49269001 APOSTILA Fundamentos de Lab Oratorio

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA CURSO TCNICO EM BIOTECNOLOGIA

Fundamentos de Laboratrio

Jlio Xandro Heck Jane Elisabete Marques de Almeida Caon

Porto Alegre, 2006

OS AUTORESJlio Xandro Heck formado em Qumica Industrial de Alimentos, Mestre em Microbiologia Agrcola e do Ambiente (nfase em Tecnologia de Bioprocessos) pela UFRGS e Doutor em Biologia Celular e Molecular (nfase em Biotecnologia) pela UFRGS. Foi bolsista de Ps-doutorado do CNPq e atualmente professor na Escola Tcnica da UFRGS. Jane Elisabete Marques de Almeida Caon formada em Biologia, Especialista em Programas de Sade e Mestre em Ecologia pela UFRGS. Professora na Escola Tcnica UFRGS.

APRESENTAOEste manual foi desenvolvido com o objetivo de servir como guia bsico para o desenvolvimento do Componente Curricular de Fundamentos de Laboratrio, oferecido para o Curso Tcnico em Biotecnologia, da Escola Tcnica da UFRGS. No nossa inteno fornecer ao aluno subsdios para a realizao de todas as operaes utilizadas em laboratrios de Biotecnologia e nem permitir a utilizao eficiente de qualquer equipamento disponvel, pois esta tarefa seria extremamente extensa e, provavelmente, no teramos sucesso. No entanto, esperamos que a nossa obra sirva de orientao geral para o desenvolvimento das atividades cotidianas do Tcnico em Biotecnologia e torne mais fcil o desempenho de suas atividades profissionais.

Os autores

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professor: Charley Christian Staats

Aula 1: NOES BSICAS DE BIOSSEGURANA ACIDENTES COM SUBSTNCIAS QUMICAS E PRIMEIROS SOCORROS Orientaes gerais sobre comportamento em um laboratrio de Biotecnologia 1. Ao entramos em um laboratrio (de qumica, bioqumica, microbiologia, etc) devemos sempre colocar o jaleco (avental, guarda p, etc). Este procedimento IMPRESCINDVEL. No devemos tolerar que pessoas circulem pelo laboratrio sem a vestimenta adequada. Obviamente, o jaleco deve ser limpo e adequado para a funo. 2. No coloque lanches, cigarros e outros materiais sobre as mesas do laboratrio, pois elas podem estar contaminadas com produtos corrosivos ou txicos . 3. Mantenha seu lugar de trabalho em perfeito estado de limpeza e evite obstculos inteis na sua bancada de trabalho. 4. expressamente proibido fumar no ambiente de laboratrio. 5. Nunca use tubos de vidro com as bordas cortantes, mesmo em caso de urgncia. Vidro trincados jamais devem ser usados. 6. No faa fora sobre o vidro. 7. Lubrifique os tubos de vidro para introduzi-los nas rolhas. No caso de rolhas de borracha, use glicerina como lubrificante.

7. Proteja suas mos com luvas de couro ao colocar rolhas em um tubo. 8. Os frascos com amostras contaminadas com soluo cida, soda custica ou outros materiais corrosivos devem ser lavados com gua aps serem usados. 9. Vidros quebrados devem ser jogados em recipientes prprios e nunca despejados no lixo comum. 10. Ao sifonar ou pipetar lquidos, NUNCA FAA ISSO COM A BOCA, use pipetadores apropriados. 11. Materiais txicos ou volteis devem ser manipulados em local apropriado (capela de exausto). Na falta desta, fazer esse procedimento ao ar livre, fora do laboratrio, tomando as devidas precaues. 12. Amostras e produtos qumicos em recipientes sem rtulos na devem ser usados. 13. Amostras quentes devem ser identificadas como tal. 14. Roupas contaminadas devem ser trocadas imediatamente. 15. O bico de Bunsen deve ser usado somente em lugares isentos de inflamveis ou explosivos. 16. Coloque os recipientes contendo produtos em seus lugares apropriados, isso evitar erros na anlise e possveis acidentes. 17. Jogue o lixo nos locais adequados. 18. No caso de diluies, DERRAME SEMPRE O CIDO NA GUA E NO a gua no cido. 19. Evite tocar em produtos que no conhece. 20. No procure, com fins recreativos, misturar reativos e produtos sem saber o que vai acontecer. 21. Evite respirar vapores e fumaas. 22. Rotule os recipientes antes de ench-los. 23. No beba gua, caf, leite, refrigerantes, etc, em locais que sejam apropriados (bqueres, por exemplo). 24. No jogue na pia lquidos corrosivos ou inflamveis que no tenham sido previamente diludos. 25. Se, por acaso, quebrar um frasco de vidro, no apanhe os estilhaos com as mos. Use uma escova ou vassoura.

26. REDOBRE SUA ATENO QUANTO ESTIVER FAZENDO ALGUM EXPERIMENTO NO LABORATRIO, POIS S ASSIM PODER INTERPRETAR CORRETAMENTE OS RESULTADOS E GARANTIR A SUA SEGURANA E A DE TODOS QUE ESTIVEREM NO LABORATRIO.

Acidentes com substncias qumicas e primeiro socorros Vale a pena lembra que dever de todos o conhecimento dos riscos dos produtos qumicos que esto sendo manipulados no laboratrio. Os procedimentos gerais, em caso de acidentes, esto listados a seguir: Derramamento de cidos e bases: CIDOS: antes de lavar com gua correto adicionar Ca(OH) 2 (hidrxido de clcio). BASES: adicionar NAHSO4 (bissulfato de sdio). Respingos de produtos qumicos sobre a pele e mucosas: 1. Lavar com gua corrente em abundncia, sem esfregar a superfcie afetada, at que seja removido o componente qumico em contato com a pele ou a mucosa. 2. Retirar as roupas da pessoa e tomar cuidado para no se contaminar neste processo. Lavar as roupas separadamente, antes de usar.

3. Procurar atendimento mdico, se necessrio.

Respingos sobre os olhos 1. Lavar os olhos com gua corrente em abundncia, forando levemente as plpebras, assegurando que a gua banhe-os totalmente. 2. Todos os acidentes causados por agentes qumicos que envolvam os olhos devem receber cuidados mdicos.

Inalao de gases 1. Remover imediatamente a pessoa do local e afrouxar as roupas. 2. Se a vtima estiver inconsciente, deite-a e verifique a respirao. Se a respirao estiver parada, inicie respirao artificial. 3. Procure assistncia mdica. Ingesto 1. Se o ocorrer o contato de qualquer produto qumico com a boca, enxge com bastante gua, tomando cuidado para no engolir. Se o composto qumico foi ingerido, beber gua para dilu-lo no estmago. 2. No induzir vmito. 3. Transportar a vtima para o centro mdico mais prximo. O tratamento dos diferentes tipos de intoxicao baseia-se, fundamentalmente, em terminar a exposio do organismo substncia, promover a excreo, empregar antdotos ou antagonistas da substncia qumica e, se esta for ingerida, aplicar medidas de sustentao. A seguir esto apresentados alguns antdotos e suas aplicaes.Antdoto Acetato de amnio (soluo 61,5%) para lavagem gstrica cido actico 1% Hidrxido de clcio (soluo 0,14%) para administrao oral Amido de milho (80 g/L) Indicado para acidentes com: Formaldedo

Hidrxidos cidos

Iodo


Aula 2: INSTRUMENTOS E MATERIAIS DE LABORATRIO - Agarradores: Utilizados para segurar buretas, bales, erlenmeyers, condensadores e funis nos suportes.

- Argola: Suporte para funil de separao, funil simples, tela de amianto e frascos que so coletados sobre a tela de amianto quando aquecidos.

- Balana analtica: Instrumento usado para determinao de massas de reagentes. As balanas analticas possuem preciso de 0,0001 g.

- Balo de fundo chato: Empregado para aquecimento ou armazenamento de lquidos ou soluo.

- Balo volumtrico: Balo de fundo chato e gargalo comprido, calibrado para conter determinados volumes lquidos. Possui um trao de referncia, que marca o volume exato. Utilizado na preparao de solues de concentraes conhecidas.

- Basto de vidro: um basto de vidro macio utilizado para agitaes e para auxiliar na transferncia de lquidos de um recipiente para outro (direcionador de fluxo).

- Bquer (becker): Recipiente de vidro utilizado para aquecer substncias, recolher filtrados, fazer decantaes, misturar reagentes, preparar solues e realizar reaes.

- Bico de Bunsen: Bico de gs especialmente construdo para usos em laboratrios. Utilizado para aquecimento at temperaturas de 800C. Alm deste, utilizam-se outros mtodos de aquecimento em laboratrio: banho-maria e banho de leo.

Como utilizar o bico de bunsen: 1. abrir a chave geral de gs do laboratrio. 2. abrir a vlvula do registro de gs individual de cada bico (ele est localizado, geralmente, prximo do bico). 3. verificar se a entrada de ar do bico est aberta. Com ela fechada no possvel ligar o bico. 4. girar a vlvula que liga efetivamente o bico e, com auxlio de um isqueiro ou de palitos de fsforo, acender o bico. A altura da chama pode ser controlada atravs do controle da entrada de ar. Para desligar: desligar a vlvula do registro de gs (item 2), desligar o bico (item 4).

- Bureta: Serve para dar escoamento a volumes variveis de lquidos. No deve ser aquecida. constituda de tubo de vidro uniformemente calibrado, graduado em dcimos de mililitro. Na parte inferior possui uma torneira. utilizada para titulaes.

- Cadinho de porcelana: Pequeno recipiente de porcelana que resiste a altas temperaturas (>1000C). Utilizado em calcinaes, eliminao de substncias orgnicas, secagens, aquecimentos e fuses.

- Dessecador: Recipiente de vidro ou porcelana, inteiramente fechado e vedado, que contm em sua parte inferior uma substncia capaz de absorver gua. usado para conservao de slidos ou mesmo lquidos, no estado seco, para preserv-los da umidade. Tambm usado para resfriamento de substncias em atmosfera contendo baixo teor de umidade.

- Erlenmeyer: Recipiente de vidro utilizado para aquecer e cristalizar substncias, especialmente quando estas precisarem ser agitadas. utilizado tambm em titulaes e para recolher filtrados. Alm dessas aplicaes amplamente utilizado em microbiologia, para o crescimento de microrganismos e para o preparo de meios de cultura.

- Esptula: Utilizada para retirar reagentes slidos de frascos. Pode ser de porcelana, plstico ou metal.

- Estantes para tubos de vidro: Suporte de madeira ou metal, de vrios tamanhos, para tubos de ensaios.

- Frasco lavador (pisseta): Frasco de plstico com tampa. So utilizados para lavagem de precipitados, cristais, gases, etc. Pode conter gua destilada, gua acidificada, etanol, acetona, hidrxido de sdio.

- Funil de separao: Recipiente de vidro, em forma de pra, que possui uma torneira e tampa esmerilhada. Utilizado para fazer extraes por meio de solventes e para a separao em lquidos imiscveis.

- Funil de vidro simples: um funil ao qual se adapta o papel filtro, l de vidro, algodo simples, etc. Usado para filtraes.

- Gral de porcelana ou vidro: Empregado para pulverizaes de substncias slidas.

- Kitassato - Usado em conjunto com o funil de Bchner na filtrao a vcuo. - Lminas: So vidros retangulares, em geral, no formato de 76 x 26, brancos, transparentes e com espessura no superior a 1,5 mm. Obs: Lminas e lamnulas nuca se seguram na face do vidro, mas sempre apenas pelas bordas. - Lamnulas: So vidros quadradas (18 x 18) ou retangulares (24 x50), com espessura entre 0,1-0,2 mm. Servem juntamente com as lminas para a incluso temporria ou permanente do objeto.

- Mufa: Utilizada para prender, nos suportes universais, os agarradores que no as contenham em seus cabos.

- Papel filtro: Papel poroso, que retm partculas slidas, deixando passar apenas a fase lquida. Quando o lquido corrosivo se substitui o papel por l de vidro ou amianto. Depois de colocado no funil o papel filtro deve ser umedecido, de forma que fique retido junto parede.

- Pra - Usada para pipetar solues. - Pina de madeira: Usada para prender tubos de ensaio durante o aquecimento direto no bico de Bunsen. - Pipeta graduada: Consiste de um tubo de vidro estreito geralmente graduado em 0,1 ml. usada para medir pequenos volumes variveis de lquidos. Encontra pouca aplicao sempre que se deseja medir volumes lquidos com maior preciso. No deve ser aquecida.

- Pipeta volumtrica: constituda por um tubo de vidro com um bulbo na parte central. O trao de referncia gravado na parte do tubo acima do bulbo. usada para medir volumes nicos de lquidos com elevada preciso. No deve ser aquecida. - Placa de Petri: Recipiente de vidro que pode se apresentar em vrios tamanhos, sua utilidade muito variada. Tem grande emprego nas culturas de bactrias, culturas de fungos, protozorios, etc. - Provetas: Recipiente de vidro, de capacidade varivel geralmente indicada em mL. Utilizada para medir volumes de lquidos, para preparar solues de concentrao aproximada ou no conhecida.

- Suporte universal: Suporte de ferro utilizado como meio de prender argolas e agarradores.

- Tenaz: Empregada para segurar cadinhos, tubos e cpsulas quando aquecidos. geralmente de ferro ou nquel.

- Termmetro: Usado para medir a temperatura durante o aquecimento em operaes como: destilao simples, fracionada, etc. - Tringulo de porcelana: Tringulo construdo de arame coberto por tubos de porcelana ou outro material refratrio. Utilizado como suporte para cadinhos e cpsulas durante a calcinao.

- Trip e tela de amianto: O trip o suporte para a tela de amianto. A tela tem a propriedade de distribuir o calor, evitando que os frascos quebrem quando aquecido no fogo.

- Tubo de ensaio: Tubos de vidro, cilndricos, com tamanhos variados, usados em vrios experimentos. Nele, efetuam-se reaes simples. Podem sofre variaes de temperatura. - Vidro de relgio: Pea de vidro de forma cncava. usado para cobrir bqueres, em evaporaes, pesagens de diversos fins. No pode ser aquecido diretamente na chama do bico de Bunsen. Equipamentos de proteo individual (EPIs) recomendados - Proteo para os olhos: para se proteger contra respingos, aerossis, combustveis ou cacos de vidro, USE CULOS DE PROTEO. - Mscara: algumas substncias, especialmente volteis, podem exigir o uso de mscaras respi ratrias. - Luvas: o manuseio de algumas substncias txicas exige o uso de luvas. Na maioria dos casos, uma luva de ltex j suficiente.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professores: Jane Caon e Jlio Xandro Heck

Aula 3: MICROSCOPIA Conceito a arte de empregar o microscpio. O que um microscpio? A palavra tem origem grega mikrs, pequeno, e skoppoo, observar, ver atravs de e significa um instrumento atravs do qual se observa coisas pequenas. Partes do microscpio a) Parte mecnica: p (base); brao (estativa ou coluna); platina (mesa); canho (tubo); parafusos: macromtrico e micromtrico; revlver (tambor); charriot. Compem o sistema de suporte e ajuste. b) Parte ptica: lente ocular; lente objetiva; condensador com diafragma; espelho ou fonte de luz acoplada. Compem o sistema de aumento e de iluminao. a) Parte Mecnica P: o local de apoio, d estabilidade ao aparelho e serve de suporte para as demais peas. Brao: Suporte pesado que sustenta os tubos, a mesa, o condensador, os parafusos macro e micromtrico. Platina: Redonda ou quadrangular, pode ser fixa, mvel ou giratria no plano horizontal. Sobre ela fica a lmina com o material a ser observado. Apresenta uma abertura no seu centro permitindo a passagem dos raios luminosos, coletados pelo espelho ou oriundos de fonte luminosa prpria e convergindo sobre o material da lmina pelo condensador e diafragma. Os raios chegam atravs da lente objetiva do tubo e da ocular at o globo ocular (retina) do observador. A preparao sobre a lmina afixada platina atravs de duas presilhas mveis. Canho: Nos microscpios monoculares (que possuem uma s ocular), o canho representa um cilindro metlico, que pode ser reto ou oblquo. Os microscpios binoculares (que possuem duas oculares) podem ser inclinados, com ajuste para as distncias entre os olhos de cada observador. Parafuso macromtrico: o parafuso maior, de avano rpido. Possui botes bilaterais, localizados acima ou abaixo da platina. Utiliza-se primeiro para atingir a aproximao da focalizao grosseira do material. Possui um percurso vertical, com cerca de 7 cm. Parafuso micromtrico: o parafuso menor, de avano lento. Comandado, tambm por tambores laterais. Permiti o deslocamento do tubo a apenas dois milsimos de milmetro ou

menos, portanto seu emprego s utilizado para acertar a focalizao do material j visvel. Emprega-lo antes no indicado, pois perde-se muito tempo tentando obter deslocamentos maiores. utilizado para obter um enfoque perfeito da preparao. Entretanto, quando a preparao j parecer estar perfeitamente focalizada, devemos ter sempre a mo sobre o parafuso e proceder a pequenas oscilaes, que permitam precisar certos detalhes, ou perceber novos elementos, ainda no vistos. Revlver: Fica acima da platina. As objetivas se encaixam numa pea rotatria e giram sempre no sentido do menor para o maior aumento. Charriot: Pea reguladora localizada na platina e que serve para movimentar a lmina no campo. Um parafuso desloca a lmina para frente e para trs e outro parafuso a desloca para a esquerda ou para a direita. b) Parte ptica Lente ocular: Encaixada na extremidade superior do tubo, pode ser retirada e substituda facilmente. Juntamente com a objetiva fornece a imagem do objeto. As oculares fornecem, geralmente, ampliaes iguais s obtidas por lentes ou lupas manuais. Com a ocular de maior aumento a parte visvel da preparao mais restrita. Ex. Se examinarmos uma preparao de glbulos de sangue com a ocular de menor ampliao, os elementos sero menores, porm mais numerosos em cada campo do microscpio. Por outro lado, com a ocular de maior ampliao, os elementos sero maiores, mas em cada campo ver-se- um nmero muito mais reduzido de elementos. Se o microscpio for monocular conveniente fazer a observao com ambos olhos abertos, olhando-se com qualquer um dos dois. Quanto menos iluminada estiver a mesa mais fcil ser consegui-lo. Caracterstica tcnica da ocular: Aumento: O poder de aumento se encontra gravado na ocular. - a ocular X 4 aumenta 4 vezes a imagem produzida pela objetiva. - a ocular X 6 aumenta a imagem 6 vezes - a ocular X 10 aumenta a imagem 10 vezes. Se a imagem do objeto aumentou 40 vezes mediante a objetiva de X 40 e aps 6 vezes mediante a ocular de X 6, o aumento total ser de 6 x 40 = 240 X. Para calcular o aumento total da imagem do objeto que se observa, multiplicamos o poder de aumento da objetiva pelo da ocular. Lente objetiva: Fornece a imagem ampliada do objeto. H objetivas a seco e de imerso. As objetivas de maior ampliao tm as lentes terminais menores. a) Objetivas a seco So as mais correntemente empregadas. Entre a lente frontal e a lamnula s existe ar. As objetivas, sem indicao especfica, so destinadas aos exames a seco, isto , nenhum lquido pode ser interposto entre a preparao e a objetiva. claro que isto no quer dizer que com elas no se possa examinar um lquido, mas sim que, neste caso preciso que o lquido esteja coberto por uma lamnula e no em contato direto com a objetiva. b) Objetiva de imerso - A objetiva de imerso promove a maior ampliao do objeto em estudo, entretanto menor a quantidade de raios luminosos que atravessam o tubo do microscpio, para corrigir essa situao e aproveitar a maior quantidade de luz possvel, coloca-se entre a objetiva de imerso e a preparao uma gota de leo de imerso, evitando assim a interposio do ar. O uso da objetiva de imerso requer grande luminosidade e o emprego do condensador. Nunca usar a seco uma objetiva de imerso.

