนแหลงไนโตรเจนแทนสารสกดจากยสตได 5.4 แรธาต

แรธาตหลายชนดสงผลตอการผลตกรดแลกตก เชน ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต (MgSO4.H2O) แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต

(MnSO4.H2O) และซงซลเฟต (ZnSO4) (Zhang, et al., 2007) แมงกานสเปนปจจยทสาคญในการเจรญเตบโตของเชอ Lactobacillus casei เนองจากแมงกานสเปนสวนประกอบของเอนไซม lactate

dehydrogenase นอกจากนนยงเปนแคทไอออนและโคเเฟคเตอร ในกระบวนการภายในเซลล (Krischke, et al., ) Zhou และคณะ (1999) ศกษาปรมาณความเขมขนของไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) พบวาปรมาณไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) 0.2-1.6 กรมตอลตร มผลเพยงเลกนอยตอการผลตกรดแลกตก

5.5 คา pH

คา pH เปนอกหนงปจจยทสาคญทสงผลตอการผลตกรดแลกตก การควบคมคา pH มหลายวธไมวาจะเปนการควบคมคา pH เรมตนไว หรอการควบคมดวยเบสโดยการไตรเตรต (Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, ) เมอมการผลตกรดแลกตกทมากขน ความเปนกรดสงขน การควบคมคา pH จงเปนสงสาคญเพอลดผลเสยตอการทางานของเชอจลนทรย สารทใชในการควบคมคา pH เชน โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) แอมโมเนยมไฮดรอกไซด (NH4OH) หรอ แคลเซยมคารบอรเนต (CaCO3) (Akerberg and Zacchi, 2000)

Kotzamanidis และคณะ (2002) พบวาการเตมแคลเซยมคารบอรเนตเพอการควบคมคา pH ในกระบวนการหมกกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus delbrueckii ทาใหคา pH อยระหวาง 6.0-7.0

Yoo และคณะ (1996) ศกษาผลของ pH ตอการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus

casei subsp. rhamnosus ATCC 10863 พบวา pH 6.0-6.5 มความเหมาะสมตอการเจรญของเชอ และการผลตกรดแลกตก และท pH 6.0 ใหผลผลตกรดแลกตกสงสดท 79 กรมตอลตร จากนาตาลกลโคส 100 กรมตอลตร ทระยะเวลา 48 ชวโมง

สำนกหอ


20

5.6 อณหภม อณหภมเปนปจจยทมผลตอการเจรญเตบโตของเชอจลนทรยและมผลตอการผลตกรดแลกตก ซงเชอจลนทรยแตละชนดจะมอณหภมทเหมาะสมแตกตางกนไป (Hofvendahl and Hahn-

Hagerdal, ) Idris และ Suzana (2006) รายงานวาอณหภมเปนปจจยทสาคญตอการเจรญของเชอ โดยพบวาเชอ Lactobacillus delbrueckii สามารถเจรญไดดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส และเปนอณหภมทสามารถผลตกรดแลกตกไดสงสดคอ 28.73 กรมตอลตร โดยใชนาตาลกลโคสจากเปลอกสบปะรด 31.3 กรมตอลตร

Qin และคณะ (2012) ศกษาผลของอณหภม ตอการผลตกรดแลกตกโดยเ ชอ Lactobacillus casei พบวาทอณหภม 41 องศาเซลเซยส สามารถผลตกรดแลกตกไดสงสด 160.2

กรมตอลตร จากนาตาลกลโคสเรมตน 170 กรมตอลตร ในระยะเวลา 36 ชวโมง และพบวาผลผลต กรดแลกตกลดลงเหลอ 126.5 กรมตอลตร เมออณหภมสง 45 องศาเซลเซยส

Hujanen และ Linko (1996) ศกษาพบวาเชอ Lactobacillus casei NRRL B-441 สามารถผลตกรดแลกตกได 80 กรมตอลตร ในระยะเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส และผลตกรดแลกตกไดสงสด 82 กรมตอลตร ในระยะเวลา 48 ชวโมง ทอณหภม 41 องศาเซลเซยส จากนาตาลกลโคสเรมตน 90 กรมตอลตร 6. การออกแบบการทดลองแบบ Plackett-Burman design

การออกแบบการทดลองแบบ Plackett-Burman design เปนการออกแบบเพอใชสาหรบการคดเลอกปจจย (screening) ซงจากแผนการทดลองทาใหสามารถวเคราะหถงผลกระทบหลก (main effect) ของปจจยทศกษาได ซงสามารถศกษาปจจยไดจานวนมากพรอม ๆ กน ทาใหประหยดทรพยากรและระยะเวลาในการทดลอง แตไมสามารถศกษาถงผลกระทบรวมกนได (interaction) (Plackett and Burman, 1946)

วางแผนการทดลองโดยกาหนดระดบของปจจยทตองการศกษา 2 ระดบ คอ คาระดบสง (high level) กาหนดคารหสดวย +1 และคาระดบตา (low level) กาหนดคารหสดวย -1 สาหรบแผนการทดลองนนมอนกรมเปนจานวนเทาของ 4(4N) เชน 4, 8, 12, 16 และ 20 เปนตน โดยทแตละแผนการทดลองทมจานวน N ปจจยจะมแผนการทดลองแรก (initial block) ดงตารางท 6

สำนกหอ


21

ตารางท Initial block สาหรบแผนการทดลองแบบ Plackett-Burman design

N แผนการทดลองแรก (initial block) 8 + + + - + - -

12 + + - + + + - - - + -

16 + + + + - + - + + - - + - - -

20 + + - - + + + + - + - + - - - - + + -

24 + + + + + - + - + + - - + + - - + - + - - - -

(ทมา: อศรพงษ พงษศรกล, 2550)

การใช Initial block โดยการกาหนดสงทดลองแรกเปนดง initial block จากนนการทดลองตอไปกาหนดในลกษณะโครงสรางวน (cyclic construction) ในลกษณะของการนารหสทายสดของ initial block ขนมาลาดบหนาสดของการทดลองตอไป และวนไปจนครบ N-1 รอบ สวนการทดลองสดทายเปน added block คอ ใชระดบตาทกปจจย ดงตารางท 7

ตารางท 7 แผนการทดลองแบบ Plackett-Burman design ทม N=8

สงทดลอง ปจจย (Factor)

Response

(Yi) A B C D E F G

1 + + + - + - - Initial block Y1

2 - + + + - + -

Cyclic

construction

Y2

3 - - + + + - + Y3

4 + - - + + + - Y4

5 - + - - + + + Y5

6 + - + - - + + Y6

7 + + - + - - + Y7

8 - - - - - - - added block Y8

(ทมา: Gacula, 1993)

สำนกหอ


22

John และคณะ (2008) ศกษาการผลตกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus delbrueckii

NCIM 2025 พบวาองคประกอบอาหารเลยงเชอทงหมด 11 ปจจย ถกคดเลอกโดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design เหลอ 4 ปจจย คอ สารสกดจากยสต เปปโทน แคลเซยมคารบอรเนต และปรมาณการเตมหวเชอ Naveena และคณะ (2005) ศกษาการคดเลอกองคประกอบอาหารเลยงเชอโดยใชแ ผ น ก า ร ท ด ล อ ง Plackett-Burman design ใ น ก า ร ผ ล ต ก ร ด แ ล ก ต ก โ ด ย เ ช อ Lactobacillus amylophilus GV6 พบวาสามารถคดเลอกปจจยทมอทธพลตอการผลตกรดแลกตกได 5 ปจจยจากทงหมด 15 ปจจย คอ เปปโทน สารสกดจากยสต ไตรแอมโมเนยมซเตต โซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตไดไฮเดรต (NaH2PO4.2H2O) และ Tween 80

Chauhan และคณะ (2007) ใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design ในการศกษาคดเลอกองคประกอบอาหารในการผลตกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. KCP01 พบวาเหลอ 4

ปจจย คอ เปปโทน ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต โซเดยมอะซเตต และนาอนทผาลม จากปจจยทงหมด 15 ปจจย

7. การออกแบบการทดลองดวยวธพนผวตอบสนอง (Response Surface Methodology)

วธการพนผวตอบสนอง (Response Surface Methodology, RSM) เปนการรวมเอาเทคนคทงทางดานคณตศาสตรและทางสถตทมประโยชนตอการสรางแบบจาลองและการวเคราะหปญหา ซงแสดงผลตอบสนองตอผลจากตวแปรตาง ๆ โดยมวตถประสงคเพอหาคาทดทสดหรอเหมาะสมตอผลนน ๆ (Ray, 2009) วธการพนผวตอบสนองสามารถอธบายความสมพนธระหวางตวแปรกบคาตอบสนองได และแสดงใหเหนแนวโนมการเปลยนแปลงของผลตอบสนองเมอมการเปลยนแปลงระดบตวแปร ในการทาพนผวตอบสนองจะตองมแผนการทดลองทเหมาะสม คอ ตองมปจจยหรอตวแปรอสระ 2 ตวขนไป และมตวแปรตามอยางนอย 1 ตว ดงนนแผนการทดลองทสามารถสรางพนผวตอบสนองได คอ Factorial Design, Mixture Design, Central Composite Design (CCD) และ

Box-Behnken Design

พนผวตอบสนองจะแสดงผลตอบสนองแบบโครงรางพนผวในรปของกราฟฟกเพอชวยใหมองรปรางของพนผวตอบสนองไดดยงขน แสดงดงภาพท 5-6

สำนกหอ


23

ภาพท 5 ภาพ 3 มต ของผลตอบสนองแบบโครงรางพนผว (ทมา: Montgomery, 1991)

ภาพท ภาพ contour plot ของผลตอบสนองแบบโครงรางพนผว

(ทมา: Montgomery, 1991)

7.1 การออกแบบสวนประสมกลาง (Central Composite Design, CCD)

การออกแบบสวนประสมกลาง (Central Composite Design, CCD) เปนหนงในวธการหาพนผวตอบสนองทนยมใชเพอหากระบวนการทเหมาะสม เปนการออกแบบททกระดบ ของแตละปจจย หางจากจดกงกลางของ design เทากน และทาซาทจดกงกลาง แตละปจจยมระดบการทดลอง 5 ระดบ (- , -1, 0, 1, ) ทาใหครอบคลมพนททตองการทดลอง (Park, et al., 2008)

สำนกหอ


24

ภาพท 7 การออกแบบ Central Composite Design

(ทมา: Cho and Zoh, 2007)

7.2 การออกแบบบอกซ-เบหนเคน (Box-Behnken Design)

การออกแบบการทดลองแบบ Box-Behnken Design เปนการออกแบบ 3 ระดบสาหรบพนผวตอบสนอง สรางขนจากการออกแบบแฟกทอเรยล 2k กบการออกแบบบลอกไมสมบรณ เปนการออกแบบทคลายกบ CCD แตตางกนทจดบนแกนจะอยในระนาบเดยวกนกบจดทเปน Factorial

และทาซาทจดกงกลาง แตละปจจยจะม 3 ระดบ คอ -1, 0, 1 การทดลองแบบ Box-Behnken Design ไมไดรวมจดใด ๆ ทเปนจดยอดของลกบาศก แสดงดงภาพท 8

ภาพท 8 การออกแบบ Box-Behnken Design

(ทมา: Souza, et al., 2005)

สำนกหอ


25

บทท 3

อปกรณและวธการดาเนนงานวจย

. แหลงเชอจลนทรย

1.1 แบคทเรยกรดแลกตกทแยกไดจากแหนมและไสกรอกอสาน จานวน 2 ไอโซเลต ไดแก Lactobacillus sp. FAG 302 และ FB 301 (ไชยวฒน นพเกา, 2553)

1.2 แบคทเรยกรดแลกตกจากศนยจลนทรย สถาบนวจยวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงประเทศไทย (วว.) จงหวดปทมธาน ไดแก

Lactobacillus casei TISTR 390

Lactobacillus casei TISTR 453

Lactobacillus casei subsp. rhamnosus TISTR 108

Lactobacillus delbrueckii TISTR 326

2. มนเทศทใชในการทดลอง

มนเทศพนธไตหวน (ไดรบความอนเคราะหจากศนยวจยและพฒนาการเกษตรพจตร จงหวดพจตร)

3. สารเคมและอาหารเลยงเชอ

3.1 สารเคม สารเคมสาหรบเตรยมอาหารเลยงเชอ

3.1.1 ไดแอมโมเนยมไฮโดรเจนซเตรต ((CH4)2C6H6O7) ยหอ Fluka บรษท Sigma-Aldrich ประเทศเยอรมน 3.1.2 แคลเซยมคารบอรเนต (CaCO3) ยหอ UNILAB บรษท Ajax Finechem

ประเทศออสเตรเลย

3.1.3 ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem ประเทศออสเตรเลย 3.1.4 สารสกดจาก เ นอ (Meat extract) ยหอ HIMEDIA บรษท HiMedia

Laboratories ประเทศอนเดย

สำนกหอ


26

3.1.5 แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต (MgSO4.H2O) ยหอ Fluka บรษท Fluka Chemika ประเทศสวสเซอรแลนด 3.1.6 เปปโทน (Peptone) ยหอ HIMEDIA บรษท HiMedia Laboratories

ประเทศอนเดย

3.1.7 โ ซ เ ด ย ม อ ะ ซ เ ต ต (CH3COONa) Fluka บ ร ษ ท Sigma-Aldrich ประเทศเยอรมน 3.1.8 Tween 80 ยหอ LABCHEM บรษท Ajax Finechem ประเทศออสเตรเลย

3.1.9 ยสต เ ห ล อ ท ง จ ากก ารหมก ไ ว น (winery yeast disposal) บ รษท Siam Winery CO., Ltd. ประเทศไทย

3.1.10 แมงกา นสซล เฟตโมโนไฮ เดรต (MnSO4.H2O) ยห อ BAKER

NALANALYZED บ ร ษ ท J.T.Baker Chemicals B.V. ป ร ะ เ ท ศ เนเธอรแลนด

สารเคมสาหรบการวเคราะหนาตาลรดวซดวยวธ DNS methodology (Miller, 1959)

3.1.11 3, 5-dinitrosalicylic acid ยหอ Fluka บรษท Fluka Chemika ประเทศ สวสเซอรแลนด

3.1.12 กลโคส (C6H12O6) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem ประเทศ ออสเตรเลย 3.1.13 โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem


3.1.14 โพแทสเซยมโซเดยมตราเตต (KNaC4H4O6.4H2O) ยหอ UNIVAR

บรษท Ajax Finechem ประเทศออสเตรเลย

สารเคมสาหรบการวเคราะหนาตาลกลโคสโดยใช PGO Enzyme

3.1.15 PGO Enzyme Preparation บรษท Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา 3.1.16 O-Dianisidine dihydrochloride บรษท Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

สำนกหอ


27

สารเคมสาหรบการวเคราะหกรดแลกตก

3.1.17 แคล เ ซ ยมไฮดรอกไซด (Ca (OH)2) ยห อ Lobachemie บ รษท Loba chemie PVT ประเทศอนเดย

3.1.18 คอปเปอรซลเฟต (CuSO4.5H2O) ยหอ Alpha บรษท Alpha Chemika

ประเทศอนเดย

3.1.19 กรดไฮโดรคลอรก (HCl) ยหอ RCI Labscan บรษท RCI Labscan Limited ประเทศไทย

3.1.20 ลเทยมแลคเตต (C3H5LiO3) ยหอ Fluka บรษท Sigma-Aldrich GmbH

สหรฐอเมรกา 3.1.21 พาราไฮดรอกซไบฟนล (C12H10O) ยหอ Fluka บรษท Sigma-Aldrich

GmbH ประเทศเยอรมน

3.1.22 โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem


3.1.23 กรดซลฟวรก (H2SO4) ยหอ EMSURE บรษท Merck KGaA ประเทศ เยอรมน

3.2 เอนไซม

3.2.1 แอลฟาอะไมเลส (BANTM 240 L บรษท Sigma-Aldrich, Novozyme,

ประเทศเดนมารก)

3.2.2 อ ะ ไม โ ลก ล โ ค ซ เ ด ส (Amyloglucosidase บ รษท Sigma-Aldrich,

Novozyme, ประเทศเดนมารก)

3.3 อาหารเลยงเชอพนฐาน

3.3.1 MRS (deMan, Rogosa and Sharpe) ยหอ HIMEDIA บรษท HiMedia

Laboratories ประเทศอนเดย

4. อปกรณและเครองมอ

4.1 เครองสเปกโทรโฟโตมเตอร (Spectrophotometer) รน CE 2031 2000 series บรษท CECIL ประเทศญปน

4.2 ตลามนารโฟว (Laminar flow) รน V-190 บรษท EHRET ประเทศเยอรมน 4.3 เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH-meter) รน 713 pH meter บรษท Metrohn

4.4 เครองหมนเหวยงปรบความเยน (Refrigerated centrifuge) รน MIKRO 22 R บรษท

สำนกหอ


28

Hettich ZENTRIFUGEN ประเทศองกฤษ

4.5 หมอนงความดน (Autoclave) รน HA-240M N บรษท Hirayama ประเทศญปน

4.6 เครองผสมสาร (Vortex mixture) รน KMC-13000V บรษท VISION ประเทศ เกาหล

4.7 อ า งนาควบคม อณหภ ม (Water bath) รน Eco Temp TW 20 บรษท Julabo สหราชอาณาจกร

4.8 เครองชงละเอยดทศนยม 4 ตาแหนง รน BA 210 S บรษท Sartorius ประเทศ เยอรมน 4.9 เครองชงละเอยดทศนยม 3 ตาแหนง รน L 420 S บรษท Sartorius ประเทศเยอรมน

4.10 ตบมเชอแบบเขยา (Incubator Shaker) บรษท New Brunswick Sciencetific Co.,

Inc. สหราชอาณาจกร

4.11 ตบมเชอ (Incubator) รน Plus II incubator บรษท GALLENKAMP, รน MIR-253

บรษท SANYO ประเทศเยอรมน 4.12 ตอบฆาเชอลมรอน (Hot air Oven) บรษท MEMMWRT ประเทศเยอรมน

4.13 เตาอบไมโครเวฟ (Microwave) รน MS-2022 C บรษท LG intellowave ประเทศ ไทย

4.14 ตแชเยอกแขงอณภมตา (Ultra-low Freezer) อณหภม -80 ºC รน C85-3 บรษท SO-LOW ENVIRONMENTAL EQUIPMENT CINCINATT ประเทศฮองกง 4.15 เครองหมนเหวยง (Refrigerated Centrifuge) รน Z36HK ยหอ HERMLE ประเทศ

เยอรมน

4.16 ถงหมกขนาด 5 ลตร (Fermenter) รน BIOSTAT® B บรษท B. Braun Biotech

International สหราชอาณาจกร

4.17 อปกรณเครองแกว flask และ beaker บรษท duran-group ประเทศเยอรมน

4.18 หลอดทดลอง (Tube) ยหอ PYREX สหรฐอเมรกา

สำนกหอ


29

5. วธดาเนนงานวจย

5.1 การเตรยมมนเทศ

การเตรยมมนเทศนงกอนนาไปยอย นาหวมนเทศมาลางใหสะอาด จากนนหนสวนหว สวนทายและสวนทเสยออก ปอกเปลอก หนเปนชนขนาดประมาณ 3×3 เซนตเมตร นาไปนงใหสก โดยใชเวลาประมาณ 30–40 นาท จากนนนามาบดจนเปนเนอละเอยดดวยโกรง แลวกวนเพอใหเนอมนเทศผสมเขากน ใสในถงพลาสตก จากนนนาไปเขาเครองหมอนงความดน (autoclave) 121 องศาเซลเซยส ทความดน 1.5 ปอนด/ตารางนว เปนเวลา 15 นาท เพอฆาเชอแลวปลอยใหเยน นาไปเกบทหองรกษาความเยนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอนาไปยอยในขนตอนตอไป

การเตรยมมนเทศผงกอนนาไปยอย นาหวมนเทศมาลางใหสะอาด จากนนหนสวนหว ทาย และสวนเสยออก ปอกเปลอกออก หนเปนชนใหมความหนาประมาณ 0.1-0.2 เซนตเมตร นาไปอบแหงทอณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 ชวโมง หรออบจนกวานาหนกคงท จากนนนามาบดใหละเอยดดวยเครองปนนาผลไม เกบใสถงพลาสตก เพอนาไปยอยในขนตอนตอไป

5.2 การยอยมนเทศเพอใชเปนซบสเตรตในการหมกกรดแลกตก

ในการศกษานเลอกใชการผลตกรดแลกตกดวยวธ SSF ดงนนจงยอยมนเทศใหได liquefied starch โดยใชภาวะทดทสดจากการศกษาของปยณฐ คานล (2555) ใชมนเทศนง 600 กรมตอลตรและมนเทศผง 240 กรมตอลตร ยอยดวยแอลฟาอะไมเลสปรมาณ 0.155 เปอรเซนตของนาหนกมนเทศ (38 Unit ตอนาหนกมนเทศ 100 กรม) จากนนเตมแคลเซยมคลอไรด 0.75 กรมตอลตร ท pH 6.5 และบมทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 90 นาท

5.3 การเตรยมหวเชอสาหรบการหมกกรดแลกตก

เลยงเชอบนอาหารแขง MRS (ภาคผนวก ก.) ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24

