1

6. DUGE NEKODIRAJUĆE RNK (LNCRNK)

Kao rezultat projekta ENCODE 2007. godine objavljen je podatak da se čak 93% genoma čoveka

transkribuje barem jednom u nekom tkivu (slika 19). Nešto kasnije objavljeni su i podaci da se 70%

genoma čoveka transkribuje bidirekciono, i da često postoje preklapanja izmeĎu transkripata. Ovi

fascinantni podaci ukazali su da bi najveći deo genoma mogao biti sastavljen od funkcionalne DNK.

Godine 2012. projekat ENCODE objavio je da više od 80% genoma čoveka služi nekoj biohemijskoj

funkciji.

Transkripcija ogromnog procenata genoma sisara danas je poznata pod nazivom „pervazivna

transkripcija―. Njen rezultat je prisustvo enormnog broja različitih molekula RNK u transkriptomu

čoveka. Čak 195 000 (ENCODE, avgust 2012. godina)! Od toga, oko 95 000 transkripata prepisuje se sa

gena za proteine, od kojih oko 57 000 kodira proteine pune dužine, oko 25 000 nosi informaciju za

parcijalne proteine, dok oko 13 000 predstavlja transkripte sa prevremenim stop kodonom (eng. nonsense

mediated decay transcripts). Skoro 100 000 preostalih transkripata nema konzervisani otvoreni okvir

čitanja i dužine je od 50 do više od 100 000 nt.

Otkriće pervazivne transkripcije i ogromnog broja nekodirajućih RNK u suprotnosti je sa

tradicionalnim konceptom "viška" DNK po kome najveći procenat genoma nema funkciju. MeĎutim, neki

naučnici i dalje podržavaju takvo shvatanje, a transkripte nastale pervazivnom transkripcijom označavaju

"viškom" RNK.

Slika 19. Pervazivna transkripcija. Plavi kvadrat predstavlja genom, zeleni krug predstavlja deo genoma koji se

transkribuje, dok tamno zeleni krug predstavlja deo genoma koji se transkribuje sa oba lanca. Transkripcijaom

najvećeg dela genoma nastaju duge nekodirajuće RNK (lncRNK). Tamno rozi krug (CDSs) predstavlja sekvence

koje kodiraju proteine, dok svetlo rozi obod (UTRs) predstavlja netranslatirajuće regione. Crne tačke predstavljau

deo genoma koji kodira mikroRNK (miRNK) i male nukleolarne RNK (snoRNK).

Bilo koja eksprimirana RNK duža od 200 nt i baz potencijala da kodira protein (ne sadrži okvir

čitanja) smatra se dugom nekodirajućom RNK (eng. long noncoding RNA, lncRNA). Dužina veća od

200 nt je arbitranrno odreĎena na osnovu eksperimentalne granice u protokolima za prečišćavanje RNK

koji isključuju male molekule RNK. U genomu čoveka za sada je identifikovano oko 13 500 gena za

2

lncRNK koji daju oko 22 500 transkripata (ENCODE, avgust 2012. godina), ali je do danas mali procenat

funkcionalno okarakterisan.

Duge nekodirajuće RNK čija je funkcija vezana za genetičko utiskivanje i doznu kompenzaciju

kod sisara otkrivene su još ranih devedesetih godina prošlog veka. MeĎutim, do otkrića pervazivne

transkripcije, smatrano je da su lncRNK retke i ekskluzivno vezane za alel- i lokus-specifičnu

epigenetičko utišavanje neophodno za doznu kompenzaciju. Današnja saznanja o funkciji lncRNK

ukazuju da one imaju široko zastupljenu regulatornu ulogu u procesima ekspresije genoma na

epigenetičkom, transkripcionom i post-transkripcionom nivou, koju ostvaruju koristeći najrazličitije

mehanizme. Pored toga, poznata je i njihova strukturna uloga u formiranju ribonukleoproteinskih

kompleksa i oblikovanju trodimanzionalne strukture nukleusa. Otkriće ogromnog broja lncRNK u

relativno kratkom vremenskom periodu svakako nadmašuje našu sposobnost da predvidimo sve njihove

funkcije i mehanizme delovanja (slika 31). "Površan uvid u molekularnu biologiju sve većeg broja

lncRNK otkriva pravi "Divlji Zapad" u pogledu njihovih funkcija i mehanizama delovanja, tako da u

godinama koje dolaze treba rešiti ključne probleme u razumevanju ovih veoma intrigantnih molekula" (J.

Lee, Science, 2012).

6.1. Osobine dugih nekodirajućih RNK

6.1.1. Geni za duge nekodirajuće RNK, ekspresija i regulacija ekspresije dugih

nekodirajućih RNK

Pozicija gena u genomu sa kojeg se prepisuje neka duga nekodirajuća RNK označava se u odnosu na gene

za proteine. Na osnovu takve pozicije lncRNK dele se na: intergenske transkripte, transkripte koji se

preklapaju sa genima, ncRNK asocirane sa promotorima (eng. promoter associated ncRNAs) i uzvodnim

promotorskim regionima (eng. promoter upstream ncRNAs), intronske ncRNK, antisense transkripte,

transkripte asocirane sa 3'-UTR-ovima (eng. 3'-UTR associated transcripts), RNK prepisane sa

pojačivača (eng. enhancer RNAs, eRNA), utišivača i izolatora, i bidirekcione transkripte (slika 20).

MeĎutim, mnoge lncRNK ne mogu se svrstati u neku od navedenih kategorija, dok se neke mogu svrstati

u barem dve kategorije.

Slika 20. Genomska organizacija kodirajućih i nekodirajućih transkripata asociranih sa genom PAX6 (eng.

paired box 6). Sekvenca tradicionalno shvaćenog gena (gena za proteine) može biti transkribovana u veći broj

kodirajućih i nekodirajućih i sense i antisense transkripata, što ukazuje da su geni modularno rasporeĎeni duž

molekula DNK.

Procena ENCODE projekta je da se u proseku 10 transkripcionih jedinica preklapa sa svakim

tradicionalnim genom (genom za proteine), a većina njih su lncRNK. Ovakva složenost transkriptoma

ujedno ukazuje da geni nisu linearno organizovani duž molekula DNK (slika 20), već pre modularno,

3

gde odreĎena sekvenca DNK može biti transkribovana u veći broj kodirajućih i nekodirajućih i sense i

antisense transkripata.

Ekspresija i regulacija ekspresije lncRNK nije dovoljno poznata. Većinu lncRNK sintetiše Pol II,

a neke Pol III. Većina lncRNK ima 5'-kapu, a za one koje nemaju nije jasno da li nastaju obradom veoma

dugih transkripta ili imaju neku alternativnu transkripcionu strategiju. Veliki broj nekodirajućih

transkripata se splajsuje, a najveći broj sadrži poli-A rep.

Suprotno molekulima iRNK, koji nakon obrade, lokalizuju u citoplazmi, većina lncRNK

lokalizuje u nukleusu. Mali broj lokalizuje u nukleusu i u citoplazmi, a postoje i one koje selektivno

lokalizuju u citoplazmi. Tkivno-specifičan obrazac ekspresije mnogih lncRNK tokom razvića, precizna

unutraćelijska lokalizacija i često prisustvo u svega nekoliko kopija ukazuju da je njihova ekspresija

izuzetno precizno regulisana. Pokazano je i da miRNK posreduju u regulaciji lncRNK.

6.1.2. Interakcija sa partner-molekulima — analogna i digitalna informacija u dugim

nekodirajućim RNK

Duge nekodirajuće RNK odlikuje izuzetna fleksibilnost i specifičnost u interkacijama sa

partner-molekulima: proteinima, DNK i drugim molekulima RNK. Ova izuzetna "moć" lncRNK vezana

je za posedovanje dve vrste informacija za interakcije. Informacija za interakciju sa proteinima sadržana

je u njihovim sekundarnim i tercijarnim strukturama koje formiraju vezivne-površine za proteine i

označena je kao analogna informacija (slika 21) . Informacija za interakciju sa DNK ili RNK sadržana

je u njihovoj primarnoj strukturu koja omogućava komplementarno bazno sparivanje sa ciljnom

nukleinskom kiselinom i označena je kao digitalna informacija (slika 21).

Slika 21. Duge nekodirajuće RNK (lncRNK) poseduju analognu i digitalnu informaciju za interakcije sa

partener-molekulima. Analogna informacija je sadržana u sekundarnoj i tercijarnoj strukturi RNK i služi za

interkacije sa proteinima. Digitalna infomacija je sadržana u primarnoj strukturi RNK i služi za interakciju sa

specifičnom sekvencom DNK ili RNK.

U poreĎenju sa proteinima, lncRNK su fleksibilnije i specifičnije u interkaciji sa

partner-molekulima (slika 21). Molekuli RNK poseduju raznovrsnije sekundarne strukture i odlikuju se

izuzetno fleskibilnom tercijarnom strukturom, uključujući i mogućnost promene strukture nakon

vezivanja liganda. Ove osobine im omogućavaju da vezuju veći broja različitih kombinatornih proteinskih

kompleksa. Specifičnost lncRNK za nukleinske kiseline vezana je za odsustvo a priori ograničenja u

dužini i kompoziciji digitalne informacije tako da mogu nepogrešivo prepoznati jedinstveno mesto u

Digitalna informacija - primarna struktura RNK je vezivno mesto za nukleinsku kiselinu

Analogna informacija - sekundarna i tercijarna struktura RNK je vezivno mesto za protein

4

genomu. Zbog ove osobine idealne su za lokus- i alel-specifičnu regulaciju. Za razliku od lncRNK,

DNK-vezivni proteini, kao što su transkripcioni faktori, prepoznaju kratke sekvence DNK koje se obično

nalaze na hiljade mesta u genomu i kao takvi deluju u okviru velikih regulatornih mreža i utiču na

(koordinišu) ekspresiju stotina gena istovremeno.

Duge nekodirajuće RNK koje učestvuju u epigenetičkoj regulaciji uglavnom poseduju i analognu

i digitalnu informaciju. One koje učestvuju u post-transkripcionoj regulaciji mogu imati samo digitalnu ili

samo analognu informaciju, dok one koje imaju strukturnu funkciju sadrže samo analognu informaciju.

Nekim dugim lncRNK nije neophodna ni analogna ni digitalna informacija da bi obavile svoju funkciju.

6.1.3. In cis i in trans delovanje dugih nekodirajućih RNK

Na osnovu mesta obavljanja funkcije, lncRNK dele se na one koje deluju in cis i one koje deluju in

trans. Ove dve kategorije lncRNK se fundamentalno razlikuju.

RNK koje deluju in cis funkciju obavljaju na mestu svoje sinteze i direktno deluju na jedan ili

nekoliko kontinuiranih gena. Eksprimiraju se u malom broju kopija, imaju kratak poluživot i precizno

regulisanu ekspresiju. Neke od njih funkciju obavljaju još tokom svoje sinteze. Brza degradacija nakon

terminacje transkripcije sprečava njihovu difuziju i delovanje na druga mesta. Uglavnom deluju kao

molekuli vodiči (na primer, pRNK ili Xite RNK).

RNK koje deluju in trans difunduju sa svog mesta sinteze i direktno deluju na udaljene gene,

uključujući i gene na drugim hromozomima. Neke od njih vrše in trans usmeravanje, kada kao molekuli

vodiči usmeravaju proteinske komplekse na specifično, udaljeno mesto u genomu (na primer, HOTAIR

RNK). Neke od njih deluju kao tipični trans faktori, slično proteinima ili miRNK, i kao takve postaju

deo globalnih regulatornih mreža (na primer, Alu RNK).

6.1.4. Modeli ostvarivanja funkcija dugih nekodirajućih RNK

Na osnovu modela koji opisuje kako obavljaju funkcije, lncRNK dele se na molekule vodiče,

molekule pojačivače, molekule spone i molekule mamce (slika 22).

Molekuli vodiči su lncRNK koje uspostavljaju direktne interakcije sa DNK na odreĎenom mestu

u genomu, in cis ili in trans, i istovremno asembliraju proteinske komplekse. Obično regrutuju proteinske

komplekse za promenu strukture hromatina, vršeći epigenetičku regulaciju, ili transkripcione aktivatore,

kada su uključene u transkripcionu regulaciju. Duge nekodirajuće RNK koje, takoĎe, regrutuju proteinske

komplekse na odreĎenom mestu u genomu, ali se za DNK vezuju posredstvom DNK-vezivnog proteina,

označavaju se kao molekuli adapteri.

Molekuli pojačivači su lncRNK prepisane sa intergenskih regiona koje in cis regrutuju proteine

za uspostavljanje interakcije sa udaljenim mestom u genomu, dovodeći do savijanja DNK i lokalnog

formiranja hromatinske petlje. One istovremeno regrutuju komplekse za promenu strukture hromatina,

tako da se njihovo delovanje širi na celu hromatinsku petlju (eng. spreading effect). Prema svojim

sposobnostima da promene lokalnu strukturu hromatina i prošire svoj efekat na sve gene u hromatinskoj

petlji, podsečaju na klasične pojačivače. Duge nekodirajuće RNK prepisane sa intergenskih regiona,

mogu in cis delovati i kao molekuli utišivači ili izolatori. Takve lncRNK, po istom principu kao i

molekuli pojačivači, regrutovanjem odgovarajućih proteina menjaju trodimenzionalnu strukturu

5

hromatina formiranjem ili sprečavanjem formiranja hromatinske petlje, i istovremenim regrutovanjem

epigenetičkih kompleksa koji šire svoj efakt na gene u okviru hromatinske petlje. Ovakvo delovanje

lncRNK ukazuje da one mogu biti ključni igrači u organizovanju hromatinskih domena

(trodimenzionalne strukture hromatina) kako bi epigenetički koordinisale aktvnost udaljenih gena.

Slika 22. Modeli po kojima duge nekodirajuće RNK (lncRNK) ostvaruju funkcije. Molekuli mamci vezuju

DNK-vezivne proteine (na primer, transkripcione faktore) onemogućavajući njihovu interkaciju sa DNK. Molekuli

spone povezuju dva li više proteina u ribonukleoproteinski kompleks ili dovode dva ili više proteina u neposrednu

blizinu. Molekuli vodiči asembliraju (regrutuju) proteinske komplekse (na primer, proteinske komplekse za

promenu strukture hromatina) na odreĎenom mestu u genomu (in cis ili in trans), kroz direktnu interakciju sa DNK.

