1994. Conceptos Basicos Del Cultivo de Tejidos. CATIE. Esquivel
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; CONCEPTOS BASICOS DEL CULTWO DE TEJIDOS VEGETALES
,/Ana Abdelnour- Esquivel
Jean Vincent Escalant
1994
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CONTENIDO
Prefacto __
Agradectmtento
Introduccton ii
Ttpos de crectmtento in vitro 1
Crectmtento orgaruzado
Crectmtento desorgantzado
Termtnos para tdenUftcar los prtnctpales ttpos de propagacton invitro
Organos
Callos
Suspension de celulas 2
Protoplastos
Anteras
Prtnctpales apltcactones del culUvode tejtdos
MtcropropagactonObtencton plantas ltbres de vtrus 4
MeJoramtento genettco
Conservacton de gennoplasma 6
Factores que tntervtenen en el culUvode tejtdos
EI ln6culo 0 explante
Factores fistcosFactores quimtcos 8
EImedto de culUvo
Sales organtcas 9
Compuestos organtcos
Preparactones naturales complejas 10
Matertalestnertes
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Formulacton de sales de Murashlge y Skoog ll
La preparacton del medto de cuIUvo 12
EJemplos de medlos de culUvo 15
Mtcropropagactcn de apices de Musa
Mtcropropagaclon de estacas de cafe
Mtcropropagacion de vaJnilla
Mtcropropagacton de Dioscotea
Mtcropropagacton de Xanthosoma
Mteropropagacton de Ipomoea batata
Mtcropropagacton de orquideas
Metodos de destnfeccton 18
EI material vegetal
EI medlo de culUvo
La crtstaleria
La camara de transferencla
Los Instrumentos de trabajo
EI cuarto de transferencta
Embrtogenests somattca y suspenstones celulares 21
Embrtogenests somattca
Suspenstones celulares 26
Metodos de conservacton de los recursos fttogeneticos 30
Conservacton in situConservacton ex situ
Los bancos de semtllas
Las colecctones de campo
Conservacton in vitro
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PREFACIO
AGRADECIMIENTO
EI presente documento se prepare como ayuda didacttca para aquellos
estudtantes que se Intctan en el culttvo de tejtdos a traves de los cursos decapacttacion y entrenamlentos en servteto del Centro. En este encontraran
conceptos y terrnmos ruttnartos expl1cados de una manera senctlla, asi como
los prtnclpales campos de apltcacion de estas tecmcas. Tambten podra ser
uUl1zado como una guia practtca para la preparacton de soluclones madre.
medtos de culUvo y metodos de destnfeccton.
Los autores desean hacer un reconoclmlento:
AKenneth G. Royo O. por su gran ayuda en la edtcton de este documento.A Domingo Loaiza por la dtagramacion y dtsefio de portada.
AI personal del Laboratorto de Cultivo de TeJldos de C.A.T.I.E. por su
valtosa colaboracton,
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INTRODUCCION
El concepto de cultivo de tejidos 0propagacton in vitro (del latin en vidrioI
abarca tanto el cultivo aseptlco de tejidos como de celulas y organos. Se lellama in vitro debido a que se cultiva en recipientes de vidrio 0 plasttco
trans parente. Esta tecnlca consiste en cultivar un Inoculo con potencialidad
de dtferenclacton bajo condiciones asepttcas en presencia de una dieta
balanceada de nutrientes y hormonas. Esta capacidad de regenerar no
solamente tejidos y organos, sino tarnblen una planta entera es unlca en
plantas. no puede encontrarse un fenorneno similar en animales superiores.
Podemos definir el cultivo de tejidos como un conjunto de tecntcas con las
cuales podemos ejercer un control relativo sobre los procesos morfogenetlcos,
flstologtcos y bioquimicos que se llevan a cabo en los tejidos bajo estudio.
Al igual que en otros metod os de multlpltcaclon vegetativa 0asexual. los
individuos descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones.
es declr, son copias genetlcamente ldentlcas entre ellas e Identicas a la planta
madre. En plantas propagadas por semilla (propagaclon sexual). la descen-
dencia no es clonica ya que cada semilla tiene su propia base genettca que
resulta de la mezcla de ambos progenltores, por 10 tanto. cada individuo esunlco.
Cuando el explante (material inicial en cultivo in vitro. que puede ser un
pedacito de tallo, hoja, yema 0 raiz) se coloca en un tubo de ensayo bajo las
condiciones antes descritas. produclra pequenas plantltas, replicas del
progenitor. Produclra un nurnero tan alto de plantulas que se necesttara
separarlas frecuentemente para que puedan sobrevivlr. El nuevo crecimlento
es generalmente iniciado en tejido merlstematlco (conjunto de celulas no
dlferencladas para su ultima funclonl. Las celulas mertstematlcas se encuen-tran localizadas en los apices de los tallos y raices, en las axllas de las hojas,
en el cambium de tallos, en los margenes de las hojas y en callos, asi. estas
celulas dependiendo de su base genetlca y locallzaclon e Influencladas por la
luz, temperatura. hormonas y probablemente otros factores se diferencian en
hojas. tallos, raices y otros organos y tejidos de una manera organizada.
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TIPOS DE CRECIMIENTO IN VITRO
I. CRECIMIENTO ORGANIZADO
Se refiere al tipo de cultlvo que se lnicia con una parte organlzada de la
planta (apices, hojas, brotes, semlllas, etc.) y esa parte u organo stgue
creciendo in vitro manteniendo sus caracteristlcas estructurales. Se aplica
tamblen cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido desorgani-
zado (organogenesis).
II. CRECIMIENTO DESORGANIZADO
Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de
tejidos u organos se produce un tejido sin estructura especifica que contiene
un numero limitado de algunos tlpos de celulas especializadas encontradas
en una planta intacta. Un tejido desorganizado (0 callo) puede crecer con
subcultivos y puede ser mantenido en medio solido 0 liquido durante varios
meses 0 anos. Puede ser usado para inlciar suspension de celulas y
protoplastos.
TERMINOS PARA IDENTIFICAR LOS PRINCIPALEST1POS DE PROPAGACION IN VITRO
1. Cultivo de organos
Corresponde al cultivo de un organo de la planta con el fin de propagar
la planta. Cultlvo de meristemas 0de apices, microestacas, cultlvo de
embriones.
2. Callos
Corresponde a un conjunto de celulas procedentes de la desorganlzaclon
de un tejido 0de una suspension de celulas. El calla tiene la pecuUaridad de
presentar celulas no diferenciadas para su ultima funclon pero que conservanel poder de dividirse (celula mertstematica 0 embnogenlca).
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3. Suspenswn de celulas
Las suspensiones celulares conslsten de celulas libres y microagregado
de celulas en medio liquido en movimiento.
4. Cultivode protoplastos
Es el cultivo de celulas sin pared pectocelulostca, Es deelr, celulas con
los componentes vivos rodeados solamente por la membrana cttoplasmlca.
Debido a la ausencia de pared celular los protoplastos son adecuados para
trabajos en mantpulacton genettca que no serian posibles con plantas 0
celulas intactas. ademas son muy utilizados para estudios flstologicos.
btoquimlcos y biofisicos.
5. Cultivode anteras
Consiste en el cultivo de anteras enteras con polen Inmaduro, el polen
se divide para formar embriones 0callo. Cuando estes se transfleren a los
medios de regeneraclon se forman plantas. Por 1 0 general el cultlvo de anteras
se utiliza para la obtenclon de plantas haploides. Estas se regeneran a traves
de la embrlogenests somatlca a partir del polen, directamente 0por la via de
organogenesis a partir de un callo. Algunas veces se cultiva el polen una vez
aislado de la antera y se le llama cultlvo de polen 0de microesporas.
PRINCIPALES APLICACIONES DEL CULTIVO DE TEJIDOS
El cultivo de tejidos puede utilizarse para diversos proposltos como son:
la mtcropropagacton, la obtenclon de plantas libres de virus y otros patogenos,
el mejoramiento genettco y la conservaclon de germoplasrna.
I. MICROPROPAGACION
La mtcropropagaclon es la tecnlca que ha logrado raplda aceptaclon en
la industria y se esta practicando tanto en especies horticolas como en
ornamentales y aun en lefiosas. Esta metodologia presenta lmportantes
ventajas sobre los metodos tradicionales de propagacton, entre elIas se puede
citar:
- Incremento acelerado del numero de plantas derivadas por genotipo:
cuando se usan metod os de propagacton convencionales un esqueje
produce una plantay una semilla produce una planta. sin embargo. un
explante teorlcamente puede prod ucir un infinito nurnero de plantas. Es
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por esta razon que se necesitan muy pocas plantas de donde tomar los
explantes que produclran miles de plantas.
- Reducclon del tlempo de multtpltcaclon.
- Posiblldad de multlpllcar grandes cantidades de plantas en una superfl-cie red uclda, a bajos costos y en un tiempo economlcamente costeable.
- Mayor control sanitario del material que se propaga.
- Facllldad de transportar el material in vitro de un pais a otro, con menos
restricciones aduaneras.
- PosibUidad de multiplicar rapldamente una varied ad de la cual existen
pocos individuos.
Debido a que la mlcropropagacton se refiere a un fenomeno de reproduc-
cion asexual. el riesgo de tener "varlantes" fenotipicas 0genettcas es bajo. Sin
embargo eso puede suceder cuando no se domina el proceso in vitro. Las
plantas que vienen de un mismo mertstema, spice. 0estaca son llamadas
Melones".
La obtenci6n de una planta entera:
La obtenclon de una planta entera puede ocurrir a traves de tres vias
diferentes:
a) a partir de brotes, prtmordlo. meristema y embriones pre-existente en el
"explante" utilizado.
b) a partir de un brote 0meristema iniciado dentro de un callo 0dtrecta-
mente sobre el explante inicial. En este caso los brotes 0meristema seforman in vitro (brotes adventicios 0de novo).
c) a partir de un embtioti somalico (embrion similar al embrion ctgottco 0de
la semilla) que se forma a partir de un tejido somatlco (embrtogenests
somatlca = asexual).
Para la mayoria de las especies que se multiplican in vitro. las vias mas
usadas son las a) y b). Muy pocas especies se multipllcan al nivel industrial
por la tercera via (ejemplo de la palma africana). sin embargo. la apllcaclon deesta tecnlca va en aumento.
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La ventaja mayor de esta tecnlca es poder prod ucir a partir de un explante
de una variedad 0especie un numero teoricamente indefinido de plantas de
esta mlsma variedad 0especie.
II. OBTENCION DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS
EI cultlvo de tejidos permite en muchos casos producir plantas Ilbres de
patogenos y de virus. En generalla tecnlca consiste en aislar el meristemo de
plantas que fueron 0no tratadas con termoterapia. Entre mas pequefio sea
el meristema inoculado mas exlto se tendra en Ia erradlcaclon del virus. Es
necesario establecer para cada tipo de virus y de planta unas pruebas
serologtcas I''Test Elisa") que permiten revelar de manera sencilla la presencia
del virus en la planta in vitro. Estas precauciones son indispensable para el
intercambio de materiales vegetales entre paises.
III. MEJORAMIENTO GENETICO
La creaclon de hfbrldos con las tecnlcas de hlbrldacton clastcas en el
campo puede ser dificil debido a problemas de esterilidad 0 incompatibilidad
de variedades. Algunas de las tecnlcas del cultivo de tejidos pueden ayudar
y facilitar la creaclon de nuevas variedades. Un incremento de la variabilidad
natural puede ser logrado usando tecnlcas como: callogenests, cultivo de
celulas y el cultivo de protoplastos. asociadas 0no a tecntcas de ingenieria
genettca (Introducclon de genes 0 transformaclon). Ya hemos vis to ladefinicion de algunos de estos termlnos. La regeneraclon de plantas a partir
de callos, celulas 0 protoplastos se hace via organogenesis 0 embrtogenesls
somatlca.
Obtenci6n de protoplastos:
En el transcurso de la expertmentaclon. los blologos constataron que se
podia lograr la agregaclon de celulas una vezeliminada la pared pectoceluloslca,permitlendo asi Ia fusion de material nuclear y cttoplasmatlco. Asi nacto el
principio de Ia hlbrldaclon somatlca.
EI primer paso para Ia obtenclon de protoplastos es la destrucclon de la
pared pectlnoceluloslca para obtener celulas de forma redondeada y Iimitadas
untcamente por Ia membrana cltoplasrnatica. Para esto se hace necesaria la
utillzacton de enzlmas pectinasas y celulasas. Una vez obtenidos los
protoplastos se puede manipular el material para prod ucir hibrtdos somatlcos.
EI protoplasto puede regenerar rapldamente Ia pared celular y por medio de
callogenests, organogenesis 0embrtogenesls somatlca producir plantas. La
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- el intercambio de material no siempre es total. se pueden obtener
adlciones incompletas.
htbrtdaclon somatlca 0 fusion consiste en la agregacton de protopastos.
Cuando se produce la fusion de dos protoplastos. todo el contenido celular es
comun y se puede alcanzar la adlclon total de del material genetlco en los tres
compartlmentos que 10 contienen tnucleo, mitocondria y cloroplasto). Esto
incrementa el nivel de ploidia. sin embargo. varios eventos pueden perturbar
la fusion:
- una vez ocurrida la fusion es posible que se den competiciones y
ellminaciones crornosomlcas. Por ejemplo, en cada mitosis subsecuente
puede suceder que algunos pares de cromosomas sean desechados.
Ejemplo de hibridos: entre tomate y papas; tomate y berenjenas; tomatey tabaco (disminuir la cantldad de nicotina); tomate y trtgo: etc ... ) muchas
veces el paso mas dificil es la regeneracton de la planta.
Introducci6n de particulas:
Hoy en dia existen un buen numero de tecnlcas para introducir el ADN
en las plantas y de esta manera obtener nuevos materiales (materiales
transformados):
a. Vso de vectores naturales
El m as comun es Agrobacterlum (A. tumefaciens y A. rhlzogenes).
Tamblen se han utilizado virus como vectores (esto por medlo de afldos). El
primer paso es la Incorporaclon de un ADNforaneo por medlo de una bacteria
infectante que porta un virus latente "el plasmldo" (porclon de gen en el
cltoplasma de la bacteria que se dupllca de manera independiente). Se
provoca una herida en la planta para que las bacterias penetren. Agrobacterlum
se pega a las paredes de la herida para formar una tnteracclon "llave-cerradura". Los genes de la bacteria son activados (los del plasrnldol y
transferidos a la planta (solo los de la region T)y son incorporados al nucleo
y al genoma de la planta. Decimos entonces que la planta fue transformada
y se evalua la expreston de los genes. Existe otro metodo en el cual se
transforman directamente protoplastos. se Ie llama tamblen "cocultivo".
Consiste en incubar las bacterias con protoplastos. la transformaclon es muy
lenta y el metodo no es muy eficiente.
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b. Transferencia directa de genes
Entre estas tecnlcas esta la absorclon de ADNpor protoplastos mediado
por procedlmlentos quimlcos (Ca-PEG. fusion de protoplastos). electroporaclon
(Gene Pulser), bombardeo de ADN (Biolistics) y mtcrotnyeccton,
Sin Importar la tecnlca usada, es necesario evaluar la transformacton y
por supuesto la regeneraclon del tejido.
Haplometodos:
Consisten en el cultivo de anteras u ovulos para la obtenclon de plantas
haploides las cuales despues de doblar sus lotes de cromosomas nos llevan
a la obtenclon de plantas homoclgotas. Estos metodos presentas c1ertas
ventajas durante el proceso de mejoramiento:
a) la fljacion de un hibrido por haplornetodos permite acortar 5 afios el
proceso.
b) facilita el anallsls genetlco debido a que los genes recesivos se expresa-
ran en la primera generaclon.
c) la dlploldizaclon permite recombinaciones genettcas nuevas que no se
observaban naturalmente.
La tecnica m a s usada pero tamblen la mas dlficil es la androgenesis que
consiste en el desarrollo de un tejido haploide a partir del polen seguldo por
la formaclon de una planta haploide.
IV. CONSERVACION DE GERMOPLASMA
La conservaclon de plantas es un componente integral de los sistemas
de agrtcultura sostenible y des de la perspectiva del mejoramiento de loscultlvos, la conservaclon de germoplasma valioso se ha considerado de alta
prioridad por el Consejo Internacional de los Recursos Fttogenettcos (lBPGR.
en Ingles). Se ha estimado que de mas de 240.000 especies de angtospermas
en el mundo, algo mas de 300 se han utilizado en un tiempo u otro, sinembargo. son doce cultivos principalmente los que proveen a la' poblaclon
mundial de allmento. 10 que indica que el hombre depende para su alimenta-
cion de unas pocas especles de los miles de angtospermas en el planeta. Como
resultado de conocer su Importancla, se ha dado gran enfasls a la necesidad
de preservar los recursos fltogenetlcos como forma demantener la biodiversidad.Mas adelante se comentara sobre los metodos de conservaclon de germoplasma
dando enfasts a la conservaclon in vitro.
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FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVODE TEJIDO:
Ventajas que presenta el cultivo de tejidos para la conservaci6n de
germoplasma:
a) se puede almacenar un gran numero de clones en espacio reducido.
b) el germoplasma se encuentra libre de patogenos. virus 0Insectos.
c) los costos de mantenimiento se reducen sensiblemente.
I. EL INOCULO 0 EXPLANTE
Es el organo, tejido 0 fragmento de tejldo, celulas, etc. exclsado del
material parental para Iniciar el cultivo in vltro. La elecclon del explante
adecuado constituye el primer paso para el establecimlento de los culttvos,
este vartara de acuerdo al objetivo perseguido. En general. factores como el
genotipo. edad de la planta y su estado fisiologico son lmportantes de
considerar.
II. FACTORES FISICOS
pH. Intercambios gaseosos. humedad, luz y temperatura.
- pH: el grado de acidez 0alcaUnidad (pH)del medio de cultivo es importan-
te y especiflco para cad a tipo de plantas. al Igual que ocurre en el suelo,
por 10 que se hace necesario ajustarlo a los requerimlentos de la especie
en estudio. Sin embargo. el pH adecuado estara en un rango de 4.5 a 7
para las plantas.
- Intercambio gaseoso: los gases mas corrientes son 02 (oxigeno),CO2
(dloxtdo de carbone). y C2H
4(etileno).
- La humedad: en condiciones invitro la humedad dentro de los recipientes
es casi 100 %. Por eso la planta in vltro en general no desarrolla
adecuados sistemas de regulaclon hidrlca tales como cera. estomas.
cuticula. etc.
- La luz: en condiciones in vitro clastcas, la Intensidad y calldad de la luz
es muy bajo (10 W1m2 en comparaclon de condiciones naturales dondela Iuz puede representar hasta 900 W1m2). La caUdad de la luz tamblen
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es muy baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en una
misma sala para tener diferentes longitudes de ondas. El espectro uttl
para los vegetales es de 400 a 700 nanornetros. Dos fenomenos
importantes dependientes de la luz son: fotosintesis y fotornorfogenests.
Fotosintesis: es el proceso por medio del cuallas plantas en presenciade luz, agua y en los doroplastos incorporan el dloxldo de carbona para
formar los compuestos organlcos que le permlttran crecer y reprod ucirse.
CO2 + 1\0 -- CARBOHIDRATOS + 02
Fotomorfogenesis: La luz es un factor importante en la morfogenests.
La morfogenests funciona con la presencia de ptgmentos suceptibles a
radlacion azuly roja. Las funciones mas conocidas son las del plgmento
suceptible al rojo: fitocromo (rojo 660 nm y rojo lejano 730 nm);
expansion foliar, elongaclon de entrenudos, dlferenclacton de estomas,
sintesis de cloroflla. etc.
ID. FACTORES QUlMlCOS
- EImedio de cultivo: consiste de una mezcla de determinadas sustancias
sobre 0dentro del cual crecen los explantes Un6culos). Para su usc, el
medio de cultivo se esteriliza ya sea en autoclave 0por flltraclon a traves
de filtros de papel miliporosos.
EL MEDIO DEL CULTIVO
Como se menclono anteriormente, para mantener la viabilidad de un
cultivo de tejidos, estimular su dlferenctaclon y gutar su crecimiento, este
requerlra de una dieta balanceada de nutrientes y hormonas.
Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias quimlcas que los
Investtgadores han descrito despues de numerosos experimentos y que
permiten que las plantas crezcan y se multipUquen in vitro,
Los ingredientes de un medio de cultivo vegetal pueden clasificarse en:
1) sales Inorganlcas (minerales), 2) compuestos organtcos, 3) preparaciones
naturales complejas y 4) materiales inertes.
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I. SALES INORGANICAS
Los esfuerzos realizados para optimlzar las necesidades de plantas
especificas. han dado como resultado numerosas formulas de mezclas de
sales. Sin embargo. los elementos mayores esenciales que todas las plantas
requiereny que estan presentes en los fertillzantes comunes. tamblen forman
parte de los medios de cultivo: Nltrogeno (N).Fosforo (P). Potasio (K).Azufre
(5). Calcio (Ca). Magnesio (Mg)y Hierro (Fe).
Adernas de los elementos menores, que tamblen son esenciales pero que
se requiere en cantidades extremadamente pequefias: Boro (B). Mollbdeno
(Mo).Manganeso (Mn).Cobalto (Co).Zinc (Zn).Cobre (Cu). Cloro (Cl)y Iodo (I).
Una de las mezclas de sales mas usadas es la descrita por Murashtge y
Skoog. Esta es conocida como formula MSy es descrita mas adelante.
II. COMPUESTOS ORGANICOS
En esta categoria se encuentran sustancias comocarbohidratos. hormo-
nas 0reguladores de crecimiento. vitaminas y algunos otros compuestos que
se han descrito como beneflciosos para el cultivo de tejidos: arnlnoactdos,
amldas, purinas y pirimldinas y acidos organlcos.
- Los carbohidratos: son sustancias organtcas como los azucares que
proveen tres de los elementos mayores esenciales: Hldrogeno (H).Carbono (C)
y Oxigeno (0).
Los azucares son producto de la fotosintests, proceso por medio del cual
la planta convierte el dloxtdo de carbono y agua en carbohidratos con la ayuda
de la cloroflla y la luz. Sin embargo. las plantas que crecen in vitro. debido a
la baja intensidad lurninlca, no pueden fabrtcar todo el azucar que requieren.
por 10 que se adicionan altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo.
- Hormonas: las sustancias hormo-nales criticas en el cultivo de
tejidos son las auxinas y las citoquininas. Estas intervienen en la elongacton
y division celular, formaclon de brotes y rakes y en la germlnacton de las
semillas.
Entre las auxinas mas utillzadas en el cultivo de tejidos se encuentra:
acldo lndolacetlco (A.I.A.).acldo naftalenacetlco (ANA).2.4-D. picIoram. Entre
las citoquininas se encuentra: benzilaminopurina (BA).la kinetina y zeatina.
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Las glbereltnas y el acldo absfclco son tamblen utUizadas en algunos
casos.
- Vitaminas: la vitamina que se ha demostrado consistentemente
como importante en el cultivo de tejidos es la tiamina. Sin embargo. otras han
sido utillzadas con frecuencia por estimular procesos especificos: blotlna,acldo mcotinlco, plrldoxlna, pantolenato. riboflavina.
- Aminoacidos: entre los arnlnoacldos y amidas que se han mostrado
mas frecuentemente como beneficiosos esta Lvarglnlna, L-acido asparttco, L-
glutamlna, L-acido glutamlco y L-tirosina.
Otros compuestos organlcos comunmente empleados en el cultivo de
tejidos son el inositol. adentna, sulfato de adenlna. el acldo citrico y el
asc6rbico (para evitar la oxldaclon de los tejidos).
ID. PREPARACIONES NATURALES COMPLEJAS
Una gran variedad de sustancias de composlclon indefinida han side
utUizadas para enriquecer los medios de cultivo. Entre elIas se menciona:
extracto de malta. agua de coco. extracto de levadura. pulpa de banano,
case ina hidrolizada y jugo de naranja y tomate.
IV. MATERIALES INERTES
- Geles hurnedos que actuan como agentes de soporte: agar. gelrtte, fltogel.
- Carbon actlvado que en bajas concentraciones contrarresta efectos
negativos que producen algunas sustancias liberadas al medio por el
cultivo (fenoles).
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FORMULACION DE SALES DE MURASIDGE Y SKOOG t
Debido a que esta formula es frecuentemente usada en la
mlcropropagacton de un gran numero de especies vegetales, se describe a
contmuaclon:
Macroelementos
Compuestos mg/L
1650
1900 .,.
440
370
170
Microelementos
6.2
MnS04·I\O 16.8
8.6
KI 0.83
0.25
0.025
0.025
Hierro
37.3
27.8
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LA PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO
Se expllcara con detalle el procedimlento de preparaclon de los medlos
de cultlvo, de manera que el estudiante que se inicia en el area del cultivo de
tejidos encuentre aqui una guia. Debe tener en cuenta que exlsten en el
mercado formulas completas listas para su uso que podran usarse cuando el
proceso es rutlnarto, sin embargo. estas son mas costosas. Debido a que el
medio de cultivo es uno de los factores mas importantes en el exlto del proceso
es importante trabajar con cuidado y despacio al principio para poder
anticipar las consecuencias de cada accton y famlliarizarse con el equtpo,
crtstaleria. etc.
Preparacion de las soluciones madre:
Por 1 0 general. la preparaclon del rnedto de cultivo se inicia preparando
soluciones concentradas (madre) de uno 0mas compuestos. Determinado
volumen de cada una de estas soluciones se mezclara mas tarde para preparar
el medio de cultivo final. Es recomendable preparar las soluciones madre en
cantidades relativamente altas y con antelaclon para ahorrar el tiempo y el
trabajo que implica pesar cada uno de los ingredientes cada vezque se prepara
un medio de cultlvo. Ademas, como muchos de los componentes(mlcroelementos. vttamlnas, hormonas) son requeridos en pequenas cantida-
des. si se multi plica esa cantidad por un determlnado numero de veces para
preparar la solucion madre. la labor de pesado sera mas facll y m a s precisa.
La concentraclon de la solucion madre debe ser un factor a considerar.
Soluclones madre muy concentradas tienden a formar precipitados. En
algunos cas os estos precipitados son el resultado de mezclar suatanctas
incompatibles, por ejernplo, calcio y fosfato 0sulfate, magnesio y fosfato. Es
recomendable que la soluclon madre no sea mayor de 100 veces (1OOX ) la
concentracton final del medlo, sin embargo. el volumen de medio a prepararpor semana en el laboratorto dara la pauta para considerar el grado de
concentracton de la solucion madre. 51 la soluclon madre presenta preclpl-
tados es mejor des carta rIa ya que no poseera el balance adecuado de
sustancias. alguna proporclon de estas. estara en el fondo con el precipitado .