ชวโมง ถายหวเชอลงอาหารเหลว MRS 1-2 ลป บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง โดยเขยาท 150 รอบตอนาท จากนนนาเชอมาปนเหวยงเพอแยกเซลลทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 6,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท เทสวนใสทงและเตม 0.1 เปอรเซนตเปปโทน แลวปนเหวยงซาสองครง จากนนเตม 0.1 เปอรเซนตเปปโทน โดยควบคมคาความขนเรมตนประมาณ 1.0 ทความยาวคลน 660 นาโนเมตร ซงจะไดความเขมขนหวเชอเรมตนประมาณ 108 CFU/ml

5.4 การวเคราะหปรมาณกรดแลกตก นาตาลรดวซ และนาตาลกลโคส

เกบตวอย า ง 10 มล ล ลตร วดค า pH บนทกผล และปรบ pH ดวย 6 โมลา ร ไฮโดรคลอรก ใหมคาระหวาง 1.6-1.8 เพอละลายตะกอนของแคลเซยมแลกเตทใหเปนกรดแลกตก

ปรบปรมาตรสดทายเปน 20 มลลลตร ดวยนากลน จากนนนาไปปนเหวยงดวยความเรว 6,000 รอบ

สำนกหอ


30

ตอนาท เปนเวลา 15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอแยกเกบสวนใสเปนสารละลายตวอยางแลวนาไปวเคราะหในขนตอนตอไป

5.4.1 การวเคราะหปรมาณกรดแลกตก โดยวธ Colorimetric determination

(ดดแปลงจากวธของ Barker and Summerson, 1941)

นาสารละลายตวอยางปรมาตร 0.1 มลลลตร ใสในหลอดปนเหวยงทสะอาด เตมนากลน 0.8 มลลลตร ปเปตสารละลาย 20 เปอรเซนตคอปเปอรซลเฟต 0.1 มลลลตร เตมแคลเซยม ไฮดรอกไซด 0.1 กรม ปดฝาและเขยา ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท จากนนนาไปปนเหวยงดวยความเรว 6,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาสวนใสทได 0.5 มลลลตร ใสในหลอดทดลอง เตมสารละลาย 4 เปอรเซนตคอปเปอรซลเฟต 0.025 มลลลตร เขยาใหเขากน แลวเตมกรดซลฟวรก 3 มลลลตร นาไปตมในนาเดอด 5 นาท จากนนแชในนาเยนทอณหภมตากวา 20 องศาเซลเซยส เตมสารละลาย 1.5 เปอรเซนตพาราไฮดรอกซไบฟนล (4 องศาเซลเซยส ) ปรมาตร 0.05 มลล ลตร พรอมทง เขยาแลวนาไปแชนาท อณหภม 30

องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนนาไปตมในนาเดอดเปนเวลา 90 วนาท นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 560 นาเมตร นาผลทไดเทยบกบกราฟมาตรฐาน เพอคานวณหาความเขมขนของกรดแลกตก

5.4.2 การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซโดย DNS method (Miller, 1959)

นาสารละลายตวอยางปรมาตร 1 มลลลตร ใสในหลอดทดลองทสะอาด เตมสารละลาย Dinitrosalicylic acid (ภาคผนวก ข.) ลงไป 1 มลลลตร ปดฝาและผสมใหเขากน นาไปตมในนาเดอดเปนเวลา 10 นาท จากนนนาไปแชในนาเยนประมาณ 3 นาทเพอหยดปฏกรยา เตมนากลน 10

มลลลตร ผสมใหเขากน แลวนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร นาผลทไดเทยบกบกราฟมาตรฐาน เพอคานวณหาความเขมขนของนาตาลรดวซ

5.4.3 การวเคราะหปรมาณนาตาลกลโคส (ดดแปลงจากคมอการใช PGO enzyme)

นาสารละลายตวอยางปรมาตร 0.1 มลลลตร ใสในหลอดทดลองทสะอาดเตมสารละลาย PGO enzyme 1 มลลลตร ผสมใหเขากน จากนนนาไปบมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท แลวนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 425 นาโนเมตร นาผลทไดเทยบกบกราฟมาตรฐาน เพอคานวณหาความเขมขนของนาตาลกลโคส

สำนกหอ


31

5.5 การศกษาปรมาณแปงในมนเทศ (ดดแปลงจากวธ Total Starch) (Goni, et al., 1997)

นามนเทศนง 2.5 กรม เตมแคลเซยมคลอไรดใหมความเขมขน 0.75 กรมตอลตร จากนนปรบปรมาตรสดทาย 50 มลลลตร ดวย 0.1 โมลารโซเดยมอะซเตตบฟเฟอร pH 6.0 เ ตมแอลฟาอะไมเลส 0.155 เปอรเซนตของนาหนกมนเทศ แลวนาไปบมทอณหภม 70

องศาเซลเซยส เปนเวลา 90 นาท หลงจากนน ปรบ pH 4.5 ดวย 10 เปอรเซนตซลฟวรก แลวเตม อะไมโลกลโคซเดส 0.155 เปอรเซนตของนาหนกมนเทศ และนาไปบมตอทอณหภม 60

องศาเซลเซยส เปนเวลา 72 ชวโมง นาไปปนเหวยงดวยความเรว 6,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15

นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอแยกเกบสวนใส นาสวนใสทไดมาวเคราะหปรมาณนาตาลกลโคสทได ดงหวขอ 5.4.3 5.6 การเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก

ศกษาเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก เนองจากมนเทศนงมปญหาเรองการเนาเสยงาย และมอายการเกบรกษาสน ดงนนในการทดลองนจงแปรรปมนเทศใหอยในรปมนเทศผง เพอยดอายการเกบรกษาโดยการเตรยมมนเทศตามหวขอ 5.1 จากนนนามาศกษาเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตกโดยใชเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ซง เ ปนเชอทใหผลผลตกรดแลคตกทดท สดจากการศกษาของ ปยณฐ คานล (2555) ทาการทดลองโดยยอยมนเทศนงและมนเทศผงใหได liquefied starch ดวยแอลฟาอะไมเลส (หวขอ 5.2) จากนนนา liquefied starch ทได 60 มลลลตร ใสในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร ตามดวยแคลเซยมคารบอเนต 6 กรม และปรบปรมาตรใหเปน 90 มลลลตร โดยการเตมอาหารเลยงเชอใหไดความเขมขนตามสตรอาหารพนฐานสาหรบการหมกสตร 1

(ภาคผนวก ก.) แลวนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 1.5 ปอนดตอตารางนว เ ปนเวลา 15 นาท ปลอยให เยนทอณหภมหอง จากนนเตม อะไมโลกลโคซเดส 0.18 เปอรเซนตของนาหนกมนเทศ (53 Unit ตอนาหนกมนเทศ 100 กรม) แลวทาการเตมหวเชอ 10 เปอรเซนต ซงจะไดเชอเรมตนประมาณ 107 CFU/ml โดยมความเขมขนสดทายของมนเทศนง 600 กรมตอลตร และมนเทศผง 240 กรมตอลตร อยางไรกตามจากการทดลองพบวามนเทศนง 600 กรม จะมเนอมนเทยบเทากบมนเทศผง 240 กรมจากนนนาไปบมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส ในภาวะเขยา โดยใชความเรว 150 รอบตอนาท เกบตวอยางทเวลา 72

ชวโมง ตวอยางทไดจากการหมกถกนามาวเคราะหดงหวขอ 5.4 ซงลกษณะทเหมาะสมของมนเทศตอการผลตกรดแลกตก คอ สามารถใหผลผลตกรดแลกตก และคา Productivity สง ลกษณะความหนดของอาหารมไมมาก และมความสะดวกในการเกบรกษา

สำนกหอ


32

5.7 การคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก เชอทนามาคดกรองม 2 กลม คอ แบคทเรยกรดแลกตกทแยกไดจากแหนมและไสกรอกอสาน ซงสามารถผลตกรดแลกตกไดด คอ Lactobacillus sp. FAG 302 และ FB 301 (ไชยวฒน นพเกา, 2553) กบแบคทเรยกรดแลกตกจากศนยจลนทรย สถาบนวจยวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงประเทศไทย (วว.) จงหวดปทมธาน ไดแก Lactobacillus casei TISTR 390, Lactobacillus casei

TISTR 453, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus TISTR 108 แล ะ Lactobacillus delbrueckii

TISTR 326 มาทดสอบประสทธภาพการหมกกรดแลกตก ดาเนนการคดกรองโดยใชลกษณะมนเทศทเหมาะสมจากหวขอ 5.6 บมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48

และ 72 ชวโมง แลวนาตวอยางมาวเคราะหดงหวขอ 5.4 คดเลอกแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสง โดยเลอกเชอแบคทเรยกรดแลกตกทสามารถผลตกรดแลกตกไดสง ใชระยะเวลาในการผลตนอยเลยงงาย และเจรญเรว 5.8 การ ศกษาอณหภม เ วลา และป รมาณมน เทศท เหมาะสมตอการผลต กรดแลกตกของเชอทคดกรองไดโดยใช Box-Behnken Design

นาเชอทผานการคดกรองมาเลยงในอาหารเลยงเชอพนฐานสาหรบการหมกสตร 1

(ภาคผนวก ก.) เพอศกษาภาวะทเหมาะสม 3 ปจจย ประกอบดวย อณหภม ระยะเวลาในการหมก และ ปรมาณมนเทศผง ซงในแตละปจจยจะศกษา 3 ระดบ (กาหนดใหเปน -1, 0 และ 1 คอ ศกษาทระดบตาสด กลาง และ สงสด) ดงแสดงในตารางท 8 และการวางแผนการทดลองจากโปรแกรมทางสถตแสดงดงตารางท 9 ทงหมดจานวน 14 รปแบบ หลงการทดลองเกบตวอยางมาวเคราะห คาตาง ๆ ดงหวขอ 5.4

ตารางท 8 ระดบของปจจยในการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken Design

ปจจย สญลกษณของปจจย

ระดบ

-1 0 1

อณหภม (องศาเซลเซยส) X1 30 34 37

ระยะเวลาในการหมก (ชวโมง) X2 24 48 72

ปรมาณมนเทศผง (กรมตอลตร) X3 150 180 210

สำนกหอ


33

ตารางท การวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken Design ชนด 3 ปจจย

รปแบบท X1 X2 X3

1 -1 -1 0

2 1 -1 0

3 -1 1 0

4 1 1 0

5 -1 0 -1

6 1 0 -1

7 -1 0 1

8 1 0 1

9 0 -1 -1

10 0 1 -1

11 0 -1 1

12 0 1 1

13 0 0 0

14 0 0 0

หมายเหต X1 อณหภม, X2 ระยะเวลาในการหมก และ X3 ปรมาณมนเทศผง

สญสกษณ -1, 0 และ 1 หมายถง การใชคาระดบของตวแปรในการวางแผนการทดลองแบบ Box-Behnken ของแตละปจจยโดยปรมาณทใชของแตละปจจยแสดงดงตารางท 8

จากแผนการทดลองแบบ Box-Behnken Design จานวน 14 รปแบบ นาผลความเขมขนกรดแลกตกทไดมาวเคราะหดวยโปรแกรมทางสถต เพอสรางสมการกาลงสอง (Quadratic

equation) แสดงความสมพนธระหวางอทธพลของปจจยทศกษา คอ อณหภม ระยะเวลาในการหมก และ ปรมาณมนเทศผงตอความเขมขนกรดแลกตกทได ดงสมการท 1

สำนกหอ


34

Y = b0 + b1X1 + b2X2 +b3X3 + b1,1X12 + b2,2X2

2 + b3,3X32 + b1,2X1X2 + b1,3X1X3 + b2,3X2X3 สมการท 1

โดยท Y คอ กรดแลกตก (กรมตอลตร)

b คอ คาสมประสทธการถดถอย (regression coefficients)

X1 คอ อณหภม (องศาเซลเซยส)

X2 คอ ระยะเวลาในการหมก (ชวโมง)

X3 คอ ปรมาณมนเทศผง (กรมตอลตร)

สรางกราฟพนผวตอบสนองในรปแบบ 3 มต (response surface) โดยใชตวแปรทมปฏสมพนธกนในกราฟ ซงแตละกราฟจะแสดงผลของการทดลอง 2 ตวแปร และอก 1 ตวแปรกาหนดใหคงท (ทระดบ 0)

ตรวจสอบผลการทดลองททานายได (validation) ในระดบขวดเขยาอกครง โดยใชจานวนซาการทดลองทมากขน นาตวอยางทไดมาวเคราะหคาตาง ๆ ดงหวขอ 5.4

5.9 การศกษาองคประกอบของอาหารทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกในระดบขวดเขยา 5.9.1 การคดเลอกองคประกอบของอาหารทมผลตอการผลตกรดแลกตกของเชอทคดกรองได โดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design

เพอคดเลอกปจจยทสงผลอยางมนยสาคญทางสถตตอการผลตกรดแลกตกโดยองคประกอบของอาหารทศกษาประกอบไปดวย 10 ปจจย ไดแก ยสตเหลอทงจากการหมกไวน (winery yeast disposal) เ ป ป โ ทน (peptone) ส า ร ส ก ด จ า ก เ น อ (meat extract) Tween 80 โซเดยมอะซเตต (CH3COONa) แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต (MgSO4.H2O) แมงกานส ซล เฟตโมโนไฮ เ ด รต (MnSO4.H2O) ไดโพแทส เ ซ ยมไฮโดร เ จนฟอส เฟต (K2HPO4)

ไดแอมโมเนยมซเตรต ((NH4)2C6H6O7) และอะไมโลกลโคซเดส แตละปจจยศกษาทสองระดบ คอ ระดบสง (1) และระดบตา (-1) ดงตารางท 10 การเลอกกาหนดคาทศกษาในระดบตาและระดบสงมาจากการตองการทราบวาปจจยใดทมผลตอการผลตกรดแลกตก โดยกาหนดใหคาทระดบตาเปน 0 กรมตอลตร ยกเวนยสตเหลอทงจากการหมกไวน เนองจากในการทดลองตองการใชเปนแหลงไนโตรเจนทดแทนจงไมสามารถใชคาระดบตาเปน 0 กรมตอลตรได และอะไมโลกลโคซเดส เนองจากในการทดลองใชกระบวนการหมกแบบ SSF จงทาใหยงจาเปนตองใชอะไมโลกลโคซเดส สวนคาระดบสงมาจากสตรอาหารเลยงเชอพนฐานสาหรบการหมกสตร 1 ซงเปนสตรทดทไดจากการทดลองของ นางสาวปยณฐ คานล (ปยณฐ คานล, 2555)

สำนกหอ


35

ตารางท ปจจยทสนใจศกษาโดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design และคาทระดบสง

และตาของแตละปจจย

ปจจย คาทระดบตา (-1) คาทระดบสง (1)

X4 ยสตเหลอทงจากการหมกไวน (กรมตอลตร) 10* 30*

X5 เปปโทน (กรมตอลตร) 0 10

X6 สารสกดจากเนอ (กรมตอลตร) 0 8

X7 Tween 80 (มลลลตรตอลตร) 0 1

X8 โซเดยมอะซเตต (กรมตอลตร) 0 5

X9 แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต (กรมตอลตร) 0 0.2

X10 แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต (กรมตอลตร) 0 0.075

X11 ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (กรมตอลตร) 0 2

X12 ไดแอมโมเนยมซเตรต (กรมตอลตร) 0 2

X13 อะไมโลกลโคซเดส (เปอรเซนตตอนาหนกมนเทศนง) 0.1 0.3

X14 Dummy 1 - -

X15 Dummy 2 - -

X16 Dummy 3 - -

X17 Dummy 4 - -

X18 Dummy 5 - -

หมายเหต * หมายถง การเตมสารโดยคานวณเปนนาหนกแหง

จากนนออกแบบตารางการทดลองโดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman Design

ซงไดทงหมด 16 สตร ดงตารางท 11 โดยเตรยม liquefied starch 60 มลลลตรใสในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร ทมแคลเซยมคารบอเนต 6 กรม (60 กรมตอลตร) เตมอาหารปรมาตร 30 มลลลตร แปรผนองคประกอบของอาหารตามปจจยทสนใจศกษาทระดบตาง ๆ ตามตารางท 11 ยกเวน อะไมโลกลโคซเดส นาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 1.5 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท ทงใหเยนทอณหภมหอง จากนนเตม อะไมโลกลโคซเดส ตามสตรทกาหนดในตารางท 11 แลวเตมหวเชอ 10 เปอรเซนต ซงจะไดเชอเรมตนประมาณ 107 CFU/ml นาไปบมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48 ชวโมง แลวนาตวอยางมาวเคราะหดงหวขอ 5.4

สำนกหอ


36

ตารางท การวางแผนการทดลองแบบแฟคทอเรยล โดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman

Design สาหรบ 10 ปจจย และ 5 dummy variable

สตรท X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18

1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1

2 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1

3 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1

4 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1

5 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1

6 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1

7 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1

8 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1

9 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1

10 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1

12 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1

13 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1

14 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1

15 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1

16 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

หมายเหต X4-X18 หมายถง ปจจยตางๆทศกษาโดยรายละเอยดแตละปจจยแสดงดงตารางท 10

1, -1 หมายถง การใชคาระดบสง และระดบตาของแตละปจจยตามลาดบโดยปรมาณท กาหนดของแตละปจจยแสดงดงตารางท 10

5.9.2 การหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการผลตกรดแลกตก โดยใชวธพนผวตอบสนอง (Response surface methodology)

จากการทดลองหวขอ 5.9.1 การคดเลอกองคประกอบของอาหารทมผลตอการผลตกรดแลกตกของเชอทคดกรองได โดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design ทาใหสามารถ คดกรองปจจยทมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตกได จากนนคดเลอกปจจยทมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตกมาศกษาหาคาทเหมาะสมของแตละปจจย ไดทงหมด 4 ปจจย คอ ยสตเหลอทง

สำนกหอ


37

จากการหมกไวน (X4) สารสกดจากเนอ (X6) โซเดยมอะซเตต (X8) และไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (X11) ใชการออกแบบการทดลองแบบ Central Composite Design (CCD) เปนแบบแผน ในแตละปจจยจะศกษาท 5 ระดบ (กาหนดใหเปน -2, -1, 0, 1 และ 2) แสดงดงตารางท 12 และการวางแผนการทดลองจากโปรแกรมทางสถตแสดงดงตารางท 13 ซงนอกจากปจจยทคดเลอกไดจากหวขอ 5.9.1 แลวในการศกษาหวขอนจะเพมปจจยปรมาณมนเทศผง (X3) อกหนงปจจย เนองจากปรมาณมนเทศผงเปนแหลงคารบอนทสาคญตอการหมกกรดแลกตก

ตารางท ระดบของตวแปรในการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

ปจจย ระดบ

-2 -1 0 1 2

X4 ยสตเหลอทงจากการหมกไวน (กรมตอลตร)* 15 20 25 30 35

X6 สารสกดจากเนอ (กรมตอลตร) 2 4 6 8 10

X8 โซเดยมอะซเตต (กรมตอลตร) 1 2.5 4 5.5 7

X11 ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (กรมตอลตร) 0 1 2 3 4

X3 ปรมาณมนเทศผง (กรมตอลตร) 140 160 180 200 220

หมายเหต * คานวณคาจากนาหนกแหง

จากนนใชโปรแกรมทางสถตคานวณเพอออกแบบการทดลองโดยม 5 ตวแปร แตละตวแปรม 5 ระดบ จะได 32 สตรดงตารางท 13

ตารางท 13 การวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ชนด 5 ปจจย

สตรท X4 X6 X8 X11 X3

1 -1 -1 -1 -1 1

2 1 -1 -1 -1 -1

3 -1 1 -1 -1 -1

4 1 1 -1 -1 1

5 -1 -1 1 -1 -1

6 1 -1 1 -1 1

7 -1 1 1 -1 1

สำนกหอ


38

ตารางท 13 (ตอ) การวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ชนด 5 ปจจย

สตรท X4 X6 X8 X11 X3

8 1 1 1 -1 -1

9 -1 -1 -1 1 -1

10 1 -1 -1 1 1

11 -1 1 -1 1 1

12 1 1 -1 1 -1

13 -1 -1 1 1 1

14 1 -1 1 1 -1

15 -1 1 1 1 -1

16 1 1 1 1 1

17 -2 0 0 0 0

18 2 0 0 0 0

19 0 -2 0 0 0

20 0 2 0 0 0

21 0 0 -2 0 0

22 0 0 2 0 0

23 0 0 0 -2 0

24 0 0 0 2 0

25 0 0 0 0 -2

26 0 0 0 0 2

27 0 0 0 0 0

28 0 0 0 0 0

29 0 0 0 0 0

30 0 0 0 0 0

31 0 0 0 0 0

32 0 0 0 0 0

หมายเหต X4, X6, X8, X11 และ X3 หมายถง ปจจยตางๆทศกษา โดยรายละเอยดของแตละปจจย แสดงดงตารางท 12

-2, -1, 0, 1 และ 2 หมายถง การใชคาของระดบตวแปรในการวางแผนการทดลอง แบบ Central Composite Design (CCD) ของแตละปจจย โดยปรมาณทเตม ของแตละระดบแสดงดงตารางท 12

สำนกหอ


39

เตรยมอาหารตามสตรทออกแบบดงตารางท 13 จากนนหมกกรดแลกตกโดยใชภาวะทเหมาะสมจากการทดลองในหวขอ 5.8 เกบตวอยางท 48 ชวโมง นาตวอยางทไดมาวเคราะหผลดงหวขอท 5.4 และนาผลทไดไปวเคราะหทางสถตเพอสรางสมการกาลงสอง (Quadratic equation)

แสดงความสมพนธระหวางอทธพลของปจจยทศกษา คอ ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเ ดยมอะซ เตต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และปรมาณมนเทศผง ตอความเขมขนกรดแลกตกทได ดงสมการท 2

