2. Analitika hiralnih jedinjenja - Univerzitet Crne Gore · Gasna hromatografija 3. Te čna...
Transcript of 2. Analitika hiralnih jedinjenja - Univerzitet Crne Gore · Gasna hromatografija 3. Te čna...
1
1
ANALITIKA HIRALNIH JEDINJENJA
Doc. dr Biljana Stojanovi ć
2
• odgovarajuće grupe jedinjenja u živom organizmu su u obliku samo jednog enantiomera
• ugljeni hidrati (D), aminokiseline (L), proteini, hormoni, enzimi, alkaloidi...
Biološki organizam Hiralni selektor(hiralna sredina)
Lekovi na tržištu – 50 % racemati
Lekovi sa 50 % nečistoća ???
Homohiralnost prirode
2
3
Hiralne molekule
Hiralnost – molekule se odnose kao predmet i lik u og ledalu.
Par hiralnihmolekula u
rukama
par enantiomera
Podsetimo se...
4
Nehiralne molekule :
� Nemaju asimetrični centar
� Imaju ravan simetrije
� Nisu optički aktivni
Hiralne molekule :
� Imaju jedan asimetrični centar –
atom povezan sa 4 različita
supstituenta
� Optički aktivni
Hiralne i nehiralne molekule
3
5
Osobine enantiomera
Iste fizi čko-hemijske osobine
(MS spektar, NMR spektar, IR spektar, hemijske reakcije...)
Razlikuju se po ravni skretanja polarizovane svetlosti:
-jedan skre će u smeru kazaljke na satu (+) - dekstrogiri
- jedan skre će u smeru suprotnom kazaljke na satu (-) -levogiri,
-smeša (+) i (-) oblika u odnosu 50:50 je racemat
-racemat ne obr će ravan polarizovane svetlosti
6
Bitne osobine hiralnih lekova
� Farmakološki aspekt� Toksikološki aspekt
� Farmakokinetički aspekt
� Aspekt analitike hiralnihlekova
� Komercijalni aspekt
4
7
Farmakološki aspekt
Upotreba lekova racemata u kliničkoj praksi:
1. jedan enantiomer aktivan (eutomer) , a drugi inaktivan ili je
aktivnost smanjena (distomer) ili prouzrokuje toksičnost ili
neki drugi željeni ili neželjeni efekat
2. oba enantiomera imaju istu aktivnost
3. jedan ili oba enantiomera podležu hiralnoj inverziji
8
1. Enantiomeri sa različitom aktivnošću
S(-) - propranolol
100 x aktivniji kao β-blokator
R(+) - propranolol
Terapija hipertireoidizma
R(-) - albuterol S(+) - albuterol
aktivan, 5 x skuplji od racemata inaktivan i neželjeni efekti
O NH
OHH
O NH
H OH
HO
HO
HN
HO H
HO
HO
HN
HHO
5
9
2. Oba enantiomera sa istom aktivnošću
R,S flekainid(antiaritimik)
R,S fluoksetin(antidepresiv)
O
F3C
HN
CH3 O
NH
O
F3C
CF3
HN
O
10
3. Enantiomer(i) podležu hiralnoj inverziji
R(-) - ibuprofen S(+) - ibuprofen
R(-) - oksazepam S(+) - oksazepam
CH3
H3C
COOH
CH3H
CH3
H3C
COOH
CH3H
in vivo
100 x aktivniji
N
HN
Cl
O
OH
H N
HN
Cl
O
OH
Hin vitro
100 x aktivniji
6
11
Toksikološki aspekt
HO
OH
COOH
NH2H
L - dopa D - dopa
(antiparkinsonik) (agranulocitoza)
S(-) - sekobarbitalR(+) - sekobarbital
(antikonvulziv) (antikonvulziv)
potentniji i toksičniji anestetik
HO
OH
COOH
H NH2
HN N
O O
OH
CH3
H
HN N
O O
OH
H
CH3
12
N
NH
O
O O
O N
NH
O
O O
Oin vivo
R(+) - talidomid S(-) - talidomid
sedativ, imunomodulator, teratogen??
