NSR 11:32 UTC: 2020-10-15 N .GCC5 C CDG;CLC' NBW-IOOD NBW ...
5.0 Méthodes spectroscopiques d’analysethibaupi/CHM2971/DOC/CHM... · monochromateur (SBW)...
Transcript of 5.0 Méthodes spectroscopiques d’analysethibaupi/CHM2971/DOC/CHM... · monochromateur (SBW)...
CHM 2971 H2006 1
5.0 Méthodes spectroscopiques
d’analyse
CHM 2971 H2006 2
Spectroscopie : Étude des interactions des radiations électro-magnétiquesavec la matière: complexe, polymère, protéines, molécules, atomes . . .
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
Rayons-X : bris des liens chimiques et ionisation des molécules
UV/Vis et fluorescence : excitation électronique
IR :vibration
Micro-ondes :rotation
CHM 2971 H2006 3
Lumière
– Ondes : champs magnétique et électrique, oscillants et perpendiculaires
– Particules : photons transportant une énergie, E, définie
νhE =où E :Énergie (J)
h : constante de Planck (6.626 x 10-34 J.s)
ν : fréquence (s-1)
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 4
• Relation entre fréquence et longueur d ’onde
• Nombre d ’onde
λν 1
= où ν : nombre d’onde (m-1)λ : longueur d’onde (m)
νλ
ν hcchhE ===⇒
c=νλ où c : vitesse de la lumièredans le vide (2.998 x 108 m.s-1)
λ : longueur d’onde (m)ν : fréquence (s-1)
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 5
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
Absorption UV/vis
Promotion d’électrons à des niveaux plus énergétiques
CHM 2971 H2006 6
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
Spectre d’un atome
Émissions de raies (pic étroits) représentants les transitions électroniques accessibles aux électrons entre les orbitales atomiques occupées et vacantes (s, p, d, f)
CHM 2971 H2006 7
Transitions électroniques possibles
liens chimiques → molécule
n-π* : C=O (carbonyle)
n-σ* : O, N, S, X
π-π* : C=C (aromatique, alcène),C=O (carbonyle), N=N (azo)C≡C (alcyne)
σ-σ* : C-C (alcane)
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 8
Spectre d’absorbance d’une moléculeObtention de bandes d’absorption car existance de plusieurs états de vibration des liens atomiques et de rotation moléculaire pour chaque niveau électronique. Dépend de plusieurs facteurs : structure de la molécule, polarité du solvant, pH du solvant, température, concentration, temps
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 9
Transmittance (T)
• Fraction de l’intensité initiale(I0) de lumière qui traverse un échantillon
• Varie entre 0 et 1• Peut exprimée en %
(100xT=%T)
0IIT =
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 10
Absorbance (A)
Relation entre A et T
TIIA loglog 0 −=⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛=
%T I/I0 A
100 1 0
10 0.1 1
1 0.01 2
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 11
Loi de Beer-Lambert
S’applique quand une radiation monochromatique traverse une solution diluée (≈0.01M) dans laquelle les espèces absorbantes ne sont pas impliquées dans un équilibre dépendant de la concentration
où A = absorbanceI0 = intensité de lumière incidenteI = intensité de lumière transmiseε = absorptivité molaire (L.mol-1.cm-1) c = concentration d’analyte (mol.L-1)l = parcours optique (cm)
lcA ε=
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 12
Absorptivités molaires (ε) typiques
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 13
Limitations de la loi de Beer-Lambert
– Chimiques• Concentration : en solution concentrée, les molécules de soluté
peuvent interagir entre elles ⇒ ε• Équilibre relié à la concentration : si ε de l’espèce non dissociée
est ≠ de ε de l’espèce dissociée, A ne sera plus proportionnel avec la concentration
– Instrumentales• Rayonnement polychromatique : lié à la difficulté de produire un
rayonnement exclusivement monochromatique• Lumière parasite : causée par la diffraction sur les composantes
optiques (lentilles, prismes, filtres, cuvettes)
5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction
CHM 2971 H2006 14
SpectrophotomètreMesure la quantité de lumière absorbée ou transmise par une solution
Principales composantes :
a) sourceb) sélecteur de λc) porte-échantillon et celluled) détecteure) dispositif pour visualiser les valeurs
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
CHM 2971 H2006 15
Spectrophotomètre à simple faisceau
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
CHM 2971 H2006 16
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
A) Prisme/fente pour le sélecteur optique de la source et détecteur à simple λ
B) Prisme pour le sélecteur optique au détecteur avec DAD
C) Réseau pour le sélecteur optique au détecteur avec DAD
A
C
(visible)
(UV)
B
CHM 2971 H2006 17
Spectrophotomètre à double faisceau
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
CHM 2971 H2006 18
Prisme pour le sélecteur (λ) optique de la source et détecteur à simple λ
Réseau pour le sélecteur (λ) optique au détecteur avec DAD
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
CHM 2971 H2006 19
• Lampe à filament de tungstène (visible)
• Lampe au deutérium (UV)
350-2200 nm
160-380 nm
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Source
CHM 2971 H2006 20
Monochromateur: réseau de diffraction
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Sélecteur de λMonochromateur : prisme
Filtre: interférentiel
Filtre: d’absorption
CHM 2971 H2006 21
Bande passanteLargeur à mi-hauteur de la bande de rayonnement transmis
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Sélecteur de λ
Mon
ochr
omat
eur
Filtr
es0,1 à 10 nm
CHM 2971 H2006 22
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Sélecteur de λRésolution spectrale et fente
La qualité d’un spectre est directement reliée à 1- la bande passante quittant le monochromateur (SBW) contrôlée par les fentes de sélection de λ et 2- la bande passante naturelle (NBW) du produit analysée.
Un rapport SBW/NBW = 0,1 donne une précision de 99,5% pour l’absorbance mesurée et une résolution spectrale optimale (spectre rouge). Plus les fentes sont grandes plus il y a distorsion et perte de résolution.
CHM 2971 H2006 23
Exemple: spectre du benzène
5.0 Méthodes spectroscopiques
Sélecteur de λ
Instrumentation
SBW
NBW
NBW
NBW
CHM 2971 H2006 24
Résolution spectrale,fente et S/N
En réduisant la largeur de la fente de la source le rendement énergétique émis est diminué. Dans le cas de la fente au détecteur, l’intensitéperçue par le détecteur est aussi diminuée. L’absorbance (A) étant un rapport, elle reste inchangée, mais le rapport S/N diminue (signal plus bruyant).
5.0 Méthodes spectroscopiques
Sélecteur de λ
Instrumentation
CHM 2971 H2006 25
Résolution spectrale et vitesse d’acquisition
Une augmentation de la vitesse d’acquisition de l’absorbance mène à une déficit d’information (signal) et une diminution de A. De plus, il y a distorsion des bandes et variabilité de leurs position. Enfin, le rapport S/N augmente mais avec un perte de résolution.
5.0 Méthodes spectroscopiques
Bruit (N)
Instrumentation
CHM 2971 H2006 26
Cellules
Standard et Volume réduit
Cylindrique
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Matériel de compositionVerre /plastique : visibleUV : quartz
Volume (µ) etFlux continue
CHM 2971 H2006 27
5.0 Méthodes spectroscopiques
Chemin optiqueD’après la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est proportionnelle au chemin optique. Plus le chemin optique est long, plus le nombre de molécules qui absorberont la radiation sera grand et plus l’absorbance augmentera.
Quinoléine jaune
InstrumentationCellule
CHM 2971 H2006 28
Détecteur
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Phototube
La lumière (photons) émise frappe une surface photosensible chargé (-) éjectant des électrons qui traversent le phototube sous vide pour être rencontrer le collecteur (+) donnant le signal électrique.
CHM 2971 H2006 29
Détecteur
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Photomultiplicateur
L’électron éjecté par la surface photosensible frappe une dynode où il éjecte d’autres électrons accélérés qui frappent des dynodes succesives. Un photon donne en moyenne 106 électrons qui seront collectésà l’anode pour produire le signal.
CHM 2971 H2006 30
Détecteur
5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation
Barrette de photodiodes
Une superposition de silicone type n et p créent des jonctions pn de diodes. En électrisant cette jonction une surface photosensible (électrons-trou) est obtenue. Les photons qui viennent la frapper perturbent l’équilibre du circuit de capacitances électriques donnant ainsi le signal.
type-pisolant
réseau
CHM 2971 H2006 31
5.0 Méthodes spectroscopiques
SolvantLe type de solvant utilisé affecte les spectres UV-Vis de plusieurs manières.
1) Seuil de coupure:En générale, pour une analyse quantitative il est à 90% et pour une analyse qualitative il peut etre < 90% transmittance
Préparation de l’échantillon
CHM 2971 H2006 32
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
Solvant (suite)
2) Interactions solvant/analyte
Dans l’éthanol il y a formation de pont H ce qui diminue le degré de liberté de la molécule et mène à une perte de la structure fine qui apparaît dans un solvant moins polaire tel le cyclohexane
3) Constante diélectrique:
Une augmentation de la constante diélectrique du solvant mène à un shift bathochromique (↑λ)
Shift bathochromique
benzophenone
Shift hypsochromique
CHM 2971 H2006 33
dim
éris
atio
n
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
Concentration de l’échantillonCertains produits ont tendance à participer à des réactions secondaires (Ex. : dimérisation) lorsque présents en grande concentration.
2
CHM 2971 H2006 34
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
Contrôle de la température (T) 1) MultivariablesIl est essentiel d’avoir un contrôle rigoureux de la T lors d’analyses UV-Vis. La T affecte de manière complexe le pH de la solution, l’indice de réfraction, l’expansion du solvant et la solvatation des molécules.
Orange de méthyle
CHM 2971 H2006 35
ΔT↑
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
Contrôle de la température (T) 2) Structure fine
L’augmentation de la T augment le nombre de degré de liberté de la molécule et mène à l’apparition de la structure fine sur le spectre. L’énergie supplémentaire donnée à la molécule accélère les transitions de type vibration et rotation ce qui les rends ‘invisible’ sur le spectre permettant de mieux percevoir et résoudre les transitions électroniques.
CHM 2971 H2006 36
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
La décroissance de la densitéoptique (hypochromicité) du →monomère au → brin à → l’hélice indique la formation d’une structure plus ordonnée. Dans l’ADN bicaténaire, la proximitédes paires de bases voisins mène à des intéractions qui diminuent l’absorbance. En dénaturant (ΔT↑) vers les brins monocaténaires, les intéractionsmoléculaires sont affaiblies et l’absorbance augmente. Enfin, en hydrolisant le tout pour obtenir les bases libres, l’absorbance atteint un maximum.
Contrôle de la température (T) 3) Hypochromicité
CHM 2971 H2006 37
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
Contrôle du pHLes molécules ionisables (acide - basique) doivent être analysées dans un tampon afin de contrôler leur protonation -déprotonation. Une charge en plus ou en moins sur la molécule affecte directement les niveaux électroniques peuplés et l’absorption dans l’UV-Vis.
CHM 2971 H2006 38
5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon
Contrôle du pHApplication: Analyse des acides aminées aromatiques.
CHM 2971 H2006 39
Erreur analytique relative en spectrophotométrie
TTA ln4343.0log −=−=
TdTdA 4343.0−
=
TdTdA 4343.0−=
[1]
[2]
[3]
TTdT
AdA
ln= [4]
Erreur
5.0 Méthodes spectroscopiques
[5]
[6]
TTdT
CdC
AdA
ln==
TTT
CC
AA
lnΔ
=Δ
=Δ
Analyse quantitative UV-Vis
CHM 2971 H2006 40
ΔT ≈ 0.005 (0.5%)
TTT
CC
AA
lnΔ
=Δ
=Δ
T=0.7; A=0.15T=0.2; A=0.7
Erreur analytique relative en spectrophotométrie
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Erreur
CHM 2971 H2006 41
Effet du rayonnement polychromatique
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Pourquoi choisir λmax ?