Caractersticas tcnicas das objetivas: 1. Aumentos: O poder de aumento de cada objetiva se indica por um nmero gravado no suporte da lente: a objetiva X 10 aumenta 10 vezes a objetiva X 40 aumenta 40 vezes a objetiva X 100 aumenta 100 vezes (A objetiva X 100 geralmente se encontra marcada com um anel para indicar que se deve us-la com leo de imerso). 2. Abertura numrica (NA): A AN tambm se acha gravada no suporte da lente, junto a indicao do poder de aumento. Ex. X 100 / 1.30 - 0,30 na objetiva X 10 - 0,65 na objetiva X 40 - 1,30 na objetiva X 100 A medida que aumenta a AN maior o poder de resoluo (capacidade de perceber detalhes adjacentes muito prximos, separando-os som nitidez). Ainda, a medida que aumenta a AN diminui a dimenso da lente frontal. A lente frontal da objetiva X 100 tem o tamanho de uma cabea de alfinete, por isso deve-se manejar com cuidado. 3. No suporte da objetiva pode ter outros nmeros: Ex. X 40 / 0.65 160 / 0,17 A altura recomendada em mm para o tubo do microscpio (entre a objetiva e a ocular), geralmente de 160 mm. A espessura recomendada em mm para a lamnula utilizada sobre a lmina, 0,17mm. 4. Distncia de operao da objetiva: a distncia entre a lente frontal da objetiva e a lmina quando a imagem se encontra focada. A medida que o poder de aumento do objeto maior diminui a distncia de operao. - objetiva X 10: a distncia de operao de 5 6 mm - objetiva X 40: a distncia de operao de 0,5 1,5 mm - objetiva X 100: a distncia de operao de 0,15 0,20 mm 5. Poder de resoluo: a capacidade de distinguir dois pontos muito prximos. A capacidade de resoluo do olho humano 0,25 mm. Quanto maior for o poder de resoluo da objetiva, mais clara ser a imagem e maior a capacidade de por em evidncia detalhes adjacentes muito prximos, separando-os com nitidez. Condensador com diafragma: Localizado abaixo da platina, sua funo principal fornecer bastante luz, tornando mais clara a preparao, indispensvel nas grandes ampliaes (objetivas de grande aumento) do material a ser observado. Ao se elevar o condensador, atravs do parafuso de ajuste, a iluminao mxima. Ao baix-lo obtemos uma iluminao mnima. Alguns microscpios tm filtros coloridos, principalmente azuis de baixo do condensador. Se pode deixar ou tirar segundo o tipo de preparao que se v observar. Pode haver trs parafusos colocados ao redor do condensador: um na frente, um a esquerda e outro a direita. Usam-se para centrar o condensador exatamente em relao ao objeto em observao. O diafragma est dentro do condensador. Utiliza-se para reduzir ou ampliar um ngulo, portanto, tambm a quantidade de luz que entra no condensador. Fecha-se o diafragma quando se usam objetivas de pouco aumento, para eliminar os raios laterais. Abre-se o diafragma na medida em que se aumentam as ampliaes, em conseqncia aumenta a NA e se pode observar detalhes menores do objeto.

Espelho: encaixado por baixo do condensador. redondo e possui duas faces: uma plana e outra cncava. A face plana usada nos pequenos aumentos, quando quisermos obter um campo uniformemente iluminado e tambm para quando usamos a objetiva de imerso. A face cncava usada em grandes aumentos. Entretanto estas regras no so absolutas. sugerido proceder por tentativas, quando a preparao est sob o microscpio, e experimentar sucessivamente uma e outra face assim como as diferentes posies do espelho, at conseguir a visibilidade desejada.

Preparao do microscpio para uso Procedimentos para centrar corretamente o condensador: 1. Coloque na platina uma preparao em lmina, sem lamnula. Desa o condensador. Abra o diafragma. Examine com a objetiva de menor aumento. Observe a preparao atravs da ocular e focalize. 2. Feche o diafragma. No campo microscpico aparecer um crculo borrado de luz rodeado por um anel escuro. 3. Elevar o condensador lentamente at que as bordas do crculo luminoso estejam claramente focalizadas. 4. Ajuste, se necessrio, a posio do espelho de maneira que o crculo luminoso fique centrado exatamente ou sobreposto rea clara que est rodeada pela zona escura. 5. Atravs dos parafusos para centrar o condensador faa os ajustes necessrios at que o crculo luminoso se encontre exatamente no centro do campo microscpico. Repita a operao quando usar as outras objetivas. Ajuste do diafragma Abra o diafragma completamente, Retire a ocular e observe diretamente atravs do tubo do microscpio; a lente superior da objetiva aparecer cheia por um crculo luminoso. Feche o diafragma lentamente at que este crculo luminoso ocupe somente 2/3 da superfcie. Repita esta operao at usar cada objetiva. Ajuste da ocular 1. Escolha da ocular: As oculares X 5 ou X 6 proporcionam resultados satisfatrios no laboratrio clnico. Se utilizarmos oculares de maior poder se intensificar o aumento, mas provvel que no se observe melhor os detalhes. 2. Ajuste da distncia interpupilar (distncia entre as pupilas dos olhos): Segurar as bases das oculares com as duas mos e regular a distncia interpupilar at obter uma perfeita viso binocular. 3. Focalizao dos olhos direito e esquerdo: Um dos suportes das oculares, quase sempre o esquerdo, est provido de um anel para focagem. Se este anel se encontra no suporte da ocular esquerda, feche o olho esquerdo e, empregando a objetiva X 40, focalize a imagem para o olho direito pela ocular direita. A seguir feche o olho direito e observe com o olho esquerdo atravs da ocular esquerda. Se a imagem se encontra focalizada no necessrio ajuste. Se a imagem no clara, faa girar o anel de focagem at obter nitidez de imagem. Neste momento o microscpio estar ajustado de acordo com a viso binocular prpria do operador.

Focalizao da objetiva 1. Emprego da objetiva de menor aumento ( X 5 ou X 10 ) Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento. - Coloque a lmina sobre a platina, fixe-a com a(s) presilha(s), mova a lmina com o charriot at que o objeto fique exatamente no centro do campo. - Desa o condensador completamente - Desa a objetiva at encontrar-se imediatamente acima da preparao - Utilizando o parafuso macromtrico de rpido avano eleve a objetiva at observar uma imagem clara atravs da ocular - Faa ajustes com o parafuso micromtrico - Se a iluminao insuficiente suba o condensador ligeiramente 2. Emprego da objetiva de maior aumento ( X 40 ) - Sem olhar pela ocular, baixe o condensador at a metade da distncia. - Ainda olhando por fora, desa a objetiva at coloc-la imediatamente por cima da preparao (a distncia de operao muito pequena, cerca de 0,5mm). - Atravs do parafuso macromtrico de rpido avano, eleve a objetiva muito lentamente at que aparea uma imagem borrada no campo microscpico. - Busque o foco por meio do parafuso micromtrico de avano lento. - Eleve o condensador para obter suficiente iluminao. - Se o microscpio no tiver condensador utilize o lado cncavo do espelho. 3. Emprego da objetiva de imerso em leo - Utilizar preparaes completamente secas - Colocar uma pequena gota de leo de imerso sobre a poro que se vai examinar (de preferncia usar leos sintticos) - Eleve o condensador at onde possa chegar - Abra completamente o diafragma - Desa a objetiva X 100 at que entre em contato com o leo - Aproxime a objetiva da preparao at onde seja possvel, mas evite a presso na lmina (as objetivas modernas tem amortizador). - Observe atravs da ocular e gire para cima, muito cuidadosamente, o parafuso micromtrico, de avano lento at que a imagem se encontre focalizada. Observao: Nos microscpios modernos a objetiva no sobe nem desce, e sim a platina que se move atravs do comando do parafuso macromtrico de avano rpido e do parafuso micromtrico de avano lento. Neste caso os parafusos devem girar em direo oposta para a focalizao da imagem. Mudana das objetivas Os microscpios modernos so construdos de tal maneira que quando se muda a objetiva de menor aumento para a de maior aumento o objeto permanece mais ou menos focalizado sendo necessrio pequeno ajuste com o parafuso micromtrico. Se isso no acontecer, suba o revlver antes de fazer a mudana para a objetiva de maior aumento e aps focalize novamente. Antes de mudar a objetiva certifique-se que o objeto examinado encontra-se no meio do campo microscpico (crculo luminoso que se observa atravs da ocular), a fim de no perde-lo depois na troca de objetivas.

Cuidados no uso apropriado do microscpio 1. essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas do microscpio, tendo o cuidado de ler e absorver as instrues contidas nos manuais que os acompanham, e/ou seguir as orientaes do professor em classe. 2. Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para mant-lo seco, cubra com capa de flanela pois evita o p e a multiplicao de fungos(Obs.: as capas devem ser lavadas periodicamente). 3. No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas. 4. Jamais comer ou beber prximo ao equipamento. 5. Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na base. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfcie plana, evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o microscpio com a lmpada acesa ou logo aps ter sido apagada. 6. Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva, portanto o conselho retirar o excesso de lquido com papel filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina, em caso de acidente, enxugar imediatamente com leno de papel absorvente macio. 7. Ao trabalhar com o colega no mesmo microscpio, aps a focalizao do objeto, desatarraxar o parafuso para soltar as oculares, e desloc-la para o colega que dever atarraxar suavemente, regulando o ajuste interpupilar. 8. Ao encerrar os trabalhos com o microscpio, desligue a luz, enrole o fio e posicione a objetiva de menor aumento sobre o orifcio da platina. Limpeza:- Parte ptica

A nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Isto pode ser evitado pelo hbito de limpeza peridica. 1. Oculares Com a objetiva de menor aumento focalizado em uma preparao, gire as oculares e verifique se existem partculas que acompanham o movimento: caso existam elas, podem estar nas duas superfcies e neste caso ambas devem ser limpas com um bulbo de borracha e cotonete. Para retirar eventuais manchas de leo, dedos; umedecer um cotonete com solvente apropriado (lcool a 70% ou ter), tomando cuidado para no inundar as lentes, e secar imediatamente com um leno de papel. Freqentemente basta projetar o hlito na superfcie das lentes e limpa-las. Limpe freqentemente as oculares com leno de papel fino; pois o contato com os clios e mesmo poeira podem suj-las. Nunca toque as lentes com os dedos, pois a gordura atrai poeira. Precauo especial requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol, pois podem penetrar na rea de fixao das lentes no suporte dissolvendo a cola, bem como produzir pelcula sobre as lentes.

2. Objetivas Cada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revlver e aps a limpeza recolocada na posio original, para tanto, usar a mesma tcnica descrita para as oculares. No entanto, como as superfcies das lentes so menores que as das oculares, recomenda-se inspeciona-las com uma pequena lupa manual. Para retirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de plo muito macio. Aps o uso da objetiva de imerso, retirar o excesso de leo com um papel de filtro e terminar a limpeza com um cotonete levemente embebido de ter. Jamais usar lcool na limpeza do leo de imerso, pois este no dissolvido pelo lcool, mas forma com ele um precipitado branco. - Parte mecnica Evitar o acmulo de poeira e areia. Antes de proceder a lubrificao, a sujeira deve ser retirada.Para lubrificar a cremalheira (pea dentada) do parafuso macro e micromtrico e condensador, coloque uma pequena quantidade de vaselina neutra e aps move-se para cima e para baixo a fim de espalha-la. Nunca force o parafuso macro e micromtrico que esteja emperrado ou duro. Para as partes expostas, suficiente lav-las usando tecido umedecido com gua e sabo neutro.

TCNICAS BSICAS DE LIMPEZA Material de vidro: 1. 2. 3. 4. 5. Lavar com gua e sabo Enxaguar com gua corrente Enxaguar com gua ou lcool acidulado Deixar escorrer e lavar com gua destilada Secar com pano limpo.

lcool acidulado: lcool 96%............................................3 partes cido clordrico ....................................1 parte gua acidulada: gua destilada ......................................3 partes cido clordrico ou actico..................... 1 parte Para o passo n. 4 tambm pode utilizar-se: Dicromato de K .........................................................5 g cido sufrico a 5% em gua destilada ................250 ml

Para lminas e lamnulas 1. Deixar repousar durante 24 horas na seguinte soluo Dicromato de K ............................................20 g cido sulfrico concentrado .........................20 ml gua destilada ........................................... 250 ml 2. Lavar em gua com sabo e deixar em gua corrente durante 24 horas 3. Colocar a gua destilada durante 24 h 4 Manter por tempo indefinido e, um recipiente fechado com lcool 70%

Para lminas com corantes e blsamo 1. Dissolver a quente 100 g de bicarbonato de K em 1 litro de gua 2. Deixar esfriar a soluo e adicionar gota a gota com um basto de vidro 100 ml de cido sulfrico concentrado. 3. Deixar as lminas e lamnulas submersas nesta mistura por 3 dias. 4. Aps lavar com gua corrente e passar a uma segunda diluio que se prepara como segue: gua corrente .....................................50 ml Soda (NaoH) ......................................10 gotas (em diluio saturada) 5. Permanecer nesta mistura durante 24 horaas para aps lavar em gua corrente e colocar em lcool a 70 %. Outra tcnica: 1. Colocar o material na seguinte mistura: gua da torneira ..........................................1 parte lcool 96 % ..................................................1 parte Xilol .............................................................1 parte 2. Permanecer na mistura por 24 horas gua atua nos corantes e resduos lcool atua na gordura do manejo e nos corantes alcolicos Xilol separa a lmina da lamnula


Aula 4: PESAGEM BANHO-MARIA

Pesagem A construo das balanas analticas assinalou um notvel progresso nas ltimas dcadas. O aperfeioamento na construo das balanas analticas foi marcado pelo esforo em aumentar a sensibilidade dos aparelhos e, ao mesmo tempo, simplificar e abreviar a operao de pesagem. Em nosso laboratrio dispomos de balanas eletrnicas de um prato em grau analtico (4 casas decimais) e em grau semi-analtico (2 e 3 casas decimais). Recomendaes gerais para o bom uso das balanas: - As balanas eletrnicas devem estar localizadas em bancadas apropriadas, planas e construdas em concreto, para evitar oscilaes. - sempre aconselhvel que as balanas sejam ligadas 15 minutos antes do uso para ambientao e auto-calibrao. - As balanas analticas so extremamente sensveis e deve-se ter o mximo cuidado no seu manuseio e manuteno. Eventuais sujidades devem ser imediatamente limpas. - Certifique-se da massa mxima que pode ser pesada na balana em questo. Essa operao muito importante, pois uma massa excessiva pode danificar enormemente a balana. - Antes de iniciar o processo de pesagem, verifique se o prato da balana est limpo e se ela est zerada (tarada). Tare a balana com o recipiente no qual vai ser colocado o material a ser pesado. Adicione o material e faa a leitura diretamente no mostrador. Em hiptese alguma coloque o reagente diretamente no prato da balana. - Conserve-a limpa, tendo o cuidado para no deixar cair reagente sobre a balana. - Depois do uso, desligue a balana e faa o registro do uso no espao apropriado. Exerccio: - Determine a massa de um objeto qualquer (anel, brinco, lpis, caneta, etc) nas duas balanas do laboratrio e anote as massas. - Pese, em um vidro de relgio, 0,250 g de acar.

Banho-maria Os aparelhos de banho-maria so utilizados em procedimentos laboratoriais sempre que se deseja um controle fino de temperatura. Desta forma, inmeras reaes importantes devem ser conduzidas neste tipo de aparelho. A maioria dos banhos-maria opera eficientemente em faixas de temperatura que variam entre a temperatura ambiente e 80C. Dicas importantes: - na maioria dos banhos, temperaturas menores que a ambiente no podem ser atingidas, uma vez que no possuem sistema de refrigerao. - a gua usada no banho-maria deve, preferencialmente, ser do tipo destilada e deve ser trocada sempre que se tornar opaca ou comear a cheirar. Alternativamente pode-se adicionar algum agente antibacteriano a esta gua. - para evitar evaporao, use sempre uma tampa.


Aula 5: PIPETAS CAPELA DE EXAUSTO Existem vrios tipos de pipetas, todas com a mesma finalidade: transferncia de lquidos de um local para outro. A transferncia pode ser volumtrica, como na maioria das pipetas, ou no, como no caso das pipetas de Pasteur. Os principais tipos de pipetas usadas em biotecnologia so: - pipetas sorolgicas (graduadas): estas so as pipetas-padro de uso dirio. Normalmente so de vidro, mas tambm podem ser de plstico. Podem ser de vrios volumes e so usadas rotineiramente na medida de lquidos. A autoclavagem deve ser evitada, pois prejudica a calibrao. A secagem tambm deve ser cuidadosa, em temperaturas que no excedam 45C. Modo de usar: Depois de perfeitamente limpa e seca, a pipeta pode ser introduzida na soluo a ser transferida, tendo o cuidado para evitar a formao de bolhas. A suco deve ser feita com o auxlio de um pipetador* ou de uma pra de suco. Se a pipeta estiver mida, deve-se ambientar a pipeta com o lquido a ser transferido e em seguida proceder a transferncia. A pipeta escolhida deve ser o mais prximo possvel do volume a ser medido. A parte externa da pipeta pode ser seca com o auxlio de um papel filtro. Em seguida, o lquido pode ser escoado da pipeta para o recipiente receptor e a ltima gotinha pode ser removida encostando-se a mesma contra a parede do recipiente. Nunca deve-se soprar a poro do lquido que fica retido na extremidade da pipeta. * Existem dezenas de pipetadores, portanto, voc poder encontrar aquele que sirva exatamente a sua necessidade. - pipetas volumtricas: o modo de utilizao destas pipetas o mesmo das pipetas sorolgicas. Ao contrrio das anteriores, medem apenas um volume fixo. - pipetas de Pasteur: so de vidro ou de plstico. No so usadas para medir volumes, apenas para transferncias mais grosseiras. So boas para preencher tubos para balanceamento de centrfugas e para remover e transferir sobrenadantes - micropipetas: so instrumentos que carregam volumes em microlitros (L, sendo 1000 L= 1 mL) por ao da capilaridade ou por bulbos de suco. So usadas para medir volumes pequenos e altamente precisos. As mais comuns so as P1 (1 L) P5 (at 5 L,

P10 (entre 5 e 10 L), P20 (entre 10 e 20 L), P200 (entre 40 e 200 L), P1000 (entre 200 e 1000 L) e P5000 (entre 1000 e 5000 L). Modo de usar: - coloque a ponteira (tip) adequada. - aperte o mbolo da pipeta at o atingir o primeiro estgio. - coloque a ponteira dentro da soluo a ser pipetada (segurando o mbolo apertado). Solte o mbolo vagarosamente, certificando-se para que a ponteira esteja sempre dentro da soluo. Este movimento deve ser lento, para que a soluo no suba muito rapidamente. Jamais se deve permitir que o lquido atinja o interior da micropipeta. Ele deve sempre ficar confinado na ponteira (ou tip). - Descarte a soluo, empurrando o mbolo. Na maioria das micropipetas o mbolo deve ser empurrado duas vezes para liberar o contedo da ponteira. Empurre at que voc sinta uma resistncia e ento empurre de novo, gentilmente. Esse empurro final expele a ltima gotinha do volume e deve ser dado o mais suavemente possvel para evitar a formao de aerossis. Estas pipetas devem sempre ser manipuladas com extremo cuidado, pois so relativamente caras e frgeis. Devem ser calibradas a cada poucos meses durante o ano, dependo da freqncia de uso. Algumas podem ser calibradas no prprio laboratrio, seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante; outras devem ser calibradas por profissionais. Este tipo de pipeta JAMAIS PODE SER AUTOCLAVADA. No entanto, as ponteiras podem, portanto, podem ser utilizadas em operaes que exijam esterilidade. Exerccio: - praticar o emprego de pipetas sorolgicas e micropipetas, pipetando 6 mL de gua destilada com o auxlio da pipeta sorolgica de 10 mL e 500 L de gua (ou 150 L) com uma micropipeta (P1000 ou P200).

CAPELA DE EXAUSTO Os produtos qumicos volteis e aqueles que liberam vapores txicos devem ser manipulados, exclusivamente, em capelas de exausto. As caractersticas recomendveis para a construo de capelas, dentro dos padres aceitveis, so descritas a seguir: - as capelas devem ser construdas, preferencialmente, em ao inoxidvel, porm aceitvel que sejam construdas em alvenaria com cpula de ao inoxidvel, para facilitar a limpeza. - a rea mxima do balco deve ser de 3 m x 0,80 m e altura de 85 cm. - as janelas devem possuir movimentao vertical e armao com contrapeso. - o sistema de escoamento de esgoto deve ser resistente a agentes corrosivos. - deve possuir uma entrada de ar auxiliar ou secundria, para manter a mesma vazo de ar com a janela fechada. - deve possuir um sistema de filtros funcionando. - deve possuir peitoril, para conter pequenos vazamentos. - o fluxo de ar de uma capela deve ser laminar e potente. Como usar uma capela de vapores qumicos:

1.

2.

3. 4. 5.

Ligue a capela e verifique se a exausto est funcionando ( possvel ouvir ou sentir). Nem o ar condicionado nem o ventilador devem estar funcionando perto da capela, pois isso poder interferir nas correntes de ar dentro da mesma. A janela deve estar abaixo da altura do queixo do manipulador! Abaixe a janela at a altura indicada na parte frontal da capela. Quanto mais baixa a altura, ou seja, quanto mais fechada a janela, mais proteo haver. Trabalhe, no mnimo, 20 cm dentro da capela. Prenda os papis e outros materiais leves. Eles podem ser sugados pelo sistema de exausto. No bloqueie as fendas de exausto traseiras ou o espao entre a borda dianteira de metal e a superfcie de trabalho.


Aula 6: PREPARO DE SOLUES E DILUIO Solues O preparo de solues um procedimento extremamente importante para o Biotecnologista, pois do preparo correto das solues depender o sucesso de todos os experimentos realizados. Soluo uma disperso homognea de duas ou mais espcies de substncias. As solues podem ser formadas por qualquer combinao dos 3 estados fsicos da matria: gases, lquidos e slidos, porm so sempre constitudas de uma nica fase. Nosso estudo se restringir a solues binrias lquidas, isto , soluto slido ou lquido, dissolvido em solvente lquido. Existem vrias classificaes para as solues, a citar: - Classificao 1: soluo saturada, no-saturada e super-saturada, - Classificao 2: solues diludas e no diludas, - Classificao 3: solues moleculares e inicas, - etc. No entanto, estudar os diferentes tipos de solues no o objetivo deste componente e por isso ficaremos restritos parte prtica. Informaes tericas teis no preparo de solues: - Concentrao simples: o quociente entre a massa do soluto (em gramas) e o volume de soluo (em litros). C = m/V (em gramas/litro) - Molaridade: o quociente entre o nmero de moles do soluto e o volume de soluo (em litros). M = n/V (em moles/litro), sendo n = m/MM m = massa MM = massa molar

- Normalidade: quociente entre o nmero de equivalentes-grama (e1) do soluto e o volume de soluo, em litros. N = m/E1.V, sendo E=MM/valncia (nmero de H ou OH ionizveis) E = Equivalente grama m = massa V = volume (litro) - Relao entre molaridade (M) e normalidade (N) N = M.x, sendo x o nmero de H ou OH ionizveis.

- Solues em porcentagem As solues em porcentagem so baseadas em 100 mL (ou, ocasionalmente, em 100 g). Quase todas as solues que voc calcular sero solues (p/v), nas quais o peso em grama do p misturado com o volume em mL. No entanto, existem 3 modos de de expressar a concentrao em porcentagem: 1. porcentagem de peso por volume (p/v). Gramas do soluto por 100 mL do solvente. Exemplo: NaCl 20% (p/v) - dissolver 20 g de NaCl em um dado volume de gua (aprox. 60 mL) e completar o volume em balo volumtrico de 100 mL. 2. porcentagem por volume (v/v). mL do solvente por 100 mL de soluo. Usado para diluir uma soluo estoque concentrada. Diluir uma soluo de SDS 10% at 1% (v/v) - 10 mL da soluo concentrada + 90 mL de gua. 3. porcentagem por peso (p/p). Gramas do soluto por 100 g do solvente. Exemplo: Soluo de sacarose a 10% (p/p) pesar 10 g de sacarose e adicionar 90 mL de gua.

Modo de preparar solues: 1. Faa os clculos apropriados e descubra a massa do soluto a ser pesada. 2. Pesar em balana analtica, em bquer de tamanho pequeno (40 80 mL), a massa calculada. 3. Dissolver o slido com gua destilada. Pode-se utilizar um basto de vidro para auxiliar nessa operao. IMPORTANTE: No esquecer do volume final da soluo no momento de adicionar gua ao bquer. Esse volume adicionado deve estar distante do volume final da soluo. 4. Transferir o contedo do bquer para o balo volumtrico apropriado. O basto de vidro pode ser utilizado com direcionador de fluxo. 5. Realizar a lavagem do bquer com gua destilada, sem exceder o volume final da soluo, para assegurar que todo o slido pesado seja transferido ao balo.

6. Ajustar o volume final com o menisco do balo volumtrico. Fechar o balo volumtrico com a tampa apropriada e homogeneizar. 7. Estocar em recipiente adequado e devidamente identificado. Toda soluo, uma vez preparada, deve ser CORRETAMENTE identificada. Esta identificao deve ser feita com fica adesiva apropriada e em tamanho que permita uma fcil visualizao. Nesta identificao deve constar: - nome da soluo (por exemplo, Hidrxido de sdio), - concentrao da soluo (0,1 M; 20%, etc), - data em que foi preparada, - responsvel pelo preparo (Fulano de Tal), - cuidados especiais (por exemplo, manter sob refrigerao) OBS 1. Em alguns casos, dependendo do grau de preciso exigido pela soluo, pode-se utilizar uma proveta ao invs de balo volumtrico. OBS 2. Em outros casos, como em meios de cultura para microbiologia, a soluo pode ser preparada simplesmente adicionando-se o volume de gua (medido em proveta) ao bquer contendo o material pesado.

Diluio Diluir uma soluo significa adicionar a ela um solvente puro e inmeras vezes essa operao ser fundamental em procedimentos qumicos, bioqumicos, microbiolgicos, etc. Lei geral da diluio: C1V1 = C2V2 Sendo, C1= concentrao da soluo inicial C2= concentrao da soluo final (nova soluo) V1= volume da soluo inicial a ser medido (esta a incgnita da equao!!!) V2= volume final (volume que se deseja preparar) Exerccios: 1. Preparar 100 mL de uma soluo 0,1M do sal fictcio XY, cuja massa molar 30 g, utilizando balo volumtrico. 2. Preparar 40 mL de uma soluo 5% (p/v) do sal fictcio XY, utilizando proveta para aferio do volume. 3. Preparar 10 mL de uma soluo 0,2 M do sal fictcio XY a partir de uma soluo concentrada a 1M.


Aula 7: UTILIZAO DE PROTOCOLOS, CATLOGOS E INTERPRETAO DE RTULOS DE REAGENTES. ARMAZENAMENTO DE PRODUTOS QUMICOS

Protocolos Os protocolos so as receitas que devemos usar para a realizao de um experimento. Um protocolo pode ser obtido de: - outro pesquisador/aluno/colega de laboratrio: o melhor lugar para conseguir um protocolo de outro investigador d laboratrio, pois o protocolo ser apropriado para os recursos e a especialidade do laboratrio, podendo conter detalhes importantes sobre os detalhes do experimento. - um livro de protocolos: existem muitos manuais de laboratrios disponveis comercialmente, com protocolos simples e claros para muitos campos da biotecnologia. Os manuais do laboratrio ou do curso tambm so uma boa fonte para protocolos simples. A desvantagem de protocolos comerciais que voc ter que adequ-lo ao seu laboratrio. - seo de materiais e mtodos dos artigos cientficos: esse o lugar menos confivel para achar um protocolo. Essas sees so notrias pela ausncia de detalhes que so deixados de lado devido a problemas de espao ou por outros motivos. Quando voc for fazer um experimento a partir de um protocolo novo algumas consideraes so importantes: - leia o protocolo atentamente para ver se ele faz sentido para voc. Faa o experimento mentalmente, passo a passo. Certifique-se que voc est, de fato, entendo cada passo. - mude o protocolo conforme suas necessidades e reescreva-o. Isso serve para tornar os passos mais compreensveis ou alterar algum equipamento conforme a necessidade. Decodifique a linguagem do protocolo para a sua linguagem. - prepare todos os reagentes listados no protocolo e certifique-se de ter tudo o que precisa. Certifique-se que todos os reagentes esto preparados e na concentrao exigida. Assegure-se que os equipamentos que voc precisar no estaro sendo usados quando voc precisar deles! - siga o protocolo exatamente na primeira vez que fizer o experimento. Se no der certo, repita, e s ento, em no dando certo novamente, faa alteraes. Tente no ser uma varivel do experimento.

- modifique o protocolo baseado em sua prpria experincia. Isso s acontece depois de algum tempo de prtica. importante anotar as modificaes realizadas e reescrever o protocolo. Exemplos de protocolos: Exemplo 1. Mtodo de determinao de atividade protesica

1. Adicionar 150 L de extrato enzimtico a tubos de microcentrfuga (eppendorfs) 2. 3. 4. 5.

contendo 250 L de uma soluo-substrato com 2% de azocasena em tampo fosfato de sdio 0,05 M e pH 7,0 (1). Incubar a mistura a 37C por 30 minutos e no final deste perodo adicionou-se cido tricloroactico (TCA) a 10% em cada tubo. Aps 15 minutos, necessrios para assegurar completa precipitao de fragmentos maiores de azocasena, centrifugar os tubos a 14000 g por 5 minutos. Transferir 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio contendo 1 mL de hidrxido de sdio 1,0 M. A absorbncia desta soluo determinada a 440 nm em espectrofotmetro Para cada amostra enzimtica prepara-se um branco, misturando, nesta ordem, enzima, TCA e substrato azocasena.

Exemplo 2: o mesmo procedimento, mas apresentado de outra forma. Em 250 L de uma soluo-substrato com 2% de azocasena em tampo fosfato de sdio 50 mM e pH 7,0 adicionaram-se 150 L de extrato enzimtico. A mistura foi incubada a 40C por 40 minutos e no final deste perodo adicionou-se cido tricloroactico (TCA) a 10% em cada tubo. Para cada amostra enzimtica preparou-se um branco, misturando, nesta ordem, enzima, TCA e substrato azocasena. Preparou-se, tambm, um reagente branco substituindo a enzima por soluo tampo. Aps assegurada a completa precipitao de fragmentos maiores de azocasena, centrifugou-se os tubos a 14000 g por 5 minutos. Transferiu-se 1 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio contendo 1 mL de hidrxido de sdio 1,0 M. A absorbncia desta soluo foi determinada a 440 nm em espectrofotmetro.

Catlogos de reagentes Os catlogos de reagentes so auxiliares extremamente teis em um laboratrio de biotecnologia. Eles so fornecidos pelos fabricantes ou pelos vendedores dos reagentes. Cada empresa fabricante de reagentes possui o seu catlogo, atualizado anualmente. Os catlogos fornecem informaes tcnicas importantes sobre os reagentes, solues, enzimas, equipamentos e todos os produtos fabricados/vendidos pela empresa. Nos catlogos so encontradas informaes como: frmula qumica, peso molecular, densidade, ponto de fuso e ebulio, coeficiente de extino molar, toxicidade, incompatibilidades, etc.

Interpretao de rtulos de reagentes Os rtulos de reagentes fornecem algumas informaes que orientam o biotecnologista no preparo do reagente. Fornecem uma quantidade menor de informaes que o catlogo, mas na falta dele oferece informaes bsicas importantes (frmula, peso molecular e densidade). Alm disso, observando-se o rtulo pode-se ter uma idia da toxicidade e dos cuidados que se deve ter ao manusear o reagente. seguir, alguns pictogramas normalmente encontrados em rtulos de reagente

Armazenamento de produtos qumicos Para armazenamento de produtos qumicos, deve-se considerar as caractersticas de todas as substncias, prevenindo, desta forma, a ocorrncia de eventuais acidentes no laboratrio. Estes produtos devem ser agrupados por espcies qumicas e no por ordem alfabtica. Assim, possvel separa-los em categorias: - inflamveis, - txicos, - explosivos, - corrosivos, - oxidantes, - gases.

Dicas gerais: - os solventes perigosos (clorofrmio ou teres no estabilizados) ou inflamveis (teres, cetonas, steres) no devem ser estocados em grandes quantidades. - anotar a data de chegada de todos os reagentes e deixar apenas a quantidade mnima destas substncias no laboratrio, verificando a data de validade de cada substncia.

- armazenar sempre nos recipientes ou frascos originais. - armazenar os agentes corrosivos em uma prateleira baixa ou em armrios especialmente separados para tais substncias. - Os produtos qumicos devem ser armazenados em rea fria, seca e ventilada. - No transformar as bancadas em armrios!!

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professor: Charley Christian Staats Aula 8: SEPARAO SLIDO/LQUIDO (decantao e filtrao) LAVAGEM DE MATERIAIS DE LABORATRIO Separao slido lquido A Decantao Um dos mtodos mais simples de separao de misturas heterogneas em laboratrios a decantao. A decantao serve para a separao de misturas heterogneas, sejam misturas heterogneas slido-lquido ou misturas heterogneas lquido-lquido. No caso da decantao slido-lquido, deixa-se o slido sedimentar no fundo do bquer e ento, cuidadosamente, verte-se a maior parte do lquido para outro bquer, com auxlio de um basto de vidro, conforme a figura 1.

B- Filtrao Um dos problemas comuns em laboratrios separar um lquido de um slido. Frequentemente utiliza-se a filtrao para este fim. A filtrao consiste na separao de um

sistema bifsico fazendo-se passar a fase lquido (filtrado) atravs de um meio que retenha a fase slida (precipitado). O filtro mais econmico o de papel. Uma das maneiras de preparar o papel filtro a seguinte: - o papel filtro cortado de forma circular dobrado pela metade e depois esta metade novamente dobrada, adquirindo aproximadamente um quarto do tamanho original. A segunda dobra deve ser feita de maneira que fique um intervalo de 5 mm entre as duas pontas, como na figura 2.1.

- Em seguida, abre-se o papel de tal maneira que adquira a forma de um cone e coloca-se no funil de modo que o corte no papel fique aderido ao vidro. Par uma rpida filtrao, o papel deve ser ajustado no funil de modo que o ar no penetre entre o papel e o funil. Para isso, coloca-se um pouco de gua destilada sobre o papel para ajust-lo s paredes do funil, conforme a figura 3. Quando o funil estiver bem selado, o lquido ficar retido na coluna do funil e o seu peso ajudar a puxar o lquido atravs do papel.

- A fim de no perder material, deve-se usar a tcnica da figura 4. Cuide para que a superfcie do lquido dentro do funil no alcance o topo do papel.

- O processo de filtrao pode ser acelerado atravs de uma filtrao por suco, a chamada filtrao a presso reduzida. Como neste processo a suco forte, necessrio um funil especial, chamado funil de Bchner. Neste caso, o papel no dobrado. O papel, de forma circular, cortado de maneira que fique a meia distncia entre a ltima linha de furos e a parede do funil, nunca podendo subir pelas paredes do mesmo, o que causaria vazamentos. Para a obteno do vcuo necessrio para este tipo de filtrao pode se usar uma trompa dgua ou um bomba de vcuo. (figura 5).

Lavagem de materiais de laboratrio A lavagem de materiais (vidrarias e outros instrumentos) um procedimento extremamente importante em qualquer laboratrio. Desta operao, certamente, depender o sucesso de todos os experimentos futuramente realizados com a vidraria em questo. Todo material utilizado em algum experimento, depois de devidamente descartado o resduo do experimento, dever ser cuidadosamente lavado com gua corrente em abundncia (gua comum), detergente e escova/esponja. Depois disso, dever ser extensivamente enxaguado com gua destilada. S depois dessas operaes que o material poder ser colocado no local de secagem.

- existem no mercado vrias escovas prprias para lavagem de materiais de laboratrio e voc dever escolher aquela que melhor se adaptar ao material a ser lavado. - na lavagem dos materiais comum a utilizao de detergentes de cozinha (detergente comum), principalmente por estes serem de preos mais acessveis. No entanto, existem detergente prprios para a lavagem de materiais de laboratrio. No mercado so encontradas vrias marcas diferentes com os mais variados preos. O mais utilizado o Extran, que pode ser encontrado na forma alcalina, cida e neutra, a qual ser escolhida conforme o tipo de material a ser lavado. - prtica comum durante as operaes de lavagem o laboratorista recorrer ao artifcio de deixar o material de molho, ou seja, imerso em uma soluo de gua com detergente por algum tempo, para facilitar a operao de lavagem. - em alguns casos, quando o material a ser lavado est com resduos firmemente aderidos a sua superfcie, o laboratorista pode recorrer ao emprego de solues extremamente corrosivas, como a conhecida Soluo Sulfocrmica. Essa soluo composta por cido sulfrico concentrado e dicromato de potssio e efetiva na limpeza de materiais que estejam sujos com matria-orgnica (protenas, acares, etc). No entanto, o uso deste tipo de soluo tem sido desaconselhado, principalmente pelos potencias efeitos carcinognicos do cromo em humanos, o que torna a sua manipulao altamente arriscada. Alm disso, essa soluo muito corrosiva e exige ateno redobrada durante a manipulao. - uma vez limpo o material, este dever ser abundantemente enxaguado com gua destilada. Essa operao crtica, pois nenhum resduo do material utilizado no experimento ou durante a lavagem poder permanecer presente no material, sob risco de interferir nos futuros experimentos. Portanto, no economize na gua destilada. Quando trabalha-se com protenas, aconselhvel, antes desta operao de enxge com gua destilada, realizar um enxge preliminar com hidrxido de sdio 0,1 M. - em experimentos de Biologia Molecular aconselhvel, em sendo possvel, no reutilizar os materiais que so descartveis, pois quantidades-trao de DNA podero no ser devidamente eliminadas pela lavagem e acabaram interferindo nas anlises seguintes.


Aula 9: ESTERILIZAO E ASSEPSIA (autoclaves, capela de fluxo laminar, luz UV, estufas e gases) Em muitas operaes utilizadas em Biotecnologia estritamente necessrio que se trabalhe em condies estreis, ou seja, sem a presena de nenhum organismo contaminante, ou, no mximo, com a presena de apenas um organismo (o seu organismo de trabalho). Autoclaves As autoclaves funcionam submetendo o material a altas temperaturas (maiores que 100C), que so atingidas graas ao aumento da presso interna do equipamento. Se voc no estiver familiarizado com a operao da autoclave em questo, pea auxilio a um colega que j tenha trabalhado com a autoclave. IMPORTANTE: apesar de o princpio de utilizao de todas as autoclaves ser o mesmo, cada autoclave possui caractersticas prprias e por isso, na primeira vez que voc for usa-la, importante que algum o acompanhe. Dicas de utilizao: - Verifique se o frasco ou recipiente que voc vai autoclavar resistente temperatura que ser usada. Em geral, utiliza-se temperatura de 121C por 15 30 minutos. - Deixe livre pelo menos, um quarto do volume do frasco ou do recipiente. Assim haver espao para que os lquidos fervam e, mais do que isso, o ar presente neste espao o responsvel pela esterilizao (o princpio pelo qual a autoclave elimina microrganismos o calor mido). - Certifique-se que as tampas estejam frouxas para prevenir que o aumento da presso interna quebre o frasco e para permitir a entrada do ar mido. - Cole um pedao de fita para autoclave (se o seu laboratrio tiver a fita) em cada item a ser autoclavado. Esta fita sensvel ao calor e mostrar alterao de cor somente aps o processo. Modo de uso da autoclave: - ligue a autoclave na rede eltrica, certificando-se da voltagem correta. - coloque gua no interior da autoclave. A quantidade de gua varia de equipamento para equipamento, mas, em geral, existe uma indicao do nvel mnimo de gua que a autoclave deve conter. fundamental que a resistncia esteja toda coberta pela gua. Essa

operao fundamental, se ela no for corretamente realizada a resistncia da autoclave ser destruda durante o processo. - ligue a chave seletora da autoclave no no mximo para que a gua comece a aquecer. Essa operao pode ser feita alguns minutos antes de o seu material estar pronto, para que no momento de colocar o material a gua j esteja quente. Isso far voc ganhar alguns minutos. - coloque o material a ser autoclavado no cesto da autoclave, no esquecendo dos cuidados que foram explicados acima. - feche e aperte bem a tampa da autoclave, mas no ao ponto de ter dificuldade na hora de abri-la novamente. Certifique-se que a vlvula lateral, responsvel pelo controle da presso ESTEJA ABERTA NESTE MOMEMENTO. - quando a sada de vapor dgua for perceptvel, indicando que a saturao do ar interno com gua foi atingida, feche a vlvula lateral. Agora a autoclave est completamente vedada e a presso e a temperatura internas comearo a subir (isto pode ser acompanhado pelo manmetro. - quando a temperatura desejada for atingida, coloque a chave seletora no mdio e comece a contar o tempo. - passado o tempo devido, desligue a chave seletora e espere a autoclave retornar a temperatura ambiente naturalmente. NO ABRA VLVULA NENHUMA! - quando a presso baixar completamente a autoclave pode ser aberta. Mas tenha cuidado, pois o material estar extremamente quente. Use luvas termorresistentes. Estufas A esterilizao de alguns materiais tambm pode ser feita em estufas. Neste caso, em virtude de o calor seco ser menos eficiente que o calor mido, empregam-se temperaturas mais elevadas e tempos mais longos. O material a ser esterilizado, em geral utenslios, deve ser recoberto com papel. Esterilizao com gases Uma forma de esterilizar materiais, principalmente em experimentos de cultura vegetal, utilizar gases com atividade antimicrobiana. Utilizam-se pastilhas de formalina (formaldedo) que so colocadas em uma cmara fechada juntamente com o material a ser esterilizado. Com a sublimao da pastilha libera-se o gs responsvel pela esterilizao. Capelas de fluxo laminar Em virtude de o ar atmosfrico estar cheio de poeira e de microrganismos necessrio trabalhar em um ambiente que esteja livre destes agentes contaminantes. Uma alternativa interessante contornar este problema trabalhar em uma capela de fluxo laminar, que promove a filtrao e a recirculao do ar no ambiente de trabalho. O fluxo de forma uma cortina que impede a passagem de ar externo para dentro da capela e de dentro para fora. Isso protege o manipulador do contedo da capela e protege o experimento do ambiente externo. Modo de trabalho: - antes de iniciar o trabalho na capela de fluxo laminar ligue a lmpada ultravioleta que existe na capela. Este tipo de luz possui atividade microbicida, ou seja, elimina os microrganismos que possam estar presentes na capela (Nota: apesar de existirem

controvrsias quanto a eficincia deste procedimento, ele ainda amplamente utilizado). A lmpada deve ficar acesa por aproximadamente 15 minutos, durante os quais voc no dever colocar as mos dentro da capela, pois a luz UV provoca srias queimaduras. - Desligue a lmpada UV e ligue a circulao de ar da capela. - Baixe o vidro da abertura da capela. - Limpe a superfcie da capela com etanol 70%. - Coloque o material para dentro da capela. - Inicie o trabalho. Dicas importantes: - nunca obstrua o fluxo de ar da capela com papis, instrumentos ou equipamentos. - se precisar colocar uma tampa estril esterilizada na superfcie da capela, coloquea virada para vaixo. - evite movimentos com as mos para dentro e para fora da capela. - evite usar fogo dentro da capela, apesar de isso, s vezes, ser necessrio.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professor: Charley Christian Staats Aula 10: PURIFICAO DE GUAS (gua destilada, deionizada e ultra-pura) A gua um importante componente das solues e no simplesmente um lquido onde se dissolvem as coisas. A qualidade da gua, a composio e o pH podem afetar drasticamente os experimentos. No faltam exemplos de experimentos que no apresentarem os resultados esperados em virtude da m qualidade da gua utilizada. Existem vrias classificaes gerais da qualidade da gua de acordo com seu grau de pureza: 1. gua de torneira: a qualidade dessa gua varia muito e sua composio depende da localizao geogrfica da fonte, da poca do ano, da quantidade de chuva, da composio dos canos, etc. Alguns minerais podem inibir reaes enzimticas ou impedir o crescimento celular. Por isso, ela no deve ser usada, a no ser para lavagem de vidrarias e utenslios de laboratrio. 2. gua com grau de laboratrio: esta a gua adequada para preparar solues e fazer os experimentos. Ela foi previamente tratada por algum dos mtodos conhecidos, a citar: gua destilada: A destilao um processo h muito estabelecido para a purificao da gua, no qual a gua aquecida at evaporar e o vapor condensado e recolhido. O equipamento relativamente econmico, mas tem um grande consumo de energia usa tipicamente 1kW de eletricidade por litro de gua produzida. Dependendo do design do destilador, a gua destilada pode ter uma resistividade de aproximadamente 1 M-cm e ser estril quando acabar de ser produzida se for utilizado equipamento especificamente concebido para o efeito, mas no continuar estril sem um armazenamento muito cuidadoso. Alm disto, impurezas volteis como dixido de carbono, slica, amonaco e uma variedade de compostos orgnicos passaro para a gua destilada. Quais so as desvantagens da destilao? A destilao produz gua purificada lentamente. No um processo de resposta a pedido. Por este motivo, necessrio destilar uma determinada quantidade de gua e armazen-la para utilizar mais tarde. Este armazenamento da gua destilada pode constituir um problema se o reservatrio em que a gua armazenada no for fabricado num material

inerte. Os ons ou plastificantes sero lixiviados do reservatrio e iro recontaminar a gua. Alm disto, as bactrias desenvolvem-se muito bem em gua que esteja arada durante algum tempo. Em reas de gua dura, os destiladores tm de ser limpos frequentemente com cido, devido acumulao de incrustaes, a no ser que a gua de alimentao seja pr-tratada. gua deionizada Neste sistema utilizam-se colunas de troca inica, contendo tanto resinas trocadoras de ctions quanto resinas trocadoras de nions, as quais removem os ons inorgnicos da gua (Ca+2, Mg+2, Cl-1). Em seguida efetua-se uma destilao normal, para remover os ons restantes e materiais orgnicos. As colunas de troca inica devem ser trocadas frequentemente. gua ultra-pura (gua Milli-Q) Alguns laboratrios tm necessidades especiais em relao gua e exigem guas de alto grau de pureza. Esta gua obtida pela combinao de processos de osmose reversa (a gua passa por uma membrana semipermevel por onde as impurezas no podem passar) com deionizao. A ultrafiltrao, a adsoro em carvo ativo para eliminar matria orgnica e a luz ultravioleta podem ser usados em alguns equipamentos para complementar a purificao deste tipo de gua. Experimentos de Biologia molecular, Bioqumica e anlises de traos de elementos so exemplos de aplicao deste tipo de gua. Princpios de osmose reversa A osmose reversa (OR) um processo que resolve muitos dos problemas da destilao e da troca inica. Para explicar a osmose reversa, vejamos primeiro a osmose. Este um processo natural que ocorre sempre que uma soluo diluda separada de uma soluo concentrada por uma membrana semi-permevel. A gua, levada por uma fora causada pela diferena na concentrao a presso osmtica passa atravs da membrana para a soluo concentrada. O fluxo de gua continua at a soluo concentrada ficar diluda e a contra-presso impedir a continuao do fluxo atravs da membrana (equilbrio osmtico). Quando aplicada uma presso superior presso osmtica no lado da membrana onde se encontra a maior concentrao, o sentido normal do fluxo osmtico invertido, a gua pura passa da soluo concentrada atravs da membrana (impermevel s impurezas) e assim separada dos seus contaminantes. Este o princpio bsico da osmose reversa.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professor: Charley Christian Staats Aula 11: CENTRIFUGAO A finalidade de uma centrfuga separar substncias imiscveis em uma mistura heterognea. E muitos experimentos realizados em Biotecnologia utilizam-se de centrfugas. So usadas para concentrar protenas, extrair DNA e separar pletes de clulas. Importante: a presena de centrfugas em todos os cantos do laboratrio no deve ser motivo de descuido. Ela um instrumento importante e complicado que pode ser facilmente danificado e causar ferimento ferimentos no manipulador, quando for mal utilizada. Existem vrios tipos de centrfugas e nos laboratrios elas so normalmente chamadas pelo nome do fabricante. As centrfugas de alta velocidade so construdas com unidade de refrigerao, necessrias devido ao calor gerado pela alta velocidade. Outras centrfugas esto disponveis tanto em modelos refrigerados como no refrigerados. O frio tambm serve para preservar a amostra que est sendo centrifugada. Os principais tipos de centrfugas so: - Centrfuga de bancada, - Microcentrfuga, - Centrfuga de alta velocidade, - Ultracentrfuga Regras gerais de trabalho na centrfuga: - no coloque para centrifugar materiais radioativos, com risco biolgico ou infecciosos antes de ter certeza de que est usando o material adequado. - Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteo e pinos. No equilibre somente os tubos e sim todo o sistema. Se for preciso usar um tubo para equilibrar encha- o com gua. - Se houver folha de registros, seja meticuloso ao anotar as informaes. Isso importante para manter um controle sobre o uso do equipamento. - Limpe a centrfuga toda vez que usa-la. Use um pano mido. - Conhea as limitaes de velocidade da centrfuga e do rotor e no ultrapasse esses limites. - Use os tubos e os suportes apropriados. Isso especialmente importante em centrifugaes de alta velocidade. Os tubos no devem ficar frouxos nem apertados demais nos suportes ou no rotor. - Preencha os tubos at aproximadamente 2 cm da borda. Se voc encher demais poder ter vazamentos.

- No use tubos com qualquer tipo de rachadura. Descarte estes tubos imediatamente. - No se esquea de tampar o rotor. - Feche a tampa das centrfugas refrigeradas no intervalo de uso para evitar condensao. - Remova as amostrar da centrfuga imediatamente. Nunca deixe as amostras paradas por muito tempo. O plete pode se tornar disperso. Como centrifugar 1. escolha os tubos apropriados ao volume e natureza do que voc vai centrifugar. Use o menor nmero de tubos possvel e procure usar aqueles de volume mais prximo ao do que voc precisa. 2. escolha uma centrfuga e um rotor apropriados a sua amostra. Saiba a que velocidade a amostra deve centrifugada e se deve ser refrigerada ou no. 3. Equilibre os tubos. Cada tubo deve ser centrifugado com um tubo do mesmo peso colocado do lado oposto. O mesmo deve ser feito para todo rotor e toda centrfuga. Importante: somente os tubos colocados frente a frente devem ser de mesmo peso. Como equilibrar os tubos: - tubos de microcentrfuga podem ser ajustados pelo volume n no pelo peso. - tubos de ultracentrfuga e centrfugas de alta velocidade devem ser pesados individualmente em uma balana. 4. coloque os tubos na centrfuga, sempre na mesma orientao. Se ele tem uma assimetria, tal como uma aba na borda, coloque sempre cada tubo no suporte da mesma maneira. Dessa forma voc saber onde procurar o plete. 5. Coloque a cobertura no rotor. 6. Feche a tampa da centrfuga. 7. Programe a centrfuga, ajustando a velocidade de acelerao, o tempo, a temperatura e velocidade de desacelerao. 8. Inicie o processo. Espere at que a centrfuga atinja a velocidade programada, s depois se ausente da sala, pois se houver algum problema de desbalano esse geralmente aparece neste intervalo de tempo. 9. Quando a centrifugao terminar, remova os tubos cuidadosamente para no misturar o plete novamente. 10. Remova o sobrenadante. Isso pode ser feito vertendo-se o lquido cuidadosamente ou por aspirao com micropipeta ou pipeta de Pasteur.

Como determinar a velocidade da centrfuga A velocidade da centrfuga ser dada como fora gravitacional (g) ou rotaes por minuto (rpm). A fora g tambm chamada RCF (relative centrifuge force- fora centrfuga relativa). Os protocolos normalmente determinam a velocidade em g, pois esta pode ser reproduzida facilmente, ao contrrio das rotaes por minuto.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professor: Charley Christian Staats Aula 12: Potenciometria (medida de pH) Em inmeros casos, dentro da rea de Biotecnologia, fundamental conhecer o potencial Hidrogeinico (pH) do material em questo. E isso normalmente deve ser realizado de forma rpida e precisa. Para tanto, utiliza-se um aparelho chamado potencimetro (pHmetro), que permite a medida direta do pH das solues (materiais) em questo. A grande maioria dos pHmetros utilizados em Biotecnologia utiliza eletrodos indicadores de vidro, de forma combinada , ou seja, o eletrodo indicador e o eletrodo de referncia esto combinados em um nica pea. Procedimentos para medida de pH utilizando pHmetros equipados com eletrodos indicadores de vidro Antes da medio: 1. remover a capa plstica de vedao do orifcio usado para enchimento do eletrodo de modo a estabelecer equilbrio com a presso atmosfrica; 2. retirar a capa plstica que protege o bulbo de vidro durante a estocagem, ela contm KCl 3M que garante a hidratao da membrana. Enxaguar o eletrodo com gua destilada para retirar resduos e eventuais cristalizaes do sal no eletrodo; 3. Verificar a necessidade de completar o nvel da soluo interna com a soluo de enchimento, normalmente KCl 3M saturado com AgCl. 4. Calibrar o eletrodo com as solues-tampo escolhidas conforme a faixa de trabalho desejada. Entre uma soluo e outra, lavar o eletrodo com gua destilada. A medida direta e o valor de pH aquele em que houver estabilizao do valor apontado no display. IMPORTANTE: O eletrodo uma pea extremamente frgil e cara. Por isso manipule-o cuidadosamente. Use apenas os dedos na sua limpeza. Na medio: 1. mergulhar o eletrodo de modo que sua juno fique abaixo do nvel da soluo a ser medida.IMPORTANTE: O pH varia em funo da temperatura. E existe uma grande variao entre os aparelhos no que diz respeito ao ajuste de temperatura, por isso procure se informar da forma com que o ajuste deve ser feito no aparelho que voc ir utilizar.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA TCNICA DA UFRGS Curso de Biotecnologia Fundamentos de Laboratrio Professor: Charley Christian Staats Aula 13: ESPECTROSCOPIA VISVEL/ULTRAVIOLETA A espectroscopia visvel/ultravioleta uma ferramenta amplamente utilizada em experimentos qumicos, bioqumicos, microbiolgicos, etc, uma vez que inmeras metodologias analticas se baseiam na absoro da luz polarizada pelas espcies analisadas. FUNDAMENTO A Espectroscopia pode ser conceituada como um procedimento analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatria, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em nm, normalmente) e que apresenta a propriedade de interagir com a matria, sendo que parte de sua energia absorvida por eltrons da eletrosfera dos tomos constituintes das molculas. Uma soluo quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que resultante da absoro relativa dos vrios comprimentos de onda que a compem. Esta absoro, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substncia, de sua concentrao e da espessura da mesma que atravessada pela luz.

Esquema simplificado de um sistema espectrofotomtrico - a luz emitida por uma fonte (normalmente uma lmpada de tungstnio para comprimentos de onda no visvel e de Deutrio no ultravioleta) passa por um monocromador que seleciona apenas o comprimento de onde desejado (luz monocromtica). A luz atinge a amostra, de comprimento de onde b. Alguma quantidade de luz absorvida de forma que I0 > I. A luz que no absorvida detectada por uma clula fotoeltrica e medida em um galvanmetro. Quando a luz (I0) absorvida pela amostra a sua intensidade diminui (I).

b

Io

I

Relao entre cor observada e cor absorvida Comprimento de onda Cor absorvida (nm) 380 440 Violeta 440 500 Azul 500 550 Verde 550 580 Amarelo 580 620 Laranja 620 680 Vermelho 680 - 780 Roxo

Cor observada Amarelo Laranja/vermelho Roxo/violeta Violeta/azul Azul Azul/verde Azul

A lei de Beer A Lei de Lambert-Beer a lei que rege a espectroscopia e diz o seguinte: a absorbncia proporcional concentrao da espcie qumica absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relao linear entre absorbncia ou densidade tica e concentrao, e de uma relao logartmica entre transmitncia e concentrao. A lei de Beer: A = a.b.c sendo A= Absorbncia (adimensional sem unidade) a = coeficiente de extino molar (constante) b= espessura atravessada pelo feixe luminoso c= concentrao

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