7
13
1. Transformacija prohiralne supstance u hiralni metabolit
ketoni 2° alkoholi
fenitoin (R,S)-4-hidroksifenitoin
2. Transformacija hiralne supstance u hiralni metabolit
(S)-varfarin (S)-7-hidroksivarfarin
redukcija
oksidacija
oksidacija
HN
NH
O
O
HN
NH
O
O
OH*
O O
OOH
H
O O
OOH
H
OH
Farmakokinetički aspekt
14
3. Transformacija hiralne supstance u dijastereoizomerni metabolit
(-)-mentol (-)-mentol glukuronid T1/2 = 2,4h
(+)-mentol (+)-mentol glukuronid T1/2 = 4,0h
OH
OH
OGlu
OGlu
2° met.
2° met.
8
15
Razvoj postupka za dobijanje čiste hiralne aktivne farmaceutske supstance
zahteva:
�Određenu kontrolu procesa sinteze
�Farmakološku i toksikološku procenu oba enantiomera
� Odgovarajuću procenu metabolizma i distribucije
�Odgovarajuću kliničku procenu lekova
Da li je lako dobiti čist aktivan enantiomer?
Odgovor: Dobijanje čistih enantiomera je složen i skup postupak!
16
Analitika enantiomera
Određivanje enantiomerne čisto će:
1. Polarimetrija2. Gasna hromatografija3. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC)
Veliki zna čaj u:
1. Farmaceutskoj industriji 2. Analizi iz biološkog materijala
9
17
1. Polarimetrija
PrednostiBrza, jednostavna i jeftina metodaNajčešće se upotrebljava za određivanje optičke aktivnosti
NedostaciZahteva da uzorci budu homogeniNe sme doći do kristalizacijeUgao rotacije čistog enantiomera mora biti poznatUgao rotacije osetljiv na promene temperature i koncentracije rastvoraKod koncentrovanih rastvora specifična optička rotacija i koncentracija nisu u linearnoj zavisnosti
α= dobijeni ugao rotacijel = dužina ćelije u dm
c = koncentracija u g/mL
18
Hiralna stacionarna faza koja sadrži hiralni agens visoke enantiomerne čistoće, adsorbovan na površinu silikeReverzibilne dijastereoizomerne interakcije – razdvajanje enantiomera
PrednostiBrza i jednostavna metoda
Nečistoće u tragovima ne utiču na rezultateVeoma osetljiva metodaNa osnovu faktora selektivnosti, α moguće je odrediti jačinu interakcije između pojedinačnih enantiomera i hiralne stacionarne faze
Moguće određivanje apsolutne konfiguracije (uz standard)NedostaciSkupa metoda
Analizirane supstance moraju biti isparljive i termostabilne
2. Gasna hromatografija
U Ph. Eur. za određivanje hiralne čistoće.
10
19
Hiralno razdvajanje:−građenje dijastereoizomernih soli−enzimsko razlaganje enantiomera (mikroorganizmi)−klasična HPLC−hiralna HPLC
najkorisnija u analizi hiralnih lekova
3. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom
20
Hiralna HPLC
Direktna Indirektna
Hiralni derivatizacioni agens�hiralna mobilna faza�hiralna stacionarna faza
Mehanizam razdvajanjaFormiranje kompleksa između enantiomera i stacionarne faze različite energije vezivanja razdvajanje
11
21
Za razdvajanje enantiomera HPLC metodom potrebno je obezbediti hiralnu sredinu!
