20071015 SNP, protein Chips (BC4) - tcu.edu.t · 玻璃, 尼龍薄膜. • 此機種為DNA, ......

生物晶片概論 4 :SNP, Protein Chips & Others

陳光琦助理教授陳光琦助理教授 ((KuangKuang--Chi Chen)Chi Chen)[email protected]@mail.tcu.edu.tw, Office: H603, Office: H603--22

http://www.chichen6.tcu.edu.tw/http://www.chichen6.tcu.edu.tw/

生物晶片原理

• 將數千至數萬個點(spot), 又稱探針(probe), 以高密度方式放置於拇指大小之晶片, 利用生物結合特性, 大量測量反應結果.

• 放置的生物有: 互補核甘酸(cDNA), 寡核甘酸(oligonucleotide), 蛋白質(protein), 抗原(antigen), 抗體(antibody) … 等.

• 晶片的材質有: 玻璃, 二氧化矽, 尼龍薄膜, 聚丙烯, 聚甲基丙烯酸甲酯, 金, 二氧化鈦..

生物晶片設備

• OmniGridArrayer生物晶片打點機

• 晶片的材質有: 玻璃, 尼龍薄膜.

• 此機種為DNA, 蛋白質皆適用多功能機型.

Source:

生物晶片設備 (CONT’D)

• Spotted DNA arrays

Source:


• 一個模版上含有標準100個顯微鏡玻片, microtiterplates放置在一個可裝載及卸下的模板上, 沖洗及乾燥站.

• 一般商業用的晶片機械裝備包含一個懸臂式XYZ手臂, 在手臂上裝載著32個針筆 Source:


• 針筆

Source:

生物晶片種類 – 依用途分類

• 1. 樣品製備– 主要用途為分離及濃縮特定細胞，以供檢驗之用

• 2. 生化反應– 加速生化反應用之晶片，典型晶片代表為核酸擴增反應晶片(PCR Chip)

• 3. 結果檢測– 如毛細管電泳晶片即是一例

生物晶片種類 – 依特性分類

• 1. 基因晶片(Gene chip, DNA microarray)利用共軛互補的核酸為探針, 整齊排列在晶片上. 應用其互補序列之核酸雜交結合, 進行檢體檢測. 依晶片上的探針可細分為: cDNA陣列 & oligonucleotide陣列

• 2. 蛋白質晶片(Protein chip)以蛋白質為生物探針, 排列於晶片上, 進行抗原-抗體免疫反應. 用以檢測蛋白質.

生物晶片種類 – 依特性分類 (CONT’D)

2. 蛋白質晶片 - 尚待克服的技術

• 提升結合於晶片上之抗體或結合物的穩定性• 有效鏈結具正確方向及足夠數量之抗體或結合物於晶片上

• 提昇晶片之靈敏度• 研發可資辨別不同生命物質的擷取抗體或晶片結合物


3. 微流體晶片(Microfluidics chip)

4. 晶片實驗室(Lab-on-a-chip )：整合若干微管道及微反應於一塊晶片上以完成各種樣品處理、反應或分析檢測，功能類似一個小型實驗室之縮影。依功能可細分成下列兩種：

–PCR晶片 (PCR chip)–毛細管電泳晶片 (capillarylectrophoresis chip)


• 基因晶片(gene chip)蛋白質晶片(protein chip)細胞晶片(cell chip)組織晶片(tissue chip)人類晶片(human chip)

電泳分析晶片(electrophresis chip)檢體前處理晶片(sample preparation chip)組合化學晶片(combinatory chemistry on a chip)

生物晶片種類 – 依製作分類

生物晶片種類 – 依製作分類 (CONT’D)

• Glass arrays

Source:


• GeneChip® cartridge. Stephen Fodor developed a technique called GeneChip® probe arrays where he built the sequences he wanted to screen. These GeneChip®arrays are printed on special glass.


• Ink-jet arrays

使用特殊生物墨水噴射技術，將所需之DNA直接“印”在晶片上，長度約為25~60mers

優點為設計彈性大、且製造速度快，但缺點是過於昂貴

Source:

PROTEIN CHIP

蛋白質晶片

蛋白質晶片的原理與免疫轉印相同

a. 例用蛋白質與分子間的專一性結合

b. 通常把蛋白質固定在玻片或尼龍薄膜

c. 以微小化增加測試數目達到高產能

d. 靈敏而方便的檢測系統是關鍵

Source:

蛋白質晶片的種類

捕捉型反應型

Source:

蛋白質晶片的應用範圍

蛋白質晶片的問題

• Difficulties in making protein chips-Different from nucleic acids, proteins are fragile and less robust, and more variable in chemical composition

-No easy way to amplify proteins in vitro-Storage of the protein array to keep the activity

* If these problems solved, it is the future star biotech tool.

蛋白質晶片系統的市場規模

7千6百萬美金

7億6千萬美金

Source:

蛋白質晶片 P-sensor 2000

P-Sensor 2000 is an ultra-sensitive biosensor instrument that can detect the interactions between biomolecules.

P-Sensor 2000 utilizes Quartz Crystal Microbalance (QCM) as the sensor transducer and user selected biological recognition component to detect and analyze the target biomolecules in solution.

Source:

P-sensor 2000

P-Sensor 2000 enables detection of molecules concentrations and monitoring the dynamics of the interactions between molecules in real time without the use of labels; such as fluorophores, radioactives.

P-Sensor can be applied to detect the interactions between biomolecules, such as protein and protein; antigen and antibody; enzyme and substrate; pharmaceutical substances and receptor; hormone and receptor; nucleic acid and nucleic acid; nucleic acid and protein; protein and whole cell.

Component of Biosensor

Analyte Biomolecule Transducer ElectronicDevice

P-sensor Application1. Antibody-antigen

2. DNA, DNA binding protein, Transcription Factor

3. Cell Biology

4. Protein-protein, Protein-ligand interaction

5. Biological Recognition

6. Product Characterization

Source:

Affinity interaction between receptor and ligand

Reaction of Biomolecules

Interaction between antibody and antigen

Interaction between nucleic acids or nucleic acid and protein

蛋白質之抗原-抗體晶片

• 利用已知基因序列, 在動物體內表達它編碼的蛋白(人工抗原), 來引發特異的抗體, 再利用這個抗體來尋找人體組織內的相應蛋白(自然抗原)。這就是抗體引導蛋白與基因鑑定法(圖)。

• 通過基因所產生的抗體(基因抗體), 在人體組織或細胞找到由這組基因的功能性蛋白質, 就可了解基因與它編組的功能性蛋白的隱密關係。

Source:

抗體引導蛋白與基因鑑定法

GAPGAP

AMIGAP : Antibody-Mediated Identification of Genes And Proteins

Gene Protein

Antibody

利用蛋白質晶片製造抗體

e.g.• 傳統的製造抗體, 費時又費錢, 並且從小鼠或兔子提取的抗體也有限。若開發以生物, 例如雞, 作為生產系統, 將值得研究與疾病相關的人類基因, 在雞體內表達人工抗原, 由雞的免疫系統對該抗原產生抗體。

• 雞的抗體在蛋黃濃縮儲存。一顆雞蛋能產生50-80毫克抗體, 相當於100隻小鼠的抗體產量。並且雞的抗體結構穩定, 與人類蛋白交叉反應小, 也許適合抗體晶片的應用。

Source:

常見的蛋白質晶片

Source: U-Vision Biotech Inc.