Ukoliko interakciju sa DNK uspostavljaju posredstvom proteina vezanog za DNK, označavaju se kao molekuli

adapteri. Molekuli slični pojačivačima regrutuju proteinske komplekse za promenu strukture hromatina i proteine

koji uspostavljaju interakcije sa odreĎenim udaljeim mestom u genomu dovodeći do savijanja DNK i formiranja

hromatinske petlje. Oni obično deluju in cis, ali ispoljavaju efakta na celu hromatinsku petlju (eng. spreading effect).

Molekuli mamci vezuju DNK-vezivne proteine (na primer, transkripcione faktore)

onemogućavajući njihovu interkaciju sa DNK. TakoĎe, mogu vezivati miRNK i RNK-vezive proteine

onemogućavajući njihovu interakciju sa ciljnim transkriptima, kada se označavaju kao endogeni sunđeri.

Molekuli mamci deluju kao trans faktori.

Molekuli spone povezuju dva li više proteina u ribonukleoproteinski kompleks ili dovode dva ili

više proteina u neposrednu blizinu, i obično imaju strukturnu ulogu.

Prethodno navedeni modeli podrazumevaju da same lncRNK imaju tačno odreĎenu ulogu u

ragulaciji ekspresije gena. MeĎutim, meĎusobna veza izmeĎu lncRNK i procesa koje kontrolišu je

složenija i uključuje primere kada je proces transkripcije lncRNK, a ne sama lncRNK, bitan za

regulaciju transkripcije ciljnih gena. Na primer, kaskadna transkripcija uzvodno od nekog promotora

služi progresivnom otvaranju strukture hromatina kako bi se povećala dostupnost transkripcionim

faktorima i RNK polimerazi i inicirala transkripcija nizvodnog gena. TakoĎe, sama transkripcija neke

molekul vodič i molekul adapter molekul (in cis i in trans delovanje)

molekul pojačivač (in cis delovanje sa efektom širenja)

molekul spona molekul mamac

6

lncRNK može omatati transkripciju ciljnog gena, što predstavalja jedan oblik transkripcione

interferencije. Transkripciona interferencija se široko definiše kao ometanje jedne transkripcione

jedinice drugom, i ostvaruje se najrazličitijim mehanizmima (videti kod Transkripcione regulacije dugim

nekodirajućim RNK).

6.2. Dozne kompenzacije i duge nekodirajuće RNK

Duge nekodirajuće RNK imaju važnu, ako ne i ključnu, ulogu u epigenetičkoj regulaciji. Godine 1991.

otkrivena je Xist RNK i njena uloga u inaktivaciji X hromozoma kod ženki sisara, što je prvi put ukazalo

da molekuli RNK imaju potencijal da regulišu alel- i lokus-specifične epigenetičke promene in cis.

Godine 2002. otkriveno je da su lncRNK ključni "igrači" u alel- i lokus-specifičnom utišavanju utisnutih

gena. Danas je prepoznato da lncRNK imaju potencijal za bilo koju lokus-specifičnu epigenetičku

regulaciju in cis ili in trans kod velikog broja eukariotskih organizama, što ukazuje da je ova njihova

funkcija konzervisna bez obzira na činjenicu da same lncRNK ne moraju biti konzervisane. Epigenetička

funkcija lncRNK je vremenski i prostorno regulisana. Glavne osobine koje lncRNK daju prednost u

odnosu na transkripcione regulatore u epigenetičkoj regulaciji su sposobnost usmeravanja kompleksa

za promenu strukture hromatina na jedinstveno mesto u genomu (obezbeĎena digitalnom inrmacijom) i

veća fleskibilnost u interkaciji sa proteinima (obezbeĎena analognom informacijom).

Dozna kompenzacija podrazumeva utišavanje jedne kopije gena, tako da se geni koji podležu

ovom fenomenu eksprimiraju samo sa jedne od dve pristne kopije u genomu. Procesi koji uključuju

doznu kompenzaciju su genetičko utiskivanje i inaktivacija X hromozoma kod ženki sisara.

Genetičko utiskivnje (eng. genetic imprinting) je fenomen da sa neki geni eksprimiraju samo sa

jednog od dva roditeljska alela. Utisnuti geni su grupisani u domene i koordinisano su in cis regulisani

kontrolnim regionom za utiskivanje (eng. imprintng control region, ICR). Inaktivacija X hromozoma

je nasumično utišavanje jednog od dva X hromozma u ćelijama ženki sisara. Slično utisnutim genima,

kontrolisana je jednim kontrolnim regionom, X inaktivacionim centrom (Xic), a celi X hromozom, sa

skoro više od 1 000 gena za proteine, predstavlja jedan domen koji se transkripciono utišava. Za

utiskivanje gena i inaktivaciju X hromozoma zajednički su: dugotrajni epigenetički efekat, koji

uspostavljaju kontrolni regioni, i alelska priroda regulatornih procesa (inaktivacija samo jednog od dva

roditeljska alela, odnosno jednog od dva X hromozoma). Regulatorne RNK kodirane sa Xic i ICR, su

ključne za regulaciju utisnutih domena i inaktivaciju X hromzoma. One služe kao platforma za

regrutovanje proteina koji uvode alel-specifične epigenetičke promene. Deluju po modelu molekula

vodiča in cis ili preko transkripcione interferencije.