Načini postizanja hiralne sredine su:
� Primenom hiralne mobilne faze i nehiralne stacionarne faze
� Primenom hiralne te čne stacionarne faze i nehiralnemobilne faze
� Primenom hiralne čvrste stacionarne faze i nehiralnemobilne faze
22
Najznačajniji hromatografski parametar za razdvajanje enanatiomera je faktor selektivnosti:
Pri čemu je k2 > k1
Cilj : razdvajanje na baznoj liniji uz α<3
12
23
���� Hiralne mobilne faze
Hiralni agens
+ enantiomeri dijastereoizomeri
Različita raspodela između stacionarne i
mobine faze
24
Princip : u mobilnu fazu doda hiralni agens koji gradi komp leks sa
parom enantiomera, nagra đuju se dijastereoizomeri koji imaju
razli čite distribucione koeficijente izme đu mobilne i stacionarne
faze.
hinin
PrImer hiralnog selektora:
13
25
Primer: razdvajanja enantiomera N-(1-feniletil)ftalamske kiseline uz upotrebu hinina kao hiralnog agensa
Hromatografski uslovi : stacionarna faza, LiChrosorb SI 100, 5 µm; mobilna faza, dihlormetan–butan-1,2-diol (99:1 V/V) koja sadrži 0,35 mM hinina i sirćetne kiseline; UV detektor.
26
Prednosti primene hiralnog agensa:
� postojanje velikog broja hiralnih agenasa
� ekonomična (hiralni agensi se dodaju u malim količinama)
� nema ograničenja pri izboru mobilne faze
� ne mora imati visok stepen optičke čistoće
Ograni čenja primene hiralnog agensa:
� nakon razdvajanja enantiomeri nalaze u obliku dijastereoizomernih
kompleksa, čija je disocijacija u nekim slučajevima onemogućena
14
27
� Hiralne te čne stacionarne faze
Primer: razdvajanja β aminoalkohola norefedrina na (+)-dibutil tartarat stacionarnoj fazi
Hromatografski uslovi: kolona, (+)-dibutil tartarat Phenyl Hypersil 150 mm ×4,6 mm, 5 µm veličina čestica; mobilna faza, fosfatni pufer (pH 6,0) koji sadrži heksafluorofosfat, zasićena dibutil tartaratom; UV detektor, 254 nm.
Ako se hiralnom tečnom fazom obloži površina stacionarne faze, pri čemu je mobilna faza zasićena stacionarnom fazom, dobija se tečno – tečni hromatografski sistem raspodele.
28
���� Hiralne čvrste stacionarne faze
1. vodonične veze
2. π-π interakcije
3. dipol interakcije
4. stvaranje inkluzionih kompleksa
5. sterno uslovljene interakcije
Da bi hiralna stacionarna faza mogla da interaguje sa svakim enantiomerom i prevede ga u odgovarajući dijastereoizomerni kompleks potrebno je da se ostvare najmanje 3 od sledećih interakcija:
16
31
Na osnovu mehanizma razdvajanja hiralne stacionarne faze dele se na:
1) „ Brush-type” hiralne stacionarne faze - mali molekuli,
najčešće sa grupama koje sadrže π – elektrone vezane za
površinu silike
2) spiralni polimeri - uglavnom celuloza i njeni derivati
3) šuplje faze - tipa ciklodekstrina, policikličnih etara i
makrocikličnih glikopeptidnih antibiotika
4) proteinske faze
5) ligand – izmenjiva čke faze
32
1. “Brush-type” hiralne stacionarne faze
Primer: prva sintetisana i najviše korišćena je sa dinitrobenzoilfenilglicinom– Pirkle faza
Osnovne karakteristike:
Ima dve amidne grupe
Mogu da ostvare dipol-dipolinterakcije, vodonične veze
dinitrobenzoilgrupa
akceptor π – elektrona
Stupa u interakciju sa donorima
π – elektrona
Jedinjenje mora imati u strukturi aromatičan
prsten!!!
17
33
Primer: Primena DNBPG silike za razdvajanje (D, L)-propranolola(u obliku oksazolidonskog derivata) iz krvi.
Hromatografski uslovi: uzorak, puna krv, 2,5 h nakon primenjene doze od 80 mg racemske smeše propranolola, koji je derivatizovan fozgenom do oksazolidonske strukture; kolona, 3,5-DNB-fenilglicin silika, 25 cm × 4,6 mm, 5 µm veličina čestica; mobilna faza, heksan – izopropanol –acetonitril (97:2:1 V/V/V), protok, 2 ml min-1; fluorescentni detektor, 290 – 335 nm; IS, interni standard (oksazolidonski derivat pronetalola).
34
Primeri brush type hiralnih stacionarnih faza
18
35
2. Spiralni polimeri
Vrste:
a) nederivatizovana mikrokristalna celuloza
b) derivatizovana mikrokristalna celuloza – triacetil, tribenzoat, trifenilkarbamat...
Nederivatizovana mikrokristalna celuloza
36(a) celuloza tris(3,5-dimetillfenilkarbamat) ; (b) amiloze tris(3,5-dimetilfenilkarbamat) i
(b) celuloza tris(4-metilbenzoat)
Derivatizovana mikrokristalna celuloza
19
37
Primeri spiralnih hiralnih stacionarnih faza
38
3. Šuplje faze
a) Ciklodekstrinske
α - cikodekstrin – sadrži 6 jedinica glukoze
β - cikodekstrin– sadrži 7 jedinica glukoze
γ - cikodekstrin– sadrži 8 jedinica glukoze
struktura zarubljene kupe
Koriste se u :
-hromatografiji reverznih faza
-hromatografiji normalnih faza
-hromatografiji sa veoma polarnim mobilnim fazama
20
39
b) policikli čni etri
-selektivno interaguju sa aminokiselinama i primarnim aminima
40
c) makrocikli čni antibiotici
vankomicin
-voluminozni molekuli koji pored nekoliko benzenovih prstenova sadrže i nekoliko prstenova peptidnog tipa
aglikon
glikon
21
41
Neke osobine stacionarnih faza sa makrolidnim antibi oticima:
1. stabilne u većini rastvarača
2. bilo koja promena u stacionarnoj fazi je reverzibilna
3. visoka selektivnost u svim tipovima hromatografije (može se
koristiti i u hromatografiji normalnih i u hromatografiji reverznih
faza)
4. pogodne je za optimizaciju i razvoj metode
42
4. Proteinske faze
Princip : mnogi proteini, pogotovo enzimi, ali transportni proteini, poput albumina, pokazuju visok stepen enantioselektivnosti u interakciji sa malim hiralnim molekulima. Ovo je iskorišćeno u enantioseparaciji tako što je vezivanjem proteina za površinu silike dobijena nova klasa stacionarnih faza namenjena za razdvajanje hiralnih lekova
22
43
�Komercijalno dostupne proteinske stacionarne faze su: albumini, α-kiseli
glikoprotein, ovomukoid, avidin, celobiohidrolaza I i pepsin.
�Proteini se nalazi vezan za sferne čestice veličine 5 µm. Enantiomeri
pretežno kiselih jedinjenja mogu se razvojiti direktno bez prethodne
derivatizacije.
Prednosti i ograni čenja:
Proteinske faze su skupe, teške za rukovanje, a zapremine uzorka koje se
mogu analizirati na njima su male. Međutim u mnogim slučajevima njihova
izvanredna enantioselektivnost nadomešćuje ove nedostatke.
44
5. Ligand izmenjiva čke faze
Princip: aminokiseline vezane za površinu stacionarne faze u prisustvu Cu2+ jona mogu stereoselektivno da interaguju sa aminokiselinama iz vodenih rastvora.
Grafički prikaz dijastereoizomernog kompleksa D- i L-fenilalanina na L-prolin silika stacionarnim fazama u prisustvu jona bakra
23
45
�Upotreba ligand – izmenjivačkih stacionarnih faza je odgovarajuća za
razdvajanje aminokiselina, β-aminoalkohola i sličnih struktura jer sadrže
dve polarne funkcionalne grupe na odgovarajućem rastojanju.