. La caUdad del agua:
Otro punto importante de tener en cuenta es el uso de agua destonfzada
(desmineralizada), destilada 0bidestilada para la preparaclon de los medios
de cultivo.
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-Almacenamiento de las soluciones madre:
Las soluciones madre deben ahnacenarse en el refrtgerador. Nose puede
dar un dato exacto de cuanto tiempo pueden permanecer almacenadas sin que
sufran detertoro, pero como regla general. los compuestos Inorgarucos son
mas estables que los organtcos, por 10 que se ha recomendado almacenarauxlnas y citocininas por un maximo de 2 semanas y los otros componentes
por 2 meses, sin embargo. si se observa un precipitado la soluclon debe
descartarse inmediatamente.
Con un ejemplo se explicara como seprepara una solucioti madre (50X)
tomando como base Iaformula de sales minerales de Murashige y Skoog.
Preparacion de los macroelementos y microelementos:
NH.NOsla formula indica 1650 mg/I en el medio de culttvo, por 10 tanto.
para preparar una soluclon SOX (50 veces mas concentrada. que sera
suflctente para preparar 50 litros de medio de cultivo) multipUque 1650 mg x
50 = 82500 mg (82.5 g).De Iamisma manera multlpllque la cantidad indicadapara cada uno de los otros macroelementos. En un halon aforado de 1 litro
que contenga aproxtrnadamente 500 ml de agua destilada agregue las
cantidades pesadas de cada uno de los macroelementos. aglte y Ilene el halon
con agua hasta la marca de aforo. Vuelque el balon de manera que quede unaburbuja en el fondo y agite varias veces. Replta unas 2 veces. Transfiera la
solucion de macroelementos a una botella para su almacenamiento en el
refrtgerador, Etiquete la botella. Noolvide escribir la formula que uso (Macro
MS). concentraclon (SOX).fecha, nombre de la persona que los prepare. Para
recordar la cantidad a agregar por litro de medio de cultivo a preparar recuerde
dividir 1000 mI / 50 = 20 ml de la solucion madre / 1 litro de medio de cultivo.Repita la operacion pero con los microelementos.
Preparacton del Hierro:
Para preparar la solucion madre de hierro. ponga a hervir aproxlmada-
mente 700 ml de agua bidestilada (destilada 0desionizada dependiendo de las
facilidades con que disponga) en un erlenmeyer de 1000 mi. cuando esta
hirviendo agregue la cantidad pesada de Na~EDTAy FeS04.7f\O (recuerde
que esta preparando una soluclon madre SOX. por 10 tanto. multiplique la
cantidad indicada en la formula por 50) hasta que desarrolle color. Tapela y
dejela enfriar en un lugar oscuro. Cuando este a la temperatura ambiente
transflerala a un balon aforado y agregue agua hasta Ia marca de aforo.
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Almacene en el refrtgerador en una botella ambar para evitar la
fotodescompostclon. Si no dispone de botella arnbar forre una botella con
papel aluminio. Identifiquela.
Preparaci6n de la soluci6n madre de 1 a hormona:
Cada hormona se prepara por separado y las mas frecuentemente usadas
se preparan de manera similar. Ejemp)o. Soluclon madre de Benciladenina:
Pese 25 mg de BA. en un balon aforado de 250 mi. agregue la hormona y 5ml
de agua. Con un gotero agregue lentamente y con agttacion HCII Mhasta que
el BA se disuelva. Agregue agua para completar el volumen. Esta solucton
provee 0.1 mg de BApor mlde soluclon madre. Si para el medio de cultivo que
prepara se indica adicionar 1 mg de BA por lltro. se deberan tomar 10ml de
la soluclon madre para obtener la cantidad recomendada. Para aquellas
concentraciones que se indiquen en ppm (partes por mlllon) recuerde que 1mg/l equivale a Ippm.
Preparaci6n del medio de cultivo:
Yase han preparado las soluciones madre. ahora se procedera a preparar
el medio de cultivo. Para esto tomaremos como ejemplo el medio de Inlclaclon
para banano.
Se pre para 1 litro de medio de lnlclacton de banana el cual consiste en
las sales MS. 100 mg/l de mlo-Inosttol, 1 mg/l de BAP. 30 mg/l de sacarosa
y 7gil de agar. EI pH se ajusta a 5.7. En su libreta de trabajo en ellaboratorio
ordene cada componente de la stgutente manera y ponga una marca de visto
bueno despues de agregar cada uno. asi podra revisar en caso de error 0duda:
Sacarosa
Macro MS
Micro MS
Fe-EDTA
Vitaminas
BAPIO.IllIg/1)
pH
Agar
30 g
20 ml (solucton madre 50X)
20 ml (solucton madre 50X)
20 ml (solucton madre 50X)
10ml (soluclon madre 100X)
10 ml
5.6 - 5.8
7g
En un balon aforado de 1 lltro, agregue cerca de 400 mi de agua. Pese
Ia sacarosa y disuelva en el balon. Con la ayuda de pipetas graduadas mlda
el volumen de soluclon requerlda (no debe plpetear directamente de los frascos
que contienen las soluciones madre. transflera volumenes pequefios de estas
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a erlenmeyers y pipetee de estos). Una vez que se han agregado la sacarosa,
los macro, microelementos, el hierro, las vitaminas y hormonas afore con
agua. Transfiera a un erlenmeyer y ajuste el pH (puede usar HCI0KOH 1M
o 0.1M). Agregue el agar y dtsuelvalo calentando la soluclon ya sea usando
el horno de microondas (aproximadamente 9 minutos por litro de medio de
cultlvo)0
una hornllla0
quemador. EI medio esta listo para transferir a losfrascos 0tubos de cultivo (el medio debe transferirse estando caliente ya que
al enfriarse se solldfflcaral. Esterilice en autoclave. 51no se va a usar el medio
de cultlvo Inmedlatamente es recomendable guardarlo en refrtgeraclon.
EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO
A conttnuaclon se detallaran los medios de cultivo utlllzados en el
Laboratorio de Cultlvo de Tejldos de CATIE para la mlcropropagacton de
bananos y platanos, cafe, orquideas, flame, camote, tlqulsque, valnillay yuca.
Medios de cultivo para la micropropaci6n de lipices de Musa sp. (Bananos Y
Platanos):
Iniciaci6n Multiplicaci6n Desarrollo
S a c a r o s a 30 gIl 30 gIl 30 gIL
M a c r o M S M S M S
M i c r o M S M S M S
V i t a m i n a s M S M S M S
BAP 1mgll 3 mgll
pH 5.7 5.7 5.7
agar 7 gIl 7 gIl 7 gIl 7 gIl
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Mediosde cultivo para la micropropagaci6n de microestacas de car~:
Iniciaci6n Multiplicaci6n Enraizamiento
* ** ***
Sacarosa 15 gIl 30 gIl 15 gIl
MacroMicroelementos MS MS 1 1 2 MS
Vitaminas Morel Morel Morel
PVP 10 gIl
Benlate 1 gIl
BAP 5 mgll 1 mgll
AlB 100 mgll
ANA 25 mgll
Kinetina 5 mgll
pH 4 . 8 5.6 5.6
Agar 7 gIl7 gIl
• EI benJate debe permanecer en el medio 15 diaa, despues de este
periodo se prepara el mlsmo medio pero sin benlate y el pHse ajusta a 5.6. Los
explantes permanecen en la oscuridad. Una vez que brotan las estacas se
transfieren al medio de multtpllcaclon .
•• Este medio tarnblen se utillza como medlo de desarrollo de las
microestacas. antes del enraizamiento pero la concentraclon de BAPse red uce
a 0.3 mg/I. Duranteestos periodos los explantes permanecen a la luz.
••• Las plantulas deben permanecer en este medio por 15 horas en la
oscuridad.
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Medios de cultivo para la mtcropropagacton de vainilla:
Para preparar este medio de cultivo se agregan 30 gil de sacarosa, las
sales minerales y vttamlnas MS. 125 mgl Ide carbon actlvado y se ajusta el pH
a 5.8. Se adiciona 7gil de agar. Para la etapa de desarrollo se ellmina el carbon
activado del medio.
Medios de cultivo para Ia mtcropropagacfon de Dioscorea (name):
Para la etapa de Inlciaclon se prepara un medio de cultlvo con las sales
mlnerales y vitaminas de Murashtge y Skoog. se agrega 0.1 mg/I de BAP. Se
ajusta el pH a 5.7 y se adiciona 7 gil de agar. Para la etapa de desarrollo se
pre para el mlsrno medio pero se ellminan los reguladores de crecimiento.
Medios de cultivo paraIamfcropropagaclen de apices de Xanthosoma(tiquisque):
El medio de Inlctaclon de tiquisque consiste de las sales mlnerales y
vttamlnas MS. 30 gil de sacarosa y 0.1 mgll de BAP. Para el periodo de
multlpllcaclon se prepara el mismo medio pero con 3 mgll de BAPy en la etapa
de desarrollo se ellmina la hormona. En todos los casos el pH se ajusta a 5.8
y se agrega 7 gil de agar. Los explantes siempre premanecen en presencia de
luz,
Medio para Ia micropropagacion de apices de Ipomoea batata (camote):
Para la Inlciaclon y multlpllcackin de camote se prepara un medio de
cultlvo con 30 gil de sacarosa, sales minerales y vitaminas MS. 0.1 mgll de
ANAy 0.1 mg/I de BAP. El pH se ajusta a 5.8 y se agrega 7 gil de agar. Para
la etapa de desarrollo se ellminan las hormonas del medio de cultlvo. Los
explantes permanecen en conclctones de luz.
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Medios de cultivo para Ia mlcroprcpegacfen de orquideas (iniciando con
semillas):
Para la Inlctaclon 0germtnacton de las semlllas se prepara un medio
con 30 gil de sacarosa y las sales minerales y vitaminas MS. Se ajusta el pH
a 5.8 y se agrega 7 gil de agar. Para la multtpllcaclon y desarrollo de lasplantulas se prepara el medlo anterior pero se adicionan 200 mg/l de caseina
hidrolizada y 400 mg/l de extracto de malta. Se puede adicionar 1mg/l de BAP
a este medio si se desea acelerar la multtpllcacion.
METODOS DE DESINFECCION
El cultivo in vitro consiste en cultivar un explante con potencialidad de
dlferenclaclon bajo condiciones aseptlcas en presencia de una dieta balancea-
da de nutrientes y hormonas. Estas a la vez son condiciones ideales para el
crecimiento y prollferaclon de microorganlsmos contaminantes, de am que
podemos Imaglnar la importancia de losmetodos que usemos para desinfectar
superflcialmente los explantes, esterillzar los medios de cultlvo, desinfectar
los instrumentos. la camara de transferencia de flujo laminar y limpiar los
cuartos de trabajo,
- Material vegetal:
El procedimiento de destnfecclon superficial del explante debe ellmlnar
los microorganismos pero a la vez debe causar el menor dana posible al
explante. Varios compuestos se han recomendado y entre los mas usados
estan el hipoclorito de sodio (cloro comercial del2% aI5%) y de calcio (del 6%
aI12%) que se recomienda como menos toxlco y el etanol (70%). Tarnbien se
ha recomendado la adiclon de un detergente (2 a 4 gotas de Tween-20) pararomper la tension superficial y permitir que el explante este en mejor contacto
con el quimlco, Por ejernplo, para desinfectar ramas ortotroplcas de cafe que
se colectan en el campo. primero se enjuagan con agua corrtente, se incuban
en hipoclorito de calcio all 0% por 30 minutos y luego en hipoclorito de calcio
al 8% por 20 mlnutos, en la camara de transferencia de flu]o laminar se
enjuagan con agua destllada esterll al menos 3 veces antes de inlciar su cultlvo
in vitro. El uso de anttblottcos se recomienda como ultima alternativa para
limpiar los explantes. estos pueden Influlr negativamente en otros procesos
del cultlvo.
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No se puede generallzar sobre el tlpo de desinfectante 0la concentraclon
de este a utlllzar ya que cada especie y tipo de explante es un caso particular
10 que resalta la importancia de experimentar con diferentes metod os utlllzan-
do un numero reducido de explantes. Sin embargo. se puede decir que la
concentraclon mas liviana de desinfectante que sea efectiva contra la conta-
mlnacton de determinado explante es la mas adecuada. si es mas dUuida que
esta no se ellmlnaran los microorganismos y si es mas concentrada se
quernara el explante. Para facilitar la limpieza del explante es importante
considerar que los brotes nuevos son mas limpios que los viejos. materiales
que crecen en el invernadero son mas limpios que los que se mantienen en el
campo yentre mas pequefio sea el explante a introd ucir a cultivo in vitro menor
sera la contammacion a ellmlnar, sin embargo. el tamafio debe ser tal que
facilite el establecimiento del tejido. Otra recornendaclon que se ha formulado
es el uso de antioxidantes si se observa coloracion cafe en el explante durante
el proceso de destnfecclon. Por ejemplo, 100 mg de acido ascorblco y 150 mgde acldo citrico en un litro de agua destilada. Esta solucton de antioxidantes
se esterUiza yen ella se sumergen los explantes antes de iniciar el proceso de
reducclon de su tamafio para iniciar el cultivo.
- El medio de cultivo:
Por 10 general el medio de cultlvo se esterillza en el autoclave a una
presion de 115 lb. (l212C) durante 20 mlnutos, sin embargo. el tiempo deestertllzaclon dependera del volumen de medio. Otro metodo muy utilizado
es la estertllzaclon en frio utUizando para esto filtros miliporosos que pueden
retener hongos y bacterias. Para esta operaclon es necesario esterUlzar
primero tanto los recipientes como los flltros que se usaran, Para facilitar este
tipo de esterlllzacton una operon podria ser la utlllzaclon de aparatos de
flltracton previamente esterUizados y desechables que se encuentran en el
mercado.
- La cristaleria:
La cristaleria debe lavarse con detergentes que se eliminen factlmente
con agua, Es recomendable que la crtstaleria que haya estado en contacto con
altas concentraciones de hormonas se enjuague con etanol al 70% antes de
lavarla con agua y detergente para asegurarnos de eliminar los residuos. Una
vez finalizado el proceso de lavado es recomendable dar un ultimo enjuague
con agua destllada.
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- La camara de transferencia deflujo laminar:
La camara de transferencia de flujo laminar esta provtsta de un flltro
HEPA(elcual no debe ser tocado debido a su fragilidad) que permite que el aire
que suavemente circula a traves de la camara sea estertl. Esto permite al
tecnlco abrir libremente los tubos y realizar las transferencias de manerarazonablemente segura. Sin embargo. antes de iniciar las labores debe limpiar
las superflcies de la camara (mesa y paredes interiores). para esto se utiUza
alcohol de 702• Otra recomendacton que ayudara a mejorar la tecnlca de
traba]o en la camara es nunca colocar beakers. frascos de cultivo u otros, al
frente del area de trabajo ya que esto interrumpe el flujo de aire estertl. UtUice
las 3/4 partes mas internas de la camara para trabajar y coloque cerca de
donde se abren los frascos de cultivo el mechero 0quemador. de manera que
no tengan que permanecer abiertos por mucho tiempo. Estas practtcas Ie
ayudaran a reducir la contammacion en los cultivos.
- Los instrumentos de trabajo:
La tecnlca cornunmente utilizada para esterilizar los instrumentos
metalicos, plnzas, btsturies. tijeras. etc. es el flarneo previa Inmerston en
alcohol de 952• Si se usa vidrio como base para las operaciones de transferen-
cia este puede asperjarse con alcohol de 952 y flamearse. Cuando se utilizan
platos petri 0papel, estos deberan esterilizarse antes haciendo uso delautoclave. Otra recomendaclon uttl es la de asperjar el exterior de los frascos
de cultivo, agua estertl, etc. con etanol para asi reducir las posibles fuentes de
contarnlnacion.
- El cuarto de transferencia:
La limpieza del cuarto de transferencia es un factor importante para
lograr el exlto. Este debe Ilmpiarse con desinfectantes y a fondo. Esrecomendable hacer la limpieza al final del dia de manera que a la manana
slgutente el cuarto este libre de olores y se pueda iniciar el trabajo temprano.
Nodebe permitirse el ingreso de alimentos a esta habltacion.
- El tecnicot
EItecnlco debe ser cuidadoso en las operaciones que realiza, estar atento
a no hacer movimientos bruscos dentro de la camara de transferencia para nointerrumpir el flujo de aire. Antes de iniciar labores de transferencia de
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cultivos es recomendable que limpie sus manos y brazos con alcohol. usar una
bata de laboratorio limpla y trabajar a brazos extendidos de manera que pueda
hacer las manlpulaclones en la parte mas interna posible de la carnara y a la
vez que el allento de su resplraclon no llegue a los explantes evitando con esto
contamtnaclon.
EMBRIOGENESIS SOMATICA Y SUSPENSIONESDE CELULAS
Estas tecnlcas tuvieron su ortgen en el concepto de Totlpotencia enun-
ciado por Haberland en 1902. Totipotencla stgnlflca que todas las celulas
vegetales tienen la capacidad de formar plantas completas.
La totlpotenclalldad de la celula vegetal se debe a la particularidad que
tlene cualquler celula vegetal de perder su dfferenctaclon (desdlferenctactonl.
Los primeros resultados a favor de esta teoria fueron los obtenldos por
Reinert en 1958 y Steward et al. en 1958. Estos Investtgadores lograron
Induclr la forrnacton de embriones sornatlcos a partlr de raices de zanahorla.