PROTEOMICS (2D-ELECTROPHORESIS)


YEAST ORF PROTEIN MICROARRAY


BINDING ASSAYS ON PROTEIN MICROARRAY


QUALITY CONTROL ON PROTEIN CHIPS

Source:

MULTI-CHANNEL REACTION KINETICS ON PROTEIN CHIP W/ IMAGING SPR-ELLIPSOMETRY

Samples kindly provided by Graffinity, Heldelberg

Source:

IMAGING SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) FOR BIOCHIPS

Source:

SNP, SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM

• 生物染色體的核酸序列經常會有變異, 很多都是發生在單一個鹼基, 稱為SNP. 人類染色體中每 100-300 鹼基(bp)就有可能有一個SNP, 這些單點變異可能不會影響後來表現出的蛋白質, 但也可能是某些疾病的根源.

• SNP為單一鹼基對變異• 定義: 在族群中的發生率

SNP - 單核苷酸多形性狀之偵測

• 因為單一核苷酸的不同，造成基因表現的強弱不同，或整個蛋白質的性質變異，使得每個人外形、健康狀況的不同，甚至罹患遺傳疾病。

• 清楚哪些SNP會如何影響人類的生理性狀和疾病的易感性。

• 可定量化個人「體質」的差異性。• 藉由檢視個人的SNP資料，醫師可

實施個人化醫療方法。

MORE SNP• SNP, single nucleotide polymorphism:單一核苷酸多型性• 總數約在1,000～3,000萬個, 可能是「個體差異」主因,

i.e., 單一核苷酸在群體中呈現差異導致• SNP圖譜製作：人類基因定序後的工作• 應用－解析病原基因與藥物

－疾病風險診斷

－縮短新藥上市時間

－提高藥品商業價值，針對特定族群上市

E.g. 1997年美國Abbott Laboratory公司藥物Zyflo(Zileuton)因有4%患者有肝障害問題, 與SNP圖譜相關, 開發選擇性處方, 於2000年核可

全球第一件依SNP判讀之新藥因有4%Source:

• 生物晶片(biochip)是一微小化之實驗室。

• 優點：克服傳統檢測的缺點，可以大量、快速、精確且靈敏地偵測病原體。

• 功能：有助於癌症及早篩檢、新型藥物開發、以及生化戰劑之偵測。

MORE 生物晶片(BIOCHIP)


一旦金粒子連接後則形成通路引發警報，可用來偵測病原體

Source:


結合抗體之生物晶片可抓住病原體，再藉與具螢光標記之抗體結合來偵測病原體

Source:

BIOCHIP

TYPES OF BIOCHIPS

生物晶片的優點

• Simultaneous screening of 100s~30,000s genes or proteins in a single experiment

• Faster rate

• Small size; less reagents needed

• Relatively low cost

• Analysis through automated hardware and software

生物晶片加速基因分析

• Parallel Analyses Parallel Analyses-Analyze entire genomes instead of single genes

-Analyze gene expression-Analyze genetic polymorphisms

• Miniaturization

• Automation

SUMMARY: DNA陣列的應用

• Measuring transcript abundance (cDNA arrays)

• Genotyping

• Estimating DNA copy number (CGH)

• Determining identity by descent (GMS)

• Measuring mRNA decay rates

• Identifying protein binding sites

• Determining sub-cellular localization of gene products

全球生物晶片的市場

年度 DNA 晶片縮微實驗室晶片

（Lab-on-a-chip）

蛋白質晶片

（Protein chip）Total

1999 158 14 4 176

2000 197 23 6 226

2001 249 35 8 292

2002 310 62 10 382

2003 395 85 17 497

2004 506 115 35 656

2005 725 157 68 950

Source:

生物晶片的發展瓶頸

微陣列基因或蛋白質晶片是目前技術較成熟之生物螢光感測晶片，但由於整個晶片從前處理、點晶到螢光掃瞄、判讀過程複雜、耗時，且標準規範尚未建立，造成許多困擾，也阻礙生物晶片的商品化及未來發展。