Inaktivacija X hromozoma dešava se u ranom embrionalnom razviću na stadijumu od 32 do 64

ćelije, a izbor koji će se X hromozom inaktivirati je nasumičan – u nekim embrionalnim ćelijama se

inaktivira X hromozom poreklom od oca, a u drugim X hromozom poreklom od majke. Jednom kada se u

datoj ćeliji selektuje koji će X hromozom biti neaktivan, ista kopija hromozoma ostaje neaktivana u svim

njenim potomcima. Kao posledica nasumične inaktivacije jednog X hromozoma ženke sisara su mozaici –

neke njihove ćelije esprimiraju gene sa majčinog, a neke sa očevog X hromozoma.1

1 Nasumična inaktivacija jednog X hromozoma obično ima male posledice na fenotip, ali u slučaju X-vezanih

bolesti može uticati na težinu simptoma u zavisnosti kolika je proporcija ćelija u kojima se eksprimira mutirani gen.

Očigledinij primer za ovu vrstu mozaičnosti ženski sisara je trobojna (eng. calico ili tortoiseshall) mačka. Jedan od

7

Inaktivacija jednog X hromozoma počinje u Xic, odakle se širi na celi hromozom, koji postaje

obogaćen markerima heterohromatina. Xic sadrži najmanje sedam gena za lncRNK čije su ekspresije

meĎusobno složeno i precizno regulisane, ali glavni "glasnik" inaktivacije je Xist RNK. Ona se

intenzivno transkribuje samo sa budućeg neaktivnog X hromozoma, širi se duž njega (eng. coating) i

regrutuje proteinski kompleks PRC22 i druge faktore koji modifikuju i kondenzuju hromatin (dodati

sliku). Jednom kada je došlo do inaktivacije hromozoma, Xist RNK više nije potrebna, jer nalseĎivanje

modifikacija hromatina obezbeĎuje da se inaktivacija istog X hromozoma dešava u svim potomcima

jedne ćelije.

Godine 2002. godine opisana je prva autozomna lncRNK sa funkcijom utišavanja — Airn

lncRNK (eng. antisense to Igf2r RNA non-coding). Airn lncRNK se prepisuje sa očevog hromozoma i

kontroliše utišavanje očeve kopije gena Igf2r (eng. insulin-like growth factor type 2 receptor) i još

najmanje tri susedna gena koji pripadaju utisnutom domenu Igf2r. U transkripciono neaktivnom alelu

utisnutih domena, transkripciono je aktivan samo gen za lncRNK koja kontroliše njegovo utišavanje.

Godine 2012. dokazano je da Airn utišava Igf2r posredstvom transkripcione interferencije:

proces transkripcije gena Airn, a ne sama Airn lncRNK, odgovoran za transkripciono utišavanje domena

Igf2r (dodati sliku). Gen za Airn ima antisense orijentaciji u odnosu na utisnuti gen Igf2r i preklapa se sa

njegovim promotorom. Model transkripcione interferencije za delovanje Airn lncRNK predivĎa da

aktivnost jakog promotora sa koga se prepisuje Airn ometa aktivnost slabijeg promotra za Igf2r, a

pokrenuta transkripcija gena Airn kroz promotor gena Igf2r onemogućava formiranje incijacionog

kompleksa Pol II na ovom promotoru. Utišavanje Igf2r zahteva kontinuiranu ekspresiju Airn lncRNK, sve

dok se ne uspostavi metilacija promotora Igf2r. Od tog trenutka Airn lncRNK više nije potrebna za

utišavanje Igf2r.

Delovanje posredstvom transkripcione interferencije, a ne same lncRNK, objašnjava neke

neobične karakteristike Airn lncRNK, kao što su odsustvo splajsovanja (za razliku od Xist RNK), izuzetna

nestabilnost, i obogaćenost ponovljenim elementima. Ovaj mehanizsam ujedno objašnjava i prisustvo

hetrohromatinskog regiona ograničenog samo na promotrski region Igf2r i podvlači značaj metilacije

DNK u održavanju utišavanja posredovanog sa lncRNK. Smatra se da bi mnoge druge lncRNK svoj

efekat u epigenetičkom utišavanju mogle ostvarivati putem transkripcione interferencije.

Kcnqot1 je utisnuti gen za lncRNK i transkribuje se sa očevog alela i posreduje u utišavanju

očeve kopije gena KCNQ1 (eng. potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily). Gen za Kcnqot1

ima antisense orijantaciju u odnosu na gen KCNQ1 i preklapa se sa njegovim kodirajućim regionom.

