1 O RGANIZÁCIA A ÚLOHY KLINICKEJ CHÉMIE - stuba.sk · 2008. 9. 13. · Krv je suspenzia pevných...

Glosár G1

1 ORGANIZÁCIA A ÚLOHY KLINICKEJ CHÉMIE Definícia klinickej chémie a laboratórnej medicíny podľa IFCC

Klinická chémia a laboratórna medicína je aplikácia chemických, molekulových a bunkových princípov a technológií za účelom porozumieť ľudskému zdraviu a chorobe a umožniť ich hodnotenie. Jadrom odboru je poskytovanie výsledkov meraní a pozorovaní súvisiacich s príči-nou choroby, udržaním zdravia a premena týchto dát na špecifické a všeobecné informácie vzťahujúce sa k pacientovi a chorobe. Úlohou odboru je prehlbovanie vedomostí o zdraví a cho-robe prostredníctvom základného a aplikovaného výskumu. IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) 1955 Klinická chémia ako multidisciplinárny vedný odbor

o medicína o biológia o fyziológia, genetika, bunková a molekulová biológia o chémia (biochémia, imunochémia, analytická chémia, farmaceutická chémia) o matematika o fyzika o výpočtová technika, informatika, automatizácia o metrológia

Organizácia a úlohy klinickej chémie a laboratórnej medicíny

Oddelenie laboratórnej medicíny (klinických laboratórií)

(Predanalytická časť) Analytická časť Klinická

biochémia Klinická

hematológia Klinická

imunológia Klinická

farmakológia Klinická

mikrobiológiaKlinická sérologia

Klinická toxikológia

Lekárska genetika

Nukleárna medicína

Ďalšie odbory

Postanalytická (interpretačná) časť

Obr. 1-1 Organizačná schéma oddelenia laboratórnej medicíny (klinických laboratórií)

Biochémia študuje chemické zloženie organizmov a premeny, ktoré v nich prebiehajú, ich regulácie a vzájomné vzťahy.

Patobiochémia sa zaoberá biochemickými procesmi pri patologických (chorobných) stavoch.

Klinická biochémia na základe stanovenia zmenenej koncentrácie substrátov alebo produktov enzýmových procesov, zmenenej aktivity enzýmov a iných látok v telových tekutinách prispieva k stanoveniu diagnózy ochorenia, k určeniu jeho prognózy a ku kontrole účinku terapie. Je to teda aplikácia znalostí biochémie a patobiochémie v klinickej medicíne.

© J. Sádecká, e-Analytické metódy v klinickej chémii, Ústav analytickej chémie STU, 2008

Glosár G2

Veľký význam biochemického vyšetrenia v diagnostickom procese vyplýva z toho, že: o v rámci laboratórnych vyšetrení poskytuje až 60-70 % informácií o zmene zdravotného

stavu, o informuje o priebehu metabolických procesov, ktorých poruchy sú príčinou väčšiny

chorôb, o je k dispozícii široké spektrum rôznych dostatočne špecifických a citlivých testov, o výsledky sú kvantifikovateľné, o vyšetrenie je relatívne ľahko dostupné a veľmi nezaťažuje pacienta.


Glosár G3

2 FÁZY LABORATÓRNYCH VYŠETRENÍ Základné zložky diagnostického procesu

Na posúdenie zdravotného stavu vyšetrovanej osoby potrebuje lekár informácie z: o anamnézy, o fyzikálneho vyšetrenia, o laboratórneho vyšetrenia (biochemického, hematologického, mikrobiologického, imuno-

logického, atď.), o prístrojového vyšetrenia (napr. rádiodiagnostika, sonografia, elektrodiagnostika alebo

endoskopia). Základným článkom diagnostického procesu je anamnéza a celkové fyzikálne vyšetrenie. Laboratórne a prístrojové vyšetrenie:

o umožňuje zachytiť zmeny, ktoré nie je možné pozorovať len zmyslami (zmeny vo funkč-ných prejavoch orgánov a zmeny na bunkovej až molekulovej úrovni),

o má lekárovi pomôcť potvrdiť alebo vylúčiť podozrenie na určitú diagnózu, spresniť diagnózu, posúdiť priebeh ochorenia, určiť zodpovedajúcu terapiu a sledovať jej účinok.

Fázy laboratórneho vyšetrenia

1. Predanalytická fáza je súbor všetkých postupov a operácií, ktorými prejde vzorka od požiadavky na analýzu až do okamihu, kedy je vzorka vložená do meracieho prístroja (obr. 2-1). Po zadaní požiadavky na vyšetrenie lekárom nasleduje:

o príprava pacienta a odberového materiálu, o odber biologického materiálu (BM) a jeho označenie, o transport biologického materiálu, o príjem a registrácia biologického materiálu, o spracovanie biologického materiálu, o skladovanie biologického materiálu.

2. Analytická fáza je určenie kvality (prítomnosti/neprítomnosti určitej vlastnosti, analytu, parametra) alebo kvantity.

o analytický výsledok je ovplyvňovaný predovšetkým použitým analytickým systémom (metóda, prístroj, kalibračný materiál) a kvalitou realizácie analytického postupu v laboratóriu,

o pracovné postupy sa riadia zásadami správnej laboratórnej praxe (SLP) a kontrolujú dobre prepracovaným systémom vnútornej kontroly kvality a externého hodnotenia kvality, čím sa významnou mierou eliminujú chyby analytickej fázy (pôsobenie vplyvov predanalytickej fázy je menej známe a tiež menej kontrolované).


Glosár G4

3. Postanalytická fáza je súbor činností, kedy výsledok vyšetrenia získava tvar informácie pre ošetrujúceho lekára.

Zhodnotenie analytického výsledku vyžaduje: o znalosť predanalytických faktorov a informácií, o znalosť metodicky závislých referenčných intervalov, o znalosť neistoty analytického výsledku, o spoluprácu medzi laboratóriom a lekárom.

Kvalitu postanalytickej fázy ovplyvňujú všetky okruhy činnosti laboratória po vykonaní vyšet-renia (záznamy o vyšetrení, výpočet výsledkov, akceptovanie výsledkov, hodnotenie, administra-tíva a iné).


Glosár G5

3 BIOLOGICKÉ MATERIÁLY 3.1 Základné biologické materiály Telové tekutiny:

o krv (plná krv, krvné sérum, krvná plazma) o moč o mozgovomiechový mok o plodová voda o sliny o výpotok o žalúdková šťava

3.1.1 Krv na kilogