4. Teknologi Gena
-
Upload
noer-roman -
Category
Documents
-
view
235 -
download
0
description
Transcript of 4. Teknologi Gena
![Page 1: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/1.jpg)
Teknologi GenaBioteknologi
Binar Asrining Dhiani, M.Sc., Apt
![Page 2: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/2.jpg)
Teknologi Gena
• Kegiatan untuk:
– Mengetahui ekspresi gen
– Mengambil manfaat dari variasi genetik
– Memodifikasi gen
– Memindahkan gen ke inang baru
![Page 3: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/3.jpg)
Langkah-langkah dalam Teknologi Gena
I. Persiapan DNA atau gen tertentu
II. Seleksi dan identifikasiklon yang benar
III. Produksi massalIII. Penerapan di bidang
kedokteran dan pertanian
Introduction ke dalam inang
![Page 4: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/4.jpg)
DNA
![Page 5: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/5.jpg)
Central DogmaAlur Informasi Genetik (dari DNA ke Protein)
![Page 6: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/6.jpg)
Replikasi DNA
• DNA Polimerase:– Mensintesis DNA
hanya dari arah 5’ ke3’, menambah dNTPke gugus hidroksil 3’
– Hanya menambahdeoksiribonukleotidabaru pada primer strand yang berikatanhidrogen dengantemplate strand
![Page 9: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/9.jpg)
Kloning DNA
![Page 10: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/10.jpg)
Vektor Rekombinan DNA
• Molekul DNA yang dapat berpindah dan bereplikasidalam suatu organisme
• Contoh:Vektor Ukuran yang dapat disisipkan (kb)
– Plasmid sampai 15
– Bakteriofage sampai 90
– Bacterial Artificial Chromosome (BAC) 100-500
– Yeast Artificial Chromosome (YAC) 250-2000
• Ciri utama:– Origin of replication: untuk membantu multiplikasi di inang
– Cloning site: untuk dipotong oleh enzim untuk menyisipkanDNA
– Drug resistance marker: untuk seleksi
![Page 11: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/11.jpg)
Metode Transfer GenProkariot
• Elektroporasi
• Perlakuan kimia– Kalsium klorida
– Rubidium klorida
– DMSO
Eukariot
• Elektroporasi– Pembentukan pori oleh arus listrik tegangan
tinggi
• Ko-presipitasi dengan kalsium fosfat– Presipitasi DNA dengan kalsium fosfat
– Absorb ke dalam membran sel
– Masuk ke dalam sel melalui proses kalsium-dependen
• Liposom enkapsulasi– Meng-enkapsulasi DNA pada vesikle liposom
– Peleburan liposom dengan membran sel
• Mikroinjeksi– Injeksi DNA dalam mikropipet gelas kapiler
langsung ke inti sel melalui tekanan udara
• Infeksi retrovirus– DNA rekombinan disambungkan ke genom
retrovirus
– Sel diinfeksi virus
![Page 12: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/12.jpg)
Seleksi DNA Rekombinan
• Sel yang di-introduce molekul DNA kedalam sel bakteri:
– Sel tidak ada plasmidnya
– Sel mengandung plasmid yang tidakmengandung gen asing
– Sel mengandung plasmid yang mengandunggen asing
![Page 13: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/13.jpg)
Seleksi DNA Rekombinan
• Menggunakanobat/antibiotik
• Menggunakan warna– Koloni biru/putih– Vektor mengandung
gen LacZ• Vektor tanpa insert
gene, gen lacz tetaptranskripsi
– Adanya substrat X-Gal akanmenghasilkan warnabiru
• Vektor dengan insert gene, gen Lacz pecah, dipisahkan oleh sisipanDNA asing tidak adaproduk warna
Koloni bakteri resisten terhadap ampisilin
Media kultur mengandung ampisilin
Isolasi koloni
Bakteri mengandungplasmid rekombinan
![Page 14: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/14.jpg)
GENE DELETION vs GENE SILENCING
• Gene Deletion (penghilangan gen)
– Mutasi (perubahan genetik) akibat hilangnyasebagian dari kromosom atau sekuen DNA
• Gene Silencing
– Ekspresi suatu gen di-”switch off” olehmesin-mesin di dalam sel.
– Terjadi ketika RNA tidak dapat menghasilkanprotein saat translasi
![Page 15: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/15.jpg)
GENE DELETION : PrincipleConstruction of KanMX4 deletion cassette
1128 bp1331 bp
SNQ2_L1 SNQ2_L3
SNQ2_L2 SNQ2_L4
SNQ2
First step PCR
Second step PCR
SNQ2_up SNQ2_dw
218bp 294bp
SNQ2_L1
SNQ2_L4
1.5 kb of NotI digested pFA6-KanMX4
KanA_R
KanA_F
SNQ2
Rekombinasi
![Page 16: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/16.jpg)
GENE SILENCING: RNAi (RNA interference)
![Page 17: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/17.jpg)
TEKNOLOGI GENA DALAMPRODUKSI INSULIN
![Page 18: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/18.jpg)
Insulin
• Molekul kecil yang terdiri dari dua rantai protein:– Rantai A: terdiri dari 21 asam amino
– Rantai B: terdiri dari 30 asam amino
• Mengatur kadar gula dalam darah
• Dihasilkan oleh sel beta di pankreas (islet Langerhans)
• Dihasilkan terus menerus dalam jumlah sedikit, namun diproduksi dalam jumlah banyak dalamrangka merespon kenaikan kadar gula dalam darah
![Page 19: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/19.jpg)
Insulin Synthesis
![Page 20: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/20.jpg)
Insulin Synthesis
![Page 21: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/21.jpg)
Insulin Synthesis
• Signal sequence:24 aa
• Chain C: 35 aa
Peptidase
Protease
![Page 22: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/22.jpg)
Insulin Production (History)
• 1920 ekstraksi insulin dari anjing sapi dan babidipurifikasi
• 1950 struktur kimia insulin dan lokasi gen insulin pada kromosom 11 ditemukan
• 1977 gen insulin tikus untuk produksi insulin
• 1980 rekayasa genetik untuk produksi insulin
• 1982 produk insulin manusia melalui rekayasagenetika dari Eli Lilly Corp. di setujui (produk obat hasilrekayasa genetika pertama)
• 2001 95% pengguna insulin menggunakan human insulin (Eli Lilly Corp.)
![Page 23: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/23.jpg)
Porcine dan Bovine Insulin
![Page 24: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/24.jpg)
Mengubah porcine menjadihuman insulin
• Porcine + tripsinmemecah alanin, menambahkanthreonin ester, + water hidrolisis ester danmemecah butanol human insulin
Ala
Thr Ester
Ala
Thr Ester
Thr Ester+
Porcine insulin
Human insulin
![Page 25: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/26.jpg)
Produksi Insulin Rekombinan
![Page 27: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/27.jpg)
Produksi Insulin Rekombinan
• Gen proinsulin
![Page 28: 4. Teknologi Gena](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033018/55cf91ca550346f57b90ae48/html5/thumbnails/28.jpg)
Insulin Purification
• Kromatografiafinitasmenggunakanantibodi spesifikterhadap insulin