【19】中華民國　　　　　　【12】專利公報 　（B）【11】證書號數：I392734【45】公告日： 中華民國 102 (2013) 年 04月 11日【51】Int. Cl.： C12N15/29

A61K36/48(2006.01)(2006.01)

C12N15/82A61P3/06

(2006.01)(2006.01)

發明　　　　　全 9 頁　

【54】名　　稱：用於降血脂之重組大豆儲藏性蛋白及其製備方法與應用RECOMBINANT SOYBEAN STORAGE PROTEIN FOR LOWERINGTRIGLYCERIDE LEVEL IN BLOOD AND METHOD FOR PREPARINGTHE SAME AND USE THEREOF

【21】申請案號：099118522 【22】申請日： 中華民國 99 (2010) 年 06月 08日【11】公開編號：201144438 【43】公開日期： 中華民國 100 (2011) 年 12月 16日【72】發 明 人： 許文輝 (TW) HSU, WEN HWEI；楊明德 (TW) YANG, MING TE；陳良築

(TW) CHEN, LIANG JWU；曾夢蛟 (TW) TSENG, MENQ JIAU；王强生 (TW)WANG, CHANG SHENG；林金和 (TW) LIN, CHIN HO；王雯靜 (TW)WANG, WEN CHING

【71】申 請 人： 國立中興大學 NATIONAL CHUNG HSINGUNIVERSITY

臺中市南區國光路 250號【74】代 理 人： 閻啟泰；林景郁【83】生物材料寄存：

食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心　 BCRC 940584　 2010年 05月 27日【56】參考文獻：

K. Nishizawa, et al.,“Accumulation of Bioactive Peptides,Novokinin, LPYPR and Rubiscolin, in Seeds of GeneticallyModified Soybean.”, Biosci. Biotechnol. Biochem., Dec. 7 2008,Vol.72, No.12, page 3301-3305。Y. Yamada, et al., “Anti-hypertensive activity of geneticallymodified soybean seeds accumulation novokinin.”, Peptides,Dec. 3 2007, Vol.29, No.3, page 331-337。G. R. Vianna, et al., “Soybeans as bioreactors forbiopharmaceuticals and industrial proteins.”, Genetics &Molecular Research, Aug. 18 2011, Vol.10, No.3, page1733-1752。Lijun Yang, et al.,“A transgenic rice seed accumulating ananti-hypertensive peptide reduces the blood pressure ofspontaneously hypertensive rats.”, FEBS Letters, May 8 2006,Vol.580, No.13, page 3315-3320。

審查人員：張瀚壬

[57]申請專利範圍1.　一種用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其係於大豆儲藏性蛋白的非核心構造區域予以插入或置換成至少一 VVYP活性胜肽，其中該大豆儲藏性蛋白係選自於由下列蛋白質所構成的群組：β-伴大豆球蛋白 β-次單元、大豆球蛋白 Gy5以及大豆球蛋白 Gy1，其中 β-

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伴大豆球蛋白 β-次單元具有一如 SEQ ID NO：10所示序列，且於其介於第 229至 230位置之間的胺基酸序列插入 VVYP活性胜肽；其中大豆球蛋白 Gy5具有一如 SEQ IDNO：6所示序列，且於其至少一選自於由下列者所構成的群組之胺基酸序列，置換成VVYP活性胜肽：介於第 203至 207位置之間、第 208至 212位置之間以及第 213至 218位置之間的胺基酸序列；其中大豆球蛋白 Gy1具有一如 SEQ ID NO：2所示序列，且於其至少一選自於由下列者所構成的群組之胺基酸序列，置換成 VVYP活性胜肽：介於第119至 126位置之間、第 286至 290位置之間以及第 292至 300位置之間的胺基酸序列。

2.　如申請專利範圍第 1項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其中該 VVYP活性胜肽包含纈胺酸-纈胺酸-酪胺酸-脯胺酸(valine-valine-tyrosin-proline,VVYP)序列以及至少一酵素辨識切點。

3.　如申請專利範圍第 2項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其中該酵素辨識切點係為消化道酵素辨識切點。

