1._Introduccion_Cromatografia

5/10/2018 1._Introduccion_Cromatografia - slidepdf.com

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Material de apoyo para EQAyC 3

La fase estacionaria esun sólido, o un líquidoinmovilizado sobre unsoporte sólido.

La fase móvil se leconoce como eluyente o acarreador y puede serun gas o un líquido

I. PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFÍA

El término “cromatografía ” fue ideado por elbotánico ruso Tswett en 1906 a partir de las palabrasgriegas que significan “color” y “escritura”. Diseño unmétodo para separar la clorofila y otros pigmentos de lasplantas mediante un tubo (columna) lleno de carbonato

de calcio seco (empaque de la columna). Vació sobre lacolumna una mezcla de disulfuro de carbono y éter de

petróleo (fase móvil) y observó que al lavar la columna conmás disolvente los constituyentes del extracto descendíanpor la columna a distintas velocidades y se separaban en

anillos coloreados (ver figura 1).

Figura 1. El experimento de Tswett.




DEFINICIÓN: La cromatografía se

define como la técnica analítica de

separación originado por la competencia

de dos fases por los componentes de

La separación de los componentes de la muestra ocurre debido a quecada componente de la muestra interactúaen forma distinta con los componentes de

la fase estacionaria. Entre más afines seanlos dos, más difícilmente serán eluídos porel solvente.

El proceso mediante el cual el eluyente hace que un compuesto salga dela columna se denomina elución . Al constituyente mayoritario de una soluciónse le denomina solvente y al constituyente minoritario soluto . No es necesario

que las substancias a separar sean coloridas, pero sí debe disponerse de algúnmétodo apropiado para su detección. En cualquier caso, los resultados segrafican para dar un cromatograma . Cada “pico” representa un componente

distinto de la muestra, y el área del pico es una medida de la concentraciónrelativa de ese componente. La figura 2 muestra un cuadro sinóptico con los

principales tipos de cromatografía y su clasificación.




Figura 2. Una clasificación de los métodos cromatográficos.




MECANISMOS DE SEPARACIÓN EN CROMATOGRAFÍA

El principio para que se separe una muestra en sus componentes puedeser debido a 5 principales fenómenos físicos:

1. Adsorción. En este mecanismo se utiliza una fase estacionaria porosa, conun área superficial muy grande (por ejemplo, carbón activado o sílica gel).El soluto se adsorbe en la superficie de la fase estacionaria. La causa de quese mantenga adsorbido el soluto se debe a la separación de este a lo largode la superficie de la fase estacionaria.La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de lacromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la hanconvertido en un método importante de la HPLC.

Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida.Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masasmoleculares inferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de

adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunoscasos se superponen.En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras

que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidadlimitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan encromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografíatambién se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales.

Una característica particular de este método es su capacidad paradiferenciar compuestos isómeros en mezclas.

2. Reparto. La fase estacionaria es una película delgada fija sobre un soportesólido previamente preparado. El soluto se separa por el equilibrio que seestablece por la solubilidad que tenga el soluto frente a este líquidoestacionario y a la fase móvil gaseosa o líquida.

Para ilustrar esto, supongamos que tenemos una serie de vasos deprecipitado llenos con agua hasta la mitad. Se añade al primero de los vasos

una mezcla de las moléculas A y B. A posee una Kr (hexano:agua) de 0.9, entanto que la Kr de B es 0.1. A continuación se añade un volumen de hexanoal primer vaso, se agita, se permite la separación de las fases y se recuperadicho hexano. El hexano recuperado en este primer vaso se añade alsegundo y se añade más hexano limpio al primer vaso. Ambos se agitan, sedejan separar las fases y se recupera el hexano. El hexano del segundo vasose pasa al tercero el del primero al segundo y se añade hexano nuevo al

primer vaso. Este procedimiento se repite hasta que todos los vasos sellenen con hexano.




Si el experimento consistiese de 8 vasos, al final la cantidad de A y de Bpresente en cada vaso (sumando lo contenido en el hexano y el agua)presentará una distribución como la que se muestra en la figura 3.

Figura 3. Distribución de A y B en hexano y agua

Si juntamos los vasos 1 al 3 por un lado y los vasos 6 al 8 por otro y evaporamos el solvente, habremos separado la sustancia A de la B con unamínima pérdida (lo que se quedó en los vasos 4 y 5).

SEPARACIÓN POR EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO

Ejemplo del principio de reparto entre dos fases inmiscibles.

Cuando una mezcla de moléculas disueltas en un solvente determinado sepone en contacto con otro solvente que sea inmiscible con el primero, lasmoléculas disueltas se difundirán hacia la nueva fase hasta alcanzar una

concentración en cada fase (solvente) que depende de la solubilidad relativade dicha molécula en las fases.

Figura 4. Principio de reparto entre dos fases inmiscibles.

En la figura 4, las esferas rojas representan moléculas muy solubles en

hexano y poco solubles en agua, mientras que las esferas verdesrepresentan moléculas muy solubles en agua y poco solubles en hexano.

AGUA

HEXANO




El resultado es que ahora la fase hexánica contiene a las moléculasrepresentadas por esferas rojas y estas se han separado de las otras, quepermanecen en el agua.

La concentración de moléculas "rojas" en el hexano dividida por la

concentración de moléculas "rojas" en el agua, cuando se ha alcanzado elequilibrio, representa el Coeficiente o Constante de Reparto de lasustancia en cuestión entre agua y hexano.

Kr = (Concentración en Hexáno)/(Concentración en el agua).

Así mismo, se puede calcular un coeficiente de reparto para las moléculas"verdes". Es evidente que la Kr("rojas") será elevada, mientras que la

Kr("verdes") será muy pequeña.

Una sustancia determinada presentará una Kr diferente para cada par desolventes que se ensaye. Debe advertirse también que esta definición esválida siempre que los volúmenes de solvente empleados sean grandes, a finde evitar que las soluciones se saturen.

Dado que la difusión de las moléculas de una fase a la otra es lenta, elproceso debe acelerarse agitando la mezcla de solventes hasta formar unasuspensión fina de gotitas de hexano en el agua o viceversa. Para recuperarla fase hexánica se permite que la dos fases se separen por sedimentación

(dado que son inmiscibles y de distinta densidad). Aunque esta separaciónde fases también puede acelerarse mediante centrifugación.

La separación puede hacerse más completa si después de recuperar elhexano, se añade una nueva cantidad de hexano limpio al agua. Esta vez,las pocas moléculas "rojas" presentes en el agua pasarán al hexano y la

cantidad de ellas que permanezcan en el agua será aún menor.

La eficiencia de la separación depende del número de lavados con solvente y de la diferencia en las constantes de reparto de ambas substancias.

Generalizando:

K =conc .de X en el solvente 1

conc .de X en el solvent e 2=

[X ]1

[X ]2

Otro ejemplo:




En teoría, es posible separar una mezclade substancias realizando un número

muy grande de extracciones hastagarantizar la pureza deseada. Sinembargo, la extracción líquido-líquidotiene la desventaja de que es un procesopor lotes, no continuo. Además, realizarun número grande de extracciones estedioso y se puede perder fácilmente unagran cantidad de muestra entre cada

extracción

el yodo es 85.5 veces más soluble entetracloruro de carbono que en agua, demodo que para este sistema elcoeficiente de reparto es:

K =conc .de yodo enCCl 4

conc .de yodo en H 2O = 85 .5

Entonces, una manera sencilla de

separar el yodo de una solución acuosasería extraerlo con CCl4. El sentido común nos dice que entre másextracciones realicemos, más completa será la remoción del componente.Aunque no es difícil deducir la fórmula básica para la extracción por lotes,

en esta ocasión la daremos sin demostración:

W n =W 0V 2

KV 1 +V 2

n

donde:K coeficiente de reparto para el soluto X entre los solventes 1 y 2

n número de extracciones realizadasW0 gramos de X en el solvente 2 antes de cualquier extracción

(iniciales)Wn gramos de X en el solvente 2 después de n extracciones (finales)V1 volumen del solvente utilizado para cada extracción

V2 volumen del solvente donde está el soluto originalmente

Explicaremos el uso de la fórmula con un ejercicio.

Ejercicio: Supongamos que queremos extraer 2 gramos de soluto X de 50 mL de agua.Como solvente de extracción se usará cloroformo. Para este sistema se sabeque el coeficiente de reparto es:

K = [X ]1[X ]2

= [X ]CHCl 3

[ X ]H 2O = 3

¿Qué es mejor: hacer una extracción con 150 mL de cloroformo, o hacertres extracciones con 50 mL de cloroformo cada una?

