(19) 대한민국특허청(KR)(12) 공개특허공보(A)

(11) 공개번호 10-2008-0114077

(43) 공개일자 2008년12월31일

(51) Int. Cl.

A61K 31/12 (2006.01) A61K 36/9062 (2006.01)

A61P 25/28 (2006.01)(21) 출원번호 10-2007-0063297

(22) 출원일자 2007년06월26일

심사청구일자 없음

(71) 출원인

아주대학교산학협력단

경기도 수원시 영통구 원천동 산 5

경기도

경기도 수원시 팔달구 매산로3가 1

(72) 발명자

이수환

경기 수원시 영통구 영통동 988-2 살구골 서광아파트 707-701

류재하

서울 양천구 목동 신시가지 아파트 601-402

(뒷면에 계속)

(74) 대리인

특허법인 신성

전체 청구항 수 : 총 5 항

(54) 양강으로부터 분리한 화합물을 포함하는 뇌질환의 예방 및치료용 조성물

(57) 요 약

본 발명은 뇌염증 또는 뇌혈관 염증이 수반되는 뇌질환의 예방 및 치료제 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는

양강으로부터 분리한 화합물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료제 조성물에 관한 것이다.

대 표 도 - 도17

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공개특허 10-2008-0114077

(72) 발명자

백은주

서울 강남구 논현동 23-3

이영돈

경기 수원시 팔달구 인계동 선경3차아파트 301-504

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공개특허 10-2008-0114077

특허청구의 범위

청구항 1

하기 화학식 1에 기재된 화합물 또는 하기 화학식 2에 기재된 화합물을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및/

또는 치료용 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]

청구항 2

제1항에 있어서, 상기 화합물은 양강으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.

청구항 3

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 양강의 클로로포름, 에틸아세테이트, 또는 아세톤 분획으로부터 분

리된 것을 특징으로 하는 조성물.

청구항 4

제 1항에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌염증 및 뇌혈관 염증이 수반되는 각종 뇌질환인 것을 특징으로 하는 조성물.

청구항 5

제4항에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌졸중, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 외상성 손상에 의한 뇌기능 부전, 면역계

이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 세균성 및 바이러스 감염에 의한 뇌기능 부전으로 구

성된 군으로부터 선택된 뇌질환인 것을 특징으로 하는 조성물.

명 세 서

발명의 상세한 설명

발명의 목적

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공개특허 10-2008-0114077

발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술

본 발명은 뇌염증 또는 뇌혈관 염증이 수반되는 뇌질환의 예방 및 치료제 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게

는 양강으로부터 분리한 화합물을 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료제 조성물에 관한 것이다.

최근의 통계에 의하면 뇌혈관질환(cerebrovascular disease)으로 인한 사망률이 10 만명 당 73.8명에 이르러 전

체 한국인의 사망원인 중 1위를 점하고 있으며 뇌혈관질환에 의한 사망은 매년 증가하는 추세에 있다. 뇌혈관

질환 발병시 사망에는 이르지 않는다 하더라도 수반되는 장애가 심각하여 삶의 질 저하는 물론 막대한 사회, 경

제적 손실을 초래하게 된다. 뇌혈관 질환의 발병율은 노년일수록 증가하는 특성이 있으며 현재 급속도로 노령화

사회로 이행하고 있는 우리나라의 실정을 감안하면 뇌혈관질환의 예방 또는 치료법의 개발은 국민보건 향상은

물론 국가경제에도 커다란 기여를 할 수 있을 것이다.

뇌질환 치료제의 국내 시장규모는 뇌졸중(뇌경색)의 경우 연간 1000억, 퇴행성 뇌질환의 경우 연간 200억 이상

으로 알려져 있으며, 해마다 증가되고 있는 추세이다. 또한, 2000년 현재 전세계 60억 인구 중 뇌졸중 환자가

4,100만명, 알츠하이머병 환자 3,700만명으로 추계된 바 있어(WHO 조사 보고서) 효과적인 뇌질환의 예방, 치료

제개발은 엄청난 경제적 부가가치를 창출할 수 있다.

뇌졸중의 치료는 허혈부위에서의 신경세포사멸을 효과적으로 제어할 수 있는 약물의 개발이 필수 조건이나 전세

계의 유수한 연구기관의 노력에도 불구하고 아직 약효가 입증된 약물의 개발이 이루어지고 있지 않은 실정이다.

뇌졸중의 치료 및 예방목적으로 사용되는 약물들은 고혈압치료제, 뇌혈류 개선제 및 고지혈증 치료제 등이 있으

나 뇌졸중 발생 후에는 혈전 용해제를 제외하고는 허혈에 의해서 야기되는 뇌손상을 보호해줄 수 있는 적절한

치료제가 현재로서는 거의 전무한 실정이다. 뇌손상을 제어하기 위한 최근의 약물개발 연구동향으로는 뇌허혈로

인한 신경세포 손상기전에 근거하여 비가역적 손상을 차단 또는 억제할 수 있는 새로운 치료제 개발을 위한 다

각적인 접근이 시도되고 있으며 뇌졸중에 의한 뇌손상과 관련된 기전들의 복잡성 때문에 특정 작용기전보다는

다양한 작용기전에 대한 연구가 진행되고 있다. 이중 뇌염증 조절을 통해 뇌손상을 경감하려는 시도는 여러 연

구자들에 의해 활발히 이루어지고 있다.

뇌염증 반응은 타박상, 뇌졸중에 의한 신경세포의 손상과 동반되어 일어나며 퇴행성 뇌질환이나 허혈성 뇌질환

의 병리적 특성의 하나이다. 뇌염증 반응은 퇴행성 신경질환의 위험인자로도 알려져 있으며, 뇌손상시 신경세포

의 손상을 가중시키고 뇌졸중 후 이차적인 뇌손상에 관여하는 것으로 알려져 있다. 뇌염증 반응은 혈관내피세포

및 백혈구의 세포부착분자의 발현 증가, 혈구세포의 뇌내 이동, 뇌-혈관 관문 기능의 변화, innate immune

response의 증가 및 각종 세포사멸 유도 반응의 증가 등을 포함한다. 따라서 뇌염증 반응은 각종 뇌질환에서

뇌 및 뇌혈관의 기능장애를 일으키는 중요한 요인이라 할 수 있으며, 뇌염증 반응의 기전 및 조절원리의 규명은

각종 뇌질환으로부터 뇌를 보호하는 핵심기술을 제공할 수 있을 것이다.

뇌졸중의 치료 및 예방목적으로 사용되는 약물들은 고혈압치료제, 뇌혈류 개선제 및 고지혈증 치료제 등이 있으

나 뇌졸중 발생 후에는 혈전 용해제를 제외하고는 허혈에 의해서 야기되는 뇌손상을 보호해줄 수 있는 적절한

치료제가 현재로서는 거의 전무한 실정이다. 현재 임상에서 사용되고 있는 뇌졸중 치료제로는 tPA나 혈전 용해

제를 비롯하여 혈소판 억제제, 항응고제, 뇌혈관 확장제, 칼슘 차단제, 뇌부종 억제제 등의 다양한 기전의 약물

들이 있다. 최근에는 뇌허혈로 인한 신경세포 손상기전에 근거하여 비가역적 손상을 차단 또는 억제할 수 있는

새로운 치료제를 개발하기 위하여 다각적인 접근이 시도되고 있다. 즉 NMDA나 AMPA와 같은 glutamate 수용체 길

항제를 비롯하여 Ca++-channel blocker, Na

+-channel blocker, free radical scavenger, calpain inhibitor,

NOS 저해제, COX-2 저해제 등이 주요 연구표적이 되고 있다. 즉, 뇌졸중에 의한 뇌손상과 관련된 기전들의 복잡

성 때문에 특정 작용기전보다는 다양한 작용기전에 대한 연구가 진행되고 있다.

이중 뇌염증 조절을 통해 뇌손상을 경감하려는 시도는 여러 연구자들에 의해 활발히 이루어지고 있다. 뇌허혈

손상에 염증반응이 기여하는 기전은 아직 완전히 규명되지는 않은 상태이나 백혈구의 뇌혈관 벽에의 부착으로

인한 혈류속도의 감소와 손상되거나 사멸중인 세포로부터의 독성 염증인자 분비 등이 가장 설득력 있는 가설로

제시된 바 있다. 최근의 연구에 의하면 iNOS 및 COX-2 등과 같은 염증 관련 효소의 발현 증가는 허혈성 뇌손상

의 진행에 있어 매우 중요한 기전이라고 알려져 있으며 이들의 조절을 통해 허혈성 뇌손상에 대한 분명한 개선

효과를, 적어도 실험동물 수준에서, 얻을 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 이와 함께 허혈시 백혈구의 혈관 내

부착 및 뇌조직으로의 침투 또한 조직 손상을 일으키는 중요한 기전으로 일찍부터 주목되어 세포부착분자 중

ICAM-1에 대한 항체 치료가 시행된 바 있으나 실험동물 수준에서의 개선 효과에도 불구하고 임상실험은 대부분

실패로 귀결된 바 있다. 이는 적용 항체가 이종 단백질인 이유에서 비롯된 것으로 보이며 따라서, 이러한 접근

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공개특허 10-2008-0114077

방법의 유용성을 살리기 위해서는 이에 대한 적절한 대응책, 즉, 인간 항체의 개발이나 small molecule의 적용

등이 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또한 각종 뇌손상시 수반되는 뇌혈관 장벽(Blood-brain barrier)의 기능

손상으로 인해 혈관성 또는 세포성 뇌부종이 유발될 수 있으며 이는 뇌기능 손실 또는 사망의 직접적인 원인이

되기도 하여 뇌혈관 장벽의 기능을 정상화하는 방안 또한 중요한 연구 방향으로 되어 있다.

염증 반응 조절을 통한 허혈성 뇌손상 억제는 대부분의 환자가 발병 후 6시간 이후에나 치료를 받는다는 사실을

감안하면, therapeutic window를 연장시킬 수 있다는 점에서 그 치료제로서의 의의가 매우 클 것으로 생각된다.

이들 치료제와 함께 thrombolysis가 병용된다면 조기 재관류 (early reperfusion)의 유용성을 증대시킬 수 있으

며 따라서 전반적으로 더 낳은 치료 성적을 기대할 수 있을 것이다.

발명이 이루고자 하는 기술적 과제

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 뇌질환의 예방 및 치료제를 제공하는 것

이다.

발명의 구성 및 작용

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1에 기재된 화합물 또는 하기 화학식 2에 기재된 화합

물을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명의 상기 화합물은 양강으로부터 분리된 것이 바람직하고, 양강의 클로로포름,에틸아세테이트, 또는 아세

톤 분획으로부터 분리되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌염증 및 뇌혈관 염증이 수반되는 각종 뇌질환인 것을 특징으로 하며, 상기

뇌질환은 뇌졸중, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 외상성 손상에 의한 뇌기능 부전, 면역계 이상 뇌기능 부전, 진행

성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 세균성 및 바이러스 감염에 의한 뇌기능 부전으로 구성된 군으로부터 선택된

뇌질환을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 뇌염증 반응의 활성화에 관여하는 신호전달체계를 규명과, 뇌염증반응이 신경세포 생존에 미치는

영향, 그리고 뇌염증 반응을 효율적으로 조절할 수 있는 물질을 탐색하고 그 작용기전을 확인하기 위한 일련의

연구를 진행하여 오고 있다. 본 발명에서는 양강추출물로부터 뇌염증 반응을 효율적으로 조절할 수 있는 물질을

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탐색하고 그 작용기전을 확인함으로써 뇌졸중 예방 또는 치료제 개발을 위한 신약선도물질을 도출하고자

하였다.

