J Sci amp Devel Vol 11 No 6 809-813 Tạp chiacute Khoa học vagrave Phaacutet triển 2013 tập 11 số 6 809-813 wwwhuaeduvn

809

NUOcircI CẤY LAacuteT CẮT BẦU NHỤY NHẰM CỨU PHOcircI LAI XA GIỮA HAI LOAgraveI Lilium longiflorum VAgrave L brownii var colchesteri

Nguyễn Thị Lacircm Hải1 Hiroshi Okubo2 1 Khoa Cocircng nghệ sinh học Trường Đại học Nocircng nghiệp Hagrave Nội

2Laboratory of Horticultural Science Kyushu University Fukuoka Japan

Email lamhai1979yahoocom

Ngagravey gửi bagravei 26062013 Ngagravey chấp nhận 24092013

TOacuteM TẮT

Lilium brownii var colchesteri (BRO) mang một tiacutenh trạng đặc trưng cho riecircng loagravei hoa chuyển magraveu từ vagraveng sang trắng chỉ sau một ngagravey nở Để sử dụng tiacutenh trạng nagravey trong tạo giống lily pheacutep lai giữa L longiflorum vagrave BRO đatilde được tiến hagravenh kết quả lagrave caacutec quả lai chỉ tạo hạt leacutep Để khắc phục sự bất thụ nagravey caacutec laacutet cắt bầu nhụy tại thời điểm từ 7 đến 28 ngagravey sau thụ phấn đatilde được nuocirci cấy trecircn mocirci trường MS coacute bổ sung 40gL-1 sucrose 40gL-1 D-mannitol vagrave 25gL-1 gellan gum trong điều kiện chiếu saacuteng liecircn tục Cacircy lai nảy mầm từ nuocirci cấy in vitro được xaacutec nhận bằng phương phaacutep phacircn tiacutech isozyme Chỉ coacute tổ hợp lai duy nhất giữa L longiflorum lsquoLPIrsquo times BRO thagravenh cocircng trong việc tạo ra cacircy lai F1 Sau khi ra ngocirci vagrave trồng trong nhagrave lưới 11 cacircy F1 đatilde ra hoa vagrave đổi magraveu từ vagraveng sang trắng giống tiacutenh trạng của cacircy bố L brownii var colchesteri

Từ khoacutea Lai xa L brownii var colchesteri L longiflorum

Ovary Slice Culture Technique for Embyro Rescue of Interspecific Crosses between Lilium longiflorum and L brownii var colchesteri

ABSTRACT

Lilium brownii var colchesteri (BRO) has an unique characteristic ie the flower color changes from yellowish-cream to white during anthesis For introducing this trait to cut flower production in Lilium interspecific crosses of L longiflorum (as seed parents) and BRO (as a pollen parent) were carried out Capsules with unviable seeds were found in all crosses To overcome the incongruity barrier ovary slices excised from developing ovaries at 7 to 28 days after pollination (DAP) were cultured in a Murashige and Skoog medium supplemented with 40gL-1 sucrose 40gL-1 D-mannitol and 25gL-1 gellan gum under 24h illumination The hybridity of germinated bulblets were confirmed before acclimatization by isozyme analysis Hybrid plantlets were obtained from the crosses of L longiflorum lsquoLPIrsquo times BRO After acclimatization and cultivation 11 hybrid plants produced flowers changing from yellowish cream to white during anthesis as does the pollen parent

Keywords Interspecific cross L brownii var colchesteri L longiflorum

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lilium brownii var colchesteri (BRO) lagrave loagravei lily đặc hữu của Trung Quốc vagrave phacircn bố ở độ cao 1500m so với mặt nước biển (McRae 1998) Hoa của loagravei nagravey coacute mugravei thơm quyến rũ coacute cấu tạo hagravei hogravea dạng loa kegraven với bao phấn magraveu nacircu đặc biệt BRO coacute một tiacutenh trạng khocircng thể tigravem thấy ở loagravei lily khaacutec đoacute lagrave hoa của chuacuteng chuyển magraveu từ vagraveng sang trắng khoảng một ngagravey

sau khi nở (Okubo 2006) Củ hoa BRO được sử dụng chủ yếu trong caacutec vị thuốc đocircng y chuacuteng được nhacircn giống bằng phương phaacutep taacutech củ vagrave lagrave loagravei rất mẫn cảm với virut Do đoacute BRO chỉ được trồng vagrave khai thaacutec một caacutech tự nhiecircn ở Trung Quốc Hagraven Quốc vagrave một số nơi trecircn quần đảo Nhật Bản

Lilium longiflorum lagrave loagravei lily coacute nguồn gốc từ quần đảo Ruykyu Nhật Bản Do lagrave loagravei coacute phổ

Ứng dụng kỹ thuật nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy nhằm cứu phocirci lai xa giữa hai loagravei Lilium longiflorum vagrave L brownii var colchesteri

810

thiacutech nghi cao necircn đatilde được trồng phổ biến khắp nơi trecircn thế giới tại Việt Nam L longiflorum cugraveng với L formosanum vagrave L formolongi được trồng phổ biến với tecircn gọi chung lagrave Loa kegraven trắng Hoa của L longiflorum coacute mugravei thơm đậm hoa higravenh phễu magraveu trắng với bao phấn magraveu vagraveng L longiforum được sử dụng nhiều trong lai tạo giống lily mới trecircn thế giới do khả năng thiacutech nghi cao khaacuteng bệnh vagrave sạch virus

Bagravei baacuteo nagravey trigravenh bagravey kết quả nghiecircn cứu sự di truyền tiacutenh trạng đổi magraveu hoa của BRO trong pheacutep lai xa giữa BRO vagrave caacutec quần thể L longiflorum thu thập từ quần đảo Ryukyu Nhật Bản nhằm tạo ra giống lily lai coacute hoa đổi magraveu vagrave thiacutech nghi với điều kiện trồng ở nhiều khu vực trecircn thế giới

2 VẬT LIỆU VAgrave PHƯƠNG PHAacuteP

21 Vật liệu nghiecircn cứu L brownii var colchesteri thu thập từ Hagraven

Quốc vagrave được trồng tại vườn thiacute nghiệm trường Đại học Kyushu Nhật Bản Bao phấn được thu haacutei 1-2 ngagravey trước khi hoa nở vagrave giữ trong điều kiện 250C trong 5 ngagravey Hạt phấn được bảo quản ở -200C cho đến luacutec sử dụng 09 quần thể L Longiflorum thu thập từ quần đảo Ryukyu Nhật Bản (Bảng 1)

22 Phương phaacutep nghiecircn cứu Thụ phấn hoa của L longiflorum được khử

đực 2 ngagravey trước khi nở đầu nhụy được bọc caacutech ly bằng giấy nhocircm để traacutenh sự lẫn tạp Sự thụ phấn được tiến hagravenh giữa hạt phấn của BRO với hoa của L longiflorum 2-3 ngagravey sau khi hoa nở

Nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy Bầu nhụy tại thời điểm 7 ndash 21 ngagravey sau thụ phấn được thu haacutei vagrave rửa sạch bằng cồn 70 trong 1 phuacutet Bầu nhụy được khử trugraveng bằng NaClO 2 trong 15 phuacutet vagrave rửa lại bằng nước cất vocirc trugraveng 3 lần trước khi được cắt thagravenh laacutet mỏng 2-3mm (chứa khoảng 30 phocirci) Những laacutet cắt nagravey được đem cấy vagraveo mocirci trường MS (Murashige vagrave Skoog 1962) coacute bổ sung 40gl sucrose 40gl D-mannitol 25 gl gellan gum pH = 58

Điều kiện nuocirci cấy Caacutec lắt cắt bầu nhụy được nuocirci ở nhiệt độ 250C trong điều kiện tối

keacuteo dagravei trong 4 tuần sau đoacute được nuocirci ở nhiệt độ tương tự vagrave điều kiện chiếu saacuteng liecircn tục Sự nảy mầm của phocirci được theo dotildei đến tận thaacuteng thứ 4 tiacutenh từ khi nuocirci cấy

Bốn tuần sau khi nảy mầm caacutec phocirci được cấy chuyển sang mocirci trường 12MS coacute bổ sung 20gl sucrose để tiếp tục nuocirci cấy Những cacircy coacute khối lượng từ 35g trở lecircn được trồng chuyển sang nhagrave lưới nơi coacute nhiệt độ dao động thấp nhất 50C vagraveo mugravea đocircng cho đến cao nhất 430C vagraveo mugravea hegrave Phacircn boacuten dạng lỏng (Hyponex Hyponex Japan Co Ltd Osaka Japan) vagrave thuốc trừ sacircu bệnh được phun với tần suất hai thaacuteng một lần

Kiểm tra con lai Những cacircy con được kiểm định bằng phương phaacutep isozyme caacutec isozyme bao gồm diaphorase (DIA) aspartate aminotransferase (AAT) glucosephophate isomerase (GPI) được phacircn tiacutech theo phương phaacutep của Hiramatsu et al (2001) Khoảng 200mg mocirc laacute non được nghiền nhỏ trong 200μl dịch chiết Tris-HCl dịch nghiền được chuyển vagraveo giấy lọc kiacutech thước 12 times 35mm vagrave điện di trecircn bản gel tinh bột (Nacalai Tesque Inc Japan) tại 75V trong 6 giờ Caacutec isoszyme được nhuộm magraveu đặc trưng vagrave phacircn tiacutech

3 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

31 Kết quả lai hữu tiacutenh giữa L brownii var colchester với caacutec dograveng thuộc L longiflorum

Kết quả lai hữu tiacutenh được tổng kết qua bảng 1 Trong tổng số 9 tổ hợp lai với 239 pheacutep lai được thực hiện chỉ coacute duy nhất pheacutep lai giữa LPI times BRO higravenh thagravenh quả tuy nhiecircn caacutec quả đoacute đều khocircng chứa phocirci hoagraven chỉnh (phocirci được coi lagrave hoagraven chỉnh khi coacute chiều dagravei bằng một nửa chiều dagravei hạt trở lecircn) Tất cả caacutec quả lai tạo ra từ caacutec tổ hợp lai của caacutec dograveng L longiflorum khaacutec cũng đều bị teo vagrave khocirc đi khoảng 4 tuần sau khi thụ phấn Việc higravenh thagravenh một số quả lai của tổ hợp LPI times BRO chứng tỏ coacute một cơ chế ức chế sự higravenh thagravenh hạt lai sau khi thụ phấn đatilde xảy ra khiến cho caacutec hạt lai được higravenh thagravenh sau thụ phấn khocircng thể phaacutet triển thagravenh hạt lai hoagraven chỉnh

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

811

Bảng 1 Kết quả lai giữa L brownii var colchesteri (cấy bố) với caacutec dograveng thuộc L longiflorum

Cacircy mẹ Số pheacutep lai Số quả

Chết Khocircng coacute phocirci Coacute phocirci

FFU (Fulung Taiwan)

LIS (Ishigaki island Ryukyu)

LKI (Kikai island Ryukyu)

LKU (Kume island Ryukyu)

LMI (Miyako island Ryukyu)

LOE (Okinoerabu island Ryukyu)

LPI (Pitouchiao Taiwan)

LYO (Yonaguni island Ryukyu)

LYR (Yoron island Ryukyu)

18

26

54

20

17

32

31

23

18

18

26

54

20

17

32

16

23

18

0

0

0

0

0

0

15

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Hạt lai khocircng phaacutet triển thagravenh thục dẫn đến quả lai bị leacutep hoặc bị chết trong caacutec pheacutep lai xa trong chi Lilium lagrave hiện tượng thường gặp vagrave lagrave ragraveo cản chiacutenh trong việc lai tạo giống hữu tiacutenh của chi nagravey Phocirci bị biến dạng vagrave sự tiecircu giảm của nội nhũ lagrave hai nguyecircn nhacircn chiacutenh dẫn đến sự thất bại khi lai xa trong chi Lilium (Van Tuyl et al 1997) Nghiecircn cứu ở mức độ tế bagraveo của caacutec hạt lai qua caacutec giai đoạn khaacutec nhau sau khi thụ phấn đatilde chỉ ra rằng sự đứt gatildey của nhiễm sắc thể lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy necircn caacutec hiện tượng bất thụ trecircn (Dowrick and Brandram 1970)

32 Kết quả cứu phocirci lai xa Để khắc phục hiện tượng phocirci bị chết trong

caacutec pheacutep lai xa khaacutec loagravei phương phaacutep cứu phocirci lai xa cụ thể lagrave phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt

bầu nhụy sau khi thụ phấn thường được aacutep dụng để tạo cacircy lai in vitro trong chi Lilium Kết quả nuocirci cấy phocirci taacutech từ cacircy mẹ sau thụ phấn từ 7 đến 21 ngagravey được thể hiện trong bảng 2 Kết quả nảy mầm của phocirci in vitro thể hiện rotilde sự ảnh hưởng của dograveng cacircy mẹ lecircn khả năng nảy mầm của phocirci lai Trong số caacutec tổ hợp phocirci được nuocirci cấy chỉ coacute duy nhất 29 phocirci thuộc pheacutep lai giữa LPI x BRO nảy mầm thagravenh cacircy với tỉ lệ nảy mầm tương đối thấp 161 Khoảng 2 thaacuteng sau khi nuocirci cấy phocirci taacutech từ caacutec tổ hợp lai cograven lại đều bị hoacutea nacircu vagrave chết

Higravenh 1 minh họa quaacute trigravenh nuocirci cấy vagrave phaacutet triển của phocirci lai cho đến cacircy trưởng thagravenh Với những phocirci nảy mầm thagravenh cacircy sẽ được cấy chuyển sang mocirci trường nuocirci để tăng kiacutech thước củ Khi củ in vitro coacute 3 laacute thật trở lecircn thigrave caacutec laacute nagravey được thu cắt vagrave chiết taacutech isozyme

Bảng 2 Phocirci nảy mầm trong phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy để cứu phocirci trong pheacutep lai giữa L brownii var colchesteri vagrave caacutec dograveng mẹ thuộc loagravei L longiflorum

Cacircy mẹ Ngagravey sau thụ phấn

Số laacutet cắt

Số phocirci

Nuocirci cấy y Nảy mầm

FFU (Fulung Taiwan)

LIS (Ishigaki island Ryukyu)

LKI (Kikai island Ryukyu)

LKU (Kume island Ryukyu)

LMI (Miyako island Ryukyu)

LOE (Okinoerabu island Ryukyu)

LPI (Pitouchiao Taiwan)

LYO (Yonaguni island Ryukyu)

LYR (Yoron island Ryukyu)

14

20

14

7

14

21

14

14

14

28

30

77

40

55

50

60

56

28

840

900

2310

1200

1650

1500

1800

1680

840

0

0

0

0

0

0

29

0

0

Ghi chuacute y Số laacutet cắt times 30 (Hayashi 1986)

Ứng dụng kỹ thuật nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy nhằm cứu phocirci lai xa giữa hai loagravei Lilium longiflorum vagrave L brownii var colchesteri

812

nhằm xaacutec định chiacutenh xaacutec cacircy lai giữa BRO vagrave L longiflorum Caacutec củ đạt khối lượng chuẩn (nặng trecircn 35g) được đưa ra ngocirci vagrave trồng trong nhagrave lưới

Trong số 3 isozyme được phacircn tiacutech chỉ coacute diaphorase (DIA) cho kết quả rotilde về caacutec con lai Higravenh ảnh caacutec băng isozyme được nhuộm magraveu thể hiện sự sai khaacutec vagrave đặc trưng isozyme cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ (Higravenh 2) trong khi đoacute cacircy lai coacute biểu hiện của cả hai băng điện di đặc trưng cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ Hoa của cacircy lai coacute kiểu higravenh phối trộn của cả hai cacircy bố mẹ Cacircy lai coacute hoa higravenh phễu mỏ hoa hướng xuống vagrave coacute mugravei

thơm đặc trưng Ngoagravei ra cacircy lai coacute hai đặc điểm dễ nhận biết của cacircy bố bao phấn coacute magraveu nacircu (trong khi bao phấn của hoa mẹ coacute magraveu vagraveng) vagrave hoa của cacircy lai cũng đổi magraveu từ vagraveng sang trắng sau một ngagravey tiacutenh từ luacutec nở hoa (Higravenh 3) Thời điểm lấy phocirci (tiacutenh theo số ngagravey sau khi thụ phấn) cũng ảnh hưởng rất lớn đền sự thagravenh cocircng hay thất bại của kết quả cứu phocirci lai xa (Hayashi et al 1986) Caacutec nghiecircn cứu của caacutec taacutec giả Van Tuyl et al (1991) Hayashi et al (1986) vagrave Kanoh et al (1988) đều khẳng định

Higravenh 1 Nuocirci cấy phocirci lai tạo cacircy hoagraven chỉnh trong pheacutep lai giữa LPI times BRO Ghi chuacute a bầu nhụy sau 3 tuần thụ phấn được khử trugraveng vagrave cắt thagravenh caacutec laacutet mỏng 3 mm b caacutec phocirci non trecircn laacutet cắt mỏng phigravenh to sau 5 tuần nuocirci cấy c phocirci nảy mầm sau 12 tuần nuocirci cấy d cacircy lai nở hoa sau 2 năm trồng