Y = b0 + b4X4 + b6X6 + b8X8 + b11X11 + b3X3 + b4,4X42 + b6,6X6

2 + b8,8X82 + b11,11X11

2 + b3,3X32 +

b4,6X4X6 + b4,8X4X8 + b4,11X4X11 + b4,3X4X3 + b6,8X6X8 + b6,11X6X11 + b6,3X6X3 + b8,11X8X11 +

b8,3X8X3 + b11,3X11X3 สมการท 2

โดยท Y คอ กรดแลกตก (กรมตอลตร)

b คอ คาสมประสทธการถดถอย (regression coefficients)

X4 คอ ยสตเหลอทงจากการหมกไวน (กรมตอลตร)

X6 คอ สารสกดจากเนอ (กรมตอลตร)

X8 คอ โซเดยมอะซเตต (กรมตอลตร)

X11 คอ ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (กรมตอลตร)

X3 คอ ปรมาณมนเทศผง (กรมตอลตร)

สรางกราฟพนผวตอบสนองในรปแบบ 3 มต (surface plot) โดยใชตวแปรทมปฏสมพนธกนในกราฟ ซงแตละกราฟจะแสดงผลของการทดลอง 2 ตวแปร และอก 1 ตวแปรกาหนดใหคงท (ทระดบ 0)

ตรวจสอบผลการทดลองททานายได (validation) ในระดบขวดเขยาอกครง โดยใชจานวนซาการทดลองทมากขน นาตวอยางทไดมาวเคราะหคาตาง ๆ ดงหวขอ 5.4

สำนกหอ


40

5.10 การหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตร

จากการทดลองหวขอ 5.9.2 การหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการผลตกรดแลกตก โดยใชวธพนผวตอบสนองในระดบขวดเขยา นาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอมาหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตร หมกปรมาตร 3.5

ลตร โดยเตรยมอาหารหมกปรมาตร 3.15 ลตร และหว เ ชอสาหรบการหมก 0.35 ลตร เพอเปรยบเทยบผลทไดกบการหมกในระดบขวดเขยาทอณหภม 34 องศาเซลเซยส กวนท 150 รอบตอนาท โดยเกบผลทก 12 ชวโมง จนครบ 72 ชวโมง นาตวอยางทไดมาวเคราะหคาตาง ๆ ดงหวขอ 5.4

5.11 การศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตกทคดกรองได

ศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตกทคดกรองไดจากขอ 5.7 วาเปน L(+)-lactic acid หรอ D(-)-lactic acid หรอทง 2 ไอโซเมอร โดยใชวธทางเอนไซม ซงมความเฉพาะเจาะจงสง ในการทดลองใชชดทดสอบของบรษท R-Biopharm GmbH ประเทศ เยอรมน ซงสามารถตรวจสอบ stereoisomer ของกรดแลกตกไดดงปฏกรยา

D-Lactate + NAD+ D-LDH pyruvate + NADH + H+ สมการท 3

L-Lactate + NAD+ L-LDH pyruvate + NADH + H+ สมการท 4

Pyruvate + L-glutamate GPT L-alanine + 2-oxoglutarate สมการท 5

เตรยมตวอยางวเคราะหโดยนาตวอยางจากการหมกแบคทเรยกรดแลกตกในอาหารเลยงเชอ MRS (ภาคผนวก ก.) ทผานการบมในภาวะทเหมาะสมเปนเวลา 48 ชวโมง มาปนเหวยงตกตะกอนเซลลท 6,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท นาสวนใสทไดเจอจางดวยนากลนปราศจากอออนใหมความเขมขนทเหมาะสม จากนนทาการปเปตสารตาง ๆ ตามขนตอน ดงตารางท 14

สำนกหอ


41

ตารางท 14 ขนตอนการศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกโดยใชชดทดสอบของบรษท R-Biopharm GmbH

สารผสมใน cuvett Cuvett Blank

(มลลลตร)

Cuvett ตวอยาง (มลลลตร)

สารละลาย 1 (ประกอบดวย glycylglycine buffer, L-glutamic acid) 1.000 1.000

สารละลาย 2 (ประกอบดวย NAD) 0.200 0.200

สารละลาย 3 (ประกอบดวย glutamate-pyruvate transaminase) 0.020 0.020

สารละลายตวอยางทเตรยมไว - 0.100

นากลนปราศจากอออน 1.000 0.900

ผสมใหเขากน ทงไว 5 นาท วดคาการดดกลนแสงท 340 นาโนเมตร (บนทกเปนคา A1) จากนนเตม สารละลาย 4 (ประกอบดวย D-lactate dehydrogenase) 0.020 0.020

ผสมใหเขากนทงไว 30 นาท วดคาการดดกลนแสงท 340 นาโนเมตร (บนทกเปนคา A2) จากนนเตม สารละลาย 5 (ประกอบดวย L-lactate dehydrogenase) 0.020 0.020

ผสมใหเขากนทงไว 30 นาท วดคาการดดกลนแสงท 340 นาโนเมตร (บนทกเปนคา A3)

เอนไซมทใชในการทดลองนมการเตมเปนลาดบขนตอนคอ มการเตม D-lactate

dehydrogenase กอนแลวจงวดคาการดดกลนแสง (A2) และเตม L-lactate dehydrogenase แลววดคาการดดกลนแสงเชนกน (A3) จากนนนาคาการดดกลนแสงทไดไปคานวณ โดยหลกการคอ D-lactate dehydrogenase ทาหนาทเรงปฏกรยาการเปลยน D-lactate และ NAD+ ไปเปน pyruvate

และ NADH ดงสมการท 3 การดาเนนไปของปฏกรยานสามารถตรวจวดไดจากอตราการเพมขนของ NADH โดยการวดการดดกลนแสงทความยาวคลน 340 นาโนเมตร ซง NAD+ จะไมมการดดกลนแสงชวงดงกลาว ดงนนถามการดดกลนแสงเมอเตมเอนไซม D-lactate dehydrogenase

แสดงวาม D(-)-lactic acid ในสารละลายตวอยาง เชนเดยวกนกบ L-lactate dehydrogenase ทาหนาทเรงปฏกรยาการเปลยน L-lactate และ NAD+ ไปเปน pyruvate และ NADH ดงสมการท 4 การดาเนนไปของปฏกรยานสามารถตรวจวดไดจากอตราการเพมขนของ NADH โดยการวดการดดกลนแสงทความยาวคลน 340 นาโนเมตร ซง NAD+ จะไมมการดดกลนแสงชวงดงกลาว ดงนนถามการดดกลนแสงเมอเตมเอนไซม L-lactate dehydrogenase แสดงวาม L(+)-lactic acid ในสารละลายตวอยาง จากนนนาคาการดดกลนแสงทไดไปคานวณ

สำนกหอ


42

การคานวณความเขมขนของกรดแลกตกดงสมการ

ความเขมขน (กรมตอลตร) : C = × ∆A

เมอ V คอ ปรมาตรรวมสดทาย (มลลลตร)

VD-lactic acid = 1.000 + 0.200 + 0.020 + 0.100 + 0.900 + 0.020 = 2.240

VL-lactic acid = 1.000 + 0.200 + 0.020 + 0.100 + 0.900 + 0.020 + 0.020 = 2.260

v คอ ปรมาณสารตวอยาง (มลลลตร)

MW คอ นาหนกโมเลกลของสารทวเคราะห (กรมตอลตร)

d คอ light path (เซนตเมตร)

คอ คา extinction coefficient ของ NADH ท 340 นาโนเมตร เทากบ 6.3 (L×mmol-1×cm-1)

∆A D-lactic acid คอ คาการดดกลนแสง (A2-A1)

∆A L-lactic acid คอ คาการดดกลนแสง (A3-A2)

สาหรบ D-lactic acid = 2.240×90.1

6.3×1.00×0.100×1000

= 0.320 × ∆AD-lactic acid × dilution factor

สาหรบ L-lactic acid = 2.260×90.1

6.3×1.00×0.100×1000

= 0.323 × ∆AL-lactic acid × dilution factor

× ∆A D-lactic acid

× ∆AL-lactic acid

V × MW

× d × v × 1000

สำนกหอ


43

นาความเขมขนทคานวณได มาคานวณ

Content D-lactic acid = CD-lactic acid × 100

CD-lactic acid + CL-lactic acid

Content L-lactic acid = CL-lactic aci × 100


Stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตกวาเปน L (+)-lactic acid

หรอ D (-)-lactic acid หรอทงสองไอโซเมอร พจารณาทคา Content D-lactic acid และ Content

L-lactic acid

สำนกหอ


44

บทท 4

ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง

1. ผลการเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก

จากการศกษาการหมกกรดแลคตกโดยใชมนเทศนงเปนซบสเตรตของปยณฐ คานล (2555) พบวาสามารถใชมนเทศนงในการผลตกรดแลกตกไดด แตมปญหาเรองการเนาเสยงาย และมอายการเกบรกษาสน ดงนนในการทดลองนจงแปรรปมนเทศใหอยในรปมนเทศผง เพอยดอายในการเกบรกษา แลวศกษาเปรยบเทยบการใชมนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก โดย

Lactobacillus sp. FAG 302 ซง เ ปนเชอทใหผลผลตกรดแลคตกทดท สดจากการศกษาของ ปยณฐ คานล (2555) หมกกรดแลกตกเปนเวลา 72 ชวโมง โดยใชมนเทศนง 600 กรมลตร และมนเทศผง 240 กรมตอลตร ซงทงมนเทศนงและมนเทศผงมปรมาณแปงเทากน คอ 140 กรมตอลตร จากผลการหมกกรดแลกตกโดย Lactobacillus sp. FAG 302 เพอเปรยบเทยบการใช มนเทศนงและมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก พบวามนเทศนงและมนเทศผงใหผลผลต กรดแลกตกทแตกตางกน โดยมนเทศผงใหผลผลตกรดแลกตกทสงกวามนเทศนงท 72 ชวโมง แสดงดงตารางท 15 และภาพท 9 ซงผลผลตกรดแลคตกสงทสด คอ 156.70 กรมตอลตร ทระยะเวลา 72 ชวโมง จากการหมกโดยใชมนเทศผงทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสทอณหภม 90 องศาเซลเซยส มคา Productivity เทากบ 2.18 กรมตอลตรตอชวโมง

ดงนนมนเทศผงทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสทอณหภม 90 องศาเซลเซยส จงถกเลอกนาไปใชในการศกษาขนตอนตอ ๆ ไป เพราะนอกจากมนเทศผงจะสามารถใหผลผลตกรดแลกตกทสงแลว ยงสามารถยดอายการเกบรกษาไดนานขนอกดวย

สำนกหอ


45

ตาราง

ท 15

ค า pH

นาตาลร

ดวซท

เหลอ น

าตาลกล

โคสท

เหลอ ก

รดแล

กตก แ

ละ Pr

oduc

tivity

เมอห

มกดว

ยกระบว

นการ

SSFโดย

Lacto

bacil

lus s

p. F

AG 3

02

บ ม

ทอณห

ภม 34

องศาเซล

เซยส

เขย า

150 รอ

บตอน

าท เก

บผลท

เวลา 7

2 ชว

โมง ใ

ชซบส

เตรตม

นเทศ

นงทย

อยดว

ยแอล

ฟาอะ

ไมเลส

ท 70

องศาเซล

เซยส เ

ปรยบ

เทยบก

บมนเท

ศผง ท

ยอยดวยแอ

ลฟาอะไมเล

สท 70

และ 9

0 องศาเซล

เซยส

ลกษณ

ะ มน

เทศ

อณหภ

มทใชยอย

มนเทศ

ดวยแอล

ฟาอะ

ไมเลส

(อ

งศาเซ

ลเซยส

)

pH

นาตาลรดว

ซทเหล

อ (กร

มตอล

ตร)

นาตาลก

ลโคส

ทเหลอ

(กรมต

อลตร

)

กรดแ

ลกตก

(กรม

ตอลต

ร)

Prod

uctiv

ity

(กรมต

อลตรตอ

ชวโม

ง) มน

เทศนง

70

4.

6 ±

0.12

9.

56 ±

0.0

8 0.

00 ±

0.0

0 11

5.07

± 1

.50

1.60

± 0

.02

มนเทศ

ผง

70

4.2

± 0.

06

76.2

2 ±

0.58

37

.27

± 0.

08

124.

44 ±

0.8

9 1.

73 ±

0.0

1

มนเทศ

ผง

90

4.1

± 0.

00

46.4

8 ±

0.09

4.

71 ±

0.0

9 15

6.70

± 1

.07

2.18

± 0

.01

สำนกหอ


46

ภาพท 9 คากรดแลกตกเมอหมกโดย Lactobacillus sp. FAG 302 ดวยกระบวนการหมกแบบ SSF บมท อณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เกบผลทเวลา 72 ชวโมง ใชซบสเตรตมนเทศนงทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสท 70 องศาเซลเซยส เปรยบเทยบกบมน เทศผง ทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสท 70 และ 90 องศาเซลเซยส

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

มนเทศนง (70 °C) มนเทศผง (70 °C) มนเทศผง (90 °C)

กรดแ

ลกตก

(กรม

ต อลต

ร)

ลกษณะมนเทศ

สำนกหอ


47

2. ผลการคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตก

นาแบคท เ รยกรดแลกตก 6 สายพน ธ คอ Lactobacillus sp. FAG 302, FB 301,

Lactobacillus casei TISTR 390, Lactobacillus casei TISTR 453, Lactobacillus casei subsp.

rhamnosus TISTR 108 และ Lactobacillus delbrueckii TISTR 326 มาทดสอบประสทธภาพการหมกกรดแลกตก ดาเนนการคดกรองโดยใชรปแบบของมนเทศทเหมาะสมจากหวขอท 1 คอ มนเทศผงทยอยดวยแอลฟาอะไมเลสทอณหภม 90 องศาเซลเซยส แตเนองจากการศกษาจากหวขอท 1 ใชปรมาณมนเทศผง 240 กรมตอลตร แลวพบวาเกดปญหาเรองความหนดของซบสเตรต และมความยงยากในกระบวนการยอยแปงจากมนเทศ ดงนนในการคดกรองแบคทเรยกรดแลกตกทมประสทธภาพสงในการผลตกรดแลกตกจากมนเทศผง จงลดปรมาณมนเทศผงเหลอ 150 กรมตอลตร บมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48 และ 72 ชวโมง ผลการทดลองดงตารางท 16

จากการหมกกรดแลกตกท 48 ชวโมง พบวาเชอ Lactobacillus casei TISTR 390

สามารถผลตกรดแลกตกได 97.56 กรมตอลตร และมคา Productivity 2.03 กรมตอลตรตอชวโมง รองลงมา คอเชอ Lactobacillus sp. FAG302 ซงสามารถผลตกรดแลกตกได 92.14 กรมตอลตร และมคา Productivity 1.92 กรมตอลตรตอชวโมง

เมอหมกตอไปจนถง 72 ชวโมง พบวาไดกรดแลกตกสงทสด คอ 104.13 กรมตอลตร โดยเชอ Lactobacillus casei TISTR 390 และมคา Productivity 1.45 กรมตอลตรตอชวโมง รองลงมาคอกรดแลกตก 99.39 กรมตอลตร โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 และมคา Productivity 1.38

กรมตอลตรตอชวโมง

เมอพจารณาความสามารถในการผลตกรดแลกตกโดยเปรยบเทยบแบคทเรย กรดแลกตกทง 6 สายพนธ (ภาพท 10) พบวา เชอ Lactobacillus casei TISTR 390 สามารถผลตกรดแลกตกไดสงสด รองลงมา คอเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ทง 48 และ 72 ชวโมง แตเนองจาก Lactobacillus sp. FAG 302 เปนเชอทแยกไดเองจากแหนมและไสกรอกอสาน ซงไดรบความอนเคราะหจากนายไชยวฒน นพเกา (2553) เปนผแยกเชอ และเปนเชอทเลยงงาย เจรญไดเรว ซงเปนผลดตอการผลตกรดแลกตก ซงในขณะน Lactobacillus casei TISTR 390 เจรญชากวา ดงนนจงเลอกใชเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ในการหมกกรดแลกตกในการศกษาขนตอไป

สำนกหอ


48

ตารางท 16 คา pH นาตาลรดวซทเหลอ นาตาลกลโคสทเหลอ กรดแลกตก คา Yp/s และ Productivity เมอหมกโดยแบคทเรยกรดแลกตก 6 สายพนธ บมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท ปรมาณมนเทศผง 150 กรมตอลตร เปนเวลา 48 และ 72 ชวโมง

ระยะเวลาในการหมก

(ชวโมง) แบคทเรยกรดแลกตก pH

นาตาลรดวซ ทเหลอ


นาตาลกลโคส ทเหลอ


กรดแลกตก (กรมตอลตร)

Yp/s

(กรดแลกตก ตอแปงทใช)

Yp/s

(กรดแลกตกตอนาตาลกลโคส

ทใช)

Productivity


48

FB 301 5.8 ± 0.07 94.70 ± 0.94 12.33 ± 0.02 12.81 ± 0.29 0.16 ± 0.00 0.14 ± 0.00 0.27 ± 001

Lactobacillus sp. FAG 302 4.4 ± 0.05 8.01 ± 0.15 0.00 ± 0.00 92.14 ± 0.77 0.98 ± 0.01 0.89 ± 0.01 1.92 ± 0.02

Lactobacillus casei TISTR 390 4.4 ± 0.11 5.76 ± 0.85 0.00 ± 0.00 97.56 ± 1.93 1.04 ± 0.02 0.95 ± 0.02 2.03 ± 0.04


Lactobacillus casei subsp.rhamnosus TISTR 108 4.5 ± 0.04 6.16 ± 0.10 0.00 ± 0.00 67.07 ± 0.94 0.72 ± 0.01 0.65 ± 0.01 1.40 ± 0.02

Lactobacillus delbrueckii TISTR 326 5.5 ± 0.22 87.09 ± 0.64 12.44 ± 0.04 27.70 ± 0.42 0.34 ± 0.01 0.31 ± 0.00 0.58 ± 0.01

72

FB 301 5.2 ± 0.01 40.82 ± 0.46 0.00 ± 0.00 74.41 ± 0.61 0.79 ± 0.01 0.72 ± 0.01 1.03 ± 0.01

Lactobacillus sp. FAG 302 4.2 ± 0.03 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 99.39 ± 0.77 1.06 ± 0.01 0.97 ± 0.01 1.38 ±0.01



Lactobacillus casei subsp.rhamnosus TISTR 108 4.2 ± 0.01 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 85.93 ± 0.13 0.92 ± 0.00 0.83 ± 0.00 1.19 ± 0.00

Lactobacillus delbrueckii TISTR 326 5.2 ± 0.01 42.62 ± 0.64 0.00 ± 0.00 60.58 ± 0.35 0.65 ± 0.00 0.59 ± 0.00 0.84 ± 0.00

สำนกหอ


49

ภาพท 10 ประสทธภาพของแบคทเรยกรดแลกตก 6 สายพนธ ตอการผลตกรดแลกตกเมอเพาะเลยง ในอาหารเ ลยง เ ชอท มปรมาณมนเทศผง 150 กรมตอลตร บมทอณหภม 34

องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48 และ 72 ชวโมง

0

20

40

60

80

100

120

FB 301 Lactobacillus sp.FAG302

L.casei 390 L.casei 453 L.casei spp.rhamnosus

L.delbrueckii326

กรดแ

ลกตก

(กรม

ตอลต

ร)

แบคทเรยกรดแลกตก

48 ชวโมง

72 ชวโมง

Lactobacillus sp. FAG 302

FB 301 Lactobacillus

casei TISTR

390

Lactobacillus

casei TISTR

453

Lactobacillus

casei subsp.

rhamnosus

TISTR 108

Lactobacillus.

delbrueckii

TISTR 326 สำนกหอ


50

3. ผลการศกษาอณหภม เวลา และปรมาณมนเทศทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกของเชอทคดกรองไดโดยใช Box-Behnken Design

นอกจากสายพนธแบคทเรย และรปแบบของซบสเตรตทเหมาะสมในการหมกกรดแลกตกแลว ระยะเวลาในการหมก ปรมาณซบสเตรต และอณหภมเปนปจจยทสงผลตอกระบวนการหมกไมวาจะเปนการเจรญของเชอหรอการหมกกรดแลกตก (Yuwono and Kokugan,

) ซงอณหภมเปนปจจยสาคญในการปรบปรงกระบวนการหมก (Qin, et al., 2012) สายพนธแบคทเรยกรดแลกตกทแตกตางกน ตางตองการอณหภมทตางกน เชน อณหภมทเหมาะสมทสดในการผลตกรดแลกตกของเชอ L. casei NRRL B-411 และ L. casei spp. rhamnosus NRRL B-445 คอ 37 องศาเซลเซยส (Demirci, et al., ) อณหภมทเหมาะสมตอการหมกกรดแลกตกอยในชวง 34-40 องศาเซลเซยส โดยเชอ Lactobacillus sp. LMI8 (Lima, et al., 2010) ในการศกษานจงใชแผนการทดลอง Box-Behnken design เพอหาคาทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ศกษา 3 ปจจย คอ อณหภม (X1) ระยะเวลาในการหมก (X2) และปรมาณมนเทศผง (X3) ในแตละปจจยศกษา 3 ระดบ คอ -1, 0 และ 1 (ระดบตาสด กลาง และสงสด) ซงไดรปแบบในการหมกกรดแลกตกทงหมด 14 รปแบบ ดงตารางท 9 คากรดแลกตกทไดจากการทดลอง และจากสมการทานาย แสดงดงตารางท 17

จากตารางท 17 พบวารปแบบท 12 ใหคากรดแลกตกสงทสด คอ 125.33 กรมตอลตร หมกทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เปนเวลา 72 ชวโมง ดวยมนเทศผง 210 กรมตอลตร และรปแบบทผลตกรดแลกตกไดนอยทสด คอรปแบบท 1 ใหคากรดแลกตก 65.81 กรมตอลตร หมกทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ดวยมนเทศผง 180 กรมตอลตร จากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design สามารถสรางขอมลเปนภาพสามมต ทเรยกวา พนผวตอบสนองได โดยอาศยความสมพนธในทางคณตศาสตร ซงประกอบไปดวย ความสมพนธเชงเสนตรง (Linear model) ความสมพนธรวมกนของปจจย (Interaction model)

และ ความสมพนธกาลงสอง (Quadratic model) ซงแบบจาลองของสมการการผลตกรดแลกตก สามารถสรางไดจากคาผลการวเคราะหทางสถต แสดงดงตารางท 18

สำนกหอ


51

ตารางท 17 การผลตกรดแลกตกโดย Lactobacillus sp. FAG 302 ในภาวะและปจจยทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design ชนด 3 ปจจย เขยา 150 รอบตอนาท

รปแบบท

รหสปจจยศกษา

pH

นาตาลรดวซทเหลอ


นาตาลกลโคสทเหลอ


กรดแลกตก (กรมตอลตร) Yp/s

(กรดแลกตกตอแปงทใช)

Yp/s

(กรดแลกตกตอนาตาลกลโคส

ทใช)

Productivity


X1 X2 X3 คาการทดลอง คาการทานาย

1 -1 -1 0 5.04 36.87 22.35 65.81 67.44 0.71 0.65 2.74

2 1 -1 0 5.05 27.84 14.20 87.60 86.68 0.81 0.73 3.34

3 -1 1 0 4.55 0.00 0.00 116.20 117.12 1.03 0.94 1.61

4 1 1 0 4.49 0.00 0.00 120.70 119.07 1.07 0.98 1.68

5 -1 0 -1 4.56 6.86 0.09 94.47 93.09 0.93 0.85 1.81

6 1 0 -1 4.65 7.83 0.08 98.82 99.99 1.02 0.93 2.00

7 -1 0 1 4.64 0.00 0.00 95.62 94.45 0.90 0.82 1.99

8 1 0 1 4.23 0.00 0.00 107.36 108.74 0.96 0.88 2.24

9 0 -1 -1 4.94 8.11 1.94 79.73 79.48 0.84 0.76 3.19

10 0 1 -1 4.92 0.00 0.00 101.13 101.59 1.08 0.98 1.40

11 0 -1 1 5.14 59.81 39.44 66.07 65.61 0.70 0.64 2.77

12 0 1 1 4.27 0.00 0.00 125.33 125.58 1.08 0.99 1.74

13 0 0 0 4.48 10.42 0.00 117.07 117.87 1.04 0.95 2.44

14 0 0 0 4.51 11.24 0.00 118.67 117.87 1.06 0.96 2.47

หมายเหต เมอ X1 คออณหภม (องศาเซลเซยส), X2 คอระยะเวลาในการหมก (ชวโมง) และ X3 คอปรมาณมนเทศผง (กรมตอลตร)

สำนกหอ


52

ตารางท 18 การวเคราะหการถดถอยของพนผวตอบสนองสาหรบแผนการทดลอง Box-Behnken

design ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302

Term Coefficient SE Coefficient T-value P-value

Contant 117.870 1.3864 85.020 0.000*

อณหภม (X1) 5.297 0.6932 7.642 0.002*

ระยะเวลาในการหมก (X2) 20.519 0.6932 29.600 0.000*

ปรมาณมนเทศผง (X3) 2.529 0.6932 3.648 0.022*

X12 -7.145 1.0960 -6.519 0.003*

X22 -13.148 1.0960 -11.996 0.000*

X32 -11.658 1.0960 10.636 0.000*

X1X2 -4.322 0.9803 -4.409 0.012*

X1X3 1.848 0.9803 1.885 0.133

X2X3 9.465 0.9803 9.655 0.001*

S = 1.961 R-Sq = 99.7% R-Sq (adj) = 99.0%

หมายเหต * แสดงคานยสาคญทระดบความเชอมนรอยละ 95 (P<0.05)

จากผลการวเคราะหการถดถอยของพนผวตอบสนองในตารางท 18 พบวา X1, X2, X3,

X12, X2

2, X32, X1X2 และ X2X3 มคา P-value นอยกวา 0.05 แสดงวา ปจจยนนมผลอยางมนยสาคญตอ

การผลตกรดแลกตก X1X3 มคา P-value มากกวา 0.05 แสดงวา ปจจยนนไมมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก เมอพจารณาคา Coefficient พบวา X1, X2, X3 และ X2X3 มคาบวก แสดงวา เมอเพมระดบปจจย มผลตอการเพมขนของการผลตกรดแลกตก สวน X1

2, X22, X3

2 และ X1X2 มคา Coefficient เปนลบ แสดงวาระดบปจจยนนมผลตอการลดลงของการผลตกรดแลกตก และพบวา คา R-Sq มคารอยละ 99.7 แสดงวา สมการทไดสามารถใชในการทานายคากรดแลกตกไดอยางเหมาะสม สรางสมการทานายปรมาณกรดแลกตก โดยนาคาของปจจยทไดจากการวเคราะหสมประสทธของสมการถดถอยในตารางท 18 มาเขยนในรปสมการดงน

สำนกหอ


53

Y = 117.870 + 5.297 X1 + 20.519 X2 + 2.529 X3 - 7.145 X12 - 13.148 X2

2

- 11.658 X32- 4.322 X1X2 + 1.848 X1X3 +9.465 X2X3 สมการท 6

เมอ Y คอ ปรมาณกรดแลกตกทไดจากการทานาย และ X1, X2 และ X3 คอ อณหภมระยะเวลาในการหมก และปรมาณมนเทศผง ตามลาดบ

จากผลการวเคราะหความแปรปรวนของแบบจาลองในตารางท 19 พบวาคา Lack of fit มคา P-value เทากบ 0.362 ซงมากกวา 0.05 นนหมายถงวา สมการทไดมความแมนยาเพยงพอในการพยากรณปรมาณกรดแลกตก

ตารางท 19 การวเคราะหความแปรปรวนของแบบจาลอง สาหรบแผนการทดลอง Box-Behnken

design ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302

Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F-value P-value

Regression 9 4946.46 4946.46 549.61 142.97 0.000

Linear 3 3643.82 3643.82 1214.61 315.97 0.000

Square 3 855.90 855.90 285.30 74.22 0.001

Interaction 3 446.73 446.73 148.91 38.74 0.002

Residual Error 4 15.38 15.38 3.84

Lack of fit 3 14.10 14.10 4.70 3.67 0.362

Pure Error 1 1.28 1.28 1.28

Total 13 4961.83

ความสมพนธระหวางผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทดลอง และผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทานาย ในรปเสนตรง แสดงดงภาพท 11 ซงมการกระจายของจดในแตละการทดลองในแนวแกนเสนตรง ซงพบวาผลผลตกรดแลกตกจากการทดลอง และจากการทานายมคาไมแตกตางกน

สำนกหอ


54

ภาพท 11 ความสมพนธระหวางคาผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทดลอง และผลผลตกรดแลกตก ทไดจากการทานาย สาหรบแผนการทดลอง Box-Behnken design

นาสมการทานายปรมาณกรดแลกตกทได (สมการท 6) มาสรางกราฟพนผวตอบสนองดวยโปรแกรมทางสถต ไดกราฟพนผวตอบสนองแสดงดงภาพท 12 – 14

ภาพท 12 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางอณหภม และ ปรมาณมนเทศผง ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอท ไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design เขยา 150 รอบตอนาท

50

70

90

110

130

60 70 80 90 100 110 120 130กรดแ

ลกตก

จากการ

ทานาย (กรมต

อลตร

)

กรดแลกตกจากการทดลอง (กรมตอลตร)

Lactic acid (g/L)

Temp (°C)

Sweet potato powder (g/L)

สำนกหอ


55

ภาพท 13 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางระยะเวลาในการหมก และปรมาณ มนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก เ มอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ใน อาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design เขยา 150

รอบตอนาท

ภาพท 14 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางอณหภม และระยะเวลาในการ หมกตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยง เชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Box-Behnken design เขยา 150 รอบตอนาท

Lactic acid (g/L)

Lactic acid (g/L)

Time (h)

Temp (°C)

Time (h) Sweet potato powder (g/L)

สำนกหอ


56

จากนนทาการหาจดสงสดจากกราฟพนผวตอบสนอง จากแผนการทดลองแบบ Box-Behnken design พบวาไมสามารถหาจดทเหมาะสมทใหผลผลตกรดแลกตกสงสดได เนองจากกราฟทไดมลกษณะโคง แตไมเปนโคงระฆงควา (ภาพท 12 - 14) ดงนนจงพจารณาผลผลต กรดแลกตกจากตารางท 17 ซงผลผลตกรดแลกตกสงสด คอ 125.33 กรมตอลตร จากรปแบบท 12

แตเมอพจารณาผลผลตกรดแลกตกรองลงมา คอรปแบบท 4 และ 14 มคากรดแลกตกเทากบ 120.70

และ 118.67 กรมตอลตร ตามลาดบ จากนนพจารณาคา Productivity พบวา รปแบบท 14 มคาสงกวารปแบบท 4 และ 12 คอ 2.47 กรมตอลตรตอชวโมง ดงนนเมอพจารณาคากรดแลกตก และคา Productivity จงเลอกรปแบบท 14 เนองดวยใชระยะเวลาในการหมกเพยง 48 ชวโมงไดคา กรดแลกตก 118.67 กรมตอลตร ทาใหไดค า Productivity สง 2.47 กรมตอลตรตอชวโมง ซงรปแบบท 14 จากแผนการทดลองแบบ Box-Behnken design ประกอบไปดวยปจจยทเหมาะสม คอ อณหภม 34 องศาเซลเซยส หมกเปนระยะเวลา 48 ชวโมง และใชปรมาณมนเทศผง 180

กรมตอลตร

สำนกหอ


57

การทวนสอบ (Verification)

การทวนสอบเปนการทาการทดลองซาเพอเปรยบเทยบ และยนยนผลของการผลตกรดแลกตกกบคาทไดจากการทานายอกครง โดยนารปแบบท 14 ซงใหผลผลตกรดแลกตกทเหมาะสม มาทาการหมกในระดบขวดเขยา โดยปจจยทเหมาะสมประกอบไปดวย อณหภมในการหมก 34

องศาเซลเซยส หมกเปนระยะเวลา 48 ชวโมง โดยใชปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร เตมอาหารเลยงเชอพนฐานสาหรบการหมกสตร 1 (ภาคผนวก ก.) หมกดวยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 เขยาดวยความเรวรอบ 150 รอบตอนาท ผลการทวนสอบแสดงดงตารางท 20 พบวาคาเฉลยกรดแลกตกทได คอ 118.41 กรมตอลตร ซงมคาใกลเคยงกบผลการทานายในการทดลองอณหภม เวลา และปรมาณมนเทศทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกของเชอทคดกรองไดโดยใช Box-Behnken Design คอ 117.87 กรมตอลตร

ตารางท 20 ผลการทวนสอบการหมกกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ในระดบ ขวดเขยาเมอใชรปแบบท 14 ซงใชอณหภม 34 องศาเซลเซยส หมกเปนเวลา 48 ชวโมง และใชปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร

ผลการทดสอบ คาเฉลย

pH 4.46 ± 0.01

นาตาลรดวซทเหลอ (กรมตอลตร) 10.07 ± 0.36

นาตาลกลโคสทเหลอ (กรมตอลตร) 0.00 ± 0.00

กรดแลกตก (กรมตอลตร) 118.41 ± 1.53

Yp/s (กรดแลกตกตอแปงทใช) 1.05 ± 0.00

Y p/s (กรดแลกตกตอนาตาลกลโคสทใช) 0.96 ± 0.00

Productivity (กรมตอลตรตอชวโมง) 2.47 ± 0.01

สำนกหอ


58

4. ผลการศกษาองคประกอบของอาหารทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกในระดบขวดเขยา 4.1 ผลการคดเลอกองคประกอบของอาหารทมผลตอการผลตกรดแลกตกของเชอทคดกรองได โดยใชแผนการทดลอง Plackett-Burman design

แบคทเรยกรดแลกตกเปนเชอทมความตองการสารอาหารทซบซอนไมวาจะเปนแหลงไนโตรเจน และแรธาตตาง ๆ (Eldeleklioglu, et al., 2013) แหลงไนโตรเจนทนยมใช คอ สารสกดจากยสต แตอยางไรกตามสารสกดจากยสตนนมราคาสง ทาใหตองศกษาแหลงไนโตรเจนอนทดแทนไมวาจะเปน คอรนสตปลเคอร แอมโมเนยมซลเฟต และยเรย (Nancib, et al., ) แหลงไนโตร เ จน ท ใช ใ นก า ร ศ กษาค ร ง นประกอบดว ย ย ส ต เ ห ล อ ท ง จ า กก า รหมก ไ วน เปปโทน สารสกดจากเนอ และไดแอมโมเนยมซเตรต แรธาตอนๆทใชในการศกษาประกอบดวย โซเดยมอะซเตต แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และ Tween 80 ในการทดลองนศกษาผลของขององคประกอบอาหารทสงผลตอการผลตกรด แลกตกของเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 โดยใช Plackett-Burman design ในการออกแบบการทดลอง ซงองคประกอบทสนใจนามาศกษามทงหมด 10 ชนด วางแผนการทดลองได 16 สตร ดงตารางท 11 มคาระดบสงและตาของแตละปจจย ดงตารางท 10 หมกกรดแลกตกโดยใชปรมาณ มนเทศผง 180 กรมตอลตร บมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48 ชวโมง ผลการทดลองแสดงดงตารางท 21

จากการทดลองพบวา Lactobacillus sp. FAG 302 สามารถผลตกรดแลกตกไดสงสด 91.74 กรมตอลตร ในสตรท 15 และพบวา เชอ Lactobacillus sp. FAG 302 สามารถผลตกรด แลกตกไดตามองคประกอบอาหารทแตกตางกนดงตารางท 21

จากการวเคราะหผลการทดลองทางสถต โดยพจารณาคาการผลตกรดแลกตก Main

effect, Standard error, T-value และ P-value ของแตละองคประกอบอาหาร แสดงผลการวเคราะหดงตารางท 22 ซงองคประกอบอาหารทแสดงคา P-value นอยกวา 0.05 แสดงวาเปนองคประกอบอาหารทมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก

สำนกหอ


59

ตารางท 21 การผลตกรดแลกตกของเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอสตรตางๆทไดจากแผนการทดลอง Plackett-Burman design ชนด 15 ปจจย โดยใชมนเทศผง 180 กรมตอลตร บมท อณหภม 34 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง เขยา 150 รอบตอนาท

สตรท

X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 pH






Yp/s

(กรดแลกตก ตอแปงทใช)

Yp/s

(กรดแลกตก ตอนาตาลกลโคสทใช)

Productivity


1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 4.60±0.02 57.67±0.55 47.41±1.66 53.38±0.73 0.77 ± 0.01 0.70±0.01 1.11±0.02

2 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 4.62±0.01 38.76±0.65 30.98±0.27 64.39±0.73 0.76 ± 0.01 0.70±0.01 1.34±0.02

3 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 4.58±0.02 54.24±2.51 42.99±1.07 76.09±2.01 1.03 ± 0.04 0.95±0.04 1.59±0.04

4 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 4.66±0.01 38.64±0.46 30.19±0.16 86.91±1.21 1.02 ± 0.01 0.93±0.01 1.81±0.03

5 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 4.72±0.02 70.50±2.90 47.95±0.59 53.96±0.44 0.78 ± 0.01 0.71±0.01 1.12±0.01

6 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 4.56±0.03 43.94±2.33 35.76±0.27 84.10±0.89 1.05 ± 0.01 0.96±0.01 1.75±0.02

7 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 4.52±0.01 59.00±0.37 44.06±1.07 67.58±5.66 0.93 ± 0.09 0.85±0.08 1.41±0.12

8 1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 4.85±0.04 47.45±1.41 35.45±1.26 77.73±0.93 0.97 ± 0.02 0.88±0.02 1.62±0.02

9 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 5.24±0.04 78.97±3.62 51.34±2.68 42.23±0.36 0.64 ± 0.03 0.59±0.02 0.88±0.01

10 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 4.84±0.04 51.50±0.22 34.54±0.46 75.03±1.10 0.92 ± 0.02 0.84±0.02 1.56±0.02

11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 5.25±0.02 43.09±1.63 18.63±0.56 55.63±0.96 0.58 ± 0.01 0.53±0.01 1.16±0.02

12 1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 4.52±0.02 45.79±1.39 40.96±0.49 72.22±0.73 0.96 ± 0.00 0.87±0.00 1.50±0.02

13 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 5.00±0.03 72.46±0.88 40.48±0.56 64.68±0.60 0.85 ± 0.01 0.78±0.01 1.35±0.01

14 -1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 4.70±0.03 75.78±0.78 55.51±0.85 58.99±0.29 0.95 ± 0.02 0.87±0.01 1.23±0.01

15 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 4.32±0.01 40.81±1.20 26.10±0.29 91.74±0.58 1.03 ± 0.01 0.94±0.01 1.91±0.01

16 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5.44±0.04 73.41±5.91 50.05±2.14 39.94±0.58 0.59 ± 0.03 0.54±0.02 0.83±0.01

หมายเหต X4 ยสต เหลอทงจากการหมกไวน , X5 เปปโทน , X6 สารสกดจาก เ นอ , X7 Tween 80, X8 โซเดยมอะซเตต , X9 แมกน เ ซยมซล เฟตโมโนไฮเดรต , X10 แมงกานสซล เฟตโมโนไฮเดรต ,

X11 ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต, X12 ไดแอมโมเนยมซเตรต, X13 อะไมโลกลโคซเดส, X14-18 Dummy 1-5

สำนกหอ


60

ตารางท 22 ผลการวเคราะหความแปรปรวน สาหรบแผนการทดลอง Plackett-Burman design ของ การผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302

Term Main effect Coefficient SE

Coefficient T-value P-value

Constant 66.539 1.021 65.16 0.000

X4 ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 6.189 3.095 1.021 3.03 0.004*

X5 เปปโทน 2.051 1.025 1.021 1.00 0.322

X6 สารสกดจากเนอ 12.454 6.227 1.021 6.10 0.000*

X7 Tween 80 -1.781 -0.890 1.021 -0.87 0.389

X8 โซเดยมอะซเตต 9.581 4.790 1.021 4.69 0.000*

X9 แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต 0.794 0.397 1.021 0.39 0.700

X10 แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต 12.894 6.447 1.021 6.31 0.000*

X11ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต -14.118 -7.059 1.021 -6.91 0.000*

X12 ไดแอมโมเนยมซเตรต 3.756 1.878 1.021 1.84 0.074

X13 อะไมโลกลโคซเดส 7.328 3.664 1.021 3.59 0.001*

S = 7.07 R-Sq = 82.48% R-Sq (adj) = 77.75%

หมายเหต * หมายถงปจจยทมนยสาคญ ทระดบความเชอมนรอยละ 95 (P<0.05)

จากผลการวเคราะหการทดลอง Plackett-Burman design ดวยโปรแกรมทางสถตจากตารางท 22 พบวาคา R-Sq มคารอยละ 82.48 แสดงวา สมการทไดสามารถใชในการทานายคากรดแลกตกไดอยางเหมาะสม

สำนกหอ


61

Plackett-Burman design เปนการออกแบบเพอใชสาหรบคดเลอกปจจยทมนยสาคญออกจากปจจยทไมมนยสาคญ จากการศกษาพบวา องคประกอบอาหารทสนใจศกษา 10 ชนด ทคาระดบสง (1) และคาระดบตา (-1) แสดงคานยสาคญของปจจยทระดบความเชอมนรอยละ 95 พบ 4 ปจจย มคา P-value มากกวา 0.05 ซงเปนปจจยทไมมผลอยางมนยสาคญตอการผลต กรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ประกอบดวย เปปโทน Tween 80 แมกนเซยม ซลเฟตโมโนไฮเดรต และไดแอมโมเนยมซเตรต ดงนนทง 4 ปจจยน จงถกตดออกจากการศกษา หาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอในขนตอนการทดลองตอไป สวนปจจยทมคา P-value นอยกวา 0.05 ม 6 ปจจย ประกอบดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และ อะไมโลกลโคซเดส ซงเปนปจจยทมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก และนาไปศกษาตอในขนตอนตอไป ยสตเหลอทงจากการหมกไวน และสารสกดจากเนอ เปนแหลงไนโตรเจนทมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก แตเปปโทน ไมมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก ซงไมสอดคลองกบผลการทดลองของ Nancib และคณะ (2001) ไดทดลองใชเปปโทนเปนแหลงไนโตรเจนเทยบกบการไมเตมเปปโทน พบวาการเตมเปปโทนสงผลตอการผลตกรดแลกตกของเชอ Lactobacillus casei subsp. rhamnosus