A la fecha se han reallzado clentos de estudios con dlferentes plantas
conflrrnadose los resultados anteriores. Algunas revisiones sobre la
ernbrtogenests somatica se pueden encontrar en: Tisserat et al. 1979:
Ammlrato 1983: Evans et at. 1981: Vasil 1982.
EMBRIOGENESIS SOMATICA
La embrtogenests se refiere a la forrnaclon de un ernbrton somatico a
partir de celulas somatlcas que no son el producto de la fusion de gametos.
Esta termlnologia fue utllizada por Tokin en 1963 para describir la forrnaclon
de un individuo a partir de una 0varlas celulas somattcas, Sin embargo. este
fenomeno no debe confundirse con la organogenesis.
Caracteristicas de un embri6n somatfcos
Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, y no poseen conexlo-
nes vasculares con el tejido materno (generalmente alslados por una epider-
mls). Esta estructura es capaz de crecer y formar una planta completa. En
muchos aspectos de su desarrollo los embriones sornatlcos mantienen una
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slmilitud con los embriones ctgotlcos. Sin embargo. pueden ocurrir anorma-
lldades en el desarrollo como por ejemplo la fusion de los cotUedones.
Embriogenesis directa 0indirecta:
Aunque a veces esta distinel6ri no es admttida es importante resaltar quela embrtogenesls somatlca puede acornpanarse de un fen6meno llamado
callogenesis 0formaclon de un cal!,p(un calla puede ser definidos como un
conjunto desorganizado de celulasvcapaces de dlvldlrse, pudiendo ser
mertstemattcas 0embriogenicas).' Es :~l~~lltado de la totipotenelalidad.
Factores que afectan Ia embriogenesis somatica:
Ala fecha existen muchas teorias sobre la embrtogenesla somatlca y los
factores que favorecen este proceso. sin embargo. no parecen existir reglas nirecetas universales.
El Explante:
En base a la definicion de totipotencia, vlrtualmente todos los tejldos
vegetales tienen capaeldad para formar embriones sornancos in vitro. Sin
embargo. dependlendo de las especies y de las condiciones de cultlvo. pocos
explantes son capaces de inielar la embrtogenests somatlca, En general. los
explantes util1zados con mas exlto en varias especies de la mayoria de lasfamjltas. de plantas son 10$ eotlledones, los hlpocotllos y los embriones. Sin
emhB:rgo. tamblen se umi~l?n los apices. segmentos de hoja, raices e
Inflorescenclas. Por ejernplo, los embriones clgottcos inmaduros han resul-
tado el explante m a s favorable para Inducir la embrtogenests somatlca en la
mayoria de los cereales. Tamblen se han util1zado las hojas en sorgo. cafe y
palmaceas y las nucelas en citrtcos y mango. En general se puede admitir que
entre mas joven sea el tejido util1zado Iestadio juvenil poco diferenciado) mas
facll sera desviarlo de su programa genettco y asi obtener la desdtferenclacton
hacla la formaclon de ernbrtogenesls somatlca.
Segun Lttz, 1984 YDhed'a et al, 1991, un factor a considerar es que
muchas veces dentro de una misma especle, las reacciones de las diferentes
variedades pueden ser muy diferentes. Asi. un metodo establecido para un
cultivar 0varied ad podra no aplicarse a otro indlviduo de la misma especle.
La semilla y sus tejidos juegan un papel muy Importante en el desarrollo
del ernbrton ctgotlco. Los tejidos en .muchas especles crean barreras que
permiten regular el lntercarnblo gase'oS6 asi, el oxigeno disponible para el
ctgoto es limitado. Anivel de nutrtcton, los teiidos de la semilla como la nucela
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y el endospermo proveen al clgoto los elementos necesarios para su desarrollo:
carbohldratos. Iipldos y proteinas. Los tegumentos juegan tarnblen un papel
lmportante en la regulacton de la luz.
Factores Extemos:
En contraste con los esfuerzos que se han dedicado al estudio de los
medios de cultivo y las sustancias de crectmlento. pocos Investtgadores se han
dedicado a estudiar el efecto de los factores ambientales.
Eloxigeno:
EI nivel del oxigeno en cultivo de tejidos depende de los gases presentes
alrededor y dentro del recipiente de cultivo y de su proporclon. EI nivel de
oxigeno dependera entonces de la manera en que se clerre el frasco de cultlvo,
de Ia frecuencia de los subcultivos y del metabollsmo de los tejldos que rodean
al tejido embrtogenlco (callos). En trtgo, Carman (1989) demostro que bajas
dosls de oxigeno favorecian la embrlogenests somatlca. Por otro lade
Engelmann (1990). trabajando con palma africana encontro que la conserva-
cion de cultivos embrtogenlcos se favoreclo en presencia de una atmosfera al
1% de 02 + 99% de N2•ya que el nttrogeno des plaza rapldarnente el oxigeno.
El medio:
Los medios sernf-solldoa son los mas empleados. Sin embargo. existen
vartos estudios que demuestran la importancia del agente gellflcante : agar.
gelrtte, agarosa.
Aunque en la fase de tntctaclon de Ia embrlogenests somatlca se utUiza
preferencialmente el medio solido. el medio liquldo es muy utillzado en la
multlpllcaclon a gran escala.
'EI cultivo en medio liqutdo presenta varias ventajas:
- Indtvtduallzacton de todos los embriones somatlcos.
- Aumento del potencial embrtogenlco.
- Aumento en la expreston de los pro-embrlones y por ende, un aumento
del nurnero de embriones sornatlcos
- Mejoramiento de la maduraclon de los embriones y como consecuencia
mejorarnlento de la gerrnlnaclon de los mismos.
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EIproceso conslste en transferir el cultivo embrlogeruco a un erlenmeyer
con medio llquldo con agttacton 0en bioreactores. Tarnblen se puede utiUzar
el"Slstema de Inmerston Temporal". el cual ha sido desarrollado reclentemen-
teo Este sistema consiste en sumergtr el cultlvo en el medio a intervalos
regulares, por ejemplo, 4 veces al dia por un periodo de 1 minuto.
EI medio de cultivo:
Por 10general. se utUiza elmedio de Murashlge y Skoog 0modificaciones
de este.
Sacarosa:
La sacarosa se utillza en nlveles de 2 a 3% (20 a 30 gIl). Sin embargo.
exlsten varios estudios que demuestran que aItas dosls de sacarosa pueden
favorecer la embrlogenesls sornatlca. As], Wetherell (1984) reporto el uso de
sacarosa a 120 gIl en zanahoria. Por otro lado, Escalant y Teisson (1989)
demostraron que en Musa fue necesario utilizar 60 gIl de sacarosa. Segun
Finer (1987). otra ventaja que conlleva el utillzar altas concentraciones de
sacarosa (120 gil) es poder disminuir la dosls de auxina.
Nitrogeno:
EI nltrogeno es ~in duda un elemento esencial en el cultivo de tejidos.Existen varias formas de sumlntstrarlo siendo las mas comunes el NH.
(amonio) y el N03(nitrato). Tamblen se puede complementar la dosls con el
nttrogeno organlco provisto por amino acldos tales como glutamina y alanma,
la caseina hidrollzada 0por el agua de coco.
Carbon Activado:
EI carbon activado se utlllza principalmente para llmitar los problemas
de oxldaclon asociados al cultivo de teJidos (ltberaclon de compuestosfenollcos que provocan la oxldaclon y muerte del tejido). EI carbon activado
adsorbe las sustancias quirnlcas en general. limitando asi su Intervenclon con
el tejido cultivado. Con respecto a las auxinas y citocininas. se cree que el
carbon activado las retiene Ilberandolas progresivamente en el medio favore-
ciendo asi la embrtogenests somatlca. Las dosts cornunmente utUizadas van
de O.1 gl I a Igl 1 .
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Reguladores del Crecimiento:
- Las auxinas
De acuerdo con Evans et al. 1981, en la mayoria de los sistemas de
embrtogenesls somatlca la ind ucclon requiere una concentraclon alta auxinao equivalente: AlA; ANA; 2.4-0; 2.4.5-T; picloram (4-amino-3.5.6-
trichloropicolinic acid); dicamba. EI 2.4-D slendo el mas utiUzado. Las
concentraciones utiUzadas son muyvariables (0.5 - 27.6pM hasta 450 pM en
presencia de carbon activado).
- Las citocininas:
Las citocininas como el SAP.la kinetinay la zeatina son a veces utiUzadas
en el medio de Inducclon de la embrlogenests somatlca, Sin embrago sonmucho mas utiUzadas en la fase de dlferenclaclon y maduraclon del embrton
sornatlco.
- Otras sustancias:
- En el caso de las especies lenosas, se ha recomendado incorporar el acldo
giberellco (G~) con el fin de ayudar a la maduraclon y gerrnlnaclon de
los embriones somaticos.
- El ABA0acldo abscislco puede favorecer la embrtogenesis somatlca. En
trigo, se observe que en ausencia de ABAel embrlon ctgottco utiUzado
como explante primario germinaba (Javed. 1989). La adlclon de ABA(0.5
- I mg/I) al medio de cultivo permite inhibir la germlnacton y aumentar
los porcentajes de callos ernbrtogentcos. Otro punta importante reside
en el control que tiene el ABAsobre el desarrollo del embrlon somatlco
reduclendo la producclon de embriones anormales.