Higravenh 2 Kết quả phacircn tiacutech Diaphorase (DIA) của cacircy bố mẹ vagrave cacircy lai Ghi chuacute Cột 1 L brownii var colchesteri (BRO) Cột 2 L longiflorum LPI Cột 3 ~ 8 Cacircy lai giữa LPI times BRO Mũi tecircn chỉ caacutec vạnh nhuộm isozyme đặc trưng cho cacircy bố mẹ

Higravenh 3 Hoa lai giữa LPI times BRO đổi magraveu từ vagraveng sang trắng một ngagravey sau khi nở

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

813

rằng thời điểm 7 ngagravey 20 ngagravey vagrave 40 ngagravey sau thu phấn lagrave thiacutech hợp nhất khi nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy của caacutec tổ hợp lai trong chi Lilium Tuy nhiecircn trong nghiecircn cứu của chuacuteng tocirci do hạn chế về số lượng tổ hợp lai thu được necircn mỗi tổ hợp lai chỉ được thực hiện một lần lấy mẫu vagraveo cugraveng thời điểm để đem nuocirci cấy do đoacute chưa thể khẳng định được thời điểm lấy mẫu cứu phocirci lai trong nghiecircn cứu nagravey lagrave tối ưu nhất cho caacutec tổ hợp lai trecircn Caacutec nghiecircn cứu về ảnh hưởng của thời điểm cứu phocirci lai đến sự nảy mầm của phocirci cần được tiếp tục tiến hagravenh trong caacutec thiacute nghiệm sau

Như vậy việc lai xa giữa LPI times BRO bằng kỹ thuật lai tạo truyền thống nhằm thu hạt lai ngoagravei đồng ruộng đatilde khocircng thagravenh cocircng do caacutec ragraveo cản xảy ra sau khi thụ phấn khiến cho hạt lai bị leacutep vagrave chết trước khi thagravenh thục Tuy nhiecircn việc aacutep dụng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau thụ phấn để cứu caacutec phocirci lai xa cacircy lai giữa L brownii var colchesteri vagrave L longiflorum đatilde được lai tạo thagravenh cocircng tạo ra thế hệ F1 coacute caacutec đặc điểm quyacute hiếm của cacircy cho phấn (hoa đổi magraveu) Phương phaacutep cứu phocirci lai xa nagravey cũng được aacutep dụng ở nhiều nghiecircn cứu khaacutec trong chi Lilium vagrave đều cho kết quả tương tự với nhiều tổ hợp hoa mới được lai tạo thagravenh cocircng (Hayashi et al 1986 Kanoh et al 1988 Van Tuyl et al 1991 Fernandez et al 1996)

Tiacutenh trạng hoa đổi magraveu được tigravem thấy duy nhất trong loagravei L brownii var colchesteri nghiecircn cứu sacircu về sắc tố trecircn caacutenh hoa của Hai (2012) chỉ ra rằng việc giảm hagravem lượng carotenoids trong caacutenh hoa lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy ra sự đổi magraveu từ vagraveng sang trắng của loagravei hoa nagravey vagrave hagravem lượng của carotenoids trong caacutenh hoa tỉ lệ nghịch với sự biểu hiện của gen LbCCD4 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4) với chức năng phacircn giải carotenoids trong caacutenh hoa Thagravenh cocircng trong việc tạo ra cacircy lai F1 với tiacutenh trạng đổi magraveu cho thấy đacircy lagrave tiacutenh trạng trội vagrave coacute thể di truyền cho caacutec thế hệ cacircy lai sau Điều đoacute cũng mở ra caacutec hướng lai tạo khaacutec giữa L brownii var colchesteri với caacutec loagravei coacute hoa magraveu sắc khaacutec (đỏ vagraveng cam) trong chi Lilium để tạo ra cacircy lai coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất coacute yacute nghĩa trong tạo giống lily mới

4 KẾT LUẬN

Dograveng lily mới trong pheacutep lai giữa L longiflorum lsquoLPIrsquo với L brownii var colchesteri đatilde được lai tạo thagravenh cocircng bằng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau khi thụ phấn Dograveng lily mới coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa từ vagraveng sang trắng đacircy lagrave một tiacutenh trạng hiếm coacute trong lily magrave chỉ coacute L brownii var colchesteri mới coacute Caacutec con lai của pheacutep lai nagravey coacute thể phaacutet triển thagravenh giống lily với tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất đặc sắc lagrave tiền đề để phaacutet triển thagravenh giống lily mới trong tương lai

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO Hayashi M Kanoh K Serizawa Y and Yoon E

(1986) Ovary slice culture of Lilium formosanum Wallace Japan J Breed 36 304-308

Hiramatsu M Ii K Okubo H Huang K L and Huang C W (2001) Biogeography and origin of Lilium longiflorum and L formosanum (Liliaceae) endemic to the Ryukyu Archipelago and Taiwan as determined by allozyme diversity Amer J Bot 88 1230ndash1239

Nguyen Thi Lam Hai Hiramatsu M Kim Jong-Hwa Masuda Ju-ichiro and Okubo H (2012) Interspecific Hybrids production between Lilium brownii var colchesteri and its close relatives by ovary slice culture J Japan Soc Sci 81 (2) 191-197

Kanoh K Hayashi M Serizawa Y and Konishi T (1988) Production of interspecific hybrids between Lilium longiflorum and L times elegance by ovary slice culture Japan J Breed 38 278-282

McRae E A (1998) Lilies A guide for growers and collectors Timber Press Portland Oregon

Okubo H (2006) History of Lilium brownii var colchesteri in Japan Sci Bul Faculty of Agri Kyushu University 61 145ndash163 (In Japanese with English summary)

Van Tuyl J M Chi H S van Kronenburg B C M and Meijer B (1997) Interspecific lily hybrids a promise for the future Acta Hort 430 539-544

Van Tuyl J M van Dien M P van Creij M G M van Kleinwee T C M Franken J and Bino R J (1991) Application of in vitro pollination ovary culture ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses Plant Sci 74 115-126

Ứng dụng kỹ thuật nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy nhằm cứu phocirci lai xa giữa hai loagravei Lilium longiflorum vagrave L brownii var colchesteri

810

thiacutech nghi cao necircn đatilde được trồng phổ biến khắp nơi trecircn thế giới tại Việt Nam L longiflorum cugraveng với L formosanum vagrave L formolongi được trồng phổ biến với tecircn gọi chung lagrave Loa kegraven trắng Hoa của L longiflorum coacute mugravei thơm đậm hoa higravenh phễu magraveu trắng với bao phấn magraveu vagraveng L longiforum được sử dụng nhiều trong lai tạo giống lily mới trecircn thế giới do khả năng thiacutech nghi cao khaacuteng bệnh vagrave sạch virus

Bagravei baacuteo nagravey trigravenh bagravey kết quả nghiecircn cứu sự di truyền tiacutenh trạng đổi magraveu hoa của BRO trong pheacutep lai xa giữa BRO vagrave caacutec quần thể L longiflorum thu thập từ quần đảo Ryukyu Nhật Bản nhằm tạo ra giống lily lai coacute hoa đổi magraveu vagrave thiacutech nghi với điều kiện trồng ở nhiều khu vực trecircn thế giới

2 VẬT LIỆU VAgrave PHƯƠNG PHAacuteP

21 Vật liệu nghiecircn cứu L brownii var colchesteri thu thập từ Hagraven

Quốc vagrave được trồng tại vườn thiacute nghiệm trường Đại học Kyushu Nhật Bản Bao phấn được thu haacutei 1-2 ngagravey trước khi hoa nở vagrave giữ trong điều kiện 250C trong 5 ngagravey Hạt phấn được bảo quản ở -200C cho đến luacutec sử dụng 09 quần thể L Longiflorum thu thập từ quần đảo Ryukyu Nhật Bản (Bảng 1)

22 Phương phaacutep nghiecircn cứu Thụ phấn hoa của L longiflorum được khử

đực 2 ngagravey trước khi nở đầu nhụy được bọc caacutech ly bằng giấy nhocircm để traacutenh sự lẫn tạp Sự thụ phấn được tiến hagravenh giữa hạt phấn của BRO với hoa của L longiflorum 2-3 ngagravey sau khi hoa nở

Nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy Bầu nhụy tại thời điểm 7 ndash 21 ngagravey sau thụ phấn được thu haacutei vagrave rửa sạch bằng cồn 70 trong 1 phuacutet Bầu nhụy được khử trugraveng bằng NaClO 2 trong 15 phuacutet vagrave rửa lại bằng nước cất vocirc trugraveng 3 lần trước khi được cắt thagravenh laacutet mỏng 2-3mm (chứa khoảng 30 phocirci) Những laacutet cắt nagravey được đem cấy vagraveo mocirci trường MS (Murashige vagrave Skoog 1962) coacute bổ sung 40gl sucrose 40gl D-mannitol 25 gl gellan gum pH = 58

Điều kiện nuocirci cấy Caacutec lắt cắt bầu nhụy được nuocirci ở nhiệt độ 250C trong điều kiện tối

keacuteo dagravei trong 4 tuần sau đoacute được nuocirci ở nhiệt độ tương tự vagrave điều kiện chiếu saacuteng liecircn tục Sự nảy mầm của phocirci được theo dotildei đến tận thaacuteng thứ 4 tiacutenh từ khi nuocirci cấy

Bốn tuần sau khi nảy mầm caacutec phocirci được cấy chuyển sang mocirci trường 12MS coacute bổ sung 20gl sucrose để tiếp tục nuocirci cấy Những cacircy coacute khối lượng từ 35g trở lecircn được trồng chuyển sang nhagrave lưới nơi coacute nhiệt độ dao động thấp nhất 50C vagraveo mugravea đocircng cho đến cao nhất 430C vagraveo mugravea hegrave Phacircn boacuten dạng lỏng (Hyponex Hyponex Japan Co Ltd Osaka Japan) vagrave thuốc trừ sacircu bệnh được phun với tần suất hai thaacuteng một lần

Kiểm tra con lai Những cacircy con được kiểm định bằng phương phaacutep isozyme caacutec isozyme bao gồm diaphorase (DIA) aspartate aminotransferase (AAT) glucosephophate isomerase (GPI) được phacircn tiacutech theo phương phaacutep của Hiramatsu et al (2001) Khoảng 200mg mocirc laacute non được nghiền nhỏ trong 200μl dịch chiết Tris-HCl dịch nghiền được chuyển vagraveo giấy lọc kiacutech thước 12 times 35mm vagrave điện di trecircn bản gel tinh bột (Nacalai Tesque Inc Japan) tại 75V trong 6 giờ Caacutec isoszyme được nhuộm magraveu đặc trưng vagrave phacircn tiacutech

3 KẾT QUẢ VAgrave THẢO LUẬN

31 Kết quả lai hữu tiacutenh giữa L brownii var colchester với caacutec dograveng thuộc L longiflorum

Kết quả lai hữu tiacutenh được tổng kết qua bảng 1 Trong tổng số 9 tổ hợp lai với 239 pheacutep lai được thực hiện chỉ coacute duy nhất pheacutep lai giữa LPI times BRO higravenh thagravenh quả tuy nhiecircn caacutec quả đoacute đều khocircng chứa phocirci hoagraven chỉnh (phocirci được coi lagrave hoagraven chỉnh khi coacute chiều dagravei bằng một nửa chiều dagravei hạt trở lecircn) Tất cả caacutec quả lai tạo ra từ caacutec tổ hợp lai của caacutec dograveng L longiflorum khaacutec cũng đều bị teo vagrave khocirc đi khoảng 4 tuần sau khi thụ phấn Việc higravenh thagravenh một số quả lai của tổ hợp LPI times BRO chứng tỏ coacute một cơ chế ức chế sự higravenh thagravenh hạt lai sau khi thụ phấn đatilde xảy ra khiến cho caacutec hạt lai được higravenh thagravenh sau thụ phấn khocircng thể phaacutet triển thagravenh hạt lai hoagraven chỉnh

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

811

Bảng 1 Kết quả lai giữa L brownii var colchesteri (cấy bố) với caacutec dograveng thuộc L longiflorum

Cacircy mẹ Số pheacutep lai Số quả

Chết Khocircng coacute phocirci Coacute phocirci

FFU (Fulung Taiwan)

LIS (Ishigaki island Ryukyu)

LKI (Kikai island Ryukyu)

LKU (Kume island Ryukyu)

LMI (Miyako island Ryukyu)

LOE (Okinoerabu island Ryukyu)

LPI (Pitouchiao Taiwan)

LYO (Yonaguni island Ryukyu)

LYR (Yoron island Ryukyu)

18

26

54

20

17

32

31

23

18

18

26

54

20

17

32

16

23

18

0

0

0

0

0

0

15

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Hạt lai khocircng phaacutet triển thagravenh thục dẫn đến quả lai bị leacutep hoặc bị chết trong caacutec pheacutep lai xa trong chi Lilium lagrave hiện tượng thường gặp vagrave lagrave ragraveo cản chiacutenh trong việc lai tạo giống hữu tiacutenh của chi nagravey Phocirci bị biến dạng vagrave sự tiecircu giảm của nội nhũ lagrave hai nguyecircn nhacircn chiacutenh dẫn đến sự thất bại khi lai xa trong chi Lilium (Van Tuyl et al 1997) Nghiecircn cứu ở mức độ tế bagraveo của caacutec hạt lai qua caacutec giai đoạn khaacutec nhau sau khi thụ phấn đatilde chỉ ra rằng sự đứt gatildey của nhiễm sắc thể lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy necircn caacutec hiện tượng bất thụ trecircn (Dowrick and Brandram 1970)

32 Kết quả cứu phocirci lai xa Để khắc phục hiện tượng phocirci bị chết trong

caacutec pheacutep lai xa khaacutec loagravei phương phaacutep cứu phocirci lai xa cụ thể lagrave phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt

bầu nhụy sau khi thụ phấn thường được aacutep dụng để tạo cacircy lai in vitro trong chi Lilium Kết quả nuocirci cấy phocirci taacutech từ cacircy mẹ sau thụ phấn từ 7 đến 21 ngagravey được thể hiện trong bảng 2 Kết quả nảy mầm của phocirci in vitro thể hiện rotilde sự ảnh hưởng của dograveng cacircy mẹ lecircn khả năng nảy mầm của phocirci lai Trong số caacutec tổ hợp phocirci được nuocirci cấy chỉ coacute duy nhất 29 phocirci thuộc pheacutep lai giữa LPI x BRO nảy mầm thagravenh cacircy với tỉ lệ nảy mầm tương đối thấp 161 Khoảng 2 thaacuteng sau khi nuocirci cấy phocirci taacutech từ caacutec tổ hợp lai cograven lại đều bị hoacutea nacircu vagrave chết

Higravenh 1 minh họa quaacute trigravenh nuocirci cấy vagrave phaacutet triển của phocirci lai cho đến cacircy trưởng thagravenh Với những phocirci nảy mầm thagravenh cacircy sẽ được cấy chuyển sang mocirci trường nuocirci để tăng kiacutech thước củ Khi củ in vitro coacute 3 laacute thật trở lecircn thigrave caacutec laacute nagravey được thu cắt vagrave chiết taacutech isozyme

Bảng 2 Phocirci nảy mầm trong phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy để cứu phocirci trong pheacutep lai giữa L brownii var colchesteri vagrave caacutec dograveng mẹ thuộc loagravei L longiflorum

Cacircy mẹ Ngagravey sau thụ phấn

Số laacutet cắt

Số phocirci

Nuocirci cấy y Nảy mầm

FFU (Fulung Taiwan)

LIS (Ishigaki island Ryukyu)

LKI (Kikai island Ryukyu)

LKU (Kume island Ryukyu)

LMI (Miyako island Ryukyu)

LOE (Okinoerabu island Ryukyu)

LPI (Pitouchiao Taiwan)

LYO (Yonaguni island Ryukyu)

LYR (Yoron island Ryukyu)

14

20

14

7

14

21

14

14

14

28

30

77

40

55

50

60

56

28

840

900

2310

1200

1650

1500

1800

1680

840

0

0

0

0

0

0

29

0

0

Ghi chuacute y Số laacutet cắt times 30 (Hayashi 1986)

Ứng dụng kỹ thuật nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy nhằm cứu phocirci lai xa giữa hai loagravei Lilium longiflorum vagrave L brownii var colchesteri

812

nhằm xaacutec định chiacutenh xaacutec cacircy lai giữa BRO vagrave L longiflorum Caacutec củ đạt khối lượng chuẩn (nặng trecircn 35g) được đưa ra ngocirci vagrave trồng trong nhagrave lưới

Trong số 3 isozyme được phacircn tiacutech chỉ coacute diaphorase (DIA) cho kết quả rotilde về caacutec con lai Higravenh ảnh caacutec băng isozyme được nhuộm magraveu thể hiện sự sai khaacutec vagrave đặc trưng isozyme cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ (Higravenh 2) trong khi đoacute cacircy lai coacute biểu hiện của cả hai băng điện di đặc trưng cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ Hoa của cacircy lai coacute kiểu higravenh phối trộn của cả hai cacircy bố mẹ Cacircy lai coacute hoa higravenh phễu mỏ hoa hướng xuống vagrave coacute mugravei

thơm đặc trưng Ngoagravei ra cacircy lai coacute hai đặc điểm dễ nhận biết của cacircy bố bao phấn coacute magraveu nacircu (trong khi bao phấn của hoa mẹ coacute magraveu vagraveng) vagrave hoa của cacircy lai cũng đổi magraveu từ vagraveng sang trắng sau một ngagravey tiacutenh từ luacutec nở hoa (Higravenh 3) Thời điểm lấy phocirci (tiacutenh theo số ngagravey sau khi thụ phấn) cũng ảnh hưởng rất lớn đền sự thagravenh cocircng hay thất bại của kết quả cứu phocirci lai xa (Hayashi et al 1986) Caacutec nghiecircn cứu của caacutec taacutec giả Van Tuyl et al (1991) Hayashi et al (1986) vagrave Kanoh et al (1988) đều khẳng định

Higravenh 1 Nuocirci cấy phocirci lai tạo cacircy hoagraven chỉnh trong pheacutep lai giữa LPI times BRO Ghi chuacute a bầu nhụy sau 3 tuần thụ phấn được khử trugraveng vagrave cắt thagravenh caacutec laacutet mỏng 3 mm b caacutec phocirci non trecircn laacutet cắt mỏng phigravenh to sau 5 tuần nuocirci cấy c phocirci nảy mầm sau 12 tuần nuocirci cấy d cacircy lai nở hoa sau 2 năm trồng

Higravenh 2 Kết quả phacircn tiacutech Diaphorase (DIA) của cacircy bố mẹ vagrave cacircy lai Ghi chuacute Cột 1 L brownii var colchesteri (BRO) Cột 2 L longiflorum LPI Cột 3 ~ 8 Cacircy lai giữa LPI times BRO Mũi tecircn chỉ caacutec vạnh nhuộm isozyme đặc trưng cho cacircy bố mẹ

Higravenh 3 Hoa lai giữa LPI times BRO đổi magraveu từ vagraveng sang trắng một ngagravey sau khi nở

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

813

rằng thời điểm 7 ngagravey 20 ngagravey vagrave 40 ngagravey sau thu phấn lagrave thiacutech hợp nhất khi nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy của caacutec tổ hợp lai trong chi Lilium Tuy nhiecircn trong nghiecircn cứu của chuacuteng tocirci do hạn chế về số lượng tổ hợp lai thu được necircn mỗi tổ hợp lai chỉ được thực hiện một lần lấy mẫu vagraveo cugraveng thời điểm để đem nuocirci cấy do đoacute chưa thể khẳng định được thời điểm lấy mẫu cứu phocirci lai trong nghiecircn cứu nagravey lagrave tối ưu nhất cho caacutec tổ hợp lai trecircn Caacutec nghiecircn cứu về ảnh hưởng của thời điểm cứu phocirci lai đến sự nảy mầm của phocirci cần được tiếp tục tiến hagravenh trong caacutec thiacute nghiệm sau

Như vậy việc lai xa giữa LPI times BRO bằng kỹ thuật lai tạo truyền thống nhằm thu hạt lai ngoagravei đồng ruộng đatilde khocircng thagravenh cocircng do caacutec ragraveo cản xảy ra sau khi thụ phấn khiến cho hạt lai bị leacutep vagrave chết trước khi thagravenh thục Tuy nhiecircn việc aacutep dụng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau thụ phấn để cứu caacutec phocirci lai xa cacircy lai giữa L brownii var colchesteri vagrave L longiflorum đatilde được lai tạo thagravenh cocircng tạo ra thế hệ F1 coacute caacutec đặc điểm quyacute hiếm của cacircy cho phấn (hoa đổi magraveu) Phương phaacutep cứu phocirci lai xa nagravey cũng được aacutep dụng ở nhiều nghiecircn cứu khaacutec trong chi Lilium vagrave đều cho kết quả tương tự với nhiều tổ hợp hoa mới được lai tạo thagravenh cocircng (Hayashi et al 1986 Kanoh et al 1988 Van Tuyl et al 1991 Fernandez et al 1996)

Tiacutenh trạng hoa đổi magraveu được tigravem thấy duy nhất trong loagravei L brownii var colchesteri nghiecircn cứu sacircu về sắc tố trecircn caacutenh hoa của Hai (2012) chỉ ra rằng việc giảm hagravem lượng carotenoids trong caacutenh hoa lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy ra sự đổi magraveu từ vagraveng sang trắng của loagravei hoa nagravey vagrave hagravem lượng của carotenoids trong caacutenh hoa tỉ lệ nghịch với sự biểu hiện của gen LbCCD4 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4) với chức năng phacircn giải carotenoids trong caacutenh hoa Thagravenh cocircng trong việc tạo ra cacircy lai F1 với tiacutenh trạng đổi magraveu cho thấy đacircy lagrave tiacutenh trạng trội vagrave coacute thể di truyền cho caacutec thế hệ cacircy lai sau Điều đoacute cũng mở ra caacutec hướng lai tạo khaacutec giữa L brownii var colchesteri với caacutec loagravei coacute hoa magraveu sắc khaacutec (đỏ vagraveng cam) trong chi Lilium để tạo ra cacircy lai coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất coacute yacute nghĩa trong tạo giống lily mới

4 KẾT LUẬN

Dograveng lily mới trong pheacutep lai giữa L longiflorum lsquoLPIrsquo với L brownii var colchesteri đatilde được lai tạo thagravenh cocircng bằng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau khi thụ phấn Dograveng lily mới coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa từ vagraveng sang trắng đacircy lagrave một tiacutenh trạng hiếm coacute trong lily magrave chỉ coacute L brownii var colchesteri mới coacute Caacutec con lai của pheacutep lai nagravey coacute thể phaacutet triển thagravenh giống lily với tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất đặc sắc lagrave tiền đề để phaacutet triển thagravenh giống lily mới trong tương lai

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO Hayashi M Kanoh K Serizawa Y and Yoon E

(1986) Ovary slice culture of Lilium formosanum Wallace Japan J Breed 36 304-308

Hiramatsu M Ii K Okubo H Huang K L and Huang C W (2001) Biogeography and origin of Lilium longiflorum and L formosanum (Liliaceae) endemic to the Ryukyu Archipelago and Taiwan as determined by allozyme diversity Amer J Bot 88 1230ndash1239

Nguyen Thi Lam Hai Hiramatsu M Kim Jong-Hwa Masuda Ju-ichiro and Okubo H (2012) Interspecific Hybrids production between Lilium brownii var colchesteri and its close relatives by ovary slice culture J Japan Soc Sci 81 (2) 191-197

Kanoh K Hayashi M Serizawa Y and Konishi T (1988) Production of interspecific hybrids between Lilium longiflorum and L times elegance by ovary slice culture Japan J Breed 38 278-282

McRae E A (1998) Lilies A guide for growers and collectors Timber Press Portland Oregon

Okubo H (2006) History of Lilium brownii var colchesteri in Japan Sci Bul Faculty of Agri Kyushu University 61 145ndash163 (In Japanese with English summary)

Van Tuyl J M Chi H S van Kronenburg B C M and Meijer B (1997) Interspecific lily hybrids a promise for the future Acta Hort 430 539-544

Van Tuyl J M van Dien M P van Creij M G M van Kleinwee T C M Franken J and Bino R J (1991) Application of in vitro pollination ovary culture ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses Plant Sci 74 115-126

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

811

Bảng 1 Kết quả lai giữa L brownii var colchesteri (cấy bố) với caacutec dograveng thuộc L longiflorum

Cacircy mẹ Số pheacutep lai Số quả

Chết Khocircng coacute phocirci Coacute phocirci

FFU (Fulung Taiwan)

LIS (Ishigaki island Ryukyu)

LKI (Kikai island Ryukyu)

LKU (Kume island Ryukyu)

LMI (Miyako island Ryukyu)

LOE (Okinoerabu island Ryukyu)

LPI (Pitouchiao Taiwan)

LYO (Yonaguni island Ryukyu)

LYR (Yoron island Ryukyu)

18

26

54

20

17

32

31

23

18

18

26

54

20

17

32

16

23

18

0

0

0

0

0

0

15

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Hạt lai khocircng phaacutet triển thagravenh thục dẫn đến quả lai bị leacutep hoặc bị chết trong caacutec pheacutep lai xa trong chi Lilium lagrave hiện tượng thường gặp vagrave lagrave ragraveo cản chiacutenh trong việc lai tạo giống hữu tiacutenh của chi nagravey Phocirci bị biến dạng vagrave sự tiecircu giảm của nội nhũ lagrave hai nguyecircn nhacircn chiacutenh dẫn đến sự thất bại khi lai xa trong chi Lilium (Van Tuyl et al 1997) Nghiecircn cứu ở mức độ tế bagraveo của caacutec hạt lai qua caacutec giai đoạn khaacutec nhau sau khi thụ phấn đatilde chỉ ra rằng sự đứt gatildey của nhiễm sắc thể lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy necircn caacutec hiện tượng bất thụ trecircn (Dowrick and Brandram 1970)

32 Kết quả cứu phocirci lai xa Để khắc phục hiện tượng phocirci bị chết trong

caacutec pheacutep lai xa khaacutec loagravei phương phaacutep cứu phocirci lai xa cụ thể lagrave phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt

bầu nhụy sau khi thụ phấn thường được aacutep dụng để tạo cacircy lai in vitro trong chi Lilium Kết quả nuocirci cấy phocirci taacutech từ cacircy mẹ sau thụ phấn từ 7 đến 21 ngagravey được thể hiện trong bảng 2 Kết quả nảy mầm của phocirci in vitro thể hiện rotilde sự ảnh hưởng của dograveng cacircy mẹ lecircn khả năng nảy mầm của phocirci lai Trong số caacutec tổ hợp phocirci được nuocirci cấy chỉ coacute duy nhất 29 phocirci thuộc pheacutep lai giữa LPI x BRO nảy mầm thagravenh cacircy với tỉ lệ nảy mầm tương đối thấp 161 Khoảng 2 thaacuteng sau khi nuocirci cấy phocirci taacutech từ caacutec tổ hợp lai cograven lại đều bị hoacutea nacircu vagrave chết

Higravenh 1 minh họa quaacute trigravenh nuocirci cấy vagrave phaacutet triển của phocirci lai cho đến cacircy trưởng thagravenh Với những phocirci nảy mầm thagravenh cacircy sẽ được cấy chuyển sang mocirci trường nuocirci để tăng kiacutech thước củ Khi củ in vitro coacute 3 laacute thật trở lecircn thigrave caacutec laacute nagravey được thu cắt vagrave chiết taacutech isozyme

Bảng 2 Phocirci nảy mầm trong phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy để cứu phocirci trong pheacutep lai giữa L brownii var colchesteri vagrave caacutec dograveng mẹ thuộc loagravei L longiflorum

Cacircy mẹ Ngagravey sau thụ phấn

Số laacutet cắt

Số phocirci

Nuocirci cấy y Nảy mầm

FFU (Fulung Taiwan)

LIS (Ishigaki island Ryukyu)

LKI (Kikai island Ryukyu)

LKU (Kume island Ryukyu)

LMI (Miyako island Ryukyu)

LOE (Okinoerabu island Ryukyu)

LPI (Pitouchiao Taiwan)

LYO (Yonaguni island Ryukyu)

LYR (Yoron island Ryukyu)

14

20

14

7

14

21

14

14

14

28

30

77

40

55

50

60

56

28

840

900

2310

1200

1650

1500

1800

1680

840

0

0

0

0

0

0

29

0

0

Ghi chuacute y Số laacutet cắt times 30 (Hayashi 1986)

Ứng dụng kỹ thuật nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy nhằm cứu phocirci lai xa giữa hai loagravei Lilium longiflorum vagrave L brownii var colchesteri

812

nhằm xaacutec định chiacutenh xaacutec cacircy lai giữa BRO vagrave L longiflorum Caacutec củ đạt khối lượng chuẩn (nặng trecircn 35g) được đưa ra ngocirci vagrave trồng trong nhagrave lưới

Trong số 3 isozyme được phacircn tiacutech chỉ coacute diaphorase (DIA) cho kết quả rotilde về caacutec con lai Higravenh ảnh caacutec băng isozyme được nhuộm magraveu thể hiện sự sai khaacutec vagrave đặc trưng isozyme cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ (Higravenh 2) trong khi đoacute cacircy lai coacute biểu hiện của cả hai băng điện di đặc trưng cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ Hoa của cacircy lai coacute kiểu higravenh phối trộn của cả hai cacircy bố mẹ Cacircy lai coacute hoa higravenh phễu mỏ hoa hướng xuống vagrave coacute mugravei

thơm đặc trưng Ngoagravei ra cacircy lai coacute hai đặc điểm dễ nhận biết của cacircy bố bao phấn coacute magraveu nacircu (trong khi bao phấn của hoa mẹ coacute magraveu vagraveng) vagrave hoa của cacircy lai cũng đổi magraveu từ vagraveng sang trắng sau một ngagravey tiacutenh từ luacutec nở hoa (Higravenh 3) Thời điểm lấy phocirci (tiacutenh theo số ngagravey sau khi thụ phấn) cũng ảnh hưởng rất lớn đền sự thagravenh cocircng hay thất bại của kết quả cứu phocirci lai xa (Hayashi et al 1986) Caacutec nghiecircn cứu của caacutec taacutec giả Van Tuyl et al (1991) Hayashi et al (1986) vagrave Kanoh et al (1988) đều khẳng định

Higravenh 1 Nuocirci cấy phocirci lai tạo cacircy hoagraven chỉnh trong pheacutep lai giữa LPI times BRO Ghi chuacute a bầu nhụy sau 3 tuần thụ phấn được khử trugraveng vagrave cắt thagravenh caacutec laacutet mỏng 3 mm b caacutec phocirci non trecircn laacutet cắt mỏng phigravenh to sau 5 tuần nuocirci cấy c phocirci nảy mầm sau 12 tuần nuocirci cấy d cacircy lai nở hoa sau 2 năm trồng

Higravenh 2 Kết quả phacircn tiacutech Diaphorase (DIA) của cacircy bố mẹ vagrave cacircy lai Ghi chuacute Cột 1 L brownii var colchesteri (BRO) Cột 2 L longiflorum LPI Cột 3 ~ 8 Cacircy lai giữa LPI times BRO Mũi tecircn chỉ caacutec vạnh nhuộm isozyme đặc trưng cho cacircy bố mẹ

Higravenh 3 Hoa lai giữa LPI times BRO đổi magraveu từ vagraveng sang trắng một ngagravey sau khi nở

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

813

rằng thời điểm 7 ngagravey 20 ngagravey vagrave 40 ngagravey sau thu phấn lagrave thiacutech hợp nhất khi nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy của caacutec tổ hợp lai trong chi Lilium Tuy nhiecircn trong nghiecircn cứu của chuacuteng tocirci do hạn chế về số lượng tổ hợp lai thu được necircn mỗi tổ hợp lai chỉ được thực hiện một lần lấy mẫu vagraveo cugraveng thời điểm để đem nuocirci cấy do đoacute chưa thể khẳng định được thời điểm lấy mẫu cứu phocirci lai trong nghiecircn cứu nagravey lagrave tối ưu nhất cho caacutec tổ hợp lai trecircn Caacutec nghiecircn cứu về ảnh hưởng của thời điểm cứu phocirci lai đến sự nảy mầm của phocirci cần được tiếp tục tiến hagravenh trong caacutec thiacute nghiệm sau

Như vậy việc lai xa giữa LPI times BRO bằng kỹ thuật lai tạo truyền thống nhằm thu hạt lai ngoagravei đồng ruộng đatilde khocircng thagravenh cocircng do caacutec ragraveo cản xảy ra sau khi thụ phấn khiến cho hạt lai bị leacutep vagrave chết trước khi thagravenh thục Tuy nhiecircn việc aacutep dụng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau thụ phấn để cứu caacutec phocirci lai xa cacircy lai giữa L brownii var colchesteri vagrave L longiflorum đatilde được lai tạo thagravenh cocircng tạo ra thế hệ F1 coacute caacutec đặc điểm quyacute hiếm của cacircy cho phấn (hoa đổi magraveu) Phương phaacutep cứu phocirci lai xa nagravey cũng được aacutep dụng ở nhiều nghiecircn cứu khaacutec trong chi Lilium vagrave đều cho kết quả tương tự với nhiều tổ hợp hoa mới được lai tạo thagravenh cocircng (Hayashi et al 1986 Kanoh et al 1988 Van Tuyl et al 1991 Fernandez et al 1996)

Tiacutenh trạng hoa đổi magraveu được tigravem thấy duy nhất trong loagravei L brownii var colchesteri nghiecircn cứu sacircu về sắc tố trecircn caacutenh hoa của Hai (2012) chỉ ra rằng việc giảm hagravem lượng carotenoids trong caacutenh hoa lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy ra sự đổi magraveu từ vagraveng sang trắng của loagravei hoa nagravey vagrave hagravem lượng của carotenoids trong caacutenh hoa tỉ lệ nghịch với sự biểu hiện của gen LbCCD4 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4) với chức năng phacircn giải carotenoids trong caacutenh hoa Thagravenh cocircng trong việc tạo ra cacircy lai F1 với tiacutenh trạng đổi magraveu cho thấy đacircy lagrave tiacutenh trạng trội vagrave coacute thể di truyền cho caacutec thế hệ cacircy lai sau Điều đoacute cũng mở ra caacutec hướng lai tạo khaacutec giữa L brownii var colchesteri với caacutec loagravei coacute hoa magraveu sắc khaacutec (đỏ vagraveng cam) trong chi Lilium để tạo ra cacircy lai coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất coacute yacute nghĩa trong tạo giống lily mới

4 KẾT LUẬN

Dograveng lily mới trong pheacutep lai giữa L longiflorum lsquoLPIrsquo với L brownii var colchesteri đatilde được lai tạo thagravenh cocircng bằng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau khi thụ phấn Dograveng lily mới coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa từ vagraveng sang trắng đacircy lagrave một tiacutenh trạng hiếm coacute trong lily magrave chỉ coacute L brownii var colchesteri mới coacute Caacutec con lai của pheacutep lai nagravey coacute thể phaacutet triển thagravenh giống lily với tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất đặc sắc lagrave tiền đề để phaacutet triển thagravenh giống lily mới trong tương lai

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO Hayashi M Kanoh K Serizawa Y and Yoon E

(1986) Ovary slice culture of Lilium formosanum Wallace Japan J Breed 36 304-308

Hiramatsu M Ii K Okubo H Huang K L and Huang C W (2001) Biogeography and origin of Lilium longiflorum and L formosanum (Liliaceae) endemic to the Ryukyu Archipelago and Taiwan as determined by allozyme diversity Amer J Bot 88 1230ndash1239

Nguyen Thi Lam Hai Hiramatsu M Kim Jong-Hwa Masuda Ju-ichiro and Okubo H (2012) Interspecific Hybrids production between Lilium brownii var colchesteri and its close relatives by ovary slice culture J Japan Soc Sci 81 (2) 191-197

Kanoh K Hayashi M Serizawa Y and Konishi T (1988) Production of interspecific hybrids between Lilium longiflorum and L times elegance by ovary slice culture Japan J Breed 38 278-282

McRae E A (1998) Lilies A guide for growers and collectors Timber Press Portland Oregon

Okubo H (2006) History of Lilium brownii var colchesteri in Japan Sci Bul Faculty of Agri Kyushu University 61 145ndash163 (In Japanese with English summary)

Van Tuyl J M Chi H S van Kronenburg B C M and Meijer B (1997) Interspecific lily hybrids a promise for the future Acta Hort 430 539-544

Van Tuyl J M van Dien M P van Creij M G M van Kleinwee T C M Franken J and Bino R J (1991) Application of in vitro pollination ovary culture ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses Plant Sci 74 115-126

Ứng dụng kỹ thuật nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy nhằm cứu phocirci lai xa giữa hai loagravei Lilium longiflorum vagrave L brownii var colchesteri

812

nhằm xaacutec định chiacutenh xaacutec cacircy lai giữa BRO vagrave L longiflorum Caacutec củ đạt khối lượng chuẩn (nặng trecircn 35g) được đưa ra ngocirci vagrave trồng trong nhagrave lưới

Trong số 3 isozyme được phacircn tiacutech chỉ coacute diaphorase (DIA) cho kết quả rotilde về caacutec con lai Higravenh ảnh caacutec băng isozyme được nhuộm magraveu thể hiện sự sai khaacutec vagrave đặc trưng isozyme cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ (Higravenh 2) trong khi đoacute cacircy lai coacute biểu hiện của cả hai băng điện di đặc trưng cho cacircy bố vagrave cacircy mẹ Hoa của cacircy lai coacute kiểu higravenh phối trộn của cả hai cacircy bố mẹ Cacircy lai coacute hoa higravenh phễu mỏ hoa hướng xuống vagrave coacute mugravei

thơm đặc trưng Ngoagravei ra cacircy lai coacute hai đặc điểm dễ nhận biết của cacircy bố bao phấn coacute magraveu nacircu (trong khi bao phấn của hoa mẹ coacute magraveu vagraveng) vagrave hoa của cacircy lai cũng đổi magraveu từ vagraveng sang trắng sau một ngagravey tiacutenh từ luacutec nở hoa (Higravenh 3) Thời điểm lấy phocirci (tiacutenh theo số ngagravey sau khi thụ phấn) cũng ảnh hưởng rất lớn đền sự thagravenh cocircng hay thất bại của kết quả cứu phocirci lai xa (Hayashi et al 1986) Caacutec nghiecircn cứu của caacutec taacutec giả Van Tuyl et al (1991) Hayashi et al (1986) vagrave Kanoh et al (1988) đều khẳng định

Higravenh 1 Nuocirci cấy phocirci lai tạo cacircy hoagraven chỉnh trong pheacutep lai giữa LPI times BRO Ghi chuacute a bầu nhụy sau 3 tuần thụ phấn được khử trugraveng vagrave cắt thagravenh caacutec laacutet mỏng 3 mm b caacutec phocirci non trecircn laacutet cắt mỏng phigravenh to sau 5 tuần nuocirci cấy c phocirci nảy mầm sau 12 tuần nuocirci cấy d cacircy lai nở hoa sau 2 năm trồng

Higravenh 2 Kết quả phacircn tiacutech Diaphorase (DIA) của cacircy bố mẹ vagrave cacircy lai Ghi chuacute Cột 1 L brownii var colchesteri (BRO) Cột 2 L longiflorum LPI Cột 3 ~ 8 Cacircy lai giữa LPI times BRO Mũi tecircn chỉ caacutec vạnh nhuộm isozyme đặc trưng cho cacircy bố mẹ

Higravenh 3 Hoa lai giữa LPI times BRO đổi magraveu từ vagraveng sang trắng một ngagravey sau khi nở

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

813

rằng thời điểm 7 ngagravey 20 ngagravey vagrave 40 ngagravey sau thu phấn lagrave thiacutech hợp nhất khi nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy của caacutec tổ hợp lai trong chi Lilium Tuy nhiecircn trong nghiecircn cứu của chuacuteng tocirci do hạn chế về số lượng tổ hợp lai thu được necircn mỗi tổ hợp lai chỉ được thực hiện một lần lấy mẫu vagraveo cugraveng thời điểm để đem nuocirci cấy do đoacute chưa thể khẳng định được thời điểm lấy mẫu cứu phocirci lai trong nghiecircn cứu nagravey lagrave tối ưu nhất cho caacutec tổ hợp lai trecircn Caacutec nghiecircn cứu về ảnh hưởng của thời điểm cứu phocirci lai đến sự nảy mầm của phocirci cần được tiếp tục tiến hagravenh trong caacutec thiacute nghiệm sau

Như vậy việc lai xa giữa LPI times BRO bằng kỹ thuật lai tạo truyền thống nhằm thu hạt lai ngoagravei đồng ruộng đatilde khocircng thagravenh cocircng do caacutec ragraveo cản xảy ra sau khi thụ phấn khiến cho hạt lai bị leacutep vagrave chết trước khi thagravenh thục Tuy nhiecircn việc aacutep dụng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau thụ phấn để cứu caacutec phocirci lai xa cacircy lai giữa L brownii var colchesteri vagrave L longiflorum đatilde được lai tạo thagravenh cocircng tạo ra thế hệ F1 coacute caacutec đặc điểm quyacute hiếm của cacircy cho phấn (hoa đổi magraveu) Phương phaacutep cứu phocirci lai xa nagravey cũng được aacutep dụng ở nhiều nghiecircn cứu khaacutec trong chi Lilium vagrave đều cho kết quả tương tự với nhiều tổ hợp hoa mới được lai tạo thagravenh cocircng (Hayashi et al 1986 Kanoh et al 1988 Van Tuyl et al 1991 Fernandez et al 1996)

Tiacutenh trạng hoa đổi magraveu được tigravem thấy duy nhất trong loagravei L brownii var colchesteri nghiecircn cứu sacircu về sắc tố trecircn caacutenh hoa của Hai (2012) chỉ ra rằng việc giảm hagravem lượng carotenoids trong caacutenh hoa lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy ra sự đổi magraveu từ vagraveng sang trắng của loagravei hoa nagravey vagrave hagravem lượng của carotenoids trong caacutenh hoa tỉ lệ nghịch với sự biểu hiện của gen LbCCD4 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4) với chức năng phacircn giải carotenoids trong caacutenh hoa Thagravenh cocircng trong việc tạo ra cacircy lai F1 với tiacutenh trạng đổi magraveu cho thấy đacircy lagrave tiacutenh trạng trội vagrave coacute thể di truyền cho caacutec thế hệ cacircy lai sau Điều đoacute cũng mở ra caacutec hướng lai tạo khaacutec giữa L brownii var colchesteri với caacutec loagravei coacute hoa magraveu sắc khaacutec (đỏ vagraveng cam) trong chi Lilium để tạo ra cacircy lai coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất coacute yacute nghĩa trong tạo giống lily mới

4 KẾT LUẬN

Dograveng lily mới trong pheacutep lai giữa L longiflorum lsquoLPIrsquo với L brownii var colchesteri đatilde được lai tạo thagravenh cocircng bằng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau khi thụ phấn Dograveng lily mới coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa từ vagraveng sang trắng đacircy lagrave một tiacutenh trạng hiếm coacute trong lily magrave chỉ coacute L brownii var colchesteri mới coacute Caacutec con lai của pheacutep lai nagravey coacute thể phaacutet triển thagravenh giống lily với tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất đặc sắc lagrave tiền đề để phaacutet triển thagravenh giống lily mới trong tương lai

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO Hayashi M Kanoh K Serizawa Y and Yoon E

(1986) Ovary slice culture of Lilium formosanum Wallace Japan J Breed 36 304-308

Hiramatsu M Ii K Okubo H Huang K L and Huang C W (2001) Biogeography and origin of Lilium longiflorum and L formosanum (Liliaceae) endemic to the Ryukyu Archipelago and Taiwan as determined by allozyme diversity Amer J Bot 88 1230ndash1239

Nguyen Thi Lam Hai Hiramatsu M Kim Jong-Hwa Masuda Ju-ichiro and Okubo H (2012) Interspecific Hybrids production between Lilium brownii var colchesteri and its close relatives by ovary slice culture J Japan Soc Sci 81 (2) 191-197

Kanoh K Hayashi M Serizawa Y and Konishi T (1988) Production of interspecific hybrids between Lilium longiflorum and L times elegance by ovary slice culture Japan J Breed 38 278-282

McRae E A (1998) Lilies A guide for growers and collectors Timber Press Portland Oregon

Okubo H (2006) History of Lilium brownii var colchesteri in Japan Sci Bul Faculty of Agri Kyushu University 61 145ndash163 (In Japanese with English summary)

Van Tuyl J M Chi H S van Kronenburg B C M and Meijer B (1997) Interspecific lily hybrids a promise for the future Acta Hort 430 539-544

Van Tuyl J M van Dien M P van Creij M G M van Kleinwee T C M Franken J and Bino R J (1991) Application of in vitro pollination ovary culture ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses Plant Sci 74 115-126

Nguyễn Thị Lacircm Hải Hiroshi Okubo

813

rằng thời điểm 7 ngagravey 20 ngagravey vagrave 40 ngagravey sau thu phấn lagrave thiacutech hợp nhất khi nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy của caacutec tổ hợp lai trong chi Lilium Tuy nhiecircn trong nghiecircn cứu của chuacuteng tocirci do hạn chế về số lượng tổ hợp lai thu được necircn mỗi tổ hợp lai chỉ được thực hiện một lần lấy mẫu vagraveo cugraveng thời điểm để đem nuocirci cấy do đoacute chưa thể khẳng định được thời điểm lấy mẫu cứu phocirci lai trong nghiecircn cứu nagravey lagrave tối ưu nhất cho caacutec tổ hợp lai trecircn Caacutec nghiecircn cứu về ảnh hưởng của thời điểm cứu phocirci lai đến sự nảy mầm của phocirci cần được tiếp tục tiến hagravenh trong caacutec thiacute nghiệm sau

Như vậy việc lai xa giữa LPI times BRO bằng kỹ thuật lai tạo truyền thống nhằm thu hạt lai ngoagravei đồng ruộng đatilde khocircng thagravenh cocircng do caacutec ragraveo cản xảy ra sau khi thụ phấn khiến cho hạt lai bị leacutep vagrave chết trước khi thagravenh thục Tuy nhiecircn việc aacutep dụng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau thụ phấn để cứu caacutec phocirci lai xa cacircy lai giữa L brownii var colchesteri vagrave L longiflorum đatilde được lai tạo thagravenh cocircng tạo ra thế hệ F1 coacute caacutec đặc điểm quyacute hiếm của cacircy cho phấn (hoa đổi magraveu) Phương phaacutep cứu phocirci lai xa nagravey cũng được aacutep dụng ở nhiều nghiecircn cứu khaacutec trong chi Lilium vagrave đều cho kết quả tương tự với nhiều tổ hợp hoa mới được lai tạo thagravenh cocircng (Hayashi et al 1986 Kanoh et al 1988 Van Tuyl et al 1991 Fernandez et al 1996)

Tiacutenh trạng hoa đổi magraveu được tigravem thấy duy nhất trong loagravei L brownii var colchesteri nghiecircn cứu sacircu về sắc tố trecircn caacutenh hoa của Hai (2012) chỉ ra rằng việc giảm hagravem lượng carotenoids trong caacutenh hoa lagrave nguyecircn nhacircn chiacutenh gacircy ra sự đổi magraveu từ vagraveng sang trắng của loagravei hoa nagravey vagrave hagravem lượng của carotenoids trong caacutenh hoa tỉ lệ nghịch với sự biểu hiện của gen LbCCD4 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4) với chức năng phacircn giải carotenoids trong caacutenh hoa Thagravenh cocircng trong việc tạo ra cacircy lai F1 với tiacutenh trạng đổi magraveu cho thấy đacircy lagrave tiacutenh trạng trội vagrave coacute thể di truyền cho caacutec thế hệ cacircy lai sau Điều đoacute cũng mở ra caacutec hướng lai tạo khaacutec giữa L brownii var colchesteri với caacutec loagravei coacute hoa magraveu sắc khaacutec (đỏ vagraveng cam) trong chi Lilium để tạo ra cacircy lai coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất coacute yacute nghĩa trong tạo giống lily mới

4 KẾT LUẬN

Dograveng lily mới trong pheacutep lai giữa L longiflorum lsquoLPIrsquo với L brownii var colchesteri đatilde được lai tạo thagravenh cocircng bằng phương phaacutep nuocirci cấy laacutet cắt bầu nhụy sau khi thụ phấn Dograveng lily mới coacute tiacutenh trạng đổi magraveu hoa từ vagraveng sang trắng đacircy lagrave một tiacutenh trạng hiếm coacute trong lily magrave chỉ coacute L brownii var colchesteri mới coacute Caacutec con lai của pheacutep lai nagravey coacute thể phaacutet triển thagravenh giống lily với tiacutenh trạng đổi magraveu hoa rất đặc sắc lagrave tiền đề để phaacutet triển thagravenh giống lily mới trong tương lai

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO Hayashi M Kanoh K Serizawa Y and Yoon E

(1986) Ovary slice culture of Lilium formosanum Wallace Japan J Breed 36 304-308

Hiramatsu M Ii K Okubo H Huang K L and Huang C W (2001) Biogeography and origin of Lilium longiflorum and L formosanum (Liliaceae) endemic to the Ryukyu Archipelago and Taiwan as determined by allozyme diversity Amer J Bot 88 1230ndash1239

Nguyen Thi Lam Hai Hiramatsu M Kim Jong-Hwa Masuda Ju-ichiro and Okubo H (2012) Interspecific Hybrids production between Lilium brownii var colchesteri and its close relatives by ovary slice culture J Japan Soc Sci 81 (2) 191-197

Kanoh K Hayashi M Serizawa Y and Konishi T (1988) Production of interspecific hybrids between Lilium longiflorum and L times elegance by ovary slice culture Japan J Breed 38 278-282

McRae E A (1998) Lilies A guide for growers and collectors Timber Press Portland Oregon

Okubo H (2006) History of Lilium brownii var colchesteri in Japan Sci Bul Faculty of Agri Kyushu University 61 145ndash163 (In Japanese with English summary)

Van Tuyl J M Chi H S van Kronenburg B C M and Meijer B (1997) Interspecific lily hybrids a promise for the future Acta Hort 430 539-544

Van Tuyl J M van Dien M P van Creij M G M van Kleinwee T C M Franken J and Bino R J (1991) Application of in vitro pollination ovary culture ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses Plant Sci 74 115-126