Ekspresija Kcnqot1 lncRNK, slično kao Xite, posreduje u utišavanju ekspresije gena KCNQ1, kada kao

molekul vodič in cis regrutuje represivni proteinski kompleks PRC2 i metiltransferazu G9A (poznatu i

gena na X hromozomu odreĎuje boju krzna i ima dva alela, od kojih jedan odreĎuje narandžasto-braon boju krzna, a

drugi crnu. Kod mački koje su heterozigoti za ovaj gen, različiti obrasci narandžasto-braon i crnih regiona krzna

sastoje se iz ćelija u kojima su različiti X hromozomi inaktivirani. Ovo objašnjava zašto su sve trobojne mačke

ženke. Bela boja krzna je determinisana autozomnim genima. 2 PRC2 (eng. polycomb chromatin remodelling complex 2), zajedno sa PRC1, pripada PcG proteinima

(eng. polycomb-group proteins). PRC2 je kompleks histon-metiltransferaza, koje pre svega uvode H3K27me3, što je

karakterističan "potpis" transkripciono utišanog hromatina. Neophodan je za incijalno zaključavanje odreĎenog

regiona genoma, dok kompleks PRC1 stabilizuje utišavanje i obezbeĎuje "memoriju" za održavanje represivnog

hromatina nakon ćelijske deobe.

8

kao EHMT2). Utišavanje obuhvata još najmanje šest susednih gena, koji zajedno sa genom KCNQ1 čine

utisnuti domen KCNQ1.

6.3. Epigenetička regulacija ekspresije genoma dugim nekodirajućim RNK

Za veliki broj lncRNK, identifikovanih nakon analiza transkriptoma, pokazano je da vrše lokus-specifično

epigenetičko utišavanje, slično lncRNK uključenim u doznoj kompenzaciji (na primer, Xite i Kcnqot1).

Pretraživanje blizu 3 300 konzervisanih i intergenskih lncRNK pokazalo je da čak 38% stupa u

interkaciju sa kompleksima za uvoĎenje represivnih oznaka hromatina. MeĎutim, lncRNK mogu

regrutovati i komplekse koji uvode aktivan hromatin.

U epigenetičkoj regulacji lncRNK deluju in cis ili in trans kao molekuli vodiči ili in cis kao

molekuli pojačivači. Vezivni domeni za proteine u lncRNK (analogna informacija) predstavljaju

začetnike u asembliranju kombinatornih epigentičkih kompleksa na tačno odreĎenom mestu u genomu,

koje se prepoznaje kroz komplementarno sparivanje lncRNK (digitalna informacija) sa DNK ili rastućim

transkriptom.

Većina lncRNK regrutuje epigenetičke proteinske komplekse posredstvom RNK-vezivnih

proteina (slika 23). Posredovanje RNK-vezivnih proteina u interakciji lncRNK sa proteinskim

kompleksima dodatno povećava fleksibilnost mreže lncRNK-proteini u regulaciji ekspresije genoma. Sa

jedne strane, RNK-vezivni proteini prepoznaju veći broj ciljnih molekula RNK jer mogu kombinatorno

koristiti svoje RNK-vezivne domene. Sa druge strane, strukturna fleksibilnost molekula RNK omogućava

da veći broj RNK ima ista vezivna mesta za neki RNK-vezivni protein koja su različito rasporeĎena.

Interakcija dugih ncRNK sa regulatornim proteinskim kompleksima posredovana RNK-vezivnim

proteinima verovatno je opšte pravilo za epigenetičku regulaciju strukture hromatina.

Slika 23. Ekspresioni program genoma zajedno regulišu mreže dugih nekodirajućih RNK (lncRNK) sa

proteinima i mreže DNK-vezivnih elemenata sa proteinima. Regulatorne mreže lncRNK-proteini obezbeĎuju

fleksibilnu platformu koja deluje kao senzor različitih signala, nakon čega integrišu aktivnost velikog broja

regulatornih kompleksa na jedinstvenom mestu u genomu. Neke lncRNK direktno vezuju regulatorne proteinske

komplekse, dok ih većina vezuje posredstvom RNK-vezivnih proteina. DNK-vezivni proteini, kao što su

9

transkripcioni faktori, prepoznaju kratke motive DNK koji se obično nalaze na hiljade mesta u genomu i kao takvi

deluju u okviru velikih regulatornih mreža utičući na ekspresiju stotina gena istovremeno.

Uloga lncRNK u epigenetičkoj regulaciji objašnjava paradoks vezan za postojanje malog

repertoara kompleksa za promenu strukture proteina koji, uz to, pokazuju malu specifičnost za sekvencu

DNK, a ipak odreĎuju složene i precizno regulisane promene strukture hromatina na odreĎenom mestu u

genomu tokom razvića, kao i u odgovoru na signale koje ćelija prima.