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SUSPENSIONES CELULARES
Los primeros ensayos de cultivo de celulas vegetales alsladas fueronreallzados por Haberlandt. Para 1937. en un estudio con celulas aisladas de
la cofia de raices, Gautheret resalto la importancia de condicionar previamen-
te el medio de cultivo (nodriza) antes de inocular las celulas aisladas.
Las suspensiones celulares consisten en celulas libres y agregados
celulares puestos en un medio Hquldo en movimiento. Tales suspensiones
pueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrientes.
Inleiaeion de las suspensiones
Expiante: EI material comunrnente utilizado consiste en trozos de
tejidos friables de tipo "callo". A veces es necesarto, utllizar enzimas
(pectinasas y celulasas) para liberar las eelulas. La calldad del explante iniciaI
es muy tmportante, el mejor Inoculo consiste de un cultivo friable con un alto
ritmo de division celular, por ejemplo, un cultivo embrlogentco el cual es un
tejido friable constituido por celulas embrtogenlcas y proembriones somatlcos.
Recipiente: Por 1 0 general el lnoculo se siembra en erlenmeyers. Sin
embargo. debido a la gran importancia de la relaclon volumen de medio y
volumen del Inoculo es aconsejable algunas veces utilizar recipientes de tipo
"Multi-Well Tissue Culture Plates" 0 sea. cajas de petri con varias celditas.
Para la produccion mas iva de celulas 0 metabolitos secundarios a nivel
industrial se utiliza los "bloreactores".
Muchos de los trabajos publlcados sobre suspensiones celulares resal-
tan la importancla de la densidad del Inoculo en el exlto de las suspensiones.
En general se recomienda empezar con volumenes pequefios de medio (10 a
50 ml)Yun Inoculo de 2 a 5 g (peso materia fresca).
Caraeteristieas de las suspensiones eelulares:
En su fase de Inlciacton las suspenslones celulares cons tan de varios
tipos de celulas:
- Celulas diferenciadas sin capacidad de division: son celulas aIargadas y
grandes con una vacuola enorrne y un citoplasma reducido con un
nucleo pequefio.
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- Celulas mertstemattcas: mas pequefias, con un citoplasma mas denso
ocupando todo el espacio intracelular.
- Celulas embrtogenlcas: con un citoplasma ocupando todo el espacio
Intracelular, sustancias de reservas como almldon, proteinas y Iipidos.
En resumen. durante el periodo de Inlclaclon Iasuspensiones celulares
constan de varios tlpos de celulas asi como de agregados de diferentestamanos y en ciertos casos de proembriones y embriones somatlcos.
Desarrollo de la suspension de celulas
EI desarrollo de Ia suspension celular, por 10 general. comprende tres
fases: una fase inicial de latencia durante la cualla densidad de celulas no
aumenta: una fase de alto crecimiento durante Ia cual el volumen celular
aumenta y una ultima fase llamada "estacionaria" durante la cual el erect-
miento se manteniene constante y el volumen celular no aumenta. Elcrecimiento de una suspension de celulas es por 10 tanto de tipo exponencial.
EI desarrollo de Ia suspension celular esta relacionado con varios
factores:
- Tipo de explante inicial.
- Calldad del medio de cultivo: reguladores del crecimiento. compuestos
organlcos y minerales.
- Condiciones ambientales: relaclon oxigeno/C02. luz/oscuridad.
- Velocidad de agttaclon (60 - 100 rpm).
- Densidad en materia celular: relacton volumen de celulas I volumen demedio.
Es dificUestablecer reglas en 10 que concierne a estos parametres. sinembargo. en la gran mayoria de los casos, se recomienda un cambio de medlo
cada semana (en ciertos casos cada 3 dias). Varios estudios han demostrado
que durante la fase de crecimiento la suspension celular puede acabar
rapldamente con varios de los nu trientes. Por ejemplo, Browny Beevers (1987)
demostraron que en suspensiones de arroz. el fosfato y el azucar del medio
fueron limitantes despues de 7dias de cultivo. Existe tambien gran evidencia
de que la division celular se favorece en presencia de reguladores tipo auxina
como el 2.4-D: el picloram. etc. Por el contrarlo, la forrnaclon de embriones
somatlcos requiere de una dtsmtnuclon en la concentraclon en auxina y la
Introducclon de citocininas al medio de cultivo.
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Tarnblen es muy importante conslderar el cultlvo de celulas en presencia
de "nodrizas". En efecto, en Ia mayoria de los casos, cuando se trata de
suspensiones de celulas aisladas (es decir obtenidas a traves de un flltro de
50 j4 ) la division celular y el crecimiento de estas celulas dependen de la
presencia cercana de un tejido "nodrlza" que proporcione a las celulas los
metabolitos necesarios.
Existe varlos tipos de nodriza como por ejemplo: los callos embrtogenlcoe
o mertstematlcos, EI cultivo con nodriza puede realizarse en varias formas.
Una es el cultlvo de las celulas aisladas en presencia de nodrtzas (callo)en su
alrededor 0tam bien se puede precondicionar un sustrato dejando la nodriza
un cierto tiempo y removlendola al momento de inocular las celulas aisladas.
Se plensa as! que las sustancias necesarias al buen desarrollo de las eelulas
aisladas son proporcionadas a traves del medio de cultivo.
Una vez que las condiciones de cultivo son establecldas. se puede
multiplicar una suspension. Para esto se realizan divisiones sucesivas de la
masa celular colocandose estas en otros recipientes.
Evaluaci6n del crecimiento:
Existen diferentes metodos para Ia evaluaclon del crecimiento de una
suspension de celulas.
•Conteo de celulas:
Es necesario en este caso tener una suspension sin agregados grandee,
de 10 contra rio se haria necesario un tratamiento con enzimas tipo pectinasa
(0.1% durante 16 h a 262C). EI conteo se realiza usando un microscopio.
•Determinaci6n del volumen celulari
Se toma una fracclon deIasuspension celular y se transflere a un tubo
graduado de centrifugacton. Despues de centrifugarla durante 3 minutos a
2500 rpm. el material celular sedimenta y se puede apreciar el volumen
celular, Se expresa en mi de celulas por ml de medio. Este metodo de
evaluaclon es facll y rapldo. Ademas, puede realizarse en condiciones
estertles, 10 que permite conservar la totalidad de Ia suspension.
•Pesofresco
• Peso seco
• Turbidez:
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Usando un fotocolorimetro con filtro azul (400-465 nm).
• Indice miiotico:
Consiste en la evaluaclon del numero de celulas en estado de mitosis.
Este Indlce se calcula de la slgutente manera:
1M= Celulas en mitosis x
total de celulas
1 0 0
Regeneracion de plantas a partir de suspenstones celulares:
La regeneracton de plantas completas a partir de suspensiones celulares
puede ocurrir mediante varios procesos tales como: calla + organogenesis;
calla + embrtogenests sornatlca0
embrtogenests somatlca "directa". Por10
general. la regeneraclon a partir de callos ocurre despues de "platear" una
aUquota de la suspension sobre un medio semi-solido adecuado. La formaclon
de plantas a traves de la embrtogenesls somatlca puede ocurrir directamente
en el medio liquido 0despues del "plateo" sobre el medio seml-soltdo.
En general. el desarrollo de plantas a partir de suspensiones celulares
requiere una dlsmlnuclon de las auxinas y la Introduccion de citocininas.
Tamblen puede ser muy uttl la presencia del acldo abscisico (ABA)como
regulador de las divisiones celulares. EI ABA favorece la obtenclon deembriones sornattcos bien formados (evita los problemas de embriones plurt-
cotUedonarios) y tamblen lagermtnacton y la obtenclon de plantas completas.
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METODOS DE CONSERVACION
DE LOS RECURSOS FITOGENETICOS
Durante los ultlmos anos el germoplasma vegetal. al Igual que otros
recursos naturales. se esta perdiendo en forma alarmante, en muchos casos
antes de percatarnos de su exlstencla, su potencial y su valor real. La
destruccton de los habitat. la selecclon natural. los agentes btotlcos y
paradojtcamente, el abandono de las variedades tradicionales en favor de las
nuevas variedades mejoradas, han sldo los factores involucrados en esta
erosion genetlca. Recordemos que el germoplasma vegetal es un recurso
irrenovable y que es vital para la seguridad allmentaria de la humanidad y por
ende para un desarrollo sostenible. Debido a esta erosion genenca aceleradade las especies vegetales se ha despertado gran Interes por desarrollar
metodos eficientes para conservar el germoplasma, esto es, preservar con la
mayor integridad posible toda la variabilidad dlsponlble en una especie dada.
I. CONSERVACION IN SITU
Idealmente ladiversidad vegetal deberia conservarse in situ coexistiendo
con otros organismos vivos en su ambiente natural. .Sin embargo. diferentes
experlenctas sefialan que a fin de garantizar la exlstencla del recurso, se
requlere de otros metodos de preservaclon. Como resultado. se han desarro-
llado sistemas de conservaclon ex situ.
