第四章
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本章内容
一、相关概念 二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、相关概念 : 灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌 (sterilization): 用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。
消毒 (disinfection): 用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
除菌 (degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。
防腐 (antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
消毒和灭菌的区别 1 消毒仅仅是杀灭生物体或非生物体表面
的微生物,而灭菌是杀灭所有的生命体。2 消毒一般只能杀死营养细胞,而不能杀死细菌芽孢和真菌孢子等,特别适合于发酵车间的环境和发酵设备、器具的无菌处理。
二、发酵工业污染的防治策略
(一)污染的危害
(二)污染的防治
1. 染菌的不良后果 ① 由于杂菌污染,使发酵培养基因杂菌的消耗而损失,
造成生产能力的下降;② 杂菌合成一些新的代谢产物,或杂菌污染后改变了发
酵液的某些理化性质,使发酵产物的提取和分离变得困难,造成产物收率降低或产品质量下降;
③ 杂菌代谢会改变原反应体系的 pH 值,使发酵发生异常变化;
④ 杂菌分解产物,使生产失败;⑤ 细菌发生噬菌体污染,微生物细胞被裂解,导致整个
发酵失败等。
2. 染菌危害的具体分析( 1 )染菌对不同菌种发酵的影响
A .细菌发酵周期较短,主要防止噬菌体污染。B. 霉菌周期较长,产物类型各不相同。C. 酵母菌 :
易污染细菌以及野生酵母菌污染。 D. 疫苗无论污染的是活菌、死菌或内外毒素,都应全部
废弃。
( 2 )不同发酵时期染菌对发酵的影响 种子扩大时期染菌 : 发酵前期染菌:
发酵中期染菌:挽救困难,应早发现,快处理,处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌:加大通风,加速产酸,调 pH3.0 ,抑
制细菌 b. 污染酵母:加入 0.025~0.035g/L CuSO4 抑制酵母;
通风加大,加速产酸。
灭菌后弃去 .
应迅速重新灭菌,补充必要的营养成分,重新接种 .
( 2 )不同发酵时期染菌对发酵的影响c. 染黄曲霉:加入另一罐将近发酵成熟的醪
液, pH 下降,黄曲霉自溶。 d. 青霉菌:在 pH 很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多,可继续发酵 污染严重,则提前放罐
( 3 )杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
丝状菌发酵被产酸菌污染: pH 不断下降,菌丝大量自溶,发酵液粘度增加,过滤困难
处理方法:①将发酵液加热后再加助滤剂;②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
(二)污染的防治1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间,数量要求 平板划线培养或斜面培养检查法:菌落,时间 8h 以上 噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑( 12-20h ) 肉汤培养检查法 ( 37℃, 27℃) 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化
pH异常变化 尾气 CO2异常变化
1
2
2. 污染原因分析
主要原因: ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③设备渗漏 ④灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
从污染时间看:早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关;后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看: 耐热芽孢杆菌:与④有关 球菌、无芽孢杆菌:与①②③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌:与水有关,即冷却盘管渗漏 霉菌:与④⑤有关,即无菌室灭菌不彻底或操作问题
酵母菌:糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看:各个发酵罐或多数发酵罐染菌,且所
污染的是同一种杂菌,一般是空气系统问题,若个别罐连续染菌,一般是设备问题。
2. 污染原因分析
3. 预防 种子带菌的防治
灭菌彻底 接种可靠:无菌室及设备可靠,无菌操作可靠
保藏可靠 过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角” 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件
口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状:大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌:添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底(时间、强度):最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
3. 预防
采取哪些措施能够保持无菌发酵? 物料、培养基、中间补料要灭菌; 发酵设备及辅助设备(空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置)和管道要灭菌; 好气发酵通入的空气要除菌; 种子无污染;接种无菌操作过关; 为了保持发酵的长期无菌状态,需维持正压。