4.　如申請專利範圍第 3項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其中該至少一消化道酵素辨識切點係選自 於下列所構成的群組：胰蛋白酶(trypsin)的辨識切點、羧肽酶 B(carboxypeptidase B)的辨識切點、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的辨識切點或者它們的組合。

5.　如申請專利範圍第 1項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其中該 VVYP活性胜肽係包含如下列公式所示的胺基酸序列：Xaa1 -(Val-Val-Tyr-Pro-Xaa2 )n ，其中 Xaa1 、Xaa2 分別與相鄰的纈胺酸(Val)以及脯胺酸(Pro)形成酵素辨識切點；以及 n至少為 1。

6.　如申請專利範圍第 5項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其中 n為 1。7.　如申請專利範圍第 6項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其中 Xaa1 為精胺酸

(Arg)；以及 Xaa2 為離胺酸(Lys)。

8.　如申請專利範圍第 1項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白，其具有一選自於由下列者所構成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：8以及 SEQ ID NO：4。

9.　一種重組載體，其包含一控制序列以及一與該控制序列可操作的相連接之重組儲藏性蛋白基因序列，該重組儲藏性蛋白基因序列編碼一如申請專利範圍第 1至 8項任一項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白。

10. 如申請專利範圍第 9項所述之重組載體，其中該控制序列係花椰菜嵌紋病毒 35S啟動子或大豆 16-kD種子成熟蛋白 GmPM9基因之啟動子。

11. 如申請專利範圍第 9項所述之重組載體，其係選自於下列者所構成的群組：寄存於財團法人食品工業研究發展所生物資源保存暨研究中心之 pET21b-Gy5nsp-v2535，其寄存編號為 BCRC 940584；寄存於財團法人食品工業研究發展所生物資源保存暨研究中心之pET21-7Sbsnp-V57，其寄存編號為 BCRC 940585；pCa-β-V57；pGm-β-V57以及pCAMBCAP-Gy5-10。

12. 一種基因轉殖植物細胞，其係具有一重組儲藏性蛋白基因序列，該重組儲藏性蛋白基因序列編碼一如申請專利範圍第 1至 8項任一項所述之用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白。

13. 如申請專利範圍第 12項所述之基因轉殖植物細胞，其係屬於大豆、稻米或玉米細胞。14. 一種製備用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白之方法，其包括：將一種如申請專利範圍第

9至 11項中任一項所述之重組載體導入一植物細胞內；以及令該植物細胞生長，藉以表現出用於降血脂的重組大豆儲藏性蛋白。

圖式簡單說明

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第一 A圖為本發明之一較佳的大豆球蛋白 Gy1多肽片段之序列示意圖，其中標示處為胺基酸置換位置。

第一 B圖為本發明的一較佳的重組大豆球蛋白 Gy1多肽片段之序列示意圖，其中標示處為插入的胺基酸序列，底線表示 VVYP套組。第二圖係本發明的載體的較佳實施例 pC1-Gy1-7的構築策略示意圖。第三圖係本發明的載體的另一較佳實施例 pC2-Gy1-7的構築策略示意圖。第四 A圖為本發明之一較佳的大豆球蛋白 Gy5多肽片段之序列示意圖，其中標示處為胺

基酸置換位置。

第四 B圖為本發明的一較佳的重組大豆球蛋白 Gy5多肽片段之序列示意圖，其中標示處為插入的胺基酸序列，底線表示 VVYP套組。第五圖係係本發明的載體的較佳實施例 pCAMBCAP-Gy5-10的構築策略示意圖。第六 A圖為本發明之一較佳的 β-伴大豆球蛋白 β-次單元多肽片段之序列示意圖，其中標

示處為胺基酸置換位置。

第六 B圖為本發明的一較佳的重組 β-伴大豆球蛋白 β-次單元多肽片段之序列示意圖，其中標示處為插入的胺基酸序列，底線表示 VVYP套組。第七 A圖係係本發明的載體的較佳實施例 pCa-β-V57的構築策略示意圖。第七 B圖係係本發明的載體的較佳實施例 pGm-β-V57的構築策略示意圖。

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