Solución: Identificamos al solvente 1 como el cloroformo. El solvente 2 es el agua. Elcoeficiente de reparto K está escrito en la forma correcta (conc. 1 / conc. 2).

Entonces,




a) Una sola extracción (n = 1) con 150 mL de cloroformoV1 = 150 mL de CHCl3

V2 = 50 mL de H2OW0 = 2 g de soluto X hay inicialmente en el agua

W 1 =W 0V 2

KV 1 +V 2

1

W 1 = 250

3(150 ) + 50

1

= 0.2 g

Quedaron 0.2 g de X en el agua. Pudimos extraer 2-0.2 = 1.8 g, es decir, el90 % de X.

b) Tres extracciones (n = 3) con 50 mL de cloroformo cada unaV1 = 50 mL de CHCl3 V2 = 50 mL de H2OW0 = 2 g de soluto X hay inicialmente en el agua

W 3 =W 0V 2

KV 1+

V 2

3

W 3 = 250

3(50) + 50

3

= 0.03125 g

Quedaron 0.03125 g de X en el agua.Pudimos extraer 2 - 0.03125 = 1.969 g, es decir, más del 98 % de X.

3. Intercambio Iónico. Para que se efectúe la separación, la fase estacionaria

se modifica uniendo a su superficie especies electro activas (aniones ocationes) de forma covalente.

¡Tres extracciones

pequeñas sonmejores que unagrande!

La separación se realiza debido a lasfuerzas electroestáticas entre cargasopuestas de la fase estacionaria y los solutos cargados. La fase móvil es un

líquido.




Intercambiadores catiónicos Intercambiadores aniónicos

La matriz de la columna contiene La matriz de la columna contiene

unidos grupos anionicos con unidos grupos catiónicos concarga negativa. carga positiva.

Figura 5. Ejemplos de intercambiadores ionicos

Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga

iónica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir unamuestra, las moléculas de igual carga salen con el amortiguador. Lasmoléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con

distintos grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas seusa una solución alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerseusando soluciones con incrementos moderados de

salinidad, o de un solo paso, echando la solución demayor concentración de sal primero. Al subir la

concentración poco a poco podemos recolectar lasmuestras desde las que menos afinidad por lacolumna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va

compitiendo con la proteína por las cargas de la matriz de la columna,hasta que la desprende.

Figura 6. Principio de la cromatografía de intercambio iónico.

. La columna puede ser

de matriz negativa(intercambio catiónico) opositiva (intercambio

aniónico).

En resumen los factoresque determinan laseparación de lasmoléculas son el tamañodel poro, el tamaño de lapartícula y el flujo deelución.




4. Exclusión molecular. Esta separación se debe al

tamaño del componente de la muestra. Se asemeja

a un “tamiz molecular”, en el cual la faseestacionaria es un gel poroso que atrapa a laspartículas pequeñas del soluto, mientras que las

grandes, no caben por los poros de este gel y pasan de largo sin serretenidos. Por lo tanto, las partículas pequeñas tardan más en salir de la

columna. El tiempo de elución es proporcional al pesomolecular de los componentes, por lo que no es

muy usada con los compuestos de alto pesomolecular. Este tipo de separación por tamaño

difiere de las demás técnicas de cromatografía enque no existen interacciones físicas o químicasentre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice quecontienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar lasmoléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande seexcluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las depequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas

que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para lasmoléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto lasmoléculas se eluyen por su tamaño decreciente.

Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente, tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex),

derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor

tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.

La cromatografía deexclusión, también esllamada de filtración en gel

o cromatografía de

permeación en gel.

Este técnica se emplea

en la separación deproteínas de alimentos,determinación de glucosa y fructosa en zumos de

fruta, etc.




Figura 7. Principio de la cromatografía de filtración en gel.

5. Afinidad. Es la técnica más reciente y más selectiva. Se inmovilizan moléculas

(como enzimas y anticuerpos) sobre lasuperficie de la fase estacionaria. Loscomponentes de la muestra altamente afines a estas moléculas se retienencon gran eficacia mientras las que no son afines, pasan de largo a través dela columna y salen en primera instancia.

Se usa ampliamente en la separación de

proteínas de alto peso molecular.




Figura 8. Principio de la cromatografía de afinidad.

Proteínas afines aglucosa unidas a

residuos de glucosa(G) en el soporte

Adición deglucosa (G)

Las proteinasenlazadas a laglucosa sonexpulsadas sobrela glucosaadicionada

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