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法( 160-170 1-2h℃ ) 湿热灭菌法 射线灭菌法(细菌芽孢和霉菌孢子不可
以,穿透力不强) 化学药剂灭菌法(环境消毒) 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、培养基及设备灭菌 (一)湿热灭菌原理 (二)分批灭菌(实罐灭菌) (三)连续灭菌(连消)(四)分批灭菌与连续灭菌的比较
1. 热阻2. 微生物热死定律:对数残留定律3. 灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
(一)湿热灭菌原理
1. 热阻
微生物对热的抵抗力称为热阻。
热死时间:在规定的温度下杀死一定比例微生物所需要的时间。
衡量灭菌彻底与否,是以能否杀灭芽孢细菌为标准。
2. 微生物热死定律:(1) 对数残留定律
在一定温度下,微生物受热致死遵循分子反应速度理论,微生物受热死亡的速率 -dN/dt 与任何瞬间残留的活菌数N 成正比,即
t=2.303(lgN0/Nt)/k
当 Nt=0 时, t=∞ , 既无意义,也不可能。
一般采用 Nt=0.001 ,即 1000次灭菌中只有一次失败。
kNdt
dN kt
N
N t 0
ln
大肠杆菌在不同温度下的残留曲线 ( 斜率的绝对值为k)
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线
(2) 非对数残留定律 某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律:如一些微
生物芽孢。 kR ks
NR Ns ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中 NR :耐热性活芽孢数; Ns :敏感性活芽孢数
ND :死亡的芽孢数; kR :耐热性芽孢的比死亡速率;
ks :敏感性芽孢的比死亡速率;
N0 :初始活芽孢数。
3. 灭菌温度和时间的选择 培养物质受热破坏也可看作一级反应:
式中 C :对热不稳定物质的浓度; k’ :分解速度常数; k’ 的变化也遵循阿累尼乌斯方程:
都与相应的活化能及 T 有关
Ckdt
dC'
)'
exp(''RT
EAk
)exp(RT
EAk
当 T1 →T2
㏑ (k2/k1)/ ㏑ (k2’/k1
’)=ΔE/ΔE’>1 ( ΔE>Δ∵E’)
∴随着 T 上升,菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数,故一般选择高温快速灭菌 。
3. 灭菌温度和时间的选择
4. 影响培养基灭菌的其它因素 培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性
低浓度( 1%-2% ) NaCl 对微生物有保护作用,随着浓度增加,保护作用减弱,当浓度达 8%-10% 以上,则减弱微生物的耐热性。
pH : pH6.0-8.0 ,微生物最耐热, pH<6.0 ,H+ 易渗入微生物细胞内,改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基 pH愈低,灭菌所需时间愈短。
培养基的物理状态 泡沫:泡沫中的空气形成隔热层,对灭菌极为
不利,可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量
4. 影响培养基灭菌的其它因素
空气过滤器灭菌并用空气吹干
夹套或蛇管排冷水,开启排气管阀,空气管通蒸汽,也可夹套内通蒸汽
达 70℃左右
取样管
放料管通蒸汽120℃ , 1×105pa
保温
保温阶段,凡液面以下各管道都应通蒸汽,液面上其余各管道则应排蒸汽,不留死角,维持压力、温度恒定
罐压接近空气压力 向罐内通无菌空气保温结束,依次关闭各排汽、进汽阀门
夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度
(二)分批灭菌(实罐灭菌) 1. 灭菌工艺过程
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果,考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行,故可以简单地利用式
㏑ (N/N0) =-kt
来粗略估算灭菌所需时间。
2. 灭菌时间的估算
2. 灭菌时间的估算 例 1 :有一发酵罐内装 40m3 培养基,在 1210C温度下实罐灭菌,原污染程度为每 1ml 有 2×105个耐热细菌芽孢,已知 1210C 时灭菌速度常数 k=1.8min-1 ,求灭菌失败机率为 0.001 时所需时间。
解: N0=40×106×2×105=8×1012( 个 ) Nt=0.001( 个 ) k=1.8(min-1)
㏑ (Nt/N0)=-kt t=2.303[lg(N0/Nt)]/k=2.303[lg(8×1015)]/k=20.34(min)
由于升温阶段就有部分菌被杀灭,特别是当培 养基加热至 1000C 以上,这个作用较为显著, 故实际保温阶段时间比计算值要短。
(三)连续灭菌(连消) 工艺流程
喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑ (Nt/N0)= - kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)]
式中: N0 、 Nt 分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
喷淋冷却连续灭菌流程
分批灭菌与连续灭菌的比较 连续灭菌的优点:(适用于大型罐)
可采用高温短时灭菌,营养成分破坏少,有利于提高发酵产率;
发酵罐利用率高; 蒸汽负荷均衡; 采用板式换热器时,可节约大量能量; 适宜采用自动控制,劳动强度小; 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌,减少营养成分的破坏。
缺点: 对小型罐无优势,不方便,对设备要求高; 蒸汽波动时灭菌不彻底; 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时,
以分批灭菌好,防止灭菌不彻底。
分批灭菌与连续灭菌的比较
五、空气除菌
(一)概述(二)空气过滤除菌流程(三)空气预处理(四)空气预处理流程设计应用举例(五)空气过滤介质(六)空气过滤除菌原理(七)提高过滤除菌效率的措施
(一)概述
空气除菌的必要性 以一个 50m3 的发酵罐为例,若装料系数为 0.7 ,
要求每立方米发酵液每分钟通气 0.8m3 ,培养周期170h ,那么每个周期需通气量 2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60) ,而每立方米大气中约有 103-104
个微生物。
空气除菌方法 辐射杀菌:超声波、高能阴极射线, x射线、 β射
线、 γ射线、紫外线 (2265Å ~3287 Å) 加热杀菌:加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产
生的热量 静电除菌 :常用于洁净工作台、洁净工作室所需无
菌无尘空气的第一次除尘,配合高效过滤器使用。 过滤除菌:采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气
所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。
(一)概述
1. 对空气过滤除菌流程的要求 流程主要设备:空气压缩机 、空气过滤器 附属设备:粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器
流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑 环境污染比较严重的地方,要考虑改变吸风的条件; 在温暖潮湿的南方,要加强除水设施 ; 压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的
污染 ,也可采用无油润滑的往复式压缩机; 往复式压缩机,要配备前置粗过滤器及空气贮罐。
通常要求压缩空气的相对湿度 Φ=50%~60% 时通过过滤器为好。
1. 对空气过滤除菌流程的要求
2. 空气除菌流程的分析
空气除菌系统包括:冷却、分离油水、加热、 过滤
典型的设备流程 两级冷却、加热除菌流程 高效前置过滤空气除菌流程 利用热空气加热冷空气流程 一次冷却和析水的空气过滤流程
(三)空气预处理
1. 原理: 除尘 ( 外源空气的前处理 ) :防塞,提高过滤效率和
滤器寿命;
降温:防烧伤介质及水分蒸发严重,对发酵不利 除油、除水:防塞(因油膜堵),防止过滤器长菌堵塞(因水滴)
加热:保持相对湿度 稳压:防止压力波动,贮罐
2. 预处理流程设计的简繁关键:去湿问题
措施:建吸风塔、粗过滤器(布袋过滤器、填料过滤器和水雾除尘装置等)、高效前置过滤器
两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器; 2- 空压机; 3-贮罐; 4 , 6-冷却器; 5-旋风分离器; 7- 丝网分离器;8- 加热器; 9- 过滤器
利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风; 2-粗过滤器; 3-压缩机; 4- 热交换器; 5-冷却器; 6 , 7- 析水器; 8- 空气总过滤器; 9- 空气分过滤器
高效前置过滤空气除菌流程图1—高效前置过滤器; 2—压缩机; 3—贮罐; 4—冷却器; 5— 丝网分离器; 6— 加热器; 7— 过滤器
空气压缩和压缩空气的冷却
空气的压缩过程可看作绝热过程,故压缩后的空气温度与被压缩的程度有关:
T2=T1(P2/P1)(k-1)/k
式中 T1,T2——压缩前后空气的绝对温度, K
P1,P2—— 压缩前后空气的绝对压强, Pa
k——绝热指数,空气为 1.4
若压缩为多变过程,则可用多变指数 m (对于 空气 m=1.2-1.3 )代替绝热指数 k 。
例 2 : 20oC 的大气被压缩至表压 2.5kg/cm2 时温度是多少?
解: T1=20+273=293k
P2/P1= ( 2.5+1.033 ) /1.033=3.42
m=1.3
T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=293×3.420.3/1.3=389k
∴t2=389-273=116oC
空气预处理流程设计
3. 几个概念 空气的绝对湿度: 1m3 湿空气中含有的水蒸气绝对量 (kg) 空气的相对湿度(Φ):空气的绝对湿度与同温度下饱 和绝对湿度之比值或者空气中水蒸汽分压与同温度时的 饱和水蒸汽压之比值,称为空气的相对湿度。 Φ=Pw/Ps 式中 Pw——空气中水蒸气分压, Pa
Ps—— 同温度下水的饱和蒸气压, Pa , 它可由各类手 册中查到。 空气的湿含量( X ): 1kg干空气中含有的水汽量 ( kg/kg干空气)
空气的湿含量( X )
设 Gg kg干空气中含 Gw kg水蒸汽时,则 X=Gw/Gg
又 Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg)
=(Gw/Gg)·(Mg/Mw)
( Mw , Mg 分别为水和空气的分子量) ∴X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)·(Pw/Pg)
=0.622Pw/(P-Pw) ( 4-1 )
( 1 ) Φ 与 X 的关系
将 ΦPs=Pw代入式 4-1 中得
X=0.622ΦPs/ ( P-ΦPs )
所以,已知某一温度 T 时 Φ值,便可求得 X 。
①当 X 一定时, T1→T2 ,导致 Φ1→Φ2 ,则
X1=0.622Φ1Ps1/(P1-Φ1Ps1)
X2=0.622Φ2Ps2/(P2-Φ2Ps2)
∵X1=X2 ∴Φ2=Φ1(PS1/PS2)(P2/P1) (式 4-2 )
②当 X 发生变化,即有水析出时, X 降低,此时 Φ2=100% ,
定义:当 Ф=1 时,空气中水蒸气已饱和,此时温度称为露点 Td 。当 T<Td 时,有水析出, X ↓ 。
( 1 ) Φ 与 X 的关系
思考题
压缩空气的露点比原始空气的露点更高,即更易析出水分,为什么压缩比愈大,露点愈高?
