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Technologieforum 2007, IHK Potsdam 21.11.2007
Technologieentwicklung:Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie
Frank F. Bier
Fraunhofer Institut für Biomedizinische Technik
Institutsteil Potsdam
Am Mühlenberg 13, 14476 Potsdam-Golm
www.ibmt.fraunhofer.de
und
Universität Potsdam, Institut für Biochemie und Biologie
Lehrstuhl für Angewandte Bioelektronik und Biochiptechnologie
In vitro Diagnostik - Wertschöpfung durch Zusammenarbeit in Berlin-Brandenburg
Technologieforum
IHK Potsdam
21.11.2007
Technologieforum 2007, IHK Potsdam 21.11.2007
Technologieentwicklung:Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie
1. Was sind und wozu braucht man BioChips?
2. Wie werden sie gemacht?
3. Wo kann man sie einsetzen?
4. Entwicklungspotenziale - Perspektiven
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1. Was sind Bio-Chips?
Werkzeuge zur
Simultanen Bestimmung vieler biochemischer und biologischer Parameter aus einer Probe
Gene Transkripte, Proteine, Metabolite...
Analyte, die biochemisch erkannt werden
„Biochip“ = „Microarray“?
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ProteinProtein--ELISA CellELISA Cell--ELISAELISA DNADNA--HybridisationHybridisation PeptidePeptide--AssayAssay
surface for capture molecule coupling
capture
antibody
labeledprobing antibody
Analyte
capture probe
labeled DNA-probe
Microorganism
DNA/RNA
Molekulare Erkennung ist die Basis der in vitro Diagnostik
peptide
Serum antibody
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1. ...und wozu braucht man Bio-Chips?
Hintergrund: in vitro molekulare Diagnostik
• Molekulare Marker• Genetische Disposition
Individualisierte Therapie→ in vivo Diagnostik → therapeutische Empfehlung→ Medikamentation
FunktionelleGenomforschung,Molekulare Medizin
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1. ... und wozu braucht man Bio-Chips?
Mit Bio-Chips werden Aussagen möglich über
• Prädispositionen - prädiktive Diagnostik
• Medikamentenverträglichkeit - Pharmakogenomik
• Wirkung von Zytostatika z.B. an Gewebeproben - Krebsdiagnostik und Therapieunterstützung
• Antibiotikaresistenzen
• ...
• Alle Multiplexanalysen, die auf Bindungsereignissen beruhenMedizin, vet. Medizin, Lebensmittel, Umweltproben etc.
Bisher nur wenige BioChips auf dem Markt - Produktreife in 5 Jahren?
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1. Was sind Bio-Chips? - DNA-Chips
Molekulare Grundlage: Hybridisierung
Sonde oder Probe auf der Oberfläche?
Mikroarray (Chip): Thermodynamisch ungünstige Situation
ACTGGCTAAGGCTACCCGTG
ACTGGCTAAGGCTACCCGTG
ACCGATTCCGATGGGC-
ACCGATTCAGATGGGC-
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Oberfläche (Glas, Si-wafer, Polycarbonat etc.)
immobilisierte Sonde“capture probe”
markierte DNA-Sonde
DNAoderRNA(Analyt)
1. Was sind Bio-Chips? - DNA-Chips
Parallele Detektion zahlreicher Hybridisierungsvorgänge> Multiparameteranalytik
oder markierter DNA-Strang
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1. Was sind Bio-Chips? - DNA-Chips
Mikroarrays aus Mikrospots auf Glas oder Si-Wafernmit >100 bis >100.000 Features
© IBMT Potsdam www.affimetrix.com
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1. Was sind Bio-Chips?
Die Basis: Genomforschung
Genetische Variationen
SNPs
Mikrosatelliten
Deletionen
- Gesamtgenom
- Gemomemikrobieller Erreger
- Auch: „entgleiste Genome“ z.B. in Tumorgewebe
Genom Transkriptom Proteom Metabolom „Phenomenom“
TranskriptionelleVariationen
Umwelteinflüsse (Rauchen, Alkohol, Ernährung, Drogen, Medikamente)
Organ- und Gewebespezifische Variationen
Stärke der Expressionssignale
Expressions-variationen
PosttranslationaleDifferenzen
z.B. Immunantwort
Effektive Mengen und Konzentrationen Krankheits-relevanter Metabolite,
Stoffwechsel-störungen
Der ganze Patient
Vollständige Beschreibung der individuellen Krankheitsausprägung
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Analyse mit Bio-Chip (Microarrays)
1. Problemanalyse:
-Auswahl der zu immobilisierenden Binder, z.B. Sequenzen der Oligomere, -Anpassung der Binder an gemeinsame Bindungsbedingungen auf dem Chip
2 .Probenvorbereitung:
-Probennahme,-Aufschluß-Reinigung -Amplifikation
5. Bindung der (markierten) Probe an die
Binder auf dem Chip:z.B. beim DNA-Mikroarray: Hybridisierung
6. Detektion
i.A. Chip-Reader erforderlich
7. Analyse
Bioinformatik, Datenbanken
3. Herstellung des Mikroarrays
-Aktivierung des Chips-Spotten-ggf. Blocken
4. Markierung
z.B. Einbau von Fluoreszenzfarbstoffen oder Isotopen
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Prozessschritte der Analytik mit Biochips
im Labor
• Probenvorbereitung
• RT-PCR
• Labelling, Markieren
• Chip-Herstellung
• Hybridisieren auf dem Chip
• Waschen, Trocknen
• Auswertung
• Datenanalyse, Interpretation
• Problemanalyse
• Binder-, Sondendesign
• Sondensynthese, Präparation
• Slidepräparation
• Spotten, Drucken, Koppeln
• Blocken
• Waschen, Trocknen
• Qualitätskontrolle
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Transkriptionsanalyse
Heute: 95% aller Mikroarray-Anwendungen(F&E)
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Technologieentwicklung:Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie
1. Was sind und wozu braucht man BioChips?
2. Wie werden sie gemacht?
3. Wo kann man sie einsetzen?
4. Entwicklungspotenziale - Perspektiven
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2. Wie werden Bio-Chips gemacht?
DNA-Chip Technologie (Microarrays)
Herstellungstechniken
Photoaddition Deprotektion Umlagerungen
Photochemisch Strukturierung
mittels Masken
Maskenlose
Strukturierung
Magnetventil-
pipette
Piezo-Pipette "Bubble Jet" Silica-Kapillare
kontaktlos
Nadeln und
Stifte
Stempel "Pin-Rings"
kontakten
"Plot"-Techniken Elektrochemisch "Micropainting" Laser-
Strukturierung
Strukturierung
über
AFM und SNOM
"Array-Techniken"
vorgefertigte Sonden, (Oligonukleotide oder aus natürlichen Quellen)
oder
Synthese auf dem Chip (nur Oligonukleotide und Peptide)
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Typen von Mikroarrays
Single nucleotide polymorphism SNP
gene: Sulfotransferase SULT1, loc 1A1
DIfE - H.R. GlattSpecies identification B. c., B. a.
RKI - U. Nübel
Featuregröße
typ. 250 µm
~ 10 µm
10 nm ?
Proben-
volumen(100 Features)
20 µl
1 nl
1 al
Feature-
zahl
20-
20000
104 -106
?
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www.affymetrix.com/wt/home
DNA-Chip Technologie (Microarrays)
Herstellungstechniken
Synthese auf dem Chip: Photolithographie (Affymetrix)
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OmingridTM Microrrayerhttp://microarray.uc.edu/Resources/microarrayer.htm Affymetrix Pin-Rings
www.mwg-iotech.com/html/instruments/ arrayer/affymetrix_417_arrayer.shtml -27k
OmingridTM Microrrayerhttp://microarray.uc.edu/Resources/microarrayer.htm
OmingridTM Microrrayerhttp://microarray.uc.edu/Resources/microarrayer.htm
OmingridTM Microrrayerhttp://microarray.uc.edu/Resources/microarrayer.htm
DNA-Chip Technologie (Microarrays)
Herstellungstechniken: Kontaktverfahren
(„Stempel“- oder Nadeltechniken, div. Hersteller)
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DNA-Chip Technologie (Microarrays)
Herstellungstechniken:
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Mikroarray Produktionstechnologie
Kontaktfreies Spotten: Universelle Piezo-Dispensierung
< 1nL
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Mikroarray Produktionstechnologie
TopSpot Technologie für R&D und Produktion
non-contact printing (multiple nozzle ink-jet principle )
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Mikroarray Produktionstechnologie
TopSpot Technologie für R&D und Produktion
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QualitätskontrolleAusschnitt aus einer Print-Serie der TopSpot M Maschine.Wässrige Lösungen auf einer hydrophoben Polymeroberfläche,
keine Vorprozesse nach der Reinigung.Direktes Kamerabild der integrierten Kamera, registriert jeden
Druckvorgang, und jeden Druck. Das Qualitätskontrollsystem ist mit zentralem LIMS verbunden.
BioChip Produktionstechnologie - Mikroarrays
TopSpot Technologie für F&E und Produktion von niedrig- bis mitteldichten Mikroarrays
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Spotting Technologie Qualitätskontrolle
Spot quality Intra-Slide-Variation Inter-Slide Variation
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Beispiel: Expressionsanalyse
Vergleichbar gut wie Affimetrix
95% corelation of identical genes foundto be expressed in
both methods
example: mRNA pattern of colon cancerpatient samples
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� Vorteile von Peptiden als Fängermoleküle:
� Peptid-Chemie ist gut etabliert und vollständig automatisiert
� Leichte Reinigung und Qualitätskontrolle
� Chemisch und physikalisch robust
� Viele Proteine können durch Präsentation der linearen Epitope
ersetzt werden > Erhöhung der diagnostischen Potenz
ELISAPeptide microarray
Beispiel: Peptid-Chip
Peptide für serologische Untersuchungen
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� Fluoreszenz basierter Sandwich-Assay
Direkte Inkubation mit Patientenserum
Cy5-goat anti-human IgG/A/M antiserum
Fluoreszenzmessung
(Scanning)
Beispiel: Peptid-Chip
Peptide für serologische Untersuchungen
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z.B. Epitopemapping mit Peptid-ArrayAnti-TSH-Receptor Screening
TSH-Rezeptor in 256 Peptiden als Array von
15meren repräsentiert alle Amionsäuren
Mit: Charité Berlin (Dr. C. Grötzinger)Heiko Andresen, Kim Zarse et al. Proteomics 2005
Beispiel: Peptid-Chip
Peptide Immobilisierung - mittels Protein
Preinkubation der Peptide mit Streptavidin
• Ausgleich der phys.-chem. Differenzen
• alle Peptide in gleichem Puffer
• gleichmäßige Tropfenbildung
• gleichmäßige Spots
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Mit Charité Berlin (Dr. C. Grötzinger)
Heiko Andresen, Kim Zarse et al. 2005
Puffer
Serum
Beispiel: Peptid-Chip
Peptide für serologische Untersuchungen: Nachweis von viralen Infektionen
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� Epitope-genaue Charakterisierung von Antikörpern gegen proteinische Antigene:
Multiparameter Analyse von mAbs gegen den humanen TSH-Rezeptor
Beispiel: Peptid-Chip
Peptide für das Epitope-Mapping
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Technologieentwicklung: Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie
1. Was sind und wozu braucht man BioChips?
2. Wie werden sie gemacht?
3. Wo kann man sie einsetzen? 4. Entwicklungspotenziale - Perspektiven
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Nervous SystemNormal retina/brain (0%)Retinoblastoma (50%)Glioblastoma multiforme (75%)Oligodendroglioma (100%)Anaplastic astrocytoma (10%)Meningioma
Ordinary (17%)Atypical (92%)Malignant (100%)
Adrenal. Neonate (0%)Ganglioneuroma (0%)Neuroblastoma (94%)Normal tissue adjacent to tumor (0%)
Head and NeckNormal oral mucosa (3%)Squamous cell carcimoma (86%)Normal adjacent tissue (4%)
HepaticNormal tissue (0%)Liver disease, nonmalignant (29%)Hepatocellular carcinoma (86%)Normal tissue adjacent to tumor (2%)
Reproductive Tract - FemaleFetal ovary (100%)Adult ovary (33%)Normal endometrium (0%)Leiomyoma (0%)Leiomyosarcoma (100%)Endometrial adenocarcinoma (100%)Cervical carcinoma (100%)Vaginal carcinoma (100%)Ovarian carcinoma (91%)
Reproductive Tract - MaleTestis (100%)Mature spermatozoa (0%)Normal prostate (0%)BPH without carcinoma (5%)BPH with carcinoma (11%)High grade PIN (60%)Prostate carcinoma (90%)
SkinNormal epidermis (44%)Squamous cell carcimoma (83%)
Basal cell carcinoma (95%)
Melanoma (86%)
Urinary TractNomal bladder endothelium (0%)Dysplastic bladder endothelium (43%)Bladder carcinoma (92
washings (73%)voided urine (29%)
Renal carcinoma (83%)Normal tissue adjacent to tumor (0%)Wilm‘s tumor (100%)Normal tissue adjacent to tumor(33%)
GastrointestinalGastric adenoma (27%)Gastric carcinoma (85%)Normal tissue adjacent to tumor (5%)Colorecta adenoma (45%)Colorecta carcinoma (89%)Normal tissue adjacent to tumor(25%)Pancreatic carcinoma (33%)
BreastNormal breast tissue (0%)Fibrocystic disease (0%)Fibroadenoma (28%)Carcinoma in situ (75%)Carcinoma, ductal and lobular (88%)Normal tissue adjacent to tumor (5%)FNA benign lesions (9%)FNA malignant lesions (81%)
LungSmall cell lung carcinoma (100%)Non-small cell carcinoma (78%)Normal tissue adjacent to tumor (4%)
nach: M.P. Granger, W.E. Wright, J.W. Shay (2002) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 41: 29-40
Biochips sind Hilfsmittel für die individualisierte Therapie
Molekulare Diagnostik
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Motivation: Indikator für Bedeutung - Marktentwicklung
Infektionskrankheiten, Krebsdiagnostik, Pharmakogenomik, Genetischer Screen
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Applikationsfelder für Mikroarrays (Labordiagnostik)
Infektionsdiagnostik: Bedarf: 1. Beschleunigung der Diagnostik
2. Bestimmung der Antibiotikaresistenzen
Keimidentifizierung: Bakterielles oder virales Genom
Species identification B. cerveus., B. anthracis
RKI - U. Nübel
Vorteil gegenüber mikrobieller Bestimmung• Zeitgewinn• differentielle Aussage möglich• ggf. Antibiotikaresistenzen frühzeitig bestimmbar > effizientere Therapie
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Applikationsfelder für Mikroarrays (Labordiagnsotik)
Krebsdiagnostik: • Genomischer Screen des entarteten Gewebes• Transkriptionsmuster des entarteten Gewebes im Vergleich zum
Normalgewebe
Hoher Forschungsbedarf für die Charakterisierung der Transkriptionsmuster (Signaturen)Problem: Probennahme und Charakterisierung (>Biobanking)
Ziel: Vorhersage der Zytostatikaeffizienz > Therapieansprechen
Beispiel:
Onkogenchip für Coloncarcinom
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Applikationsfelder für Mikroarrays (Labordiagnsotik)
Pharmakogenomik: • Genomischer Screen des Patienten
Ziel: Vorhersage der Arzneimittelverträglichkeit bzw. optimaler Dosierung aufgrund des individuellen Metabolisierungsmusters, das aus dem Genom besimmt wird.
Stand: Ein P450-Chip ist auf dem Markt
P450 Affimetrix-Roche diagnsotics
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Applikationsfelder für Mikroarrays (Labordiagnsotik)
Humangenetik: Patienten/ Probandengenom
Multifaktorielle ErbkrankheitenPrädispositionen
Epidemiologische Studien erforderlich- aber:Was ist der Standard? - was ist Krankheit?
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Technologieentwicklung: Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie
1. Was sind und wozu braucht man BioChips?
2. Wie werden sie gemacht?
3. Wo kann man sie einsetzen?
4. Entwicklungspotenziale - Perspektiven
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„Die Wertschöpfungskette“ der molekularen Diagnostik
1. Risikogruppen Identifizierung
Identifizierung
molekularer Marker
in vivo DiagnostikaIndikation
DatenpoolGenom/Proteom
IVD, Biochips:1. DNA-Analyse,2. mRNA-Analyse3. Marker-Proteine
4. Prädiktive Diagnostik
3. Fühstadien Erkennung
2. Präsymptomatische Diagnose
5. Therapiekontrolle
Validierungmolekularer Marker
Klinische Studien
Probennahme (SOP)
Biobanking
Gesundheitsversorgung
Regularien
Markt
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Die „Wertschöpfungsspirale“ der Molekularen Diagnostik
Analyse der Genomischen
Datenressourcen (Bioinformatik)
Identifizierung von
Risikogruppen(ggf. klin. Studie)
IdentifizierungMolekularer Marker
in vivo Diagnostik
Indikation
Genomik/ProteomikIVD, Biochips:
1. DNA-Analyse,
2. mRNA-Analyse
3. Marker-Proteine
TherapievorschlagMedikamentauswahl 3. Prädiktive Diagnostik
+ klinische Studien
2. Früherkennung
+ klinische Studien
1. Präsymptomatische
Diagnose + klin. Studie
4. Therapiekontrolle
Feed-Back: ValidierungMolekularer Marker
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Integrierte Mikroarrays für die Point-of-Care Diagnose?
Stand der Entwicklungen und Forschung
Affymetrix;
Biacore;
Agilent; >> F&E-Markt, non diagnostics
i-stat, >> few parameters, not flexibel
QuickLab (SIEMENS)
• viele F&E-Projekte mit öffentlicher Förderung für Lab-on-Chip
• viele F&E-Projekte mit Ziel der Point of Care Diagnostik
>> bisher „proof of principles“- oder „proof of concepts“> Schwerpunkt auf Technologie ohne Produktionstechnik> ohne konkrete Anwendung
Bewertung:
Noch erheblicher Entwicklungsbedarf bis zur Routineanwendung
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Ergebnis hoch-differentielle Diagnostik
> Therapie und Medikamentierung werden besser auf Patient und
Krankheit abgestimmt,
> höherer Therapieerfolg,
- Diagnose ohne Therapievorschlag?
Feststellung von Prädispositionen
> gesunde Lebensführung möglich
- wird der Patient erst durch die Diagnose zum „Leidenden“?
- wie geht der Patient mit Wahrscheinlichkeitsaussagen um?
Point of Care-Diagnostik
> schnellere Diagnose - früherer Therapiestart
- auch für den Patientenselbsttest?
Ohne ärztliche Beratung in den meisten Fällen unsinnig!
Missbrauch genomischer Daten - möglich?
- wie kann die ärztliche Schweigepflicht gesichert werden?
- wer bekommt Zugang?
Konsequenzen