II. CONSERVACION EX SITU
Estos metodos dependeran del tipo de propagaclon de la especie en
particular y /0el tipo de semilla que presentan.
Los bancos de semillas:
En general los bancos de semillas son adecuados para la conservaclon
a largo plazode especies con semillas ortodoxas, es declr, semillas que resisten
alto grado de desecaclon y almacenamiento a bajas temperaturas (entre 50C
y -20OC).Sin embargo. este tlpo de almacenamiento es inadecuado 0imposible
para un alto numero de cultivos debido a que poseen semUlas recalcitrantes
(no resisten la desecaclon y el almacenamiento por largos periodos sin perder
rapldamente la vlabllidad),0son propagados vegetativamente. Este es el caso
del cacao. coco. mango. hule, banano, aguacate, yuca, ptna, cafe. pimienta y
muchos otros cultivos. Para la conservaclon de especies con semillas
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recalcitrantes 0 propagadas vegetativamente las colecciones en el campo y
mas reclentemente, las colecctones in vltro representan altematlvas a cons i-
derar.
Las coiecciones de campo:
Las colecciones de campo son dificiles de implementar presentandose
problemas como la decision del tamafio adecuado de la muestra para
conservar la diversidad genetlca. Dependiendo de la especle, esta podria
variar desde unos pocos individuos hasta miles de plantas para poder
mantener la heterocigocidad. Esto impllca que el espacio requerido para la
conservaclon sera considerable. mas aun cuando se piensa en conservaclon
de especies forestales. Por otra parte. cuando se piensa en conservaclon a largo
plazo este no serfa el metodo mas adecuado. Las plantas estan expuestas a
desastres naturales. agentes blotlcos, errores humanos y camblos en laspolittcas instltucionales 0gubemamentales. Ademas.Jos costos de manteni-
miento y labor son muy altos.
Conservaci6n in vitro:
Con el desarrollo de las tecnlcas de cultlvo de tejidos es posible la
conservaclon y el intercambio de germoplasma vegetal in vltro. La conserva-
cion in vltro ha estado sujeta a dtscuslones, principalmente debido a que el
germoplasma debe mantenerse bajo estrictos controles de asepsia. Sinembargo. esto es precisamente 10 que permite el intercambio de material
vegetal entre paises sin pasar por el periodo de cuarentena. Esta tecnlca ofrece
muchas otras ventajas. por ejernplo, permite el almacenamiento de gran
numero de especies en un espacio reducldo, se elimina el riesgo de ataques
de plagas y enfermedades. Para aquellos materiales de ciclos cortos se puede
alargar los perfodos de transferencta, ademas, es posible producir y mantener
plantas libres de virus con altas tasas de multtplicacton y todo esto indepen-
diente de las condiciones cllmatlcas.
Bajo esta modalidad la conservaclon puede realizarse:
1. a mediano plazo. modificando la tasa de crecimiento del cultivo para
alargar los periodos entre transferencias y por ende, disminuir los riegos de
vartaclon.
2. a largo plazo 0crioconservaci6n que consiste en suprimir totalmente el
crecimiento y metabolismo del material almacenandolo a~ltra bajas tempe-
raturas (rutrogeno liquldo, -196°C)por tiempo indefinido.
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Oonservacton in vitro a mediano plazo:
EI metodo consiste en mantener los cultivos (yemas. plantulas 0
meristemos) en condiciones flslca (factores ambientales) y quimlcas (compo-
stolon del medio de cultlvo) que permltan extender al maximo el lntervalo de
transferencia a los medios de cultivo frescos. sin afectar su vlabilldad y
reduciendo la posibilldad de perdlda por manlpulaclon y contamlnaclon. La
reducclon en la tasa de crecimlento generalmente se logra dismlnuyendo en
unos grados la temperatura del ambiente y /0 Ia intensldad de la luz,
dependlendo la temperatura de almacenamlento de la sensibUidad de la
especie. Por ejemplo, IaRed Internacional para el Mejoramiento del Banano
y el Platano (INlBAP. en Ingles) conserva la colecclon mundial in vitro de
bananos y platanos bajo esta modalldad de crecimiento reducido almacenan-
do los merlstemos apicales a una temperatura de 152C y una Intensidad
Iuminlca de 2000 lux. Por otro lado, el Centro Intemacional de Agrtcultura
Tropical (CIAT)conserva la colecclon in vitro de yuca a 222C. ya que tempera-
turas inferiores a los 182Cson perjudiciales para estos materiales a menos que
la Intensidad lurninlca se reduzca por debajo de 500 lux. Sin embargo.
modificaciones en la concentraclon de nutrientes. reguladores de crectmlento,
presencia de osmottcos, oxigenaclon y el fotoperiodo son factores que tamblen
afectan el crecimiento.
Crtoconservacien 0Conservacton in vitro a largo plazo:
La crtoconservaclon consiste en lIevar material blologlco desde su
temperatura flslologtcarnente normal hasta ultra bajas temperaturas y de
nuevo a su temperatura normal sin causar dano. Esta tecnlca tiene sus raices
htstortcas en estudios realizados sobre Ia sobrevivencia de especies vegetales
en condiciones de temperaturas bajo cero grados centfgrados, en zonas
templadas y en la busqueda de resistencia a las heladas. sin embargo. no fue
sino hasta 1973 cuando se logro una verdadera crtoconservaclon en nttrogeno
Iiqutdo de celulas de zanahoria.
AIpresente, la crtoconservaclon se ha considerado como el unlco metodo
viable para el almacenamiento de germoplasma vegetal a largo plaza bajo
condiciones de alta estabilldad genetlca y con un minimo de mantenimiento.
Una vez que el material ha sido congelado a -196OC.las funciones metab611cas
cesan, por 10 tanto. no ocurre division celular, deterioro 0 mutaciones. Mas
aun, elmaterial puede permanecer en este estado por tiempo Indeflnldo, Otras
ventajas que presenta este metodo de almacenamiento son los bajos costos de
labor y mantenimiento y el reducido espacio requerido. Ademas, permite la
conservacton no solo de meristemos. sino tambten de embriones ctgottcos,somatlcos. callos embrtogentcos. polen y suspensiones celulares, es declr,
material generado en ellaboratorio y por ingenieria genetlca.
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Requisitos para la crioconservaci6n de especies vegetales:
- Habilidad de cultivar el material in vitro.
- HabUidad de multlpllcarlo in vitro.
- Los materiales deben reststlr los pretratamientos y crioprotectores.
- El tejldo debe regenerarse despues del congelamiento.
Etapas en el proceso de crioconservaci6n:
a) La seleccion y aislamiento del material a conservar. En esta etapa se debe
de considerar la establlidad genettca tntrinseca del sistema. por 10tanto.
los meristemos y embriones son los materiales prloritarios en programas
de conservaclon de germoplasma.
b) Pretratamiento y crtoproteccton, se induce cierto grado de deshldrataclon
en las celulas y tejidos para evitar dafios causados por la formaclon de
cristales de hielo durante los procesos de congelamiento y
descongelamiento. El material puede cultivarse desde unos pocos
minutos hasta varios dias en presencia de sustancias crloprotectoras
como la sacarosa, gltcerol, sulfoxldo de dimetilo y otras. Ademas de
inducir una deshldrataclon protectora, estas sustancias disminuyen la
temperatura a la cual el agua intracelular se congela e intervienen en la
establllzaclon de membranas y en la protecclon de sitios de enlace de
enzimas durante el proceso de congelamiento.
c) Congelamtento, este puede ser ultra rapldo por Inmerston directa en
nltrogeno liquido 0lento siendo necesario un congelador prograrnable
para obtener resultados precisos y reproducibles. El almacenamiento en
nttrogeno liquido es recomendable ya que las fases liquida y vapor se
estabillzan a -150Q
C. 10que evita el deterioro progresivo del material.
d) Descongelamlento, ella mayoria de los cas os se realiza por Inmerston de
los viales que contienen las muestras en banos de agua a 40QC. sin
embargo. se han reportado algunas excepciones donde el
descongelamiento lento ha sido necesario.
e) Recuperaclon. es el tratamiento a que se somete el material despues del
descongelamiento. Consiste en ellavado 0dlluclon de loscrioprotectores
y el cultlvo de las muestras en condiciones opttmas para asegurar sucrecimiento.
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Durante los ulttmos 20 afios las investigaciones en esta area han
generado gran numero de reportes sobre tecntcas desarrolladas para la
crtoconservaclon no solo de especies vegetales de clima templado sino
tamblen de especies tropicales comoMusa spp.•Manlhot esculenia, Theobroma
cacao. Elaels gulneensls. Coffea spp.• Rubus. Cocos nucifera, Saccharum
offtctnarum y muchas otras. Actualmente son pocos los laboratorios queutllizan lacrtoconservacton, sin embargo. el interes par conocer e implementar
este nuevo metodo de preservacion de germoplasma va en aumento.
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