思考题答案:
由
可知当 = 1 时,求出 Ps2 对应 Td
Ps2 愈高, Td 愈高
而
∴压缩空气的露点 比原始空气 高 ( P2>P1)
压缩比 愈大,露点愈高
1
2
2
112 P
P
P
P
s
s
2
1
21s12s P
PPP
1
21s1 P
PP
1
11s1 P
PP
1
2
P
P
加热后空气的温度
设析出水后,在升温阶段 ΔX=0 ,根据式 4-2
可以求出析水后应升温到多少度才能满足相对湿度保持 50-60% 。
∵Φ 后 = ΦdPsd/Ps 后
∴ Ps 后 = ΦdPsd/ Φ 后
Ps 后→ T 后
例 3 :温度 20℃ 、 Φ=85% 的空气,当压缩至 2.0kg/cm2 时,温度为 120℃ ,求此时空气相对湿度是多少?若在压力不变的情况下将温度冷却至 40℃ 后,相对湿度又是多少?
已知: 20℃ 时, Ps1=0.0238 kg/cm2,120℃ 时, Ps2=2.025 kg/cm2 ,40℃ 时, Ps3=0.0752 kg/cm2
解: 120℃时,相对湿度为
40℃时,相对湿度为
%93.2033.1
033.3
025.2
0238.0%85
1
2
2
112
p
p
p
p
s
s
%9.780752.0
025.20293.0
2
3
3
223
p
p
p
p
s
s
例 4 :若将例 4 中空气继续冷却,至水析出,求露点 td?(假定压力不变)
解:已知Φ4 = 100% , X 一定, P 一定由
所以
查蒸汽压表, 0.059 kg/cm2饱和蒸汽压对应温度 td = 35℃。所以,当 t<35℃,继续冷却时,有水析出。
4
33
3
4
4
334
s
s
s
s
p
p
p
p
p
p
2
4
334 /059.0
1
0752.0%9.78 cmkg
pp ss
例 5 :若将例 4 中的空气冷却至 28℃(压力不变),求其湿含量为多少?并求每公斤干空气将析出多少水分?(已知: 28℃时,Ps5= 0.0385 kg/cm2 )
解:
而最初
所以,每公斤干空气将析出水分: ΔX = X1-X5 = 0.0124-0.0080 = 0.0044 ㎏水
干空气水汽 kgkgpp
px
s
s /0080.00385.01033.3
0385.01622.0622.0
55
555
干空气水汽 kg/kg0124.00238.085.0033.1
0238.085.0622.0
pp
p622.0x
1s1
1s11
例 6 :若将例 5 中空气加热至 38 ℃时,求其 Φ6 ? ( 38 ℃时, Ps6 = 0.0675 kg/cm2 )
解:升温时 X 不变,Φ5→Φ6 时Φ值下降
也可根据 X6= X5= 0.0080 不变,由
得
%0.570675.0
0385.0%100
5
6
6
556
p
p
p
p
s
s
%0.570080.0622.0
0080.0
0675.0
033.3
622.0 6
6
66
x
x
p
p
s
s
s
pp
px
622.0
(五)空气过滤介质 棉花 玻璃纤维 活性炭 超细玻璃纤维纸 石棉滤板 烧结材料过滤介质 新型过滤介质
(六)提高过滤除菌效率的措施 减少进口空气的含菌数量,主要方法:正确选择进风口;提高进口空气的采气位置;采用粗过滤预处理。
设计和安装合理的空气过滤器,选用除菌效率高的过滤介质。
针对不同地区,设计合理的空气预处理工艺流程,以达到除油、水和杂质的目的 。
降低进入空气过滤器的空气相对湿度,保证过滤介质能在干燥状态下工作,主要方法:使用无油润滑的空气压缩机;加强空气冷却和去除油、水;提高进入过滤器的空气温度。
稳定压缩空气的压力,采用合适容量的贮气罐。
(七)提高过滤除菌效率的措施
本章小结
掌握有关无菌技术的基本概念 了解发酵工业污染的原因及其防治策略 掌握培养基及设备灭菌的基本原理、基本方
法及灭菌时间的估算 掌握空气除菌基本原理、流程及空气预处理
设计