실험결과 양강의 메탄올(AOM) 및 클로로포름(AOC) 분획은 LPS 처리한 뇌미세아교세포 (microglia)에서 염증성

매개인자인 NO 생성 및 PGE2 생성을 강하게 억제하였으며 이 활성을 바탕으로하여 주요 성분으로 AO-A 및 AO-

B를 순수분리하여 역시 활성을 확인하였다. AOC의 활성은 COX-2의 발현 유도와는 관계가 없었으며 COX-2에 대한

직접적인 효소활성 저해 작용에 기인하는 것으로 확인되었으며 COX-1에 비해 비교적 선택성을 갖고 있음을 확인

하였다.

또한 AOC는 in vitro 뇌혈관장벽 (BBB) model에서 염증자극에 의해 증가된 BBB 투과도를 억제하는 작용을 보였

으며 또한 염증 자극에 의해 증가된 백혈구-뇌혈관내피세포 부착을 효과적으로 억제하였으며 이는 부착분자 발

현 저해와 관계있는 것으로 확인되어 뇌손상시 관찰되는 뇌부종 및 뇌실질로의 백혈구 침윤을 효과적으로 억제

할 수 있을 것으로 판단되었다.

따라서 AOC로부터 분리된 본 발명의 화합물은 뇌염증 및 뇌혈관 염증이 수반되는 각종 뇌질환 예컨대 뇌졸중,

Parkinson 병, Alzheimer 병, 외상성 손상에 의한 뇌기능 부전, 세균성 또는 바이러스 감염에 의한 뇌기능 부전

등의 예방 또는 치료에 유효할 것으로 기대된다.

한편, 양강은 (良姜, Alpinia officinarum Hance) 고량강이라고도 하며 생강과 (Zingiberaceae)에 속하는 다년

생 초본의 뿌리줄기를 말린 것으로 구부러진 원주형 또는 원추형이고 때때로 몇 개의 곁뿌리가 달려있다. 표면

은 적갈색이 또는 암갈색이고 회백색의 마디가 있고 마디 사이에 세로주름이 있으며 재질은 단단하고 쉽게 꺽이

지 않는다. 예부터 방향성 건위, 진통, 진토약으로서 소화불량, 구토, 복통, 하리에 응용하고 있는 생약이며

[한의과대학 본초학 편찬위원회. 2004, 본초학, 388-389, 영림사], 동남아시아에서는 류마티스성 질환에 사용하

는 것으로 알려져 있다. 또한, 중국에서는 전통적으로 비장과 위관련 질환에 대해 탁월한 치료효과를 나타내는

것으로 알려져 있다. 주요성분으로는 정유가 0.5-1%로서 1, 8-cineol, methyl cinnamate, α-cadinene등과 신

미성분으로서 galangol, flavonoid 성분으로 galangin, kaempferide, alpinin 등을 함유하고 있다. [소화관편,

1985. 중약대사전 제2권, 782. 상해과학기술출판사]

양강의 약리활성에 대한 연구로는 pandreatic lipase의 억제작용[Shin, J.E.; Han, M.J.; Kim, D.H. 2003,

Biol. Pharm. Bull. 26, 854-857], 지방산합성 억제작용[Li, B.H.; Tian, W.X. 2003, J. Enzyme Inhib. Med.

Chem. 18, 349-356] 등이 보고되어있다.

German Commission E Monographs에는 식욕감퇴와 소화 불량에 사용되어지는 것으로 기재되어 있으며, 미국의

FDA에서는 ‘generally regarded as safe (21CFR section 182. 10, 182. 20)' 로 규정하고 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: 양강 조추출물의 제조

경동시장 내 진흥건재약업사에서 구입한 양강 (4.5 kg) 을 환류냉각하면서 2시간 동안 추출하였다. 이 과정을

3회 반복한 후, 추출액을 여과하고, 여액은 회전 진공농축기를 사용하여 감압하에 농축하여 메탄올추출물 421 g

을 수득하였다.

실시예 2: 양강 분획물의 제조

(실시예 1)에서 얻은 메탄올추출물 400g을 물 2 liter에 현탁시킨 후 헥산 2 liter를 첨가하여 용해한 다음 헥

산층에 용해된 성분만 얻고 이 과정을 3회 반복한 후 합하여 진공건조하여 헥산 가용분획 58 g을 수득하였다.

남은 수층에 클로로포름 2 liter를 첨가하여 용해한 다음 클로로포름에 용해된 성분만 얻고 이 과정을 3회 반복

한 후 합하여 진공건조하여 클로로포름 가용분획 26 g을 수득하였다. 상기와 동일한 방법으로 에틸아세테이트

가용분획 18 g을 수득하고, 마지막으로 남은 수층을 감압농축하여 수층 분획물을 수득하였다.

실시예 3: 양강의 클로로포름 가용 분획으로부터 화합물 A와 B의 분리

클로로포름 가용 분획 (2 g)을 Hexane : EtOAc (30 : 1 → 10 : 1) 의 조건으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래

피를 행하여 용출물을 크게 6개의 분획으로 나누었다. 그 중 C-4 분획 (874 mg) 과 C-6분획 (400 mg) 으로부터

다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 행하여 다시 각각 3개의 분획으로 나누고 그 중 C-4-1 (19 mg) 과 C-4-

2분획 (124 mg)으로부터 각각 화합물 A (10.9 mg)와 화합물 B (96.3 mg)를 분리하였다.

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공개특허 10-2008-0114077

실시예 4: 양강으로부터 분리한 화합물 A의 구조결정

양강의 클로로포름가용 분획에서 분리된 화합물 A은 진갈색의 결정상으로 실리카겔 TLC상에서 10 % 황산에 의해

청녹색으로 발색되었다. 1H-NMR에서 δ6.6-δ7.3 부근의 8개의 aromatic proton (H-2′, H-3′, H-4′, H-5′,

H-6′ 및 H-2", H-5", H6")과 δ5.50에서 OH기 및 δ3.80에서 1개의 methoxy기, δ2.4 -δ2.8사이에 8개의

saturated type의 proton (H-1, H-2, H-6, H-7)을 관찰하였고, 또한 δ6.1과 δ6.8에서 trans 형태의 두개의

이중결합성 proton (H-4, H-5)을 확인하였다. 그리고 13C-NMR 로부터 δ200에서 한 개의 keton성 carbon (C-3)

및 δ56.0에서 전형적인 methoxy carbon을 관찰하여 1개의 methoxy기를 가진 전형적인 enone형태의

diarylheptanoid성 구조로 추정함으로써 7-(4-hydoxy-3-methoxy phenyl)-1-phenylhept-4-en-3-one임을 확인하

였다. [Fumiyuki, K., Satoshi, I., Masaaki, S., Fumio, H., Ushio, S., 1992. Chem. Pharm. Bull. 40, 387-

391]

분자식 C20H22O3 (m.w. 310.39)

7-(4'-Hydroxy-3'-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3 -one

1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) : δ2.47 (2H, dd, H-6, ), δ2.68 (2H, t, H-7), δ2.82 (2H, m, H-2), δ2.89 (1H,

m, H-1), δ3.80 (3H, s, OCH3), δ5.48 (1H, s, OH), δ6.10 (1H, dd, H-4), δ6.62 (1H, s, H-2″), δ6.64

(1H, s, H-6″), δ6.70 (1H, m, H-5″), δ6.82 (1H, m, H-5), δ7.107.30 (5H, m, H-2′, H-3′, H-4′, H-

5′, H-6′).

13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) : δ30.02 (t, C-1), δ34.11 (t, C-7), δ34.46 (t, C-6), δ41.70 (t, C-2), δ

55.83 (q, -OCH3), δ110.81 (d, C-2″), δ114.29 (d, C-5″), δ120.85 (d, C-6″), δ126.06 (d, C-4'), δ

128.33 (d, C-2′, -6′), δ128.45 (d, C-3′,C-5′), δ130.62 (d, C-4), δ132.57 (s, C-1″), δ141.19

(s, C-1'), δ143.92 (s, C-4″), δ146.38 (d, C-5), δ146.41 (s, C-3″), δ199.46 (s, C-3).

실시예 5: 양강으로부터 분리한 화합물 B의 구조결정

양강의 클로로포름 가용 분획에서 분리된 화합물 B는 갈색의 결정상으로 실리카겔 TLC상에서 10 % 황산에 의해

진녹색으로 발색되었다. 1H-NMR에서 δ6.6-δ7.3 부근의 8개의 aromatic proton (H-2′, H-3′, H-4′, H-5′,

H-6′ 및 H-2", H-5", H6")과 δ5.64 및 δ3.18 에서 각각 한 개의 OH기, δ3.80에서 한 개의 methoxy기, δ

2.4-δ2.9사이에 8개의 saturated type의 proton (H-1, H-2, H-6, H-7), δ1.6-δ1.8에서 2개의 proton을 관찰

하였다. 그리고 13C-NMR 로부터 δ211에서 한 개의 keton성 carbon (C-3) 및 δ55.7에서 전형적인 methoxy

carbon을 관찰하였고, δ66.8에서 OH기가 결합된 oxycarbon (C-5)을 확인함으로써 1개의 methoxy기를 가진 전

형적인 diarylheptanoid성 구조로 추정하여 5-Hydroxy -7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenylheptan-3-

one임을 확인하였다.

분자식 C20H24O4 (m.w. 328.40)

5-Hydroxy-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenylheptan-3-one

1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) : δ1.78 (2H, m, H-4), δ2.402.90 (4H, m, H-1, H-2), δ2.502.90 (4H, m, H-6, H-

7), δ3.18 (1H, s, 5-OH), δ3.86 (3H, s, OCH3), δ4.04 (1H, dd, H-5), δ5.63 (1H, s, 4″-OH), δ6.58

(1H, d, H-5″), δ6.64 (1H, s, H-6″), δ6.70 (1H, d, H-2″), δ7.147.30 (5H, m, H-2′, H-3′, -4′,

-5′, H-6′).

13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) : δ29.39 (t, C-7), δ31.33 (t, C-1), δ38.26 (t, C-6), δ44.93 (t, C-2), δ

49.17 (t, C-4), δ55.77 (q, -OCH3), δ66.77 (d, C-5), δ111.01 (d, C-2″), δ114.22 (d, C-5″), δ

120.82 (d, C-6″), δ126.15 (d, C-4') δ128.19 (d, C-2′, C-6′), δ128.48 (d, C-3′,C-5′), δ133.61

(s, C-1″), δ140.57 (s, C-1'), δ143.64 (s, C-4″), δ146.35 (s, C-3″), δ211.15 (s, C-3).

실험예

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공개특허 10-2008-0114077

(1) 추출물 library의 확보 및 활성 성분의 분리, 정제

iNOS 및 COX-2 활성 저해 추출물을 출발점으로 하여 활성 성분을 분리 정제하였다. 즉, MeOH를 이용한 표준 추

출법으로 추출물을 얻은 다음 극성에 따른 용매분획 (hexane, ethylacetate, BuOH)을 제조하였다. 활성이 우수

한 분획은 각종 컬럼크로마토그래피로 활성물질을 정제하고 분광학적인 자료를 이용하여 구조분석을

시행하였다.

(2) iNOS 및 COX-2 저해활성

-세포배양 및 처리

뇌 미세아교세포주인 BV-2 cell을 96 well plate에 분주한 후 (2-3 x 105/well) 10% fetal bovine serum

(Hyclone)과 10% penicilline (100U/ml)/streptomycin(100U/ml) (Gibco)이 함유된 DMEM (Gibco) 배지를 넣어

5% CO2/95% air, 37℃ 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후 새로운 DMEM 배지로 갈아주고 LPS (10 μg/ml)를 처

리하여 대식세포를 활성화 시켰다. 이 때, 배양액내에 천연물 추출물을 농도별로 처리하고 이 후 24시간 동안

배양하여 생성된 PGE2 및 nitrite의 양을 정량하였다.

-Nitrite (NO2-) 정량

Nitrite의 양은 Griess 반응을 이용하여 정량하였다. 위의 LPS를 처리한 배지를 각각 100μl씩 취하고 1%

sulfanilamide와 0.1% N-1-naphthylethylene dihydrochloride/50% H3PO4를 동량씩 위의 배지에 가하여 발색 시

킨다음 10분 후 540 nm에서 배지의 흡광도를 측정하고 검량선으로부터 nitrite의 양을 산출하였다.

-PGE2 생성 억제능과 Cyclooxygenase 활성의 측정

세포에 3% fetal calf serum(FCS, GIBCO)이 포함된 RPMI배지를 가하고 LPS 및 시료를 함께 37℃에서 일정 시간

배양하였다. 일정 시간 동안 배양한 후 배지를 전량 취하여 -20℃에 보관하였다가, 생성된 PGE2의 양을 EIA로

측정하였다. COX의 세포내 활성은 Fu 등에 의한 실험 방법에 준하여 측정하였다. 즉, PGE2 생성능을 측정하기

위해 배지를 제거한 세포에, 과량의 arachidonic acid (30μM, Sigma)가 함유된 PBS를 가하여 10분간 배양하였

다. 그 후, 배지를 취하여 여기에 포함된 PGE2의 양을 EIA로 정량하여 COX의 활성으로 표시하였다.

-iNOS, COX-2의 wetern blot

Raw264.7 cell을 confluent하게 배양한 후 LPS를 처리하고 24시간 후 세포의 whole lysate를 얻었다. Cell

lysate는 10% SDS-PAGE로 전기 영동을 한 후 PVDF transfer membrane에 electrophoretically transfer하였다.

Membrane을 3% non-fat dried milk가 함유된 PBS로 90분간 처리하여 blocking한 후, polyclonal anti iNOS- 또

는 COX-2 rabbit IgG를 PBS에 1:600으로 희석하여 overnight incubation 하였다. PBS로 3-4차례 세척한 후

goat antirabbit immunoglobulin-alkaline phosphatase (1:600)로 3-4 시간 배양하였다. 그 후 bromo-4-

chloro-3-indoyl phosphate (5 mg/ml, 70% ethanol)과 nitro blue tetrazolium (5 mg/ml, 100%

dimethylformamide)을 각각 1:600, 1:300의 비율로 alkaline phosphate buffer에 희석한 용액을 membrane에 가

하여 발색 시킨 후 iNOS, COX-2의 band를 확인하였다.

-iNOS, COX-2 mRNA 정량

Total RNA는 easy BLUE(intron, Korea)을 사용하여 분리하였다. easy BLUE 1ml과 chloroform 200ul를 넣고 4

℃ 5분 동안 incubation을 하여 세포를 lysis시키고 12,000xG, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액만 취하였

다. 여기에 같은 양의 isopropanol을 넣고 15min 4℃동안 incubation을 한 후 12000G, 15min, 4℃로 원심분리

하여 RNA 침전물을 얻어, 70% ethanol로 씻고 공기 중에서 10분간 건조한 후 spectrophotometer을 이용하여

260nm에서 RNA양을 측정하였다. RT-PCR을 통해 해당 mRNA를 증폭하여 iNOS, COX-2와 ICAM-1의 변화를 확인하였

다. Reverse transcription은 AMV revers-transcriptase를 이용하여 25℃ 10분→ 42℃ 60분→ 97℃ 5분→4℃

for ever의 조건에서 행하였으며 PCR은 COX-2는 94℃ 1분→ 60℃ 1분→72℃ 1분)×28cycle, iNOS는 94℃ 1분

→60℃ 1분→72℃ 1분)×28cycle의 조건에서 행하였다.

iNOS primer

Sense(서열번호:1) : 5'-GTGTTCCACCAGGAGATGTTG-3'

- 8 -

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Antisense(서열번호:2) : 5'-CTCCTGCCCACTGAGTTCGTC-3'

COX-2 primer

Sense(서열번호:3) : 5'-ACTCACTCAGTTTGTTGAGTCATTC-3'

Antisense(서열번호:4) : 5'-TTTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3'

(3) In vitro 뇌혈관 기능 검색

뇌혈관 기능은 생쥐 뇌혈관내피세포주인 bEnd.3 세포를 이용하여 검색하였다.

-ICAM-1 mRNA 정량

Total RNA는 easy BLUE(intron, Korea)을 사용하여 분리하였다. easy BLUE 1ml과 chloroform 200ul를 넣고 4℃

5분 동안 incubation을 하여 세포를 lysis시키고 12,000xG, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액만 취하였다.

여기에 같은 양의 isopropanol을 넣고 15min 4℃동안 incubation을 한 후 12000G, 15min, 4℃로 원심분리하여

RNA 침전물을 얻어, 70% ethanol로 씻고 공기 중에서 10분간 건조한 후 spectrophotometer을 이용하여 260nm에

서 RNA양을 측정하였다. RT-PCR을 통해 해당 mRNA를 증폭하여 iNOS, COX-2와 ICAM-1의 변화를 확인하였다.

Reverse transcription은 AMV revers-transcriptase를 이용하여 25℃ 10분→ 42℃ 60분→ 97℃ 5분→4℃ for

ever의 조건에서 행하였으며 PCR은 GAPDH는 94℃ 3분→ (94℃ 30초→60℃ 30초→72℃ 1분)×30 cycle의 조건에

서, ICAM-1은 94℃ 3분→ (94℃ 1분→60℃ 1분→72℃ 2분)×30 cycle의 조건에서 행하였다.

ICAM-1 primer

Sense(서열번호:5) : 5'-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3'

Antisense(서열번호:6) : 5'-GAAGGTGGTTCTTCTGAGCG-3'

GAPDH

Sense(서열번호:7) : 5'-GTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3'

Antisense(서열번호:8) : 5'-CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'

-백혈구-내피세포 부착 (Leukocyte-endothelial cell adhesion assay)

염증반응에 의해 유도되는 백혈구-내피세포의 부착 정도를 확인하고자 cover glass가 놓인 24well에 bEnd.3 세

포를 배양하였고, 약물을 처리하였다. Human monocyte cell line인 U937에 cellTrackerTM Orange CMTMR로 30분

동안 세포 배양기에서 염색시킨 후 500ul(1×106cells/well)씩 bEnd.3가 배양된 cover glass위에 뿌렸으며, 약

1시간동안 세포 배양기에서 부착 시킨 후 1×PBS로 씻어내고 VECTA Shield로 mounting하여 slide glass에 고정

시켰으며 confocal laser scanning microscopy CLSM를 이용하여 부착 정도를 확인하였다.

-Zymography

MMP의 활성을 측정하기 위해 gelatin이 함유된 SDS-PAGE gel에서 전기영동을 시행하고 MMP에 의한 gelatin 분해

를 염색으로 확인하였다. 전기영동은 4℃에서 90V로 running 하였으며 gel running을 마친 후 gel을 떼어내어

gel이 잠길 정도의 2.5% Triton-X-100에 gel을 넣어 30분씩 2번 washing 하였다. Washing 후 gel을

incubation buffer에 넣어 37℃에서 48시간 동안 shaking incubation하고 Coomassie Blue R-250으로 40분간 염

색하였다. 이후 destaining solution (Methanol : Acetic acid : Water = 50 : 10 : 40)으로 약 40분간 탈염색

하고 분해된 band를 확인하여 MMP 활성의 척도로 하였다.

-In vitro Blood-Brain-Barrier (BBB) Model 확립 및 BBB 투과도 측정

뇌혈관의 기능적 integrity를 검정하기 위해 생쥐 뇌혈관 내피세포주인 bEnd.3 cell과 일차 분리 배양한 생쥐

성상세포 (mouse primary astrocyte)를 gelatin이 coating된 Transwell(ICN)에 함께 배양하는 in vitro BBB

model을 확립하여 기존의 model system과 비교 검토하였다. 우선 transwell insert를 뒤집은 상태에서

primary astrocyte를 가하여 5시간 동안 배양한 뒤 insert를 원위치에 되돌려 1일간 배양하였다. bEnd.3 또는

primary HUVEC을 insertso부에 가하고 2주간 배양하였으며 매일 transendothelial electrical

resistance(TEER)를 Millcell-ERS (Millipore, Bedford, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 염증자극을 위해서

는 TNFa (20ng/ml)또는 LPS(1ug/ml)을 가한 뒤 TEER을 측정하였다.

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상기 실시예와 실험예를 통한 결과는 다음과 같다.

(1) 활성분획이 뇌미세아교세포에서의 NO 및 PGE2 생성에 미치는 영향

양강으로부터 항염 활성을 지닌 분획을 정제하여 그 활성 본체를 확인하기 위한 일련의 실험을 행하였으며, 이

중 code 명을 AO로 한 시료에 대해 solvent fractionation을 행하여 얻은 분획에 대해 (도 1) NO 및 PGE2 생성

에 미치는 영향을 검토하였다. 메탄올 용매 분획은 농도의존적으로 LPS 유도 PGE2 생성을 억제하였으며 이는 다

른 양강 시료에서 얻은 메탄올 분획 (AOIIM)에서도 재확인 할 수 있었다 (도 2). 개략적인 IC50는 약 2ug/ml 이

었다. 양강의 메탄올 분획은 또한 cyclooxygenase-2 (COX-2) 활성도 농도 의존적으로 저해하였다 (도 3). 메탄

올 이후의 용매분획 중에서는 클로로포름 분획이 가장 강한 NO 생성 저해 활성을 관찰했으나 (도 4) PGE2 생성

은 용매분획간에 유의적인 차이를 보이지는 않았다 (도 5).

(2) 양강의 클로로포름 분획이 LPS 유도 PGE2 생성 및 COX 활성에 미치는 영향

가장 강력한 활성을 보인 클로로포름 분획을 대상으로 LPS에 의해 유도되는 PGE2 생성과 총 COX 활성에 미치는

영향을 검토하였다. LPS에 의해 유도되는 총 PGE2 생성은 AOC에 의해 농도 의존적으로 억제되었으며 개략적인

IC50는 약 0.1 ug/ml 이었다 (도 6). 그러나 AOC는 LPS에 의해 유도되는 COX 활성을 10 ug/ml의 경우를 제외하

고는 유의적인 영향을 주지는 못하였다 (도 7). 그러나 AOC는 COX-2 활성을 직접 농도의존적으로 저해하는 것으

로 확인되었으며 (도 8) 반면 COX-1의 활성에는 10 ug/ml의 경우를 제외하고는 유의적인 영향을 주지는 못하였

다 (도 9). AOC는 LPS 유도 COX-2 발현에는 유의적인 영향을 주지 못하였으며 (도 10) 이러한 결과들은 AOC에

의한 LPS 유도 PGE2 생성 저해는 COX-2 유도 저해에 기인하기보다는 COX-2 활성에 대한 직접적인 작용의 결과인

것으로 보이며 COX-1에 비해서는 상대적으로 COX-2를 더 선택적으로 저해하고 있음을 확인할 수 있었다.

(3) iNOS 및 COX-2 저해활성 성분 규명

용매분획 중 가장 강한 활성을 보인 클로로포름 분획에 대해 실리카 겔 컬럼크로마토그래피 (silica gel column

chromatography)와 preparatory HPLC를 이용, 단일 성분으로 분리하고 분광학적인 자료를 이용하여 구조분석을

시행하였다. 모두 7종의 화합물 구조를 확인할 수 있었으며 그 중 2종 화합물의 구조를 도 11에 나타내었다. 이

들 화합물은 iNOS 발현을 protein 및 mRNA 수준에서 저해하고 있음을 확인하였다 (도 12). 이중 AO-A는 COX-2

활성도 강하게 억제하였다 (도 13).

(4) In vitro Blood-Brain-Barrier Model 확립과 BBB투과도에 미치는 양강 용매분획의 영향

뇌혈관의 기능적 integrity를 검정하기 위해 뇌혈관 내피세포주인 bEnd.3 cell과 mouse primary astrocyte를

gelatin이 coating된 Transwell(ICN)에 함께 배양하는 in vitro BBB model (도 14)을 확립하여 기존의 model

system과 비교 검토하였다. 기존의 model 에서는 뇌혈관 세포주 대신 HUVEC과 rat 유래의 C6 glioma cell을 이

용하고 있는데 이는 내피세포 유래가 뇌혈관이 아닌 점, 그리고 co-culture하는 astrocyte의 종이 다른 점 등이

문제점으로 제시되고 있어 본 연구에서는 뇌혈관 내피세포주와 함께 동일한 종의 성상세포의 co-culture system

을 개발하고자 하였다.

도 15에 보인 바와 같이 bEnd.3+primary astrocyte model은 14일까지 배양한 결과 세포간의 간격이 거의 없는

형태를 유지하고 있었으며 이는 HUVEC+C6 glioma model 보다 더 치밀한 tight junction이 형성될 수 있음을 보

여주고 있다. 반면, bEnd.3+C6 glioma 혹은 bEnd.3 단독의 경우 세포의 상태는 4일 후부터 급격히 나빠져 7일

정도엔 많은 세포가 떨어져 나감을 확인하였다. 동일한 조건하에서 배양혈관내피세포를 통한 전기저항

(transendothlial electric resistance, TEER)을 측정한 결과 위의 사실과 대체로 일치하는 결과를 얻었다.

즉, bEnd.3+primary astrocyte model은 15일까지 지속적으로 TEER이 증가되었으며 이는 기존의 HUVEC+C6

glioma model과 거의 필적하는 수준이었다 (도 16). 반면, 다른 model에서는 TEER이 크게 증가하지 않았으며 4

일을 기점으로 급격하게 감소되는 경향을 보였다. HUVEC은 제대혈관 내피세포여서 뇌혈관 내피세포와는 그 기원

이 다르며, 또한 일차 배양해야 한다는 조건 때문에 많은 양을 얻기에 어려움이 있다. 또한 C6 glioma는 배양에

는 유리한 점이 있으나 분화된 성상세포가 아니며, 또한 흰쥐 유래세포라는 점이 이 모델에 제한점을 주고

있다. 반면, 본 연구에서 시도한 bEnd.3+primary astrocyte model은 뇌혈관 내피세포를 이용하고 있다는 점, 세

포주를 이용하므로 필요한 세포양을 용이하게 확보할 수 있다는 점, primary astrocyte는 다량, 손쉽게 구할 수

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있다는 점, 그리고 두 세포의 기원이 둘다 mouse라는 점 등이 안정적인 BBB model을 구성하는데에 장점으로 발

휘될 수 있다. 이러한 결과는 본 연구에서 시도한 bEnd.3+primary astrocyte model이 기존의 model을 대체할

수 있을만한 장점을 지니고 있다는 것을 시사하고 있다.

확립된 bEnd.3+primary astrocyte model에서 LPS를 가하여 염증 상태를 유발한 뒤 BBB permeability를 측정한

결과 대조군에 비하여 현저한 증가 (TEER의 감소)를 확인할 수 있었으며 AOC는 농도의존적으로 permeability를

유의적으로 개선하였다 (도 17)

(5) 양강의 용매분획이 백혈구-혈관내피세포 부착 및 세포부착분자 발현에 미치는 영향

양강의 용매 분획중 AOC는 염증성 자극에 의한 백혈구-혈관내피세포 부착을 농도 의존적으로 억제하였으며 (도

18) ICAM-1의 발현 또한 유의적으로 억제하였다 (도 19).

(6) 양강의 용매분획이 matrix metalloproteinase 활성에 미치는 영향

백혈구의 뇌내 이입에는 metalloproteinase의 활성 또한 매우 중요한 인자로 알려져 있어 zymography를 통한

MMP 활성 측정법을 확립하였으며 도 20에서 보는 바와 같이 spontaneous하게 MMP를 분비하는 SK-hep-1 세포에

aspirin과 curcumin을 처리한 경우 MMP의 활성이 저해됨을 확인할 수 있었으며, 앞서 PGE2 생성을 유의적으로

저해하는 양강 메탄올 분획도 동일한 결과를 보였다.

발명의 효과

상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 화합물은 뇌염증 및 뇌혈관 염증이 수반되는 각종 뇌질환에

효과적인 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 양강의 용매분획을 나타낸다.

도 2는 양강의 메탄올 분획이 LPS 유도 PGE2 생성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 3은 양강의 메탄올 분획이 COX-2 생성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 4는 양강의 용매분획이 LPS 유도 NO 생성에 미치는 영향을 나타내며, 도에서 Methanol (M), hexane(Hx),

chloroform (Hx), ethylacetate (EA)을 나타낸다.

도 5는 양강의 용매분획이 LPS 유도 PGE2 생성에 미치는 영향을 나타내며, 도에서 Methanol (M), hexane(Hx),

chloroform (Hx), ethylacetate (EA)을 나타낸다.

도 6은 양강의 클로로포름분획이 LPS 유도 PGE2 생성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 7은 양강의 클로로포름분획이 LPS 유도 COX 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 8은 양강의 클로로포름분획이 COX-2 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 9는 양강의 클로로포름분획이 COX-1 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 10은 양강의 클로로포름 분획이 LPS 유도 COX-2 발현에 미치는 영향을 나타내며, 도 에서 A) RT-PCR : 1:

대조군; 2: LPS 처리군; 3: LPS+NS398; 4: LPS+AOC (10ug/ml); 5: AOC (1 ug/ml); 6: AOC (0.1 ug/ml)

B) Western blot : 1: 대조군; 2: LPS; 3: LPS+AOC (10ug/ml); 4: AOC (1 ug/ml); 5: AOC (0.1 ug/ml); 6:

LPS+dexamethasone을 각각 나타낸다.

도 11은 양강으로부터 분리한 활성물질을 나타낸다.

도 12는 양강으로부터 분리한 화합물 AO-A, AO-B가 iNOS protein(위) 및 mRNA(아래)에 미치는 영향을 나타낸

다.

도 13은 양강으로부터 분리한 화합물 AO-A가 LPS 유도 PGE2 생성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 14는 In vitro BBB Model을 나타낸다.

도 15는 위상차 현미경하에서의 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포의 형태을 나타내며, 생쥐 일차배양 성상세포와 동시

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배양하였다.

도 16은 여러 in vitro BBB model에서의 TEER의 변화을 나타낸다.

도 17은 양강의 클로로포름 분획이 in vitro BBB Model에서 TEER 변화에 미치는 영향을 나타낸다.

도 18은 양강의 클로로포름 분획이 염증자극에 의한 백혈구-혈관내피세포 부착에 미치는 영향을 나타낸다.

도 19는 양강의 클로로포름 분획이 혈관내피세포 부착분자 발현에 미치는 영향을 나타낸다.

도 20은 양강의 메탄올 분획이 matrix metalloproteinase (MMP) 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도면

도면1

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도면2

도면3

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도면4

도면5

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도면6

도면7

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도면8

도면9

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도면10

도면11

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도면12

도면13

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도면14

도면15

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도면16

도면17

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도면18

도면19

도면20

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서 열 목 록

Ajou University Industry Cooperation Foundation

KYONGGI PROVINCIAL GOVERNOR

Composition for preventing and treating cerebrovascular disease

comprising a compound isolated from Alpinia officinarum Hance

8

KopatentIn 1.71

1

21

DNA

Artificial Sequence

iNOS primer

1

gtgttccacc aggagatgtt g 21

2

21

DNA

Artificial Sequence

iNOS primer

2

ctcctgccca ctgagttcgt c 21

3

25

DNA

Artificial Sequence

COX-2 primer

- 22 -

공개특허 10-2008-0114077

3

actcactcag tttgttgagt cattc 25

4

25

DNA

Artificial Sequence

COX-2 primer

4

tttgattagt actgtagggt taatg 25

5

20

DNA

Artificial Sequence

ICAM-1 primer

5

gtctgctgag acccctcttg 20

6

20

DNA

Artificial Sequence

ICAM-1 primer

6

gaaggtggtt cttctgagcg 20

7

- 23 -

공개특허 10-2008-0114077

24

DNA

Artificial Sequence

GAPDH primer

7

gtgaaggtcg gtgtgaacgg attt 24

8

24

DNA

Artificial Sequence

GAPDH primer

8

cacagtcttc tgagtggcag tgat 24

- 24 -

공개특허 10-2008-0114077

문서서지사항요 약대 표 도특허청구의 범위명 세 서발명의 상세한 설명발명의 목적발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술발명이 이루고자 하는 기술적 과제

발명의 구성발명의 효과

도면의 간단한 설명

도면도면1도면2도면3도면4도면5도면6도면7도면8도면9도면10도면11도면12도면13도면14도면15도면16도면17도면18도면19도면20

서 열 목 록

문서서지사항 1요 약 1대 표 도 1특허청구의 범위 3명 세 서 3 발명의 상세한 설명 3 발명의 목적 3 발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술 4 발명이 이루고자 하는 기술적 과제 5 발명의 구성 5 발명의 효과 11 도면의 간단한 설명 11도면 12 도면1 12 도면2 13 도면3 13 도면4 14 도면5 14 도면6 15 도면7 15 도면8 16 도면9 16 도면10 17 도면11 17 도면12 18 도면13 18 도면14 19 도면15 19 도면16 20 도면17 20 도면18 21 도면19 21 도면20 21서 열 목 록 22