�Interesovanje za ovakav pristup je ograničeno zbog niske efikasnosti
ovih kolona, problema prilikom detekcije nederivatizovanih uzoraka i
prisustva jona bakra u mobilnim fazama.
46
Primeri ligand-izmenjiva čkih hiralnih stacionarnih faza
Prolin-bakar kompleks
24
47
Indirektno razdvajanje enantiomera
Princip : ako se enantiomeri derivatizuju sa hiralnim, optički čistim reagensom,
dobija se par dijastereoizomera. Dijastereoizomeri su molekuli sa dva ili više
hiralnih centara, koji imaju različite fizičke osobine.
Dijastereoizomeri mogu biti razdvojeni u nehiralnom hromatografskom sistemu,
ali derivatizacioni agens mora biti pažljivo odabran.
Dervatizacioni agens mora biti visokog stepena čistoće da ne bi došlo do
nastajanja dva para enantiomera
Pri procesu derivatzacije voditi računa da ne dođe do racemizacije
Derivatizacioni agens mora biti u višku
Funkcionalna grupa koja se derivatizuje treba da bude blizu hiralnog centra
48
Reakcija (R,S)-metoprolola sa (S)-terc-butil-3-(hloroformoksi)-butirat i određivanje odnosa enantiomera u humanoj plazmi.
Hromatografski uslovi: stacionarna faza, oktadecil silika; mobilna faza, fosfatni pufer – acetonitril (50:50 V/V); fluorescentni detektor, 272/312 nm.
Primer
Pogodno za analizu bioloških
uzoraka
25
49
Primeri ispitivanja enatiomerne čisto će
Levodopa
1.
Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.
Određuje se D-dopa (nečistoća D).
Hromatografski uslovi:
Kolona: C18 150 mm × 4,6 mm, 10 nm veličina čestica
Mobilna faza: rastvor bakar(II)-acetata i N, N-dimetil-L-fenilalanina u vodi sa pH podešenim glacijalnom sirćetnom kiselinom na 4,0 i metanol.
Talasna dužina: 280 nm.
Protok: 1 mL min-1
Limit za ne čisto ću D je 0,5 %.
50
Metotreksat
2.
Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.
Određuje se (R)-metotreksat (nečistoća F).
Hromatografski uslovi:
Kolona: 150 mm × 4,6 mm pakovana sa goveđim albuminom vezanim za silika gel za hromatografiju veličine čestica 7 µm sa porama veličine 30 nm
Mobilna faza: rastvor anhidrovanog dinatrijum-hidrogenfosfata i natrijum-dihidrogenfosfata, pH podešen na 6,9 pomešan sa propanolom.
Talasna dužina: 302 nm.
Protok: 1,5 mL min-1
Limit za ne čisto ću F je 3,0 %.
26
51
Naproksen
3.
Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.
Određuje se (R)-naproksen (nečistoća G).
Hromatografski uslovi:
Kolona: 250 mm × 4,6 mm pakovana sa stacionarnom fazom tipa π-akceptor/π-donor za hiralno razdvajanje, 5 µm veličine čestica
Mobilna faza: glacijalna sirćetna kiselina, acetonitril, 2-propanol i heksan.
Talasna dužina: 263 nm.
Protok: 2,0 mL min-1
Limit za ne čisto ću G je 2,5 %.
52
Zaklju čak
1. Razdvajanje enantiomera je od velikog značaja u farmaceutskoj inustriji
2. Zbog malih razlika u osobinama između enantiomera (samo u smeru okretanja ravni linearno polarizovane svetlosti) mora se posvetiti posebna pažnja razvoju metode
3. Najveći značaj u analitici enantiomera ima hiralna hromatografija
4. Hiralna hromatografija je složena i zahteva veliko iskustvo ekpserimentatora