1- La loi de Beer-Lambert est plus facilement respectée, même si le rayonnement n’est pas totalement monochromatique
2- La sensibilité de l’analyse est plus élevée (réponse maximale pour une concentration donnée)
CHM 2971 H2006 42
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Courbe d’étalonnageLa loi de Beer-Lambert permet de construire une courbe d’étalonnage pour un standard (x) afin d’effectuer une quantification subséquente sur une solution inconnue qui contient (x). LD accessible ~10-7 M
A
[x]
λ
A Même variation de λ
Petite erreur
Grande erreur Courbe d’étalonnage direct
[ ] [ ] CxmAxlA x +=≡= )()( λλ ε
CHM 2971 H2006 43
Analyse multicomposants basée sur l’additivité des absorbances
Atot (λ) = A1(λ) + A2(λ) + … + An(λ)
- La loi de Beer-Lambert s’applique aux mélanges qui contiennent plus d’une substance absorbante, à condition qu’il n’y ait aucune interaction entre les diverses espèces.
- Les spectres des produits ne doivent pas être identiques dans tout le domaine spectral
- L’absorption doit être mesurée à autant de λ qu’il y a de constituants
5.0 Méthodes spectroscopiques
[ ] [ ] [ ]nlllA ntot )()(2)(1)( ...21 λλλλ εεε ++=
[ ]∑=
=
=ni
iiitot xlA
1)()( λλ ε
Analyse quantitative UV-Vis
CHM 2971 H2006 44
Choix des λ :
- Si possible, choisir la λmaximale d’absorbance pour chaque produit
- A ne doit pas changer trop brutalement au voisinage de la λ d’analyse (λ max)
- L’absorbance totale ne doit pas être trop petite (>0,1) ou trop grande (<1,5)
- Les absorbances doivent être additives à cette λ
- Les ε des produits doivent différer le plus possible, et ce aux deux λ
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
CHM 2971 H2006 45
Application analytique : Dosage de la caféine et de l’acide benzoïque dans une boisson gazeuse
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
CHM 2971 H2006 46
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Composition:Trois produits d’intérêt sont présents et absorbants dans ce breuvage
CHM 2971 H2006 47
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
HPLC
CE
CHM 2971 H2006 48
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Spectrophotométrie différentielle
Basée sur les spectres d’absorption dérivés (algorithme Savitsky-Golay)
Ordres pairs : valeurs extrêmes (minimum ou maximum)
- Les ordres pairs respectent la loi de Beer-Lambert - 4ème dérivée : meilleur compromis entre l’augmentation de la résolution et la diminution du rapport signal sur bruit
Ordres impairs : passage par zéro
Maximum
Point d’inflexion
CHM 2971 H2006 49
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Avantages :
• Lissage du spectre d’absorption et atténuation des interférences: diffractions, diffusions, matrice …• Résolution de bandes chevauchées rendant possible l’analyse quantitative• Discrimination des bandes larges
Désavantages :
• Génération d’un profil complexe• Perte d’information suite au lissage
- déplacement du λmax (shift)- rapport S/N diminue
CHM 2971 H2006 50
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
Application :Détermination d’hémorphines• Peptides contenant des résidus aromatiques (F, Y, W)• Digestion protéique et séparation par HPLC des peptides de la digestion• Détection DAD et quantification par 2ème dérivée
Séparation HPLC du digestat1- VVYPWTQRF2- LVVYPWTQRF
1- VVYPWTQRF 2- LVVYPWTQRF
Phe, 259 nm
Tyr, 283,5 nm
Trp, 289,5 nm
CHM 2971 H2006 51
Applications analytiques Complexe à transfert de charge
• Espèce fortement absorbante, constituée d’une espèce donneur d’é et d’une espèce accepteur d’é
• Peut servir à la détermination indirecte d’un analyte• Propriétés du réactif chromogène
– Stabilité en solution– Réaction rapide– Réaction quantitative– Absence d’absorption gênante– Absence d’influence d’ions étrangers
• Propriétés du complexe formé– Stabilité– Couleur suffisamment intense– Absence d’influence de faibles variations de pH,
température– Obéissance à la loi de Beer-Lambert
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis
CHM 2971 H2006 52
Ex. : Dosage du fer (thiocyanate ou o-phénanthroline)
++ →+ 23218218
2 )(3 NHCFeNHCFe 1212
)3(3 )( nnSCNFeSCNnFe −−+ →+
5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis