Prof. Alexandre S. Osrio

O QUE UM GENOMA o conjunto haplide de cromossomos de uma espcie. O projeto genoma humano cromossomos humanos. - 22 autossomos + X + Y analisou 24

Podemos considerar o genoma como o conjunto de todo material gentico de um ser vivo.

COMPOSIO DO GENOMA HUMANO

Objetivo Mapear o patrimnio gentico do Homem

Avano na Medicina Preventiva Diagnstico (especfico, sensvel, efetivo e seguro) Tratamento (desenhos de frmacos especficos)

O arranjo linear dos nossos cromossomos fazem parte da nossa micro-anatomia. Histrico: 1543- corporis humani Fabrica por Andreas Vesalius; 1628- fisiologia da circulao por Harvey; 1761- anatomia mrbida por Morgagni.

1956- Evoluo da Gentica Mdica 1956- Estabelecimento do nmero de cromossomos e a determinao da estrutura de dupla-hlice do DNA por Watson e Crick; 1959, descrita a 1 sndrome (Down). Nos anos 60 uma srie de anormalidades comearam a ser descritas (n, translocao, deficincia, mosaicos, triploidias e microdelees).

Mapeamento Gentico

Provavelmente o 1 gene a ser mapeado foi o do Daltonismo (1911-1968) 1980- anlise de clulas somticas atravs do uso de sondas (diretamente no gene afetado); Construo de marcadores genticos para serem utilizados em famlias (RFLP, Seq TANDEM, Microsatlites, etc).

O Sequenciamento do Genoma Humano A ltima anatomiaAntes mesmo do lanamento do PGH ser lanado uma variedade genes j haviam sido descritos; 1944- 1 apresentao do material gentico por Avery, McLeod e McCArty em pneumococcus; 1953- Watson e Crick deduziram a dupla-hlice do DNA por difrao de radiografia; 1966- deduo dos nucleotdeos (para codificao de aa); 1960s Uso de enzimas de restrio; 1970s- Clonagem de genes em plasmdeos bacterianos e a tcnica do DNA recombinante;

1980- O Departamento de Energia dos EUA propem do sequenciamento do genoma humana devido a preocupao de mutaes ocorridas devido a radiao que seus trabalhadores estavam expostos.

Dcada de 1980- Primeiras discusses PGH; 1984- PG: EUA mapear patrimnio gentico humano. Japo e Austrlia: organismo de coordenao internacional HUGO (Human Genome Organization) facilitar e coordenar mapear, sequenciar e analisar: genoma humano e sua aplicao; 1990- PGH internacional: pesquisadores americanos e europeus.

1988- acreditava-se que o mapeamento e o seq. completo do genoma humano seria possvel ser feito em 10-15 anos (2005), com um custo de $200 milhes de dlares as ano liberado pelo congresso nacional americano. O Comit assessor do PGH recomendou que se fizesse o seq. a partir da construo dos mapas genticos e fsicos dos cromossomos e que fossem sendo feitos modelos de outros organismos em paralelo.

01/10/1990: foi lanado nos EUA do PGH: patrocinado pelo NIH (National Institutue of Health) e pelo DOE (Departament of Energy). Foi criado o grande consrcio mundial para o seq. do genoma humano formado pela Europa, Japo e Austrlia. HUGO ( Human Genome Organization)sintonizar o trabalho e organizar o conhecimento em um banco de dados.

Abril de 2003 durante as comemoraes de 50 anos da molcula de DNA. 96% do genoma. Os 6% restante so regies que ainda hoje no se possui meios de serem analisadas. Essas regies so basicamente os centrmeros e os telmeros dos cromossomos, que representam o centro e as extremidades de um cromossomo, respectivamente. A dificuldade em se analisar essas regies se deve a grande quantidade de repeties de DNA e regies de extremo condensamento.

No dia 4 de Setembro de 2007, o grupo de pesquisa do Instituto J. Craig Venter publicou a sequncia completa do genoma do prprio pesquisador Craig Venter (Venter, et al 2007). A grande revoluo nesse novo trabalho a de que o genoma avaliado corresponde ao genoma diplide, contendo a informao de cada par de cromossomo herdado de nossos pais, ao contrrio da sequncia determinada pelo Projeto Genoma que corresponde ao genoma haplide. Como resultado, descobriu-se que a diferena das sequncias genticas entre dois indivduos de 99,5% e no de 99,9% como se imaginava ao fim do Projeto Genoma Humano.

Quem participa do PGH ? Quem participa do PGH ? Setor Pblico dados - qualidade e preciso: detalhes das clulas humanas. Setor Privado genes de interesse. 18 Pases : Alemanha, Austrlia, Brasil, Canad, China, Coria, Dinamarca, EUA, Frana, Holanda, Israel, Itlia, Japo, Mxico, Reino Unido, Rssia, Sucia e Unio Europia.

MAPEAMENTO E MAPEAMENTO E SEQUENCIAMENTO DO GENOMA SEQUENCIAMENTO DO GENOMAGENOMA: DNA clulas - determinado organismo. Mapeamento Diviso dos cromossomos fragmentos menores propagados, caracterizados e ordenados respectivas posies nos cromossomos. Sequenciamento Seqncia de bases fragmentos de DNA j ordenados genes na seqncia do DNA.

VANTAGENS DO PGH VANTAGENS DO PGH Doenas fator gentico; Tecnologias clnicas diagnsticos de DNA; Terapias novas classes de remdios; Tcnicas imunoterpicas;

Preveno Doenas condies ambientais: mal de Alzheimer, hipertenso, obesidade, artrite reumtica, suscetibilidade ao cncer de mama e ovrio, osteoporose, cncer do clon, doenas cardiovasculares, mal de Parkinson, calvcie; Genes defeituosos Terapia Gnica Drogas medicinais organismos geneticamente alterados

Filme Projeto Genoma Humano

COMO FEITO O SEQUENCIAMENTO COMO FEITO O SEQUENCIAMENTO Mapeamento Sequenciamento Etapas do Sequenciamento1. 2. 3. Picotando o DNA Clonagem Marcao com Fluorescncia 4. Separao 5. Leitura

Ver animao!!!1. Picotando o DNA 4. Separao

Fig . 1 : Bases nitrogenadas do DNA

2. Clonagem 3. Marcao com Fluorescncia

Fig . 3: Fragmentos de DNA separados pelo tamanho

5. Leitura

Fig . 2 : Cromatograma de 4 cores Fig . 4 : Dados processados

Os resultados so mostrados num cromatograma de quatro cores. Depois os computadores renem as seqncias em longos e contnuos trechos.

1 organismo livre seq. foi a bactria Haemophilus influenzae, com 1800 genes que codificam protenas. Este seq. foi feito pelo grupo do J. Craig Venter utilizando a tcnica de aproximao. Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis e Treponema pallidum. 1996- 1 eucarioto seq. completamente, o Saccharomyces cereviae. 1998- 1 organismo multicelular completamente seq. foi o nematode Caenorhabditis elegans. 2000/ maro Drosophila melanogaster.

ALGUNS GENOMAS FINALIZADOS

26 de junho de 2000 Na Casa Branca, Colins e Venter anunciaram a concluso inicial do PGH O grupo do Colins publicou na Nature O grupo do Venter publicou na Science

A maior concluso deste grande projeto foi explicar que a complexidade do ser humano esta baseada codificao de diferentes protenas e no no nmero de genes.

Venter et al.

Colins et al.

Abril de 2003 : seqncia completa. O sequenciamento do genoma humano no corresponde ao genoma especfico de determinada pessoa. Estima-se que 99.9% da seqncia seja exatamente a mesma entre todos os seres humanos. O Tamanho dos genes varia enormemente: gene mdio = 3.000 bases Maior gene conhecido: distrofina (2.4 milhes de bases). Cromossomo 1 tem a maioria dos genes (2.968), e o Y a menor parte (231).

Sequenciamento dos genes cada vez maior o esforo dos cientistas para colocar disposio um nmero crescente de genomas inteiros sequenciados dos mais diferentes organismos.

Fig.7 : Representao do mapeamento gentico no cromossomo humano

O DNA humano formado por 3.1 bilhes de pares de base, com 4 nucleotdeos diferentes (A, C, G, T). Essas combinaes se repetem ao longo do genoma em diferentes ordens para formar aa, que combinado formaram as protenas necessrias. Ele formado por grandes desertos e alguns osis. S 3% do DNA contm regies codificadoras (centrais). O genoma humano idntico em 99,5%, os 0,1% que traz as variaes e pistas de muitas doenas

A complexidade dos seres humanos surgiu de alguma outra fonte Colins 12/02/01

O Brasil tambm participou do Projeto Genoma Humano . As principais iniciativas tomadas foram a da clonagem dos genes pelo laboratrio da pesquisadora Mayana Zatz; Projeto Genoma Humano do Cncer est em andamento graas a unio da Fapesp, Instituto Ludwig, Unicamp, EPM e da Faculdade de Medicina da USP; O Genoma Cana leva o Brasil a liderar a pesquisa em genoma de plantas (Copersucar FAPESP em 1998) O seqenciamento de uma praga de lavoura de laranja chamada de Xylella fastidiosa.

Cncer e o Projeto Genoma Cncer e o Projeto Genoma

Fig . 8 : Representao da porcentagem dos tipos de cncer

Genoma Cncer Genoma Cncer Pretende gerar entre 500mil e 700mil sequenciamentos Acesso a regies codificadoras ainda no explorados Elucidao no sequenciamento gentico do Homo sapiens Descoberta (???) da cura do cncer

O Futuro: A Medicina do Sculo 21 Saber a funo de todas essas protenas Saber as variaes, padres, estruturas e fentipos Identificar alelos para suscetibilidade Buscar marcadores Especificar diagnsticos (mendelianos ou no) Conhecer a vulnerabilidade ou resistncia Influncia: medicina reprodutiva, preditiva, no conceito de doenas que levem os mdicos a interpretar genes como hemogramas, diagnsticos especficos e clnicos, caracterizao precisa das doenas, busca de terapias personalizadas (frmacos), impresso digital dos tumores (2020).

EXERCCIOS1) (Unifesp-2004) Em abril de 2003, a finalizao do Projeto Genoma Humano foi noticiada por vrios meios de comunicao como sendo a decifrao do cdigo gentico humano. A informao, da maneira como foi veiculada, est a) correta, porque agora se sabe toda a seqncia de nucleotdeos dos cromossomos humanos. b) correta, porque agora se sabe toda a seqncia de genes dos cromossomos humanos. c) errada, porque o cdigo gentico diz respeito correspondncia entre os cdons do DNA e os aminocidos nas protenas. d) errada, porque o Projeto decifrou os genes dos cromossomos humanos, no as protenas que eles codificam. e) errada, porque no possvel decifrar todo o cdigo gentico, existem regies cromossmicas com alta taxa de mutao.

CORRETA : LETRA C

2) O bacterifago t2 tem como material gentico uma molcula de DNA com cerca de 3600 nucleotdeos, que compreendem trs genes. Admitindo que esses trs genes tenham aproximadamente as mesmas dimenses e que a massa molecular mdia dos aminocidos seja igual a 120, cada uma das protenas por eles codificada deve ter uma massa molecular aproximada de: a) 48000 d) 12 000 b) 24 x 103 e) 144 x 103 c) 4 x 102 RESOLUO: 3600 nucleotdeos / 3 genes = 1200 nucleotdeos em cada gene.

3 nucleotdeos ----------- 1 aminocido 1200 nucleotdeos ------- X aminocidos X = 400 aminocidos em cada protena.

400 aminocidos x 120 massa molecular mdia 48 000 massa molecular das protenas

RESPOSTA : LETRA A

3) (UnB DF) Cientistas norte-americanos e britnicos conseguiram, pela primeira vez, identificar todos os elementos que compem o genoma de um animal, um verme conhecido como Caenorhabditis elegans. O trabalho, realizado durante oito anos por equipes da Universidade de Washington, de Saint Louis (EUA), e do Centro Sanger de Carnbridge (GrBretanha), permitiu que fossem identificados os 97 milhes de pares de bases e os cerca de 20 mil genes que constituem o cido desoxirribonuclico (DNA) do animal. O Estado de s. Paulo, 11/12/98 (com adaptaes). Supondo que todos os genes mapeados codifiquem protenas e que uma protena possui, em mdia, 200 aminocidos, calcule a porcentagem do genoma do Caenorhabditis elegans representada pelas regies codificadoras de protenas. Despreze a parte fracionria de seu resultado, caso exista.

RESOLUO : 20 000 genes = 20 000 protenas = 2 x 104 protenas. 2 x 104 protenas x 200 aminocidos 400 x 104 = 4 x 106 aminocidos em todas as protenas do verme. 3 nucleotdeos ------------ 1 aminocido X nucleotdeos ----------- 4 x 106 aminocidos X = 12 x 106 nucleotdeos (que codificam todas as protenas do verme)

97 000 000 de pb. = 97 x 106 pb. 97 x 106 ----------------- 100% 12 x 106 ----------------- X X = 1200/97 = 12,37 % RESPOSTA: 12

4) As duas principais revistas cientficas do planeta, a inglesa Nature e a norte-americana Science, publicaram, dia 12/02/2001, uma das conquistas mais aguardadas dos ltimos tempos: a concluso do seqenciamento do genoma humano. A grande novidade, no final dos estudos, foi que o nmero de genes identificados (cerca de 30 mil) bem mais tmido do que o inicialmente aguardado (em torno de 140 mil). Os trabalhos desenvolvidos pela empresa de biotecnologia Celera e o Projeto Genoma Humano (PGH), formado por 16 instituies pblicas de pesquisa, permitiram a identificao quase total dos 3 bilhes de pares de bases que constituem o cido desoxirribonuclico dos humanos. (http://noticias.correioweb.com.br, com adaptaes) Supondo que todos os genes mapeados codifiquem protenas e que uma protena possui, em mdia, 200 aminocidos, calcule a porcentagem do genoma humano representada pelas regies codificadoras de protenas. a) 0,6% d) 2,5% b) 1% e) 50% c) 1,6%

RESOLUO: 30 000 genes = 30 000 protenas = 3 x 104 protenas 3 x 104 protenas x 200 aminocidos 600 x 104 aminocidos em todas as protenas humanas 3 nucleotdeos ------------- 1 aminocido X nucleotdeos ------------ 6 x 106 aminocidos X = 18 x 106 nucleotdeos (codificam todas as protenas humanas) 3 000 000 000 pb = 3 x 109 pb 3 x 109 ---------------- 100% 18 x 106 ---------------- X X = 18 x 108 / 3 x 109 X = 18/30 = 0,6 % RESPOSTA: LETRA A

5) O gene supressor de tumor p-53 um dos principais alvos de mutao durante o processo de carcinognese. Est localizado no brao curto do cromossomo 17 e codifica a nucleoprotena p-53 que responsvel pela regulao da transcrio nuclear, funcionando como um policial molecular. Se a clula for exposta a agentes mutagnicos externos a p-53 acumula-se no ncleo freando o ciclo celular em G1, dando tempo para que a clula repare seu DNA. Caso a clula no o repare, a p-53 dispara a morte celular por apoptose. Na verso mutagnica desse gene, a clula que sofre leso em seu material gentico no tem sua diviso celular interrompida e deste modo, o dano celular se transmite s clulas filhas. A mutao de p-53 no causa a transformao maligna sozinha, porm predispe a clula a outras mutaes que a levaro a uma transformao maligna. Baseando-se no texto e em conhecimentos correlatos, responda ao que se pede. a) Sabendo que a p-53 uma protena constituda por 393 aminocidos, quantos nucleotdeos sero necessrios apenas para a codificao desses aminocidos? b) Quantos cdons sero necessrios para a sntese dos 393 aminocidos? Justifique.

RESOLUO : a) 3 nucleotdeos --------------- 1 aminocido X nucleotdeos --------------- 393 aminocidos X = 1179 nucleotdeos b) 3 nucleotdeos = 1 cdon = codificao de 1 aminocido, logo 393 aminocidos = 393 cdons.

6) Galactosemia: incapacidade de transformar galactose em glicose As reaes bioqumicas que envolvem a galactose monossacardeo derivado da lactose (acar do leite) so de particular interesse porque, em seres humanos, esto sujeitas a defeitos genticos que resultam na doena conhecida como galactosemia. Quando o defeito est presente, os indivduos so incapazes de metabolizar a galactose a metablitos da glicose, o que freqentemente ocasiona catarata, crescimento deficiente, retardo mental e eventual morte por leso heptica. Um dos distrbios genticos devido mutao no gene GALK1, expressa como uma deficincia celular da enzima galactoquinase, promotora da degradao do referido monossacardeo. Sabendo-se que a enzima galactoquinase possui 392 aminocidos e que o gene GALK1 ocupa uma regio de 7.300 pb no genoma, qual a porcentagem da regio codificadora (xons) em relao ao tamanho total do gene?

RESOLUO : 1 aminocido ------- 3 bases no RNAm -------- 3 pb no DNA 392 aminocidos -------------------------------------- X X = 1.176 pb 7.300 pb ------------ 100% 1.176 pb ------------x x = 16,11%

7) "Um mecanismo molecular para as conexes entre os neurnios" Artigo publicado recentemente na revista norte-americana Cell (vol. 101, pp. 671684, 2000) apresenta uma possvel explicao para a grande especificidade e diversidade das conexes feitas pelas clulas nervosas. Alm de dar novas pistas sobre as bases moleculares dos circuitos neuronais, o trabalho tambm uma valiosa contribuio aos estudos sobre o papel de certas regies do genoma, que aparentemente no tm funo, na sntese de protenas. O trabalho baseou-se na clonagem e na identificao de um gene da Drosophila, mais conhecida como moscadas- frutas. Esse gene codifica uma protena localizada na membrana celular dos axnios, que so as projees dos neurnios responsveis pelas conexes com outras dessas clulas nervosas. G. Schmucker e colaboradores descobriram que uma protena, denominada Dscam, localizada na membrana dos axnios, o componente externo do receptor de um sistema de sinalizao que governa o movimento e o estabelecimento de conexes entre os neurnios. (Cincia Hoje, n 168, com adaptaes) Sabendo-se que a Dscam tem 2.026 aminocidos e que o gene que a produz contm 24 regies codificadoras (exons), espalhadas num total de 61.200 pares de bases nitrogenadas, calcule: a) A porcentagem aproximada da regio do DNA codificadora de tal protena. b) A quantidade aproximada de cdons do RNAm responsvel pelo "comando" da traduo da Dscam. Justifique.

RESOLUO: a) 3 nucleotdeos --------------- 1 aminocido X nucleotdeos ------------- 2026 aminocidos X = 6078 nucleotdeos

61.200 nucleotdeos ----------------- 100% 6.078 nucleotdeos -------------------- x x = 9,93% b) 3 nucleotdeos ----------------- 1 cdon 6078 nucleotdeos ------------- X X = 2026 cdons.

8) "DNA pode criar novo teste para hansenase" O bacilo da hansenase acaba de ter seu genoma decifrado. Os resultados devero permitir o desenvolvimento de testes de diagnstico mais rpidos e eficazes para a doena, que responsvel por 700 mil casos novos anualmente em todo o mundo, mais de 42 mil s no Brasil. O trabalho publicado na edio de hoje da revista britnica "Nature" (www.nature.com) trouxe algumas surpresas para os pesquisadores do Instituto Pasteur (Frana) e do Sanger Centre (Reino Unido) que conduziram o estudo. Uma delas o nmero reduzido de genes, principalmente se comparado com o de um parente prximo, o bacilo da tuberculose. Enquanto a Mycobacterium leprae (que causa a hansenase) tem cerca de 1.600 genes, a M. tuberculosis (que causa a tuberculose) tem mais de 3.900 genes. O tamanho do genoma dos bacilos 3.268.203 e 4.411.532 pares de bases, respectivamente. A anlise do proteoma (o repertrio de protenas que so produzidas pelo organismo) revelou dados mais curiosos ainda. Como a cada gene corresponde pelo menos uma protena, seria de esperar que a M. leprae produzisse 1.600 protenas. No entanto, foram detectadas apenas 391. "Cerca de um tero so protenas de membrana, insolveis, e portanto no identificveis pelo proteoma.(...) (Folha de So Paulo, 22/02/2001, com adaptaes) Supondo-se que todas as protenas do M. leprae possuam 300 aminocidos, calcule a porcentagem da regio codificadora, identificvel pelo proteoma, em relao ao genoma total dessa bactria.

RESOLUO :1 cdon ----------- 3 nucleotdeos ------ 1 aminocido x ---------------------- 300 aminocidos X = 900 nucleotdeos 1 gene ---------- 900 nucleotdeos ----------1 protena X ------------- 391 protenas X = 351.900 nucleotdeos Genoma: 3.268.203 pb ---------------- 100% 351.900 pb ---------------- X X = 10,77%

8) Grupo decifra DNA de levedura da cerveja Um consrcio internacional completou o seqenciamento do material gentico da levedura de cerveja Schizosaccharomyces pombe, que tornouse o sexto organismo com ncleo celular organizado a ter seu genoma conhecido. O grupo foi coordenado pelo britnico Paul Nurse, do Instituto do Cncer em Londres, Nobel de Medicina de 2001. O sequenciamento revelou um nmero pequeno de genes que codificam protenas (4.824) e um grande nmero deles (43%) com os chamados "ntrons" no meio (DNA no-codificador de protena). "Pombe" quer dizer cerveja em suali, lngua da frica oriental, onde a levedura foi primeiro isolada, no sculo 19. O estudo est na "Nature". (Folha de So Paulo 21/02/2002) Baseando-se no texto e em conhecimentos correlatos, responda: a) Supondo que cada gene codifique uma protena de 400 aminocidos, calcule o tamanho total (em pares de bases ou pares de nucleotdeos) das regies que no contm introns nesses genes. b) Quantos cdons seriam transcritos pelos exons?

RESOLUO: a) 3 nucleotdeos ----------- 1 aminocido X ---------- 400 aminocidos X = 1.200 nucleotdeos no DNA = 1 gene (com exon e intron) 1 gene ---------------- 1.200 nucleotdeos 4.824 genes ---------- X X = 5.788.800 nucleotdeos (sendo que 43% so introns, portanto, 57% so exons) 5.788.800 x 57% = 3.299.616 nucleotdeos

b) 1 cdon --------------- 3 nucleotdeos X ---------------- 3.299.616 nucleotdeos X = 3.299.616/ 3 = 1.099.872 cdons