Mreže lncRNK-proteini predstavljaju fleksibilnu platformu i deluju kao senzori različitih

signala u ćeliji (fizioloških signala i signala tokom razvića) i integratori aktivnosti velikog broja

regulatornih kompleksa na jedinstvenom mestu u genomu (slika 23). Mreža lncRNK-proteini zajedno

sa mrežom DNK-vezivni elementi-transkripcioni faktori, koja ima globalniji efekat (koordiniše ekspresiju

velikkog broja gena), reguliše ekspresioni program genoma (slika 23).

6.3.1. Utišavanje gena dugom nekodirajućom RNK asociranom sa promotorom

Geni za rRNK, označeni i kao rDNK, kod sisara se sastoje od tandemski ponovljenih modula. Moduli su

sastavljeni iz dugog intergenskog graničnika (IGS, ~30 kb) i transkripcione jedinice za pre-rRNK (~14

kb). Nivo transkripcije rDNK je čvrsto regulisan u skladu sa potrebama ćelije za sintezom proteina.

Približno polovina od nekoliko stotina modula rDNK je transkripciono aktivna, odlikuje se otvorenom

euhromatinskom strukturom i formira nukleolusne organizatore. Transkripciono neaktive kopije odlikuje

hetrohromatinska struktura i lokalizuju u perinukleolarnom regionu.

Važnu ulogu u epigenetičkoj regulaciji rDNK ima lncRNK nazvana pRNK. Duga je 150-250 nt i

transkribuje se sa promotra za transkripcionu jedinicu rDNK, koji je lociran u IGS-u. pRNK deluje in cis

kao molekul vodič: utišava kopije rDNK formiranjem specifične strukture drška-petlja koja regrutuje

nukleolusni kompleks za remodelovanje (eng. nucleolar remodeling complex, NoRC) na promotor

transkripcione jedinice rDNK (slika 24). NoRC dovodi do promene u pozicioniranju nukleozoma u

promotorskom regionu i deluje kao spona u koordinaciji aktivnosti drugih proteinskih kompleksa koji

"pišu" represivne histonske oznake i metiluju DNK, kako bi se uspostavio heterohromatin. TakoĎe,

tripleks strukturu DNK-RNK, koju formira pRNK sa ciljnom DNK, specifično prepoznaje DNK

metiltransferaza (DNMT3b) kako bi se uspostavila de novo metilacija CpG u promotrskom regionu.

Opisani epigenetički mehanizmi deluju na nivou promotora svake transkripcione jedinice rDNK koja se

zaključava.

Slika 24. Duga nekodirajuća RNK (lncRNK) in cis regrutuje kompleks za modifikaciju N-krajeva histona.

Epigenetičko utišavanje neaktivnih transkripcionih jedinica rDNK incirano sa lncRNK koja deluje in cis. pRNK se

10

transkribuje sa promotora neaktivnih transkripcionih jedinica rDNK i in cis kao molekul vodič regrutuju nukleolusni

kompleks za remodelovanje (NoRC) i de novo DNK metil-transferazu, koji dalje posreduju u epigenetičkom

utišavanju.

6.3.2. Duga nekodirajuća RNK in cis regrutuje RNK-vezivni protein

CCND1 lncRNK se prepisuje sa uzvodnog regiona u odnosu na promotor gena za ciklin D1 (CCDN1)

(slika 25). Duga je nekoliko stotina bp i zastupljena je u svega dve do osam kopija po ćeliji. Pojačano se

eksprimira u uslovima odgovora na genotoksični stres (oštećenja DNK), što reprimira transkripciju gena

za ciklin D1.

CCND1 lncRNK deluje in cis kao molekul vodič: regrutuje RNK-vezivni protein TLS (eng.

translocated in liposarcoma), koji stupa u interakciju sa kompleksom p300/CBP i istovremeno inaktivira

njegovu histon-acetil transferaznu aktivnost. Rezultat ovih interkacija je uspostavljanje hipoacetilovanog

hromatina i reprimiranje transkripciju gena za ciklin D1 (slika 25). Pored toga, CCND1 lncRNK, izgleda,

olakšava i vezivanje kompleksa PRC2 i PRC1, bitnih za represiju promotora gena CCND1 (slika 25).

Slika 25. Duga nekodirajuća RNK (lncRNK) in cis regrutuje RNK-vezivni protein, koji dalje posreduje u

regrutovanju epigenetičkih kompleksa.CCDN1 lncRNK in cis regrutuje RNK-vezivni protein TLS. C-kraj

proteina TLS sadrži RNK-vezivne domene, dok N-kraj sadrži regione bogate glutaminom i odgovoran je za

interakciju sa kompleksom p300/CBP. Njhovom interakcijom inhibira se histon acetil-transferaznu aktivnost

p300/CBP, čime se indukuje hipoacetilaciju gena za ciklin D1. CCND1 lncRNK, izgleda, olakšava i vezivanje

kompleksa PRC2, koji reprimira promotor gena za ciklin D1.