Illuminex發展的光纖式微陣列生物晶片

•250000 array sensors

•將光纖朿端面腐蝕形成坑凹再將光纖束浸在不同的微米球溶液中，微米球表面先經修飾不同的官能基及螢光劑；將光纖取出乾燥，此時帶有不同官能基的小球會落在光纖端面凹坑處，不同的官能基即可選擇性的結合待檢測的蛋白質或抗體分子，雷射光經由光纖打照到光纖端面的微米球激發螢光，再直接經由光纖反射至光偵測器或CCD成像，同樣具有高密度微陣列生物晶片的效果。 Source:

光子晶體光纖微陣列生物感測晶片之競爭優勢

‧光纖式生物晶片免除了傳統生物晶片點晶及掃瞄等步驟，可顯著改善時效及準確性。

‧光纖式生物晶片製作成本低，未來在市場競争力也較具有優勢。

‧目前光纖式生物晶片在製程上仍有問題，如光纖端面腐蝕如何達到最佳化及如何控制小球穩定的固定在凹坑位置。

‧硏究光子晶體光纖可精密控制空孔大小，使小球亦較容易穩定的固定在凹坑位置。

光子晶體光纖微陣列生物感測晶片之競爭優勢

‧光子晶體是十年來光電學門最重大的發展之一，其中光子晶體光纖在通訊、感測技術、光譜分析及醫學上的應用都深具潛力。

‧設計及製作出實用性空心蕊光子晶體光纖，將此

技術應用在製作高密度微陣列生物晶片。

OTHER KNOWLEDGE … NANO

奈米電腦

• (1) 量子計算機(quantum computer)• 2000年8月15日：IBM公司、Stanford大學、卡爾加里大學的科學家運用奈米技術，聯合研製出以5個原子作為處理器和內存的高子計算機，並首次證明這類裝置有明顯快於常規計算機的運算潛力。

• 科學家成功地將量子理論和資訊科學結合起來，產生一個新的領域------量子資訊技術(quantum information technology)。

Source:

• 量子計算機的特點目前正在開中的量子計算機有3種類型：核磁共振(NMR)量子計算機、矽(Si)基半導體量子計算機和離子井(ion well)量子計算機。

• 1. 具有真正的平行計算功能。一個400位長的數字要對其進行因子分解(factorization)，即使使用世界上最快的巨型機也要10億年(人類的歷史才300多萬)的時間，但若用量子計算機求解，有一年左右的時間便夠了。這種並行計算方式與傳統計算機線性運算方式相比，就如同萬隻飛鳥飛上天空與萬隻蝸牛排隊過獨木橋的區別。

• 2. 存儲能力大大提高。量子計算機的數據是用量子位元存儲的。量子位元(quantum bit)具有疊加效應(superposition effect)，一個量子位元可同時處於0和1兩個狀態

• 3. 體積和功耗大幅度減小

• (2) 超導電腦• 所謂超導(superconductor)是指有些物質在接近絕對零度(ok)時，電流流動是無阻力的。1962年，英國物理學家約瑟夫遜(Josephson)提出了超隧道效應(superconducting tunnel effect)原理，即由超導體一絕緣一超導體(SIS)組成元件。約瑟夫遜因此獲得諾貝爾獎(Nobel Prize)。

• 用約瑟夫遜元件製成電腦，稱為約瑟夫遜電腦，也就是超導電腦。

• (3) 化學電腦• 化學電腦是採用碳(C)基化學製品來代替電子零件。在活的生物體內進行震盪化學反應，可起開關作用，以此代替電晶體製程化學電腦。

• (4) 生物電腦• 科學家發現，蛋白質(protein)有開關特性，用蛋白質分子作元件製成的積體電路，稱為生物晶片(bio chip)。使用生物晶片的電腦稱為蛋白質電腦(protein computer)，或稱為生物電腦。