แมงก า นสซ ล เฟ ตโมโนไฮ เ ด รต เ ป น ป จ จย ส า คญ ในก า ร เ จ รญขอ ง เ ช อ Lactobacillus casei เนองจากแมงกานสไอออนทาหนาทเปนโคแฟกเตอร (co-factor) ชวยในการทางานของเอนไซมแลคเตตดไฮโดรจเนส (lactate dehydrogenese) (Krischke, et al., 1991) จากการศกษาพบวาแมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรตมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก ซงสอดคลองกบการศกษาปจจยองคประกอบอาหารเลยงเชอโดย Plackett-Burman design ของเชอ Lactobacillus sp. KCP01 พบวาแมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรตมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตกเชนกน (Chauhan, et al., ) โซเดยมอะซเตตเปนปจจยทมผลตอการปรบสภาพ pH และเปนสารตงตนของไขมนตาง ๆ ในเซลล (Snell, et al., 1937) Peters and Snell (1954) ศกษาพบวาโซเดยมอะซเตตมผลตอการเพมขนของการเจรญของเซลล และมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก ซงสอดคลองกบการศกษาในครงน คอ โซเดยมอะซเตตเปนปจจยทมผลตอการผลตกรดแลกตกอยางมนยสาคญ

สำนกหอ


62

Tween 80 นอกจากเปนสารชวยลดแรงตงผวแลวยงสามารถละลายฟอสโฟลพด เมมเบรนและอานวยความสะดวกในการดดซมอาหาร (Srivastava, et al., 2014) และเปนอกหนงปจจยทมการรายงานวา มผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตกโดยใชราขาวสาล ภายใตการหมกแบบ solid-state (Naveena, et al., 2005) แตไมสอดคลองกบการศกษาในครง น คอ Tween 80 เปนปจจยทไมมผลตอการผลตกรดแลกตกอยางมนยสาคญ

แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรตทาหนาทเปนโคแฟกเตอรชวยในการทางานของเอนไซมเชนเดยวกนกบแมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต (Saha, 2006) ซงปรมาณแมกนเซยม ซลเฟตโมโนไฮเดรตทแตกตางกนไมมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก (Hofvendahl and

Hahn-Hagerdal, ) ซงสอดคลองกบการศกษาในครงน คอ แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรตเปนปจจยทไมมผลตอการผลตกรดแลกตกอยางมนยสาคญ ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟตเปนแหลงโพแทสเซยมไอออน และแหลงฟอสเฟตสาหรบการเจรญของเชอ และนอกจากนนยงเปนสารปรบสภาพ pH ในอาหารเลยงเชอดวย พบวากรดแลกตกสงขนเมอเพมปรมาณไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Coelho, et al., )

4.2 ผลการหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการผลตกรดแลกตก โดยใชวธพนผวตอบสนอง (Response surface methodology)

จากผลการทดลองในหวขอ 4.1 พบวาปจจยทสงผลอยางมนยสาคญตอการผลต กรดแลกตกของเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ม 6 ปจจย ประกอบดวย ยสตเหลอทงจากการ หมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และอะไมโลกลโคซเดส แตเนองจาก แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต มการเตมเพยงแค 0.075 กรมตอลตร และอะไมโลกลโคซเดส ถงแมจะมการเตมเพยงแค 0.1 เปอรเซนตของนาหนกมนเทศ แตเนองดวยอะไมโลกลโคซเดสนนมราคาสง ดงนนในการศกษาหวขอน จงกาหนดแมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต และอะไมโลกลโคซเดส เปนปจจยทกาหนดปรมาณศกษาทแนนอน นอกจากนนยงพบวาปรมาณมนเทศผงเปนแหลงคารบอนทสาคญในการผลตกรดแลกตก ดงนนจงเพมปรมาณมนเทศผงเปนอกปจจยในการศกษา ดงนนในการศกษาหวขอนจงมทงหมด 5

ปจจย ประกอบดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซ เตต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และปรมาณมนเทศผง โดยในแตละปจจย ศกษาท 5 ระดบ คอ -2, -1, 0, 1 และ 2 ดงตารางท 12 โดยวธพนผวตอบสนองใชแผนการทดลองแบบ Central Composite

Design (CCD) ชนด 5 ปจจย วางแผนการทดลองได 32 สตร แสดงดงตารางท 13 หมกดวยเชอ

สำนกหอ


63

Lactobacillus sp. FAG 302 บมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนระยะเวลา 48 ชวโมง คากรดแลกตกทไดจากการทดลอง และจากสมการทานายแสดงดงตารางท 23

จากตารางท 23 พบวาไดกรดแลกตกสงสด 107.10 กรมตอลตร จากสตรท 21

ประกอบดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร สารสกดจากเนอ 6 กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต 1 กรมตอลตร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร ซงมคากรดแลกตกใกลเคยงกบคาทานายคอ 105.51 กรมตอลตร การวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) สามารถสรางขอมลเปนภาพสามมต ทเรยกวา พนผวตอบสนองได โดยอาศยความสมพนธในทางคณตศาสตร ซงประกอบไปดวย ความสมพนธเชงเสนตรง (Linear model) ความสมพนธรวมกนของปจจย (Interaction model) และ ความสมพนธกาลงสอง (Quadratic model) ซงแบบจาลองของสมการการผลตกรดแลกตกสามารถสรางไดจากคาผลการวเคราะหทางสถต ตารางท 24

สำนกหอ


64

ตารางท 23 การผลตกรดแลกตกโดย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

ชนด 5 ปจจย บมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48 ชวโมง

สตรท X4 X6 X8 X11 X3 pH







Yp/s

(กรดแลกตกตอนาตาลกลโคสทใช)

Productivity


คาการทดลอง คาการทานาย

1 -1 -1 -1 -1 1 4.49 58.45 28.64 72.32 71.08 0.73 0.67 1.51

2 1 -1 -1 -1 -1 4.47 26.73 16.98 79.57 81.08 0.94 0.86 1.66

3 -1 1 -1 -1 -1 4.43 27.27 16.88 91.74 91.97 1.08 0.99 1.91

4 1 1 -1 -1 1 4.27 46.71 38.45 96.96 98.62 1.08 0.98 2.02

5 -1 -1 1 -1 -1 4.56 34.64 13.56 94.06 92.29 1.06 0.98 1.96

6 1 -1 1 -1 1 4.49 47.62 38.45 94.64 94.29 1.05 0.96 1.97

7 -1 1 1 -1 1 4.38 46.71 39.96 94.06 92.43 1.06 0.97 1.96

8 1 1 1 -1 -1 4.40 28.89 18.79 87.68 88.81 1.06 0.96 1.83

9 -1 -1 -1 1 -1 4.62 32.36 22.11 76.67 75.41 0.96 0.87 1.60

10 1 -1 -1 1 1 4.45 46.71 29.40 104.49 104.65 1.06 0.97 2.18

11 -1 1 -1 1 1 4.33 44.91 45.24 89.71 88.59 1.07 0.97 1.87

12 1 1 -1 1 -1 4.36 29.98 16.58 91.16 92.79 1.07 0.98 1.90

13 -1 -1 1 1 1 4.83 48.52 46.00 88.26 85.14 1.06 0.97 1.84

14 1 -1 1 1 -1 4.52 29.98 14.57 82.46 82.09 0.95 0.86 1.72

15 -1 1 1 1 -1 4.64 28.35 14.47 85.36 83.71 0.98 0.89 1.78

16 1 1 1 1 1 4.38 30.64 20.34 103.62 103.40 0.97 0.89 2.16

หมายเหต X4 ยสตเหลอทงจากการหมกไวน, X6 สารสกดจากเนอ, X8 โซเดยมอะซเตต, X11 ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และ X3 ปรมาณมนเทศผง

สำนกหอ


65

ตารางท 23 (ตอ) การผลตกรดแลกตกโดย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD) ชนด 5

ปจจยบมทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนเวลา 48 ชวโมง

สตรท X4 X6 X8 X11 X3 pH

นาตาลรดวซ

ทเหลอ (กรมตอลตร)





Yp/s

(กรดแลกตกตอนาตาลกลโคสทใช)

Productivity


คาการทดลอง คาการทานาย

17 -2 0 0 0 0 4.62 40.57 30.15 72.32 77.30 0.85 0.77 1.51

18 2 0 0 0 0 4.35 43.64 24.13 96.96 93.58 1.07 0.98 2.02

19 0 -2 0 0 0 4.92 37.86 31.67 72.32 74.74 0.86 0.79 1.51

20 0 2 0 0 0 4.33 38.58 27.14 89.13 88.31 1.01 0.92 1.86

21 0 0 -2 0 0 4.40 46.71 14.07 107.10 105.51 1.07 0.98 2.23

22 0 0 2 0 0 4.47 40.93 14.47 106.81 110.00 1.08 0.98 2.23

23 0 0 0 -2 0 4.41 42.56 30.16 83.91 83.34 0.99 0.90 1.75

24 0 0 0 2 0 4.63 32.80 23.12 82.46 84.64 0.90 0.82 1.72

25 0 0 0 0 -2 4.56 13.07 6.13 84.78 84.25 1.04 0.94 1.77

26 0 0 0 0 2 4.43 45.81 46.00 94.64 96.77 0.99 0.90 1.97

27 0 0 0 0 0 4.48 39.13 27.89 93.48 92.63 1.07 0.98 1.95

28 0 0 0 0 0 4.45 38.58 27.74 93.19 92.63 1.07 0.97 1.94

29 0 0 0 0 0 4.43 38.04 28.34 92.61 92.63 1.07 0.97 1.93

30 0 0 0 0 0 4.50 38.22 28.64 93.48 92.63 1.08 0.99 1.95

31 0 0 0 0 0 4.45 39.31 27.89 92.03 92.63 1.06 0.96 1.92

32 0 0 0 0 0 4.46 39.49 28.04 92.61 92.63 1.06 0.97 1.93

หมายเหต X4 ยสตเหลอทงจากการหมกไวน, X6 สารสกดจากเนอ, X8 โซเดยมอะซเตต, X11 ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และ X3 ปรมาณมนเทศผง

สำนกหอ


66

ตารางท 24 การว เ ค รา ะ หกา รถดถอยของพนผ วตอบสนองส าห รบแผนการทดลอง Central Composite Design (CCD) ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp.

FAG 302

Term Coefficient SE

Coefficient T-value P-value

Contant 92.6330 1.1993 77.236 0.000

ยสตเหลอทงจากการหมกไวน (X4) 4.0700 0.6138 6.631 0.000*

สารสกดจากเนอ (X6) 3.3933 0.6138 5.529 0.000*

โซเดยมอะซเตต (X8) 1.1225 0.6138 1.829 0.095

ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (X11) 0.3250 0.6138 0.529 0.607

ปรมาณมนเทศผง (X3) 3.1283 0.6138 5.097 0.000*

X42 -1.7980 0.5552 -3.238 0.008*

X62 -2.7767 0.5552 -5.001 0.000*

X82 3.7808 0.5552 6.810 0.000*

X112 -2.1617 0.5552 -3.894 0.003*

X32 -0.5305 0.5552 -0.955 0.360

X4X6 -0.7062 0.7517 -0.939 0.368

X4X8 -2.1925 0.7517 -2.917 0.014*

X4X11 2.1913 0.7517 2.915 0.014*

X4X3 3.8950 0.7517 5.181 0.000*

X6X8 -1.5762 0.7517 -2.097 0.060

X6X11 -0.7425 0.7517 -0.988 0.345

X6X3 0.0912 0.7517 0.121 0.906

X8X11 -2.0113 0.7517 -2.675 0.022*

X8X3 0.4175 0.7517 0.555 0.590

X11X3 2.8438 0.7517 3.783 0.003*

S = 3.007 R-Sq = 96.2% R-Sq (adj) = 89.4%

หมายเหต * แสดงคานยสาคญทระดบความเชอมนรอยละ 95 (P<0.05)

สำนกหอ


67

จากผลการวเคราะหการถดถอยของพนผวตอบสนองในตารางท 24 พบวา X4, X6, X3,

X42, X6

2, X82, X11

2, X4X8, X4X11, X4X3, X8X11 และ X11X3 มคา P-value นอยกวา 0.05 แสดงวา ปจจยนนมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก และ X8, X11, X3

2, X4X6, X6X8, X6X11, X6X3 และ X8X3 มคา P-value มากกวา 0.05 แสดงวา ปจจยนนไมมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก และเมอพจารณาคา R-Sq พบวามคารอยละ 96.2 แสดงวา สมการทไดสามารถนาไปใชในการทานายคากรดแลกตกไดอยางเหมาะสม สรางสมการทานายปรมาณกรดแลกตก โดยนาคาของปจจยทไดจากการวเคราะหสมประสทธของสมการถดถอยในตารางท 24 มาเขยนในรปสมการดงน

Y= 92.6330 + 4.0700 X4 + 3.3933 X6 + 1.1225 X8 + 0.3250 X11 + 3.1283 X3

- 1.7980 X42 - 2.7767 X6

2 + 3.7808 X82 - 2.1617 X11

2 - 0.5305 X32 - 0.7062 X4X6

- 2.1925 X4X8 + 2.1913 X4X11 + 3.8950 X4X3 - 1.5762 X6X8 - 0.7425 X6X11

+ 0.0912 X6X3 - 2.0113 X8X11 + 0.4175 X8X3 + 2.8438 X11X3 สมการท7

เมอ Y คอ ปรมาณกรดแลกตกทไดจากการทานาย และ X4, X6, X8, X11 และ X3 คอ

ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และปรมาณมนเทศผง ตามลาดบ

ความสมพนธระหวางผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทดลอง และผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทานาย ในรปเสนตรง แสดงดงภาพท 15 ซงมการกระจายของจดในแตละการทดลองในแนวแกนเสนตรง ซงพบวาผลผลตกรดแลกตกจากการทดลอง และจากการทานายมคาไมแตกตางกน

นาสมการทานายปรมาณกรดแลกตกทได (สมการท 7) มาสรางกราฟพนผวตอบสนองดวยโปรแกรมทางสถต ไดกราฟพนผวตอบสนองแสดงดงภาพท 16-25

สำนกหอ


68

ตารางท 25 การว เคราะ หความแปรปรวนของแบบจาลอง ส าห รบแผนการทดลอง Central Composite Design (CCD) ของการผลตกรดแลกตก โดยเชอ Lactobacillus sp.

FAG 302

Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F-value P-value

Regression 20 2533.45 2533.448 126.672 14.01 0.000

Linear 5 941.56 941.561 188.312 20.83 0.000

Square 5 941.82 941.823 188.365 20.83 0.000

Interaction 10 650.06 650.064 65.006 7.19 0.002

Residual Error 11 99.46 99.458 9.042

Lack of fit 6 97.78 97.776 16.296 48.44 0.000

Pure Error 5 1.68 1.682 0.336

Total 31 2632.91

ภาพท ความสมพนธระหวางคาผลผลตกรดแลกตกทไดจากการทดลอง และผลผลตกรด

แลคตกทไดจากการทานาย สาหรบแผนการทดลอง Central Composite Design (CCD)

40

60

80

100

120

70 75 80 85 90 95 100 105 110

กรดแ

ลกตก

จากการ

ทานาย (กรมต

อลตร

)

กรดแลกตกจากการทดลอง (กรมตอลตร)

สำนกหอ


69

ภาพท 16 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และสารสกดจากเนอ ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302

ในอาหารเ ลยง เ ชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite

Design (CCD)

ภาพท 17 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และโซเดยมอะซเตต ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302

ในอาหารเ ลยง เ ชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite

Design (CCD)

สำนกหอ


70

ภาพท 18 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต ตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

ภาพท 19 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางยสตเหลอทงจากการหมกไวน และปรมาณมนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก เ มอหมกดวย Lactobacillus sp.

FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite

Design (CCD)

สำนกหอ


71

ภาพท 20 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางสารสกดจากเนอและโซเดยม อะซ เตต ตอการผลตกรดแลกตก เ มอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ใน อาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

ภาพท 21 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางสารสกดจากเ นอและ ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต ตอการผลตกรดแลกตก เ มอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

สำนกหอ


72

ภาพท 22 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางสารสกดจากเนอ และปรมาณ มนเทศผงตอการผลตกรดแลกตก เมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหาร เลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

ภาพท 23 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางโซเดยมอะซเตตและไดโพแทส เซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต ตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp.

FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite

Design (CCD)

สำนกหอ


73

ภาพท 24 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางโซเดยมอะซเตต และปรมาณ มนเทศผง ตอการผลตกรดแลกตกเมอหมกดวย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหาร เลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

ภาพท 25 กราฟพนผวตอบสนอง แสดงความสมพนธระหวางไดโพแทสเซยมไฮโดรเจน ฟอส เฟต และป รม าณมน เทศผง ต อก ารผ ล ตกรดแลก ตก เ ม อหมก ดว ย Lactobacillus sp. FAG 302 ในอาหารเลยงเชอทไดจากการวางแผนการทดลองโดย Central Composite Design (CCD)

สำนกหอ


74

จากนนทาการหาจดสงสดจากกราฟพนผวตอบสนอง จากแผนการทดลองแบบ Central Composite Design (CCD) พบวาไมสามารถหาจดทเหมาะสมทใหผลผลตกรดแลกตก สงสดได เนองจากกราฟทไดมลกษณะไมเปนโคงระฆงควา (ภาพท 16-25) ดงนนจงเลอกสตรทใหคาผลผลตกรดแลกตกสงสด คอ 107.10 กรมตอลตร จากสตรท 21 ประกอบไปดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร สารสกดจากเนอ 6 กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต 1 กรมตอลตร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร รวมไปถงอก 2 ปจจยทกาหนดปรมาณศกษาทแนนอน คอ แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต 0.075

กรมตอลตร และอะไมโลกลโคซเดส 0.1 เปอรเซนต

สำนกหอ


75

การทวนสอบ (Verification)

การทวนสอบเปนการทาการทดลองซาเพอเปรยบเทยบ และยนยนผลของการผลตกรดแลกตกกบคาทไดจากการทานายอกครง โดยนาสตรท 21 ซงใหผลผลตแลกตกทสงทสดมาทาการหมกในระดบขวดเขยา โดยปจจยทเหมาะสมประกอบไปดวย ดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร สารสกดจากเนอ 6 กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต 1 กรมตอลตร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร รวมไปถงอก 2 ปจจยทกาหนดปรมาณทแนนอน คอ แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต 0.075 กรมตอลตร และอะไมโล กลโคซเดส 0.1 เปอรเซนต หมกดวยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 เขยาดวยความเรวรอบ 150

รอบตอนาท เปนเวลา 48 ชวโมง

ผลการทวนสอบแสดงดงตารางท 26 พบวาคาเฉลยกรดแลกตกทได คอ 105.94 กรมตอลตร ซงมคาใกลเคยงกบผลการทานายในการทดลองสภาวะและปจจยทเหมาะสมโดยการออกแบบการทดลองแบบ Central Composite Design (CCD) คอ 105.51 กรมตอลตร

ตารางท 26 ผลการทวนสอบการหมกกรดแลกตกโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ในระดบ ขวดเขยาเมอใชสตรท 21 ซงใชดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร ส า ร ส ก ด จ า ก เ น อ 6 ก ร ม ต อ ล ต ร โ ซ เ ด ย ม อ ะ ซ เ ต ต 1 ก ร ม ต อ ล ต ร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร หมกเปนระยะเวลา 48 ชวโมง

ผลการทดสอบ คาเฉลย

pH 4.49 ± 0.02

นาตาลรดวซทเหลอ (กรมตอลตร) 38.85 ± 0.38

นาตาลกลโคสทเหลอ (กรมตอลตร) 16.12 ± 0.71

กรดแลกตก (กรมตอลตร) 105.94 ± 0.41

Yp/s (กรดแลกตกตอแปงทใช) 1.08 ± 0.01

Y p/s (กรดแลกตกตอนาตาลกลโคสทใช) 0.99 ± 0.01

Productivity (กรมตอลตรตอชวโมง) 2.21 ± 0.01

สำนกหอ


76

เมอเปรยบเทยบสตรอาหารหลงการปรบปรง จากผลการทดลองท 4.2 กบสตรอาหารกอนการปรบปรง จากผลการทดลองท 3 พบวา ถงแมผลผลตกรดแลกตกทไดจากสตรอาหารหลงการปรบปรงจะลดลง แตสตรอาหารหลงการปรบปรงสามารถตดปจจยออกได 4 ปจจย คอ เปปโทน Tween 80 แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต และ ไดแอมโมเนยมซเตรต และนอกจากนนยงสามารถลดปรมาณการใชสารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต และ อะไมโลกลโคซเดส ซงเปนการชวยลดตนทนในการผลตกรดแลกตกไดอกทาง

ตารางท 27 องคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการหมกกรดแลกตกกอนการปรบปรง เปรยบเทยบกบหลงการปรบปรง