6.3.3. Duga nekodirajuća RNK in trans regrutuje kompleks za modifikaciju N-krajeva

histona

Geni HOX kontrolišu anteriorno-posteriornu osu i segmentalnu duplikaciju tokom razvića. U genomu

čoveka su organizovani u četri klastera, označena kao A, B, C i D, smeštena na različitim hromozomima.

U okviru četri klastera gena HOX indentifikovano je 230 lncRNK, čija je ekspresija precizno i

sekvencijalno regulisana tokom razvića. One definišu hromatinske domene sa različitom strukturom i

dostupnošću RNK polimerazi, regulišući tako transkripciju gena HOX tokom razvića.

HOTAIR RNK (eng. HOX transcript antisense RNA) je duga oko 2,2 kb i transkribuje se sa

HOXC klastera. Ona dovodi do transkripcionog utišavanja klastera HOXD delujujući in trans kao

11

molekul vodič: regrutuje represivni kompleks za modifikaciju histona PRC2 (eng. polycomb chromatin

remodelling complex 2) i usmerava ga ka klasteru HOXD (slika 26), gde on uvodi karakterističan "potpis"

(H3K27me3) transkripciono utišanog hromatina. HOTAIR RNK takoĎe regrutuje LSD1 (Lys specifična

demetilaza 1) koja uklanja H3K4me2, oznaku aktivnog hromatina. Globalne analize ukazuju da veliki

broj drugih lncRNK takoĎe vezuju PRC2 i LSD1.

Region klastera HOXA sa kojeg se prepisuje HOTAIR RNK predstavlja utišivač (eng. silencer) i

danas postoje brojni primeri da ovi regulatorni regioni, kao i pojačivači (videti kod transkripcione

regulacije sa lncRNK), svoju funkciju u regulisanju transkripcije upravo ostvaruju posredstvom

nekodirajućih RNK koje se prepisuju sa njih.

Slika 26. Duga nekodirajuća RNK (lncRNK) in trans regrutuje kompleks za modifikaciju N-krajeva histona .

HOTAIR RNK se sintetiše sa klastera HOXC na hromozomu 12, i in trans kao molekul vodič reprimira ekspresiju

gena klastera HOXD na hromozomu 12 regrutovanjem PRC2, koji uvodi H3K27me3 oznaku represivnog hromatina.

Sekvencijalna epigenetička regulacija klastera gena HOX posredovana je velikim brojem lncRNK koje deluju in

trans.

6.3.4. Duga nekodirajuća RNK kao pojačivač (RNK pojačivač, RNKe)

HOTTIP RNK (eng. HOXA transcript at the distal tip) je lncRNK dužine 3,7 kb koja se transkribuje sa

antisense lanca intergenskog regiona uzvodno od 5'-kraja klastera HOXA i koordiniše aktivaciju nekoliko

gena u ovom regionu. Ona deluje in cis kao molekul pojačivač. HOTTIP RNK regrutuje proteine koji

menjaju trodimenzionlanu strukturu hromatina indukovanjem formiranja hromatinske petlje (slika 21).

Formirana hromatinska petlja dovodi HOTTIP RNK u neposrednu blizinu ciljnih gena, kada ona direktno

vezuje adaptorni protein WDR5 iz kompleksa WDR5/MLL (eng. mixed lineage leukemia). MLL uvodi

"potipis" aktivnog hromatina (H3K4me3) i širi ga na gene u okviru petlje, čime se aktivira njihova

transkripcija.

6.3.5. Duge nekodirajuće RNK i metilacija DNK

Mnogi geni imaju antisense transkripte koji dovode do utišavanje ekspresije sense transkripta. Antisense

transkripti često omogućavaju RNK posredovanu epigenetičku regulaciju specifičnu za dati gen, koja se

ostvaruje metilacijom ili demetilacijom DNK(slika 27).

Tumor supresorni gen P15 je veoma često utišan kod malignih bolesti (na primer, leukemija)

usled hipermetilacije. Antisense transkript gena P15 je lncRNK dužine ~200 nt, označena kao P15AS.

Suprotni obrasci ekspresije P15 i P15AS kod leukemija ukazuju da bi P15AS mogla da posreduje u

12

epigenetičkom utišavanju P15 gena u malignim ćelijama kroz lokalnu promenu strukture hromatina i

metilaciju DNK. Mnogi drugi tumor supresorni geni čija je ekspresija epigenetički utišana u malignim

ćelijama, takoĎe, poseduju antisense transkripte i mogli bi biti regulisani istim mehanizmom.

Slika 27. Antisense RNK indukuju metilaciju DNK i histona u promotoru sense transkripta.

KHPS1 je antisense lncRNK koja se transkribuje sa regulatornog regiona za sense transkript

SPHK1 (eng. sphingosine kinase 1), a njena prekomerna ekspresija dovodi do demetilacije CpG, koja

koreliše sa ekspresijom Sphk1.