• 蛋白質構成的積體電路大小只相當於矽片積體電路的10萬分之一，而且運轉速度更快，只有10~11s。

• 生物晶片傳遞資訊時阻抗小，耗能低，而且具有生物的具有自我組織(self organization)和自我修複(self repair)的功能。

• 在生物電腦中，最誘人的設想首推DNA電腦(DNA computer)，科學家提出DNA電腦的原理是，DNA分子之間可以在某種酶(enzyme)的作用下瞬間完成生物化學反應，從一種基因代碼(gene code)變成另一種基因代碼。

• DNA電腦運算速度快。存儲容量非常大，1m3的DNA溶液可存儲1萬億億位數據。消耗的能量極低，只有一台普通電腦的十億分之ㄧ。

• (5) 神經電腦(neural computer)• 人腦總體運行速度相當於每秒1000萬億次的電腦功能，用許多為處理器摹仿人腦的神經元結構，採用大量的並行分布式網路以構成神經電腦。

• 日本科學家已開發出神經電腦用的大型積體電路晶片，在1.5 cm2的矽片上可設置400萬個神經元和4萬個神經節，這種晶片能實現每秒2億次的運算速度。NEC推出一種神經網路聲音識別系統，能識別出任何人的聲音，正確率達99.8%。

• 神經電腦將廣泛應用於各領域，又被稱為人工電腦(artificial brain)，是人類開發的第六代電腦.

奈米技術

•一、分子計算機• 2000年科學家頭一次證實從DNA可以組裝為奈米馬達驅動鑷子，稱為DNA馬達(DNA motors)。

• DNA馬達由三條DNA單縷(three single strands of DNA)所構成A(深藍色)、B(綠色)、C(紅色)。A縷依照鹼片段的密碼而與B和C縷各一半附結於中央處而形成為鉸鍵狀。然而B和C縷的另一半各懸掛在兩腳端，猶如做兩手臂的作用。如此，DNA馬達可成為分子開關(molecular switch)。

Source:

• 電腦(計算機)的原理是藉開關或電晶體的電流開關作用，代表”1”和”0”的數位電腦語言。

• 因為電腦晶片是由這種開關元件所構成，所以當分子開關(DNA馬達或奈米碳管都具潛力)被開發以後，電腦晶片必變成為超級晶片構成為分子計算機(molecular computer)。

• 奈米DNA馬達有兩特點：(一)在馬達內NA同時擔任建築磚塊以及馬達燃料的角色。(二)假如選擇之合的成分，達成可自已組裝(self-assrmbling)為微細回路(micro-circuits)。

• 理論上，利用DNA馬達將可以在數滴溶液內組裝有30兆(trillion)(=1012)個，可以反覆運作”開”或”關”的鑷子。Bell實驗室的科學家預期10年內時間內這種技術將之產品化。

二、生物晶片

• 現代科學家，將電腦科技(computer technology)和基因科技(gene technology)相結合，就可以開發出傳統的電腦晶片(computer chips)一樣的DNA生物晶片(bio-chips)。

• 生物晶片的原理是將生物體高分子，如核酸、蛋白質、抗體等，用微面積、高密度方法精確的點製在如玻璃片、尼龍膜片基質上，製成如一張郵票大小的晶片。在這晶片表面上連結的DNA分子，稱為探針。每一探針內依DNA長度而含有從種到數百萬稱的單核酸(nucleotides)片段。

• 晶片檢測的程序是從患者的血液或組織試片中，篩選出要檢驗特定基因DNA拉鍊片段，並分離為兩條單縷再取出其中之一單縷使其分裂小片段。將這檢體小片段與螢光物質(fluorescent chemical)相混合。將這混合射入探針DNA晶片使其進行雜交反應。雜交成功的檢體DNA會留在探針晶片上，再根據晶片上的呈色用雷射掃瞄來讀各基因是右與正常基因有差別。分析儀將告訴是否突然變異基因存在。

• 在21世紀開端，人類已完成了基因定序的圖譜，使生命科學向前邁進一大步。基因工程最具代表性的產品就是生物晶片。據估，目前全球晶片市場約三億元，成長快速，至2005年將達30億美元.