ปจจย สตรอาหาร

กอนการปรบปรง หลงการปรบปรง

ยสตเหลอทงจากการหมกไวน (กรมตอลตร) 10 25

เปปโทน (กรมตอลตร) 10 -

สารสกดจากเนอ (กรมตอลตร) 8 6

Tween 80 (มลลลตรตอลตร) 1 -

โซเดยมอะซเตต (กรมตอลตร) 5 1

แมกนเซยมซลเฟตโมโนไฮเดรต (กรมตอลตร) 0.2 -

แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต (กรมตอลตร) 0.075 0.075

ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (กรมตอลตร) 2 2

ไดแอมโมเนยมซเตรต (กรมตอลตร) 2 -

อะไมโลกลโคซเดส (เปอรเซนตตอนาหนกมนเทศ) 0.18 0.1

ปรมาณมนเทศผง (กรมตอลตร) 180 180

กรดแลกตก (กรมตอลตร) 118.41 105.94

สำนกหอ


77

5. ผลการหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตร

จากการหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอสาหรบการผลตกรดแลกตกโดยวธพนผวตอบสนอง พบวา สตรอาหารเลยงเชอสตรท 21 ซงประกอบไปดวย ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร สารสกดจากเนอ 6 กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต 1 กรมตอลตร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร รวมไปถงอก 2 ปจจยทกาหนดปรมาณทแนนอน คอ แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต 0.075 กรมตอลตร และอะไมโลกลโคซเดส 0.1 เปอรเซนต เปนปรมาณองคประกอบของอาหารเลยงเชอทเหมาะสมสาหรบการผลตกรดแลกตก ดงนนการทดลองนจงนาองคประกอบอาหารทไดมาหมกในถงหมกขนาด 5 ลตร หมกดวยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 ทาการกวนดวยความเรวรอบ 350 รอบตอนาท โดยเกบผลทก 12 ชวโมง เปนเวลา 48 ชวโมง ผลการทดลองแสดงดงตารางท 28

ตารางท 28 ผลการหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตรโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 เมอใชสตรท 21 เขยา 350 รอบตอนาท หมกเปนระยะเวลา 48 ชวโมง


(ชวโมง)

pH


ทเหลอ





Yp/s (กรดแลกตก ตอแปงทใช)

Y p/s (กรดแลกตก ตอนาตาลกลโคสทใช)

Productivity


0 5.74 ± 0.03 67.96 ± 1.53 20.37 ± 0.37 0.25 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

12 4.71 ± 0.00 79.73 ± 1.27 85.15 ± 1.23 11.54 ± 0.72 0.32 ± 0.00 0.30 ± 0.00 0.96 ± 0.06

24 4.56 ± 0.00 62.90 ± 4.09 63.20 ± 0.78 34.90 ± 0.24 0.63 ± 0.01 0.58 ± 0.01 1.45 ± 0.01

36 4.52 ± 0.01 55.34 ± 0.96 42.71 ± 1.20 75.89 ± 1.67 1.03 ± 0.01 0.94 ± 0.01 2.11 ± 0.05

48 4.51 ± 0.00 41.61 ± 0.32 18.97 ± 0.45 102.82 ± 1.39 1.08 ± 0.01 0.98 ± 0.00 2.14 ± 0.03

สำนกหอ


78

จากผลการทดลองตารางท 28 พบวาไดกรดแลกตกสงสด 102.82 กรมตอลตร ในระยะเวลา 48 ชวโมง ซงไดคากรดแลกตกใกลเคยงกบในระดบขวดเขยาซงได 105.94 กรมตอลตร แตเนองจากตองการศกษาคา pH ทเหมาะสมในการผลตกรดแลกตกในระดบถงหมก ดงนนจงเปลยนสารควบคมคา pH จากแคลเซยมคารบอเนตเปน 10 นอรมอลโซเดยมไฮดรอกไซด ซงคา pH 5-7 เปนคาทเหมาะสมตอการผลตกรดแลกตกในขณะทเชอแบคทเรยกรดแลกตกยงสามารถเจรญได (Guyot, et al., , Kashket, ) และนอกจากนนยงเปนชวง pH ทเหมาะสมตอการทางานของอะไมโลกลโคซเดส ดงนนในการศกษาคา pH จงเลอกศกษาคา pH 5, 6 และ 7 โดยหมกดวย เ ชอ Lactobacillus sp.FAG 302 เ มอใช สตร ท 21 (ตารางท 23) กวน 250 รอบตอนาท ในระยะเวลา 24 ชวโมงแรก หลงจากนนกวน 200 รอบตอนาท หมกเปนระยะเวลา 72 ชวโมง ผลการศกษาแสดงดงตารางท 29

จากผลการศกษาคา pH ในถงหมกขนาด 5 ลตร พบวา pH 6 สามารถผลตกรดแลกตกไดสงสด 119.29 กรมตอลตร ในระยะเวลา 72 ชวโมง ไดคา Productivity 1.66 กรมตอลตรตอชวโมง ซงสอดคลองกบการศกษาของ Yoo และคณะ ไดทาการศกษาคาของ pH ตอการผลตกรดแ ล ก ต ก ข อ ง เ ช อ L. casei subsp. rhamnosus. ใ น ถ ง ห ม ก ข น า ด 2.5 ล ต ร โ ด ย ใ ช 10

นอรมอลโซเดยมไฮดรอกไซดเปนสารควบคม pH พบวา ท pH 6 สามารถผลตกรดแลกตกไดสงสด 79.0 กรมตอลตร

เมอเปรยบเทยบคากรดแลกตกจากเชอและแหลงคารบอนตาง ๆ พบวา กรดแลกตกทผลตไดจากมนเทศสามารถผลตกรดแลกตกไดสงและใหคา Productivity สง ดงตารางท 30

สำนกหอ


79

ตารางท 29 ผลคา pH จากการหมกกรดแลกตกในถงหมกขนาด 5 ลตรโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 เมอใชสตรท 21 กวน 250 รอบตอนาท ในระยะเวลา 24 ชวโมงแรก หลงจาก นนกวน 200 รอบตอนาท หมกเปนระยะเวลา 72 ชวโมง

pH



ทเหลอ





Yp/s (กรดแลกตก ตอแปงทใช)

Y p/s (กรดแลกตก ตอนาตาลกลโคสทใช)

Productivity


5.0

0 58.80 ± 0.94 18.20 ± 0.32 0.41 ± 0.19 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

12 56.45 ± 1.36 40.71 ± 0.71 13.84 ± 0.36 0.18 ± 0.00 0.17 ± 0.00 1.15 ± 0.03

24 53.06 ± 0.38 39.88 ± 0.70 42.90 ± 1.16 0.56 ± 0.01 0.51 ± 0.01 1.79 ± 0.05

36 51.05 ± 0.24 38.19 ± 0.35 56.55 ± 1.15 0.73 ± 0.02 0.66 ± 0.02 1.57 ±0.03

48 41.87 ± 0.52 34.35 ± 0.48 61.08 ± 0.54 0.75 ± 0.01 0.68 ± 0.01 1.27 ± 0.01

60 32.42 ± 0.61 25.74 ± 0.34 71.82 ± 1.34 0.81 ± 0.01 0.73 ± 0.01 1.20 ± 0.02

72 20.71 ± 0.65 14.70 ± 0.14 82.09 ± 0.62 0.83 ±0.01 0.75 ± 0.00 1.14 ± 0.01

6.0

0 56.11 ± 0.46 20.60 ± 0.17 0.24 ± 0.03 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

12 51.26 ± 1.11 50.57 ± 0.56 24.04 ± 0.97 0.36 ± 0.02 0.33 ± 0.02 2.00 ± 0.08

24 49.92 ± 0.62 20.82 ± 0.28 55.42 ± 0.25 0.59 ± 0.00 0.54 ± 0.00 2.31 ± 0.01

36 28.58 ± 1.22 0.11 ± 0.01 92.33 ± 0.45 0.82 ± 0.00 0.75 ± 0.00 2.56 ± 0.01

48 23.72 ± 1.79 0.01 ± 0.00 109.01 ± 0.64 0.97 ± 0.01 0.88 ± 0.01 2.27 ± 0.01

60 17.52 ± 1.78 0.01 ± 0.00 116.82 ± 0.28 1.04 ± 0.00 0.95 ± 0.00 1.95 ± 0.00

72 8.10 ± 1.57 0.01 ± 0.00 119.29 ± 0.63 1.06 ± 0.01 0.97 ± 0.01 1.66 ± 0.01

7.0

0 63.74 ± 1.45 17.68 ± 0.58 0.23 ± 0.01 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

12 61.62 ± 0.92 29.32 ± 0.48 20.19 ± 0.44 0.24 ± 0.00 0.21 ± 0.00 1.66 ± 0.04

24 37.57 ± 0.84 2.95 ± 0.79 63.81 ± 1.52 0.58 ± 0.02 0.53 ± 0.02 2.70 ± 0.06

36 27.48 ± 0.07 0.20 ± 0.02 75.67 ± 0.57 0.67 ± 0.01 0.61 ± 0.00 2.11 ± 0.02

48 17.24 ± 1.21 0.11 ± 0.02 103.86 ± 0.82 0.93 ± 0.01 0.84 ± 0.01 2.18 ± 0.02

60 10.45 ± 0.75 0.11 ± 0.01 107.94 ± 0.60 0.96 ± 0.01 0.87 ± 0.00 1.81 ± 0.01

72 9.49 ± 0.57 0.09 ± 0.00 110.85 ± 0.26 0.99 ± 0.00 0.90 ± 0.00 1.54 ± 0.00

สำนกหอ


80

ภาพท 26 คากรดแลกตก ระยะเวลาในการหมก และ pH จากการหมกกรดแลกตกในถงหมก ขนาด 5 ลตรโดยเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 เมอใชสตรท 21 กวน 250 รอบ ตอนาท ในระยะเวลา 24 ชวโมงแรก หลงจากนนกวน 200 รอบตอนาท หมกเปน ระยะเวลา 72 ชวโมง

ตารางท 30 กรดแลกตกจากเชอและแหลงคารบอนตาง ๆ

เชอจลนทรย

แหลงคารบอน

ระยะเวลา ในการหมก

(ชวโมง)


Productivity (กรมตอลตรตอชวโมง)

แหลงทมา

Lactobacillus delbruckii นาออย 72 116.28 1.62 Day et al. (2012)

Lactobacillus plantarum LMISM6 กากนาตาล 48 94.8 1.98 Coelho et al. (2011)

Lactobacillus paracasei แกนตะวน 72 92.5 1.28 Choi et al. (2012)

Lactobacillus sp. FAG 302 มนเทศ 48 109.01 2.27 การศกษาน

020406080

100120140

0 12 24 36 48 60 72

กรดแ

ลกตก

(กรม

ต อลต

ร)

ระยะเวลาในการหมก (ชวโมง)

pH5 pH6 pH7

สำนกหอ


81

6. ผลการศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตกทคดกรองได

ศกษา stereoisomer ของกรดแลกตกทผลตโดยแบคทเรยกรดแลกตกทคดกรองได คอ Lactobacillus sp. FAG 302 วาเปน L (+)-lactic acid หรอ D (-)-lactic acid หรอทง 2 ไอโซเมอร โดยใชวธทางเอนไซม ซงมความเฉพาะเจาะจงสง ในการทดลองใชชดทดสอบของบรษท R-Biopharm GmbH ประเทศ เยอรมน ซงสามารถตรวจสอบ stereoisomer ของกรดแลกตกได โดยพบวาสามารถคานวณความเขมขนของ D (-)-lactic acid ได 9.216 กรมตอลตร และความเขมขนของ L (+)-lactic acid ได 8.494 กรมตอลตร แสดงดงตารางท 30 วธการคานวณความเขมขนของกรดแลกตก และ content แสดงดงน

การคานวณความเขมขนของกรดแลกตกดงสมการ

ความเขมขน (กรมตอลตร) : C = × ∆A

เมอ V คอ ปรมาตรรวมสดทาย (มลลลตร)

VD-lactic acid = 1.000 + 0.200 + 0.020 + 0.100 + 0.900 + 0.020 = 2.240

VL-lactic acid = 1.000 + 0.200 + 0.020 + 0.100 + 0.900 + 0.020 + 0.020 = 2.260

v คอ ปรมาณสารตวอยาง (มลลลตร)

MW คอ นาหนกโมเลกลของสารทวเคราะห (กรมตอลตร)

d คอ light path (เซนตเมตร)

คอ คา extinction coefficient ของ NADH ท 340 นาโนเมตร เทากบ 6.3 (L×mmol-1×cm-1)

∆A D-lactic acid คอ คาการดดกลนแสง (A2-A1)

∆A L-lactic acid คอ คาการดดกลนแสง (A3-A2)

สาหรบ D-lactic acid = 2.240×90.1

6.3×1.00×0.100×1000

= 0.320 × ∆AD-lactic acid × dilution factor

สาหรบ L-lactic acid = 2.260×90.1

6.3×1.00×0.100×1000

= 0.323 × ∆AL-lactic acid × dilution factor

× d × v × 1000

× ∆A D-lactic acid

× ∆AL-lactic acid

V × MW ส

ำนกหอสมดกลาง

82

นาความเขมขนทคานวณได มาคานวณ

Content D-lactic acid = CD-lactic acid × 100


Content L-lactic acid = CL-lactic aci × 100


ตารางท 31 คาการดดกลนแสง การคานวณความเขมขนกรดแลกตก การคานวณ content จาก การศกษา stereoisomer ของกรดแลกตก โดยใชชดทดสอบของบรษท R-Biopharm

GmbH ประเทศ เยอรมน

เชอ คาการดดกลนแสง 340

นาโนเมตร ∆AD =

A2-A1

∆AL =

A3-A2

Conc.

D-lactic

Conc.

L-lactic

Content

D-Lactic

Content

L-lactic A1 A2 A3

Lactobacillus sp.

FAG 302 0.012 0.300 0.563 0.288 0.263 9.216 8.494 52.038 47.961

จากตารางท 30 เชอ Lactobacillus sp. FAG 302 มคา Content D-Lactic acid คอ 52.038 และ Content L-Lactic acid คอ 47.961 ซงแสดงวากรดแลกตกทผลตไดของเชอ Lactobacillus sp. FAG 302 คอ D/L-lactic acid

ดงนนจงอาจไมเหมาะสมในการใชประโยชนสาหรบการผลตโพลแลกตก เนองจากไมสามารถควบคมอตราสวนระหวาง D และ L ได ซงอตราสวนของ D/L-lactic acid นมผลตอคณสมบตของโพลแลกตก คอ จดหลอมเหลว และระดบการตกผลก (Martin and Averous,

2001) อยางไรกตาม กรดแลกตกทผลตไดนสามารถนาไปใชในอตสาหกรรมอาหาร เชน ใชในรปโซเดยมแลกเตทผสมในสารเสรมคณภาพขนมปง (dough conditionner) และใชเปน emulsifier ในผลตภณฑเบเกอร เปนตน นอกจากนนยงสามารถนาไปใชในอตสาหกรรมดานอน ๆ เชน อตสาหกรรมการผลตเครองสาอาง ใชเปนสวนผสมในโลชน สารใหความชมชน และยงสามารถนาไปใชเปนสารเพมความเปนกรดในอตสาหกรรมฟอกหนงไดอกดวย (John, et al., 2009)

สำนกหอ


83

บทท 5

สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ

สรปผลการทดลอง

มนเทศเปนพชทางเลอกทสามารถนามาใชเปนวตถดบในการผลตกรดแลกตกไดอยางมประสทธภาพ โดยนามนเทศมาผานกระบวนการแปรรปเปนมนเทศผง เพอเปนการยดอายการเกบรกษา จากนนนามาผานการยอยดวยอณหภม 90 องศาเซลเซยส แลวนามาหมกกรดแลกตกดวยเชอทเหมาะสม คอ Lactobacillus sp. FAG 302 ดวยอณหภม 34 องศาเซลเซยส ปรมาณมนเทศผง 180

กรมตอลตร เปนระยะเวลา 48 ชวโมง จากผลการทดลองแบบ Box-Behnken

จากการคดเลอกองคประกอบอาหารทมผลตอการผลตกรดแลกตก โดยใช Plackett-

Burman design พบวาจาก 10 ปจจยทศกษาม 6 ปจจยทมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก คอ ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และอะไมโลกลโคซเดส จากนนนาปจจยยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และปรมาณมนเทศผง มาศกษาหาคาทเหมาะสมของปรมาณองคประกอบอาหารเลยงเชอ โดยกาหนดใหแมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต และอะไมโล กลโคซเดส เปนปจจยทเตมในปรมาณทแนนอน โดยใชวธพนผวตอบสนองซงใชแผนการทดลองแบบ CCD หมกทอณหภม 34 องศาเซลเซยส เขยา 150 รอบตอนาท เปนระยะเวลา 48 ชวโมง พบวา ปรมาณองคประกอบอาหารทเหมาะสม คอ ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 25 กรมตอลตร สารสกดจากเนอ 6 กรมตอลตร โซเดยมอะซเตต 1 กรมตอลตร ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต 2 กรมตอลตร และปรมาณมนเทศผง 180 กรมตอลตร รวมไปถงอก 2 ปจจยทกาหนดปรมาณศกษาทแนนอน คอ แมงกานสซลเฟตโมโนไฮเดรต 0.075 กรมตอลตร และอะไมโลกลโคซเดส 0.1

เปอรเซนต นอกจากนยงสามารถสรางสมการแบบจาลองความสมพนธระหวางปจจยทมผลอยางมนยสาคญตอการผลตกรดแลกตก ดงน

สำนกหอ


84

Y= 92.6330 + 4.0700 X4 + 3.3933 X6 + 1.1225 X8 + 0.3250 X11 + 3.1283 X3 - 1.7980 X42

- 2.7767 X62 + 3.7808 X8

2 - 2.1617 X112 - 0.5305 X3

2 - 0.7062 X4X6 - 2.1925 X4X8

+ 2.1913 X4X11 + 3.8950 X4X3 - 1.5762 X6X8 - 0.7425 X6X11 + 0.0912 X6X3

- 2.0113 X8X11 + 0.4175 X8X3 + 2.8438 X11X3

เมอ Y คอ ปรมาณกรดแลกตกทไดจากการทานาย และ X4, X6, X8, X11 และ X3 คอ

ยสตเหลอทงจากการหมกไวน สารสกดจากเนอ โซเดยมอะซเตต ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต และปรมาณมนเทศผง ตามลาดบ

แบบจาลองสมการสามารถนามาอธบายความสมพนธระหวางตวแปรตาง ๆ ไดรอยละ 96.2 คากรดแลกตกทไดสงสดจากการทดลอง คอ 107.10 กรมตอลตร ซงใกลเคยงกบคาแลคตกจากการทานาย คอ 105.51 กรมตอลตร และผลจากการทวนสอบ มคาใกลเคยงกบคาการผลตกรด แลกตกจากคาทานาย

การขยายขนาดการผลตโดยการหมกในถงหมกขนาด 5 ลตร พบวาสามารถผลตกรดแลกตกได 102.82 กรมตอลตร ในระยะเวลา 48 ชวโมง เขยา 350 รอบตอนาท เนองจากความหนดของอาหารและแคลเซยมคารบอเนต จงเปลยนสารปรบคา pH เปน 10 นอรมอลโซเดยมไฮดรอกไซด พบวาท 48 ชวโมง ของ pH 6 สามารถผลตกรดแลกตกได 109.01 กรมตอลตร และสามารถผลตกรดแลกตกไดสงสด 119.29 กรมตอลตร ในระยะเวลา 72 ชวโมง

ขอเสนอแนะ

ในการแปรรปมนเทศผงเปนเพยงการอบมนเทศใหแหงและนามาบดทาใหใน มนเทศผงนนประกอบไปดวยกากใย สงผลใหในกระบวนการยอย และการหมกเกดความหนดของมนเทศผง ดงนนในการศกษาขนตอไป ควรศกษาขนตอนวธการแปรรปมนเทศ เพอใหไดเปนแปงจากมนเทศ

สำนกหอ


85

รายการอางอง กรมสงเสรมอตสาหกรรม. (2552). การศกษาความเปนไปไดของการผลตเอทานอลจากมน

สาปะหลง ประจาป 2552

ไชยวฒน นพเกา. (2553). การศกษาองคประกอบอาหารและสภาวะการหมกทเหมาะสมในการผลตกรดแลกตกจากเวยโดยแบคทเรยกรดแลกตก. การศกษารายบคคล ปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร.

ปยณฐ คานล. (2555). การผลตกรดแลกตกจากมนเทศโดยแบคทเรยกรดแลกตกดวยกระบวนการเปลยนเปนนาตาลพรอมกบการหมก . การศกษารายบคคล ปรญญาวทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร.

สารานกรมไทยสาหรบเยาวชนโดยพระราชประสงคในพระบาทสมเดจพระเจาอยหว, (ออนไลน) แหลงทมา: http://kanchanapisek.or.th/kp /sub/book/book.php?book= &chap= &page=chap .htm เขาถงเมอ 16 เมษายน 2558

อศรพงษ พงษศ รกล . (2550). การว เคราะหผลทางสถตโดยใชโปรแกรมสาเรจรปสาหรบ อตสาหกรรมเกษตร. พมพครงท 4. เชยงใหม: มหาวทยาลยเชยงใหม. อดมทรพย ใจด. (2551). การเปรยบเทยบเกณฑทเหมาะสมสาหรบแผนแบบพนผวตอบสนองแถว- หลก. การศกษารายบคคล ปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาสถต ภาควชาสถต บณฑตวทยาลยมหาวทยาลยเกษตรศาสตร Abegunde, O. K., Mu, T.-H., Chen, J.-W., and Deng, F.-M. 2013. Physicochemical characterization

of sweet potato starches popularly used in chinese starch industry. Food Hydrocolloids.

33, 169-177.

Akerberg, C. and Zacchi, G. 2000. An economic evaluation of the fermentative production of lactic

acid from wheat flour. Bioresource Technology. 75, 119-126.

Altaf, M., Naveena, B. J., and Reddy, G. 2005. Screening of inexpensive nitrogen sources for

production of L (+) lactic acid from starch by amylolytic Lactobacillus amylophilus GV6

in single step fermentation. Food Technology and Biotechnology. 43, 235-239.

สำนกหอ


86

Anuradha, R., Suresh, A. K., and Venkatesh, K. V. 1999. Simultaneous saccharification and

fermentation of starch to lactic acid. Process Biochemistry. 35, 367-375.

Axelsson, L. 1998. Lactic acid bacteria: Classification and physiology, p. 1-72. In S. Salminen and

A. v. Vright (eds.), Lactic acid bacteria: Microbiololgy and functional aspects. , New York.

Barker, S. B. and Summerson, W. H. 1941. The colorimetric determination of lactic acid in

biological meterials. The Journal of Biological Chemistry 138, 535-554.

Bulut, S., Elibol, M., and Ozer, D. 2004. Effect of different carbon sources on L (+) -lactic acid

production by Rhizopus oryzae. Biochemical Engineering Journal. 21, 33-37.

Chauhan, K., Trivedi, U., and Patel, K. C. 2007. Statistical screening of medium components by

Plackett-Burman Design for lactic acid production by Lactobacillus sp. KCP01 using date

juice. Bioresource Technology. 98, 98-103.

Chindaruska, S. and Pin, M. 2008. Bio-ethanol from sweet sorghum, Lampi di Stampa.

Cho, I.-H. and Zoh, K.-D. 2007. Photocatalytic degradation of azo dye (reactive red 120) in TiO2/uv

system: Optimization and modeling using a Response Surface Methodology (RSM) based

on the Central Composite Design. Dyes and Pigments. 75, 533-543.

Choi, H.-Y., Ryu, H.-K., Park, K.-M., Lee, E. G., Lee, H., Kim, S.-W., and Choi, E.-S. 2012. Direct

lactic acid fermentation of jerusalem artichoke tuber extract using lactobacillus paracasei

without acidic or enzymatic inulin hydrolysis. Bioresource Technology. 114, 745-747.

Chu, C.-Y., Sen, B., Lay, C.-H., Lin, Y.-C., and Lin, C.-Y. 2012. Direct fermentation of sweet

potato to produce maximal hydrogen and ethanol. Applied Energy. 100, 10-18.

Coelho, L. F., Lima, C. J. B., Rodovalho, C. M., Bernardo, M. P., and Contiero, J. 2011. Lactic acid

production by new Lactobacillus plantarum LMISM6 grown in molasses: Optimization of

medium composition. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 28.

Demirci, A., Pometto, A., III, and Johnson, K. 1993. Evaluation of biofilm reactor solid support for

mixed-culture lactic acid production. Applied Microbiology and Biotechnology. 38, 728-

733.

Dey, P., Sikder, J., Roy, S., and Pal, P. 2012. Fermentative lactic acid production from a renewable

carbon source under Response Surface optimized conditions without alkali addition: A

membrane-based green approach. Clean Technologies and Environmental Policy. 14, 827-

835.

สำนกหอ


87

Eiteman, M. and Ramalingam, S. 2015. Microbial production of lactic acid. Biotechnology Letters.

37, 1-18.

Eldeleklioglu, B., Bayraktar, E., and Mehmetoglu, U. 2013. The effects of nutrient supplements on

the production of lactic acid from cheese whey. Turkish Journal of Biochemistry. 38, 81-

91.

Gacula, M. C. 1993. Design and analysis of sensory optimization, Wiley.

Ghaffar, T., Irshad, M., Anwar, Z., Aqil, T., Zulifqar, Z., Tariq, A., Kamran, M., Ehsan, N., and

Mehmood, S. 2014. Recent trends in lactic acid biotechnology: A brief review on

production to purification. Journal of Radiation Research and Applied Sciences. 7, 222-

Goni, I., Garcia-Alonso, A., and Saura-Calixto, F. 1997. A starch hydrolysis procedure to estimate

glycemic index. Nutrition Research. 17, 427-437.

Guyot, J. P., Calderon, M., and Morlon-Guyot, J. 2000. Effect of ph control on lactic acid

fermentation of starch by Lactobacillus manihotivorans LMG 18010T. Journal of Applied

Microbiology. 88, 176-182.

Hofvendahl, K. and Hahn-Hagerdal, B. 1997. L-lactic acid production from whole wheat flour

hydrolysate using strains of lactobacilli and lactococci. Enzyme and Microbial Technology.

20, 301-307.

Hofvendahl, K. and Hahn-Hagerdal, B. 2000. Factors affecting the fermentative lactic acid

production from renewable resources1. Enzyme and Microbial Technology. 26, 87-107.

Hongo, M., Nomura, Y., and Iwahara, M. 1986. Novel method of lactic acid production by

electrodialysis fermentation. Applied and Environmental Microbiology. 52, 314-319.

Huang, L. P., Jin, B., Lant, P., and Zhou, J. 2003. Biotechnological production of lactic acid

integrated with potato wastewater treatment by Rhizopus arrhizus. Journal of Chemical

Technology & Biotechnology. 78, 899-906.

Hujanen, M. and Linko, Y. Y. 1996. Effect of temperature and various nitrogen sources on L (+)-

lactic acid production by Lactobacillus casei. Applied Microbiology and Biotechnology.

45, 307-313.

Idris, A. and Suzana, W. 2006. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH

and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized

Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry. 41, 1117-1123.

สำนกหอ


88

John, R. P., Anisha, G. S., Nampoothiri, M. K., and Pandey, A. 2009. Direct lactic acid

fermentation: Focus on simultaneous saccharification and lactic acid production.

Biotecnology Advances. 27, 145-152.

John, R. P., Gangadharan, D., and Madhavan Nampoothiri, K. 2008. Genome shuffling of

Lactobacillus delbrueckii mutant and Bacillus amyloliquefaciens through protoplasmic

fusion for L-lactic acid production from starchy wastes. Bioresource Technology. 99,

8008-8015.

John, R. P., Nampoothiri, K. M., and Pandey, A. 2006. Solid-state fermentation for L-lactic acid

production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry. 41,

759-763.

Kashket, E. R. 1987. Bioenergetics of lactic acid bacteria: Cytoplasmic pH and osmotolerance.

FEMS Microbiology Letters. 46, 233-244.

Kotzamanidis, C., Roukas, T., and Skaracis, G. 2002. Optimization of lactic acid production from

beet molasses by Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130. World Journal of Microbiology

and Biotechnology. 18, 441-448.

Krischke, W., Schroder, M., and Trosch, W. 1991. Continuous production ofl-lactic acid from whey

permeate by immobilized Lactobacillus casei subsp. casei. Applied Microbiology and

Biotechnology. 34, 573-578.

Li, Z., Han, L., Ji, Y., Wang, X., and Tan, T. 2010. Fermentative production of L-lactic acid from

hydrolysate of wheat bran by Lactobacillus rhamnosus. Biochemical Engineering Journal.

49, 138-142.

Lima, C. J. B., Coelho, L. F., and Contiero, J. 2010. The use of Response Surface Methodology in

optimization of lactic acid production: Focus on medium supplementation, temperature

and pH control. Food Technology and Biotechnology. 48, 175-181.

Linko, Y. Y. and Javanainen, P. 1996. Simultaneous liquefaction, saccharification, and lactic acid

fermentation on barley starch. Enzyme and Microbial Technology. 19, 118-123.

Martin, F. W. 1988. Sweet potato. Eho technical note. USA.

Martin, O. and Averous, L. 2001. Poly (lactic acid): Plasticization and properties of biodegradable

multiphase systems. Polymer. 42, 6209-6219.

สำนกหอ


89

Martinez, F. A. C., Balciunas, E. M., Salgado, J. M., Gonzalez, J. M. D., Converti, A., and Oliveira,

R. P. S. 2013. Lactic acid properties, applications and production: A review. Trends in

Food Science & Technology. 30, 70-83.

Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.

Analytical Chemistry. 31, 426-428.

Montgomery, D. C. 1991. Design and Analysis of Experiments. Third Edition. John Wiley&Son

Moon, S.-K., Wee, Y.-J., and Choi, G.-W. 2012. A novel lactic acid bacterium for the production

of high purity L-lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CHB 2121. Journal

of Bioscience and Bioengineering. 114, 155-159.

Nancib, N., Nancib, A., Boudjelal, A., Benslimane, C., Blanchard, F., and Boudrant, J. 2001. The

effect of supplementation by different nitrogen sources on the production of lactic acid

from date juice by Lactobacillus casei subsp. rhamnosus. Bioresource Technology. 78,

149-153.

Narayanan, N., Roychoudhury, P. K., and Srivastava, A. 2004. L (+) lactic acid fermentation and

its product polymerization. Electronic Journal of Biotechnology. 7, 167-179.

Naveena, B. J., Altaf, M., Bhadriah, K., and Reddy, G. 2005. Selection of medium components by

Plackett-Burman Design for production of L (+) lactic acid by Lactobacillus amylophilus

GV6 in SSF using wheat bran. Bioresource Technology. 96, 485-490.

Nguyen, C. M., Choi, G. J., Choi, Y. H., Jang, K. S., and Kim, J.-C. 2013. D- and l-lactic acid

production from fresh sweet potato through simultaneous saccharification and

fermentation. Biochemical Engineering Journal. 81, 40-46.

Okafor, N. 2007. Modern industrial microbiology and biotechnology, Science publishers.

Oke, M. O. and Workneh, T. S. 2013. A review on sweet potato postharvest processing and

preservation technology. African Journal of Agricultural Research. 8, 4990-5003.

Oluwole, O. B., Kosoko, S. B., Owolabi, S. O., Salami, M. J., Elemo, G. N., and Olatope, O. A.

2012. Development and production of fermented flour from sweet potato

(Ipomea batatas L.) as a potential food security product Journal of Food Science and

Engineering. 2, 257-262.

สำนกหอ


90

Panda, S. H., Naskar, S. K., Sivakumar, P. S., and Ray, R. C. 2009. Lactic acid fermentation of

anthocyanin-rich sweet potato (Ipomoea batatas L.) into lacto-juice. International Journal

of Food Science & Technology. 44, 288-296.

Panda, S. H., Parmanick, M., and Ray, R. C. 2007. Lactic acid fermentation of sweet potato

(Ipomoea batatas L.) into pickles. Journal of Food Processing and Preservation. 31, 83-

101.

Panda, S. H. and Ray, R. C. 2008. Direct conversion of raw starch to lactic acid by Lactobacillus

plantarum MTCC 1407 in semi- solid fermentation using sweet potato (Ipomoea batatas

L.) flour. Journal of scientific and industrial research : JSIR. 67, 531-537.

Park, S., Kim, H., and Cho, J.-I. 2008. Optimal Central Composite Designs for fitting second order

Response Surface linear regression models, p. 323-339. Recent advances in linear models

and related areas, Physica-Verlag HD.

Plackett, R. L. and Burman, J. P. 1946. The design of optimum multifactorial experiments.

Biometrika. 33, 305-325.

Peters, V. J. and Snell, E. E. 1954. Peptides and bacterial growth VI. : The nutritional requirements

of Lactobacillus delbrueckii. Journal of Bacteriology. 67, 69-76.

Qin, H., Gong, S.-S., Ge, X.-Y., and Zhang, W.-G. 2012. The effect of temperature on L-lactic acid

production and metabolite distribution of Lactobacillus casei. Preparative Biochemistry

and Biotechnology. 42, 564-573.

Ray, R. C. and Ravi, V. 2005. Post harvest spoilage of sweet potato in tropics and control measures.

Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 45, 623-644.

Ray, R. C., Sharma, P., Panda, S. H. 2009. Lactic acid production from cassava fibrous residue

using lactobacillus plantarum MTCC 1407. Journal of Environmental Biology. 3,

847-852.

Reddy, G., Altaf, M., Naveena, B. J., Venkateshwar, M., and Kumar, E. V. 2008. Amylolytic

bacterial lactic acid fermentation - a review. Biotechnology Advances. 26, 22-34.

Roberfroid, M. B. . Prebiotics and probiotics: Are they functional foods. The American

Journal of Clinical Nutrition. , S- S.

Saha, B. C. 2006. Effect of salt nutrients on mannitol production by lactobacillus intermedius

NRRL B-3693. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 33, 887-890.

สำนกหอ


91

Silveira, M., Fontes, C. M. L., Guilherme, A., Fernandes, F. N., and Rodrigues, S. 2012. Cashew

apple juice as substrate for lactic acid production. Food and Bioprocess Technology. 5,

947-953.

Snell, E. E., Strong, F. M., and Peterson, W. H. 1937. Growth factors for bacteria: Fractionation

and properties of an accessory factor for lactic acid bacteria. Biochemical Journal. 31,

1789-1799.

Souza, A. S., dos Santos, W. N. L., and Ferreira, S. L. C. 2005. Application of Box-Behnken Design

in the optimisation of an on-line pre-concentration system using knotted reactor for

cadmium determination by flame atomic absorption spectrometry. Spectrochimica Acta

Part B: Atomic Spectroscopy. 60, 737-742.

Sreenath, H., Moldes, A., Koegel, R., and Straub, R. 2001. Lactic acid production from agriculture

residues. Biotechnology Letters. 23, 179-184.

Sreenath, H. K., Moldes, A. B., Koegel, R. G., and Straub, R. J. 2001. Lactic acid production by

simultaneous saccharification and fermentation of alfalfa fiber. Journal of Bioscience and

Bioengineering. 92, 518-523.

Srivastava, A., Poonia, A., Tripathi, A. D., Singh, R. P., and Srivastava, S. K. . Optimization

of nutritional supplements for enhanced lactic acid production utilizing sugar refinery by-

products. Annals of Microbiology. , - . Swain, M. R., Mishra, J., Thatoi, H. 2013. Bioethanol production from sweet potato

(ipomoea batatas L.) flour using co-culture of Trichoderma sp. and Saccharomyces

cerevisiae in solid-state fermentation. Brazilian Archives of Biology and Technology. 56,

171-179.

Tay, A. and Yang, S.-T. 2002. Production of L (+)-lactic acid from glucose and starch by

immobilized cells of Rhizopus oryzae in a rotating fibrous bed bioreactor. Biotechnology

and Bioengineering. 80, 1-12.

Thao, H. M. and Noomhorm, A. 2011. Physiochemical properties of sweet potato and mung bean

starch and their blends for noodle production. Journal of Food Processing & Technology.

2.

Van Hal, M. 2000. Quality of sweet potato flour during processing and storage. Food Reviews

International. 16, 1-37.

สำนกหอ


92

Vijayakumar, J., Aravindan, R., and Viruthagiri, T. 2008. Recent trends in the production,

purification and application of lactic acid. Chemical and Biochemical Engineering

Quarterly. 22, 245-264.

Wang, L., Zhao, B., Liu, B., Yang, C., Yu, B., Li, Q., Ma, C., Xu, P., and Ma, Y. 2010. Efficient

production of L-lactic acid from cassava powder by Lactobacillus rhamnosus.

Bioresource Technology. 101, 7895-7901.

Wee, Y.-J., Kim, J.-N., and Ryu, H.-W. 2006. Biotechnological production of lactic acid and its

recent applications. 44, 163-172.

Wee, Y.-J. and Ryu, H.-W. 2009. Lactic acid production by Lactobacillus sp. RKY2 in a cell-

recycle continuous fermentation using lignocellulosic hydrolyzates as inexpensive raw

materials. Bioresource Technology. 100, 4262-4270.

Woolfe, J. A. 1992. Sweet potato: An untapped food resource. Cambridge University 648.

Xu, K. and Xu, P. 2014. Efficient production of L-lactic acid using co-feeding strategy based on

cane molasses/glucose carbon sources. Bioresource Technology. 153, 23-29.

Yoo, Keun, I., Chang, H. N., Lee, E. G., Chang, Y. K., and Moon, S. H. 1996. Effect of pH on the

production of lactic acid and secondary products in batch cultures of Lactobacillus casei.

Journal of microbiology and biotechnology. 6, 482-486.

Yu, L., Lei, T., Ren, X., Pei, X., and Feng, Y. 2008. Response Surface optimization of L-(+) lactic

acid production using corn steep liquor as an alternative nitrogen source by Lactobacillus

rhamnosus CGMCC 1466. Biochemical Engineering Journal. 39, 496-502.

Yuwono, S. D. and Kokugan, T. 2008. Study of the effects of temperature and pH on lactic acid

production from fresh cassava roots in tofu liquid waste by Streptococcus bovis.

Biochemical Engineering Journal. 40, 175-183.

Zhang, T. and Oates, C. G. 1999. Relationship between α-amylase degradation and physico-

chemical properties of sweet potato starches. Food Chemistry. 65, 157-163.

Zhang, Z. Y., Jin, B., and Kelly, J. M. 2007. Production of lactic acid from renewable materials by

Rhizopus fungi. Biochemical Engineering Journal. 35, 251-263.

สำนกหอ


93

Zhou, Y., Dominguez, J. M., Cao, N., Du, J., and Tsao, G. 1999. Optimization of L-lactic acid

production from glucose by Rhizopus oryzae ATCC 52311. Applied Biochemistry and

Biotechnology. 78, 401-407.

Zuraida, N. 2003. Sweet potato as an alternative food supplement during rice shortage. Journal

Litbang Pertanian. 22, 150-155.

สำนกหอ


ภาคผนวก

สำนกหอ


ภาคผนวก ก.

สำนกหอ


96

ภาคผนวก ก.

อาหารเลยงเชอ

1. สตรอาหารเลยงเชอ MRS (deMan, Rogosa และ Sharpe) ตอปรมาตร 1 ลตร

เปปโทน 10 กรม

สารสกดจากเนอ 10 กรม

สารสกดจากยสต 5 กรม

นาตาลเดกซโตส 20 กรม

Tween 80 1 มลลลตร

แอมโมเนยมซเตรต ((NH4)2C6H6O7) 2 กรม

โซดยมอะซเตต (CH3COONa) 5 กรม

แมกนเซยมซลเฟต (MgSO4.H2O) 0.2 กรม

แมงกานสซลเฟต (MnSO4.H2O) 0.05 กรม

ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) 2 กรม

2. สตรอาหารเลยงเชอพนฐานสาหรบการหมกสตร 1 ตอปรมาตร 1 ลตร

ยสตเหลอทงจากการหมกไวน 10 กรม

เปปโทน 10 กรม

สารสกดจากเนอ 8 กรม

Tween 80 1 มลลลตร

แอมโมเนยมซเตรต ((NH4)2C6H6O7) 2 กรม

โซเดยมอะซเตต (CH3COONa) 5 กรม

แมกนเซยมซลเฟต (MgSO4.H2O) 0.2 กรม

แมงกานสซลเฟต (MnSO4.H2O) 0.075 กรม

ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) 2 กรม

สำนกหอ


ภาคผนวก ข.

สำนกหอ


98

ภาคผนวก ข.

การเตรยมสารเคม

1. 0.1 เปอรเซนต เปปโทน

เปปโทน 0.1 กรม

นากลน 100 มลลลตร

2. กรดไฮโดรคลอรก เขมขน 6 นอรมอล

ใชกรดไฮโดรคลอรกเขมขนปรมาตร 497.51 มลลลตร ใสลงในนากลนปรมาตร 502.49 มลลลตร อยางชาๆ

3. การเตรยมสารเคมสาหรบใชในการวเคราะหนาตาลรดวซ (Miller, ) 3.1 สารละลาย 2.0 โมลาร โซเดยมไฮดรอกไซด (2M NaOH)

ชงโซเดยมไฮดรอกไซด 80 กรม ละลายในนากลน 100 มลลลตร

3.2 สารละลายไดไนโตรซาลไซลก (Dinitrosalicylic acid)

2.0 โมลาร โซเดยมไฮดรอกไซด (2M NaOH) 20 มลลลตร

ไดไนโตรซาลไซลก (Dinitrosalicylic acid) 1 กรม

โพแทสเซยมโซเดยมทารเทต (KNaC4H4O6.4H2O) 30 กรม

ละลาย 1 กรม ไดไนโตรซาลไซลก ในสารละลาย 2.0 โมลาร โซเดยมไฮดรอกไซด ปรมาตร 20 มลลลตร ผสมใหเขากน แลวเตมนากลน 50 มลลลตร จากนนเตมโพแทสเซยมโซเดยมทารเทต 30 กรม ปรบปรมาตรสดทายเปน 100 มลลลตร เกบในขวดสชาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

3.3 สารละลายมาตรฐานนาตาลรดวซ

ชงนาตาลกลโคส 0.2 กรม ละลายในนากลน 50 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 100

มลลลตร จะไดความเขมขนสดทาย 2 กรมตอลตร

สำนกหอ


99

4. การเตรยมสารเคมสาหรบใชในการวเคราะหนาตาลกลโคส

พจโอเอนไซม (PGO enzyme) 1 แคปซล

O-dianisidine dihydrochloride (No. D3252) 1.6 มลลลตร

ชง O-dianisidine 25 มลลกรม ละลายในนากลน 10 มลลลตร จากนนละลาย พจโอเอนไซม (PGO enzyme) 1 แคปซล ในนากลน 60 มลลลตร ละลายใหเขากน เตมสารละลาย O-

dianisidine ทเตรยมไวลงไป 1.6 มลลลตร ปรบปรมาตรสดทายเปน 100 มลลลตร เกบในขวดสชาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

5. การเตรยมสารเคมสาหรบใชในการวเคราะหกรดแลกตกดวยวธ Colorimetric method

(Barker and Summerson, 1941)

5.1 คอปเปอรซลเฟต 20 เปอรเซนต

ชงคอปเปอรซลเฟต (CuSO4.5H2O) 20 กรม ละลายนาแลวปรบปรมาตรสดทายเปน 100 มลลลตร

5.2 คอปเปอรซลเฟต 20 เปอรเซนต

ชงคอปเปอรซลเฟต (CuSO4.5H2O) 4 กรม ละลายนาแลวปรบปรมาตรสดทายเปน 100

มลลลตร

5.3 พาราไฮดรอกซไบฟนล 1.5 เปอรเซนต ชงพาราไฮดรอกซไบฟนล (C6H5C6H4OH) 0.75 กรม ละลายใน 5 เปอรเ ซนต โซเดยมไฮดรอกไซด 5 มลลลตร บนแทนใหความรอนและคนดวยแทงแมเหลก เมอสารเรมละลายใหเตมนากลน 30 มลลลตร เมอละลายหมดถายใสขวดปรบปรมาตรเปน 50 มลลลตร

5.4 กรดซลฟวรกเขมขน 1 นอรมอล (1N H2SO4)

เตรยมกรดซลฟวรกปรมาตร 27.7 มลลลตร ใสลงในนากลนปรมาตร 972.3 มลลลตรอยางชาๆ 5.5 สารละลายมาตรฐานกรดแลกตก

ชงลเทยมแลคเตต (อบทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เพอไลความชนกอนนามาชง) 0.1

กรม ละลายดวยนากลนปรมาตร 50 มลลลตร เตมซลฟวรกเขมขน 1 นอรมอล 20 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ความเขมขนสดทายทไดคอ 1 มลลกรมตอมลลลตร

สำนกหอ


ภาคผนวก ค.

