5.2 酵母菌的基因工程

发展历程1. 1974 年 rlarck—walker 和 Miklos 发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。2. 1978 年 Hmnen 将来自一株酿酒酵母的 leu 2 基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的 Leu2 缺陷，标志着酵母表达系统的建立。3. 1981 年 Hinnen 等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。4. 我国也在 1983 年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。5. 1996 年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。

酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统优势在于：1. 安全无毒，不致病；2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；3. 容易进行载体 DNA 的导入。 DNA 转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵；5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。缺陷在于：1. 表达效率相对低2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。

5.2 .1 酵母菌的宿主系统1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌

广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：酵母属 如酿酒酵母克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想

提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变

突变 产生的异源蛋白 增加产量（倍数） 作用位点

SSC1 凝乳酶原 Ca2+-ATPase 牛生长因子 3-10 转录后SSC2 凝乳酶原 转录后 牛生长因子rgrl 鼠 α— 淀粉酶 5-10 转录后osel β— 内啡肽 7-12 转录后NDS 人血清蛋白 溶酶原活化剂抑制因子 2 型 10 转录ss1l α1 —抗胰蛋白酶 P 人溶菌酶 10 羧肽酶 Yrho 人溶菌酶 10 转录 人表皮因子 NDE

抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 突变类型 生物效应

mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺

陷och 外侧糖链添加缺陷型

酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。

减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用

靶蛋白

靶蛋白

靶蛋白

Lys

Lys

Ubiquitin 76 aaLysLys

Ubiquitin ligase E3

Ubiquitin ligase E3

蛋白酶体

减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母UBI4 缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由 UBI4 基因表达， UBI4- 突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此 UBI4 缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA1 缺陷型：UBA1编码泛素激活酶 E1 ， UBA1 突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。

5.2.2 酵母菌的载体系统载体的一般结构选择标记 复制子表达盒 启动子先导序列 终止子有用的蛋白结构域1 酵母菌中的野生型质粒2 酵母菌克隆表达质粒的构建

酵母菌种的野生型质粒酿酒酵母中的 2μ环状质粒

几乎所有的酿酒酵母都含有 2μ双链环状质粒，拷贝数维持 50-100 个。 Irs 反向重复序列

600bp ，重组 FLP编码产物驱动 Irs 的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性 STB REP 的结合位点 接合酵母属中的pSRI、 pSR1、 pSB2和 pSR1 以及克鲁维酵母属中的 pKD1 质粒等，均有类似的结构。

酵母菌种的野生型质粒 乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒 pGKL1 和 pGKL2，拷贝数为 50-100个，分别携带 K1和 K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。

酵母菌克隆表达质粒的构建含有 ARS 的 YRp 和 YEp 质粒及其构建

• ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在 0.8-1.5Kb,染色体上每 30-40bp就有一个 ARS元件。

• 由染色体 ARS构成的质粒称为 Yrp ，而由 2μ 质粒构建的杂合质粒为 Yep 。• 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达

200 个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70% ，主要由于分配不均匀所致。

酵母菌克隆表达质粒的构建含有 CEN 的 YCp 质粒的构建

• CEN为酵母菌染色体 DNA 上与染色体均匀分配有关的序列。将 CEN插入到 ARS质粒中，获得的新载体称为 YCp 。• YCp 质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有 1-5 个。

酵母菌克隆表达质粒的构建含有 TEL 的 YAC 质粒的构建

• 利用酵母菌的端粒 TEL.CEN.ARS 等 DNA元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源 DNA ，这是构建 YAC 载体的基本思路• YAC 载体的装载量可高达 800kb ，适用于构建人的基因组文库。

5.2.3 酵母菌的转化系统酵母菌的转化程序转化质粒在酵母细胞中的命运用于转化子筛选的标记基因

酵母菌的转化程序酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在 Ca2+ 和 PEG 的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的 1%-5% 。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。 原生质转化法德一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的 25%-33% 。

酵母菌的转化程序碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如

Li+ 等）、 PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒 DNA ，而且具有以下特性：吸收吸收线性 DNA 的能力明显大于环状

DNA ，二者相差 80倍。共转化现象较为罕见。

酵母菌的转化程序酵母菌电击转化• 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒 DNA ，但在此过程中应避免使用 PEG ，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达 105 转化子 /μgDNA 。

转化质粒在酵母细胞中的命运单双链 DNA均可高效转化酵母菌，但单链

DNA 的转化率是双链的 10-30倍含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有利。同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的 50-

80% 。

用于转化子筛选的标记基因营养缺陷型的互补基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要由营养缺陷型互补基因和显性基因两大类。营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成记忆如： Leu 、 Trp、 His、

Lys、 Ura 、 Ade 。但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。

用于转化子筛选的标记基因显性标记基因显性标记基因的编码产物只 标记基因 编码产物 遗传表型

Aph 氨基糖苷转移酶 抗 G418Cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺Cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子Suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂

5.2.4 酵母菌的表达系统酵母菌启动子的基本特征和选择酵母菌启动子的可调控表达系统外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌表达系统的选择

酵母菌启动子的基本特征和选择用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌Ⅱ型启动子由基本区和调控区两部分组成，基本区包括 TATA盒和转录起始位点。调控区位于基本区上游几百碱基对的区域内，由上游激活系列（ UAS）和上游阻遏序列（ URS）等顺式元件组成。利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，另一种方法是从已有的启动子中构建杂合启动子

酵母菌启动子的可调控表达系统（ 1）温度控制性启动子酿酒酵母有 a 和 α 两种单倍体，分别由

MATa 和 MATα 两种等位基因决定。MATα 由顺反子

MATα1 和 MATα2组成，前者决定 α1的激活过程，后者决定 α2阻遏过程。MATa 中， a1 和 a2蛋白共同决定 a1-

a2阻遏。

A 25℃ Sir3-8ts

Sir3-8ts

hmlα2-102

α1

a1

MATa

MATa

a1

hmlα2-102

受体细胞基因组 重组质粒

a 型启动子

a 型启动子

α 型启动子

α 型启动子

酵母菌启动子的可调控表达系统（ 2）超诱导型启动子当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基时，其 GAL1、 GAL7、 GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖或者葡萄糖时，启动子活性被诱导 1000倍。

酵母菌启动子的可调控表达系统（ 3）严紧控制表达系统一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效地将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围，以弥补酿酒酵母的宿主 - 载体系统缺少的严紧控制表达机制

外源基因在酵母菌种表达的限制性因素外源基因稳态 mRNA 的浓度外源基因 mRNA 的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 GAPDH ，磷酸甘油激酶 PKG ，乙醇脱氢酶 ADH）中 96% 以上的氨基酸是由 25 个密码子编码的。

酵母菌表达系统的选择酿酒酵母表达系统酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛 -3-磷酸脱氢酶基因 GAPDH、磷酸甘油激酶基因 PKG、乙醇脱氢酶基因 ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。

酵母菌表达系统的选择乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒 pKD1 已被广泛用作重组异源蛋白生产的搞笑表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传 40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌性的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。

酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因 AOX1所属强启动子、表达的可诱导性事巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体 DNA 上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。

酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS 已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是， HARS 质粒能高频自发地整合在受体的染色体 DNA 上，甚至可以连续整合 100 多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表卖弄抗原在内的数种外源蛋白在该系统中成功表达。

酵母菌的蛋白修饰分泌系统蛋白质的分泌运输机制信号肽及其剪切系统分泌型蛋白的糖基化修饰

蛋白质的分泌运输机制 酵母菌的蛋白质分泌系统与其他高等真核生物相似，高度分化的细胞器结构在酵母菌蛋白分泌运输过程中起着重要作用。内质网膜

核膜

高尔基体

泡囊

质膜

信号肽及其剪切系统与其他真核生物相似，酵母菌信号肽序列的保守性较低，大都由 15-30 个氨基酸残基组成，含有三个不同的结构特征，即 N端带正电荷的 n区，中间疏水残基的 h区， C端极性的 c区。n区的长度及氨基酸残基性质各异，都含正电荷。h区的疏水氨基酸残基大都随即排列。c区具有对应于信号肽剪切位点的特征序列。

分泌型蛋白的糖基化修饰酵母菌中的蛋白质糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。进入高尔基体的分泌型蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应。酵母菌的修饰形式不同于高等真核生物。重组异源蛋白在酵母菌受体细胞中的超糖基化会造成重组蛋白的生物活性降低以及蛋白质的免疫原性增加等。

利用重组酵母生产乙肝疫苗乙肝肝炎病毒的结构与性质、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母

乙型肝炎病毒的结构与性质乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链 DNA 病毒，具有感染能力的病毒颗粒，直径 42nm ，基因组仅为 3.2kb 。病毒的主要结构蛋白石病毒的表面抗原多肽（ HBsAg）或 S 多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式，颗粒内的蛋白成分包括核心抗原、病毒 DNA聚合酶、微量病毒蛋白。

乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因

产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母20 世纪 80 年代开始选择酿酒酵母表达重组

HBsAg ，主要工作包括将 S 多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为 22nm ，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。

目前，由酿酒酵母生产的重组 HBsAg颗粒以作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的 1%-2% 。

整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建

利用重组酵母生产人血清蛋白人血清蛋白是血浆的主要成分，由肝脏合成，并分泌到血液循环系统中，然后散布于大多数体液中。最初采用的重组人血清蛋白表达分泌系统是酿酒酵母。进一步的改进方法是使用乳酸克鲁维酵母作为受体细胞，该菌体杀手毒素蛋白 α 的信号肽能大大提高表达产物的分泌效率。巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清蛋白的表达分泌系统。