三、基因醫療法

• 基因治療是靠聰明醫藥遞送系統(smart drug delivery systems)將相關的基因材料輸送到需要修復破損的體內細胞(body cells)。這醫藥送系統目前採用三種導子導航：

• 1. 病毒(virus)• 2. 油脂類(lipids)• 3. 高分子(polymers)

理想的導子應具下面三點特徵：

1. 能濃縮基因DNA成為細小(奈米等級)的包裝(package)以期能為目標細胞所吸收。

2. 能保護基因DNA不被細胞破壞性酵素(enzymes)所損害而能將DNA活性遞送到目標細胞。

3. 導子本身不帶毒性(toxic) 。

–科學家正尋找適當的油脂類和高分子以便可代替以病毒為基的導子。

–Mark E. Davis (California Institute of Technology)發展出一種高分子叫著β-cyclodextrins (CDs)做為導子，並與DNA結合形成為奈米級粒子(nanometer-size particles), Davis正採用這種醫藥遞送系統醫治各種癌症以及肝病(liver diseases)等疾病。

–油脂類(lipids)中也有可做為基因療法中方醫藥遞送導子。

四、醫藥遞送系統

• 從基因治療法的說明，我們已知道，醫藥遞送系統是治療成功與否的關鍵。許多醫藥特別是蛋白質為基的醫藥假如被口服，就很快被消化酸(digestive acid)或酵素所分解而很難安然地通過腸壁再進入血液而遞送到患部。

解決之道有三：• 1. 以生體粘住性高分子(bioadhesive polymers)塗覆醫藥並使其容易通過細胞粘膜(mucosa) 。

• 2. 以目標分子(targeting molecule)連結醫藥，使其容易被腸細胞上的接受體(receptors)所吸收。

• 3. 以載體分子(carrier molecules)連結醫藥，使其護送到細胞內。

• 其他管道的醫藥遞送系統包括：• 1. 經皮膚：用滲透原理• 2. 經肺：用噴射原理

五、智慧微晶片

• 有效醫藥的另一方法是控制釋放(controlling release)。醫藥的功效靠定時定量釋放醫藥，使在身體內的藥分水準能夠保持一定。科學家設計出一種可植入體內的微晶片(microchips)使醫藥箱內的醫藥能定時定量釋放。這智慧微晶片是生物科學和奈米科學共同開發的成果。

• 控制釋放的原理是晶片內有一電源，以金薄片(thin gold foil)蓋許多藥物箱。當接信號來電時，就溶解金薄片蓋而因此藥物被釋放。

六、細胞感應器

• 在生物奈米科技中，第一個實際應用的例子就是生物感應器。生物對分析物有高度的感應特性。

• 最近，麻省理工學院(MIT)研究人員製出一種新種生物感應器也叫著細胞感應器。這種感應細胞一旦接觸危險病毒或細菌，幾秒鐘內就會發亮，以協助第一線應變人員迅速偵測出任何生物恐佈攻擊武器。

• 利用這種生物感應系統可在街上、地下鐵或機檢驗可疑物質，不必須送到實驗室檢驗，至少需要幾小時才結果，而細胞感應器在30秒鐘內就完成檢驗。

• 生物感應系統也能夠迅速分辨大腸桿菌，因此，可以用於檢驗食品和水質。這種系統也可用於診斷、例知檢驗唾液，立即判斷病人究竟感染SARS或普通感冒。

REFERENCES & 資料來源

• 中研院蔡驥孟研究員之演講/講義• 台灣大學林啟萬教授之演講/講義• 台灣大學莊耀宇教授之演講/講義• 台灣大學基因體中心微陣列核心實驗室蔡孟勳博士• 耶魯大學趙崇基博士之演講/講義• 中央大學洪炯忠教授之演講/講義• 僑光技術學院許信儀教授之演講/講義• 中華大學溫盛發教授之演講/講義• U-Vision Biotech Inc. (微晶生物科技股份有限公司)

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