สำนกหอ


101

ภาคผนวก ค.

กราฟมาตรฐานและวธการวเคราะห

1. การวเคราะหนาตาลรดวซโดยวธ DNS method (Miller, 1959)

1.1 เตรยมสารละลายมาตรฐานนาตาลกลโคสเขมขน 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 และ 1.0

กรมตอลตร ใสหลอดทดลอง หลอดละ 1 มลลลตร

1.2 เ ตมสารละลายไดไนโตรซาลไซลก (Dinitrosalicylic acid) ลงไปหลอดละ 1 มลลลตร ผสมใหเขากน 1.3 ปดฝาจากนนนาไปตมในนาเดอดเปนเวลา 10 นาท

1.4 จากนนหยดปฏกรยาโดยแชในนาเยนเปนเวลา 3 นาท

1.5 เตมนากลนหลอดละ 10 มลลลตร ผสมใหเขากน

1.6 นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

1.7 สรางกราฟมาตรฐานระหวางความเขมขนของนาตาลรดวซและคาการดดกลนแสง หาคา R2, Slope และ Y-intercept (C)

1.8 ทดสอบกบตวอยาง โดยวธการในขอ 1.1-1.6 โดยเปลยนจากสารละลายนาตาลเปนตวอยางทตองการทดสอบ

2. กราฟมาตรฐานการวเคราะหนาตาลรดวซโดยวธ DNS methodology

จากตารางท 32 สามารถสรางกราฟมาตรฐานไดดงภาพท 27 พบวามสมการเสนตรง y = 0.5494X – 0.0077 เมอแกน y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโมเมตร และแกน X คอ ความเขมขนของนาตาลรดวซมาตรฐาน (กรมตอลตร) ดงนนเมอทราบคาการดดกลนแสงของตวอยางทดสอบ สามารถแทนลงในคา y เพอคานวณความเขมขนของนาตาลได ดงน

ความเขมขนนาตาลรดวซ (กรมตอลตร) = (คาการดดกลนแสงท 540 นาโนเมตร + 0.0077)/0.5494

สำนกหอ


102

ตารางท 32 ความสมพนธของความเขมขนนาตาลกลโคสกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

ความเขมขนนาตาลรดวซ (g/L) คาการดดกลนแสงท 540 นาโนเมตร 0.0 0.00

0.2 0.098

0.4 0.202

0.6 0.322

0.8 0.440

1.0 0.540

ภาพท 27 กราฟมาตรฐานนาตาลรดวซทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

3. การวเคราะหปรมาณนาตาลกลโคสโดยใชพจโอเอนไซม 3.1 เตรยมสารละลายมาตรฐานนาตาลกลโคสความเขมขน 0.00, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16

และ 0.20 กรมตอลตร ใสในหลอดทดลอง หลอดละ 0.1 มลลลตร

3.2 เตมสารละลายพจโอเอนไซม 1 มลลลตร ผสมใหเขากน

3.3 บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท


y = 0.5494x - 0.0077R² = 0.9988

-0.10

0.10.20.30.40.50.6

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ค าการดดก

ลนแส

งทคว

ามยาว

คลน 5

40 นา

โนเมต

ร

ความเขมขนนาตาลกลโคส (กรมตอลตร)

สำนกหอ


103

4. กราฟมาตรฐานการวเคราะหนาตาลกลโคสโดยใชพจโอเอนไซม

จากตารางท 33 สามารถสรางกราฟมาตรฐานไดดงภาพท 28 พบวามสมการเสนตรง y = 3.6429X – 0.0123 เมอแกน y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 425 นาโมเมตร และแกน X คอ ความเขมขนของนาตาลกลโคส (กรมตอลตร) ดงนนเมอทราบคาการดดกลนแสงของตวอยางทดสอบ สามารถแทนลงในคา y เพอคานวณความเขมขนของนาตาลได ดงน

นาตาลกลโคส (กรมตอลตร) = (คาการดดกลนแสงท 425 นาโนเมตร + 0.0123)/3.6492


ความเขมขนนาตาลกลโคส (g/L) คาการดดกลนแสงท 425 นาโนเมตร 0.0 0.00

0.2 0.120

0.4 0.275

0.6 0.426

0.8 0.573

1.0 0.718

ภาพท กราฟมาตรฐานนาตาลกลโคสทความยาวคลน 425 นาโนเมตร

y = 3.6429x - 0.0123R² = 0.999

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25ค าการดดก

ลนแส

งทคว

ามยาว

คลน 4

25 นา

โนเมต

ร

นาตาลกลโคส (กรมตอลตร)

สำนกหอ


104

5. การวเคราะหปรมาณกรดแลกตก

5.1 เตรยมสารละลายมาตรฐานกรดแลกตกทความเขมขน 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,

80, 90 และ 100 มลลกรมตอลตร ใสหลอด eppendrof หลอดละ 0.1 มลลลตร 5.2 เตมนากลนหลอดละ 0.8 มลลลตร ใส 20 เปอรเซนตคอปเปอรซลเฟต 0.1 มลลลตร

5.3 เตมแคลเซยมคารบอเนต 0.1 กรม จากนนเขยาใหเขากน ทงไวทอณหภมหอง 30

นาท 5.4 นาไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ดวยความเรว 6,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท

5.5 รบดดสวนใส 0.5 มลลลตร ใสหลอดทดลอง จากนนเตม 4 เปอรเซนต คอปเปอร

ซลเฟต 0.025 มลลลตร เขยาใหเขากน

5.6 เตมกรดซลฟวรกเขมขน 3 มลลลตร จากนนนาไปตมในอางนาเดอด 5 นาท

5.7 หยดปฏกรยาในอางนาเยน

5.8 เตมพาราไฮดรอกซไบฟนล 0.5 มลลลตร เขยาแรงๆ เตมหางกนหลอดละ 30 วนาท 5.9 วางในอางนาทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท

5.10 นาไปตมในอางนาเดอดหลอดละ 90 วนาท จากนนหยดปฏกรยาในนาเยน


6. กราฟมาตรฐานการวเคราะหกรดแลกตก

จากตารางท 34 สามารถสรางกราฟมาตรฐานไดดงภาพท 29 พบวามสมการเสนตรง y = 0.0071X – 0.031 เมอแกน y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 560 นาโมเมตร และแกน X

คอ ความเขมขนของกรดแลกตก (มลลกรมตอลตร) ดงนนเมอทราบคาการดดกลนแสงของตวอยางทดสอบ สามารถแทนลงในคา y เพอคานวณความเขมขนของกรดแลกตกได ดงน

กรดแลกตก (มลลกรมตอลตร) = (คาการดดกลนแสงท 560 นาโนเมตร + 0.031)/0.0071

สำนกหอ


105


ความเขมขนนาตาลกลโคส (mg/L) คาการดดกลนแสงท 560 นาโนเมตร 0 0.00

10 0094

20 0.168

30 0.279

40 0.311

50 0.404

60 0.473

70 0.555

80 0.597

90 0.642

100 0.724

ภาพท กราฟมาตรฐานกรดแลกตกทความยาวคลน 560 นาโนเมตร

y = 0.0071x + 0.031R² = 0.9916

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80 100 120

ค าการดดก

ลนแส

งทคว

ามยาว

คลน 5

60 นา

โนเมต

ร

ความเขมขนกรดแลกตก (ไมโครกรมตอมลลลตร)

สำนกหอ


106

7. การวดกจกรรมเอนไซมแอลฟาอะไมเลส (BAN™ 240L) โดยใช 10 กรมตอลตร มนเทศผง

8.1 ละลาย 0.1 กรม มนเทศผงใน 0.1 โมลารโพแทสเซยมฟอสเฟตบฟเฟอร pH 6 เตมสารละลายใสหลอดทดลองทสะอาด ปรมาตร 0.5 มลลลตร

8.2 จากนนเตมแอลฟาอะไมเลส โดยใชความเขมขน 0.155 เปอรเซนต ปรมาตร 0.5

มลลลตร โดยหลอด Blank ใหเตมนากลนแทนแอลฟาอะไมเลส

8.3 ผสมใหเขากนนาไปบมทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท

8.4 นาไปวเคราะหความเขมขนนาตาลรดวซโดยวธ DNS method (ภาคผนวก ค.)

8.5 นาคาทไดไปคานวณกจกรรมเอนไซม โดย 1 หนวยของเอนไซมแอลฟาอะไมเลส หมายถง ปรมาณเอนไซมทปลดปลอยนาตาลกลโคส 1 ไมโครโมลตอนาท ภายใตสภาวะทกาหนด

8. การวดกจกรรมเอนไซมอะไมโลกลโคซเดส (Amyloglucosidase) โดยใช 10 กรมตอลตร มนเทศผง

10.1 ละลาย 0.1 กรม มนเทศผงใน 0.1 โมลารโซเดยมอะซเตตบฟเฟอร pH 5 เตมสารละลายใสหลอดทดลองทสะอาด ปรมาตร 0.5 มลลลตร

10.2 จากนนเตมอะไมโลกลโคซเดส โดยใชความเขมขน 0.1 เปอรเซนต ปรมาตร 0.5

มลลลตร โดยหลอด Blank ใหเตมนากลนแทนอะไมโลกลโคซเดส

10.3 ผสมใหเขากนนาไปบมทอณหภม 55 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท

10.4 นาไปวเคราะหความเขมขนนาตาลรดวซโดยวธ DNS method (ภาคผนวก ค.)

10.5 นา ค า ท ได ไปคานวณ กจก รรม เอนไซม โดย 1 หนวยของ เอนไซม อะไมโลกลโคซเดส หมายถง ปรมาณเอนไซมทปลดปลอยนาตาลกลโคส 1 ไมโครโมลตอนาท ภายใตสภาวะทกาหนด

สำนกหอ


107

ตารางท 35 กจกรรมเอนไซมแอลฟาอะไมเลส และกจกรรมเอนไซมอะไมโลกลโคซเดส โดยใช 10 กรมตอลตร มนเทศผง ทาปฏกรยา เปนเวลา 10 นาท

เอนไซม อณหภม pH กจกรรมเอนไซม

(Unit/mL)

แอลฟาอะไมเลส 90 6 281.35 ± 11.47

อะไมโลกลโคซเดส 55 5 477.45 ± 2.86

สำนกหอ


ภาคผนวก ง.

สำนกหอ


109

ภาคผนวก ง.

ผลการจาแนกเชอ FAG 302

ตารางท 36 ผลการจาแนกเชอ FAG 302

สำนกหอ


110

ตารางท 37 ลาดบนวคลโอไทดของเชอ FAG 302

ตารางท 38 ขอมลการเปรยบเทยบความเหมอนของลาดบนวคลโอไทด

สำนกหอ


111

ภาพท ภาพความสมพนธทางววฒนาการระหวาง FAG 302 กบสายพนธใกลเคยง

สำนกหอ


ภาคผนวก จ.

สำนกหอ


113

ภาคผนวก จ.

ผลการศกษานาหนกมนเทศหลงการนง

มนเทศสด 100 กรม เมอนงสกแลวไดเปนมนเทศนง = 102.2 กรม ดงตารางท 39

ตารางท 39 ผลการศกษานาหนกมนเทศหลงการนง

มนเทศสด (กรม) มนเทศนง (กรม) 100 102.6

100 102.7

100 101.7

100 102.8

100 101.8

100 102.5

100 101.9

100 102.0

100 101.9

100 102.1

เฉลย มนเทศสด 100 กรม เมอนงแลวไดมนเทศนง = 102.2 กรม

สำนกหอ


114

ผลการศกษาปรมาณแปงในมนเทศ

ตารางท 40 ปรมาณนาตาลกลโคส และปรมาณแปงในมนเทศนง

นาตาลกลโคสทวดได


นาตาลกลโคส

(ตอ 100 กรมมนนง)

แปง

(กรมตอ 100 กรมมนเทศนง)

14.24 27.34 24.61

14.03 26.94 24.25

14.03 26.94 24.25

14.07 27.02 24.32

14.28 27.42 24.68

14.15 27.17 24.45

14.24 27.34 24.61

14.11 27.09 24.38

14.03 26.94 24.25

14.11 27.09 24.38

เฉลย ในมนเทศนง 100 กรม มแปง = 24.42 กรม

สำนกหอ


ภาคผนวก ฉ.

สำนกหอ


116

ภาคผนวก ฉ.

การเตรยมอปกรณและการควบคมถงหมกขนาด 5 ลตร (Fermenter) รน BIOSTAT®B บรษท B. Braun Biotech International สาหรบการหมกกรดแลกตก

1. การเปดเครอง control unit

1.1 เสยบปลกไฟปม และ control unit จกนนยก cut out “cool” และ “pump” ทตรงบรเวณดานขางของเครองปมตามลาดบ 1.2 กดเปดเครองจายไฟสารอง

1.3 เปดเครอง control unit โดยหมนเปดท “main” เปดเครองทงไว 10-15 นาทกอนใชงาน เพอเปนการวอมเครอง

2. การ Calibration คาความเปนกรดดาง electrode

การ Calibration คาความเปนกรดดาง ตองทากอนนาถงหมกไปฆาเชอ

2.1 ตอสาย temperature probe และสาย electrode probe เขากบ control unit

2.2 กดปม “calibration” ท control unit ซง cursor จะปรากฏแบบกระพรบ ใหกดปมเลอนลง เพอให cursor กระพรบทคา “pH 7” จากนนจม electrode probe ลงใน buffer 7 และกดปม “Enter” เมอ cursor เลอนไปกระพรบทดานหลงคา “pH 7” แลว แสดงวาเครอง control unit กาลงทาการ calibration และเมอ cursor เลอนไปกระพรบทคา “pH 4” แลว แสดงวาเครอง control unit ทาการ calibration เสรจแลว

2.3 ลาง electrode probe ใหสะอาดแลวเชดใหแหง จากนนจมลงใน buffer 4 แลงทาเหมอน buffer 7

2.4 ดคา “Zero” ใหอยระหวาง 0-130 mV และคา “Slope” ใหอยระหวาง 54-60 mV

2.5 ลาง electrode probe ใหสะอาดแลวเชดใหแหง ถอดสายออกจาก control unit แลวหอสายดวยสาลหมตามดวยฟลอยด

2.6 นา electrode probe ไปตอกบ Vessel โดยเสยบลง Vessel ตรงๆระวงอยาใหกระทบดานขาง หมนบดเกลยวใหแนน ปดฝา หอสาลและฟลอยด

2.7 รวมทงถอดสาย temperature probe ออกจาก control unit พรอมทงหอสายดวยสาลหมตามดวยฟลอยดอกชน

สำนกหอ


117

3. การเตรยม Vessel และการนงฆาเชอ 3.1 ปด Top plate กบ Vessel โดยคอยๆหมนนอตพรอมๆกน

3.2 ใส electrode probe ท calibration แลว ปดฝา หมสาลพรอมกบหอฟรอยด

3.3 หมสาลพรอมกบหอฟรอยด temperature probe

3.4 ใส Level probe หมสาลพรอมกบหอฟรอยด แตเนองจากในการทดลองไมใช Level probe ดงนนจงตอสายยางกบ Air filter และ Clamp สายยางไว

3.5 แกน motor หมสาลพรอมกบหอฟรอยด

3.6 ระบบใหอากาศ แตเนองจากในการทดลองไมใช ดงนนจงตอสายยางกบ Air filter

และ Clamp สายยางไว

3.7 ทอเกบตวอยาง ตอกบสายยางกบหลอดเกบตวอยาง ซงสายยางทกเสนตอง Clamp

3.8 Addition port ชองทไมใชใหตอสายยางแลว Clamp ไว สวนชองทใชใหตอสายยางยาวสาหรบตอกบขวดกรดหรอเบส 3.9 ทาความสะอาด Exhaust condenser ดวย 95% เอทานอล แลวนาไปอบทอณหภม 80 องศาเซลเซยส สวนปลายทอใหตอกบสายยางกบ Air filter และ Clamp สายยางไว

3.10 เตมนาเขาส Jacket โดยใหมนาในระดบทสงกวาอาหารภายใน Vessel เลกนอย

3.11 จากนนนาไปนงฆาเชอ 4. การตออปกรณตางๆหลงการนงฆาเชอ

4.1 ภายหลงการนงฆาเชอใหแกะฟรอยดและสาลออก แลวตงทงไวจนอณหภมลง

4.2 เมอ Vessel อณหภมลดลงจนเปนอณหภมหองแลว ตอสาย temperature probe และสาย electrode probe เขากบ control unit

4.3 ตอตว motor กบแกน

4.4 ตอ Exhaust condenser ทผานการอบแลวกบ Top plate และตอสายนาเขา นาออก กบตว control unit สวนดานบนของ Exhaust condenser ใหตอดวยสายยางกบ Air filter

4.5 เตมนาใหเตม Jacket

สำนกหอ


118

5. การตงคาควบคมการทางาน

การตงคาการกวน

กดปม “Control loop” ท Control unit จนกวา cursor จะปรากฏท Stir ซงเปนหนาจอทควบคมการทางานระบบการกวน กดปมเลอนขนเพอให cursor กระพรบทหนา “Set up” จากนนกดปมตวเลขทตองการ แลวกดปม “Enter”

กดปมเลอนลงเพอให cursor กระพรบทหนา “Mode” จากนนกดปม “Alter” เพอเปลยนจาก off เปน auto แลวกดปม “Enter” เพอเรมการทางาน

การตงตาอณหภม กดปม “Control loop” ท Control unit จนกวา cursor จะปรากฏท Temp ซงเปนหนาจอทควบคมการทางานระบบอณหภม กดปมเลอนขนเพอให cursor กระพรบทหนา “Set up” จากนนกดปมตวเลขทตองการ แลวกดปม “Enter”


การตงคาการเตมเบส

กดปม “Control loop” ท Control unit จนกวา cursor จะปรากฏท Base ซงเปนหนาจอทควบคมการทางานระบบเบส กดปมเลอนขนเพอให cursor กระพรบทหนา “Set up” จากนนกดปมตวเลขทตองการ แลวกดปม “Enter”


สำนกหอ


119

6. การปดเครอง และการทาความสะอาด

การปดเครอง ปดการทางานของระบบการกวน ระบบอณหภม และระบบการเตมเบส โดยการกดปมเลอนลงเพอให cursor กระพรบทหนา “Mode” ของแตละระบบ จากนนกดปม “Alter” เพอเปลยนจาก auto เปน off แลวกดปม “Enter” เพอหยดการทางาน

ปดเครอง Control unit จากนนปดเตรองจายไฟสารอง โดยการยก Cut out ลง ปด Cut

out “Pump” แลวตามดวย ปด Cut out “Cool” ทบรเวณดานขางปมนา จากนนดงสายไปออก

การทาความสะอาด

ถอดสาย temperature probe และสาย electrode probe ออกจาก control unit เชดทาความสะอาด สวนปลาย electrode probe เกบไวใน KCl 3 M

ถอด Motor ออกจาก Top plate ถอดสายนาเขา นาออกของ Exhaust condenser ออกจาก control unit แลวจงถอด Exhaust condenser ออกจาก Top plate

ถอดสายยางออกใหหมด แลวถายนาออกจาก Jacket ใหหมด จากนนเปด Top plate กบ Vessel โดยคอยๆหมนนอตออกทละค จากนนทาความสะอาดทง Top plate กบ Vessel ใหเรบยรอย

สำนกหอ


120

ประวตผวจย

ชอ-สกล นางสาวรววรรณ บญสมปอง

ทอย 19 หม 10 ต. คลองนกกระทง อ. บางเลน จ. นครปฐม 73130

ประวตการศกษา พ.ศ. 2555 สา เ รจการศกษาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาชววทยา จากมหาวทยาลยศลปากร พระราชวงสนามจนทร จงหวดนครปฐม

พ.ศ. 2556 ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา มหาวทยาลย ศลปากร พระราชวงสนามจนทร จงหวดนครปฐม

ผลงานทางวชาการ

Boonsompong, R. and Adthalungrong, C. (2014) Lactic acid production from sweet

potato powder by a simultaneous saccharification and fermentation process. In processdings of TSB

international forum 2014 “Green Bioprocess Engineering”, 16-19 September 2014, BITEC Bang

Na Hall EH101-102, Bangkok, Thailand, page 26 (Oral presentation)

สำนกหอ


า 2557 ิทยาลัิลปากรยศ · lactic acid was 107.10 g/L when using 25 g/L...

Documents

Transcript of า 2557 ิทยาลัิลปากรยศ · lactic acid was 107.10 g/L when using 25 g/L...