355a Molecular y Control de Calidad) - Universidad de Granada
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La Patología Molecular y el Control de CalidadLa PatologLa Patologíía Molecular y el Control de Calidada Molecular y el Control de Calidad
AsunciAsuncióón Olmo Sevillan Olmo SevillaMaster DiagnMaster Diagnóóstica S. L. stica S. L.
UNIDAD DIDÁCTICA 7: LOS PROCESOS EN ANATOMÍA PATOLÓGICA
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X
Patología Molecular: Patología del futuro
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Personal:Director Facultativo: Patólogo con amplia formación en Patología Molecular
Responsable Técnico: Licenciado/Doctor/Tecnólogo especializado en Biólogía Molecular.
Técnicos de laboratorio: Capacitados para técnicas moleculares
Responsable de Calidad: Conocimientos y capacidad de gestión
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Obtención de tejidoObtención de tejido
Preparación de tejido
Selección de material
AnálisisInterpretación
Informe de resultados
AnálisisInterpretación
Informe de resultados
Biólogo Molecular+
Patólogo
PCRqPCR
Western Blot
FISH……
Cirujano
Patólogo
Técnico E. A. P.
Técnico
Especializado B. M
Extracción DNA
Responsable de Calidad
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ORGANIZACIÓN DE LAS ÁREAS DE TRABAJO
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OBJETIVOS:- Minimizar la contaminación de reactivos y muestras clínicas- Bioseguridad- Separación de espacios físicos- Diferentes presiones (positiva en pre- y negativa en post-)
Flujo de trabajo y material unidireccional
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1. Uso obligatorio de guantes desechables en todas las etapas del proceso:• Bioseguridad para el usuario.• Impedir que las DNasas/RNasas/proteasas de la piel degraden el DNA/RNA
o inhiban las técnicas moleculares.• Evitar contaminaciones con el DNA genómico del usuario.• Recambio frecuente evita la mayor parte de las contaminaciones.
2. Precisión en el pipeteo:• Manejo de volúmenes muy pequeños: < 1ml (escala de microlitros)• Errores en volúmenes mínimos ( p. ej. 0,5 µl de DNA polimerasa), pueden
invalidar un test.
3. Rigurosidad en la manipulación de las muestras clínicas:• Mínimas cantidades de una muestra que pasen a otra pueden contaminar y
dar lugar a resultados erróneos (falsos positivos)
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� Fuentes de contaminaciFuentes de contaminacióón:n:DNA procedente de muestras clínicasDNA del usuario (si no trabaja con guantes)DNA de productos de amplificación!!!!
��QuQuéé hay que descontaminar:hay que descontaminar:- Superficies - Material- Equipos
��CuCuáándo: ndo: - Diariamente o después de cada uso, - Cuando se detecte una contaminación en las pruebas diagnósticas
��CCóómo se elimina el DNA contaminante: mo se elimina el DNA contaminante: -Lejía diluida (1% en agua) durante 10 min- Etanol 70% para eliminar los restos de lejía
EL ETANOL NO DESTRUYE EL DNA!!!EL ETANOL NO DESTRUYE EL DNA!!!LA ESTERILIZACILA ESTERILIZACIÓÓN EN AUTOCLAVE NO DESTRUYE EL DNA!!!N EN AUTOCLAVE NO DESTRUYE EL DNA!!!
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- Costo/beneficio-Selección de la técnica más adecuada:
- Información que aporta - Complejidad- Rapidez- Requerimientos:
- Espacios, equipos, material, personal- Desarrollo propio/Kits comerciales - Manual/Automatización
CRITERIOS DE SELECCIÓN
- Protocolo de trabajo - Formulario de solicitud- Informe de resultados- Comunicación a los clínicos- Controles de calidad
PUESTA EN MARCHA
VALIDACIÓN DEL TEST-Controles y calibraciones
Reproducibilidad Sensibilidad y especificidad Correlación con datos clínico
- Análisis comparativo con otros métodos gold-estándard
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•La carga de trabajo y conocimientos que requiere la puesta a punto,validación y control de calidad de métodos caseros(llega a superar los costes de los kits comerciales)
•Reproducibilidad y verificación de lotes
•Las normativas legales requieren que los diagnósticos sean realizadoscon métodos aprobados por las Autoridades Sanitarias (Marcado CE IVD)
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Programas de Control de Calidad
� Interno: � Control de sensibilidad y especificidad, validación de
resultados, etc.� Monitorización de todas las etapas del análisis a través
de controles apropiados� Externo:
� Evaluación de resultados mediante comparaciones
periódicas interlaboratorios.
Controles: muestras de positividad/concentración /calidad reconocidas que se procesan en paralelo a las muestras de pacientes.
Qué controles?
Cuándo se usan?
Qué aportan?
Qué hacer cuando fallan?
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TECNICAS BASADAS EN PCR:
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TECNICAS BASADAS EN PCR:
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TECNICAS BASADAS EN PCR:
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TECNICAS BASADAS EN PCR:
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-Revisiones externas periódicas y documentadas de la metodología y resultados
-Evaluar por un centro de referencia externo:la calidad pre-analítica, analítica y post-analítica (sensibilidad y especificidad)
-Comparativa interlaboratorios : fiabilidad, reproducibilidad y mejora calidad de diagnóstico
Garantía de Calidad en Patología de la SEAP (GCP):Módulo de Patología Molecular 2011:
Mutaciones KRAS/BRAFMutaciones EGFRDetección del virus HPVAmplificación Her2-neu
KRAS European Quality Assurance Program
ESP European QA Program
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� Los resultados brutos del test: electroferogramas, imágenes de geles, secuencias, autorradiogramas,.. deben ser de suficiente claridad y calidad para que su interpretación sea unívoca.
� Se requiere la documentación de las condiciones del ensayo, lote de reactivos y cantidad y calidad del DNA empleado.
� Para los ensayos in situ (FISH), los resultados deben mostrar una clara correlación con los hallazgos histopatológicos del tejido (H&E)
� Todos los resultados brutos se deben adjuntar con el informe final y con la interpretación clínica de los resultados.
� Sólo deben informarse los resultados con resultados adecuados de controles+/-
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Steps of the direct sequencing
Wherever any productresults during the workflow process, QCmay be implemented
QC can occur at each step
Reagent QC at all steps
KRAS : Direct SequencingANÁLISIS MUTACIONAL DE KRAS POR SECUENCIACION
QC en todas las etapas del proceso
Cualquiera de los productos intermedios que resulten del proceso de trabajo se deben controlar
QC de reactivos en todas las etapas
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Material de partida
Extracción de DNA
Amplificación por PCR
Análisis de mutaciones
ANÁLISIS MUTACIONAL DE KRAS
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5 sections 20 µm-thick 1 H.E.
QC Tejido
Examen microscópico por
el patólogo
Secciones de tejido
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Microdisección (concentrar el tumor)
+ =
normaltumor
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Material de partida
Extracción de DNA
Amplificación por PCR
Análisis de mutaciones
ANÁKISIS MUTACIONAL DE KRAS
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Extracción automática de DNA de Tejidos parafinados
QC: Blanco sin DNA Control de calidad DNA(concentración y pureza)
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Material de partida
Extracción de DNA
Amplificación por PCR
Análisis de mutaciones
ANÁKISIS MUTACIONAL DE KRAS
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Agarose Gel
Amplificación del DNA por PCR
QC1: Blanco sin DNAQC2: Blanco de PCRQC3: Control Negativo
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Material de partida
Extracción de DNA
Amplificación por PCR
Análisis de mutaciones
ANÁKISIS MUTACIONAL DE KRAS
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Análisis mutacional por Pirosecuenciación
QC1: Control Negativo
QC1: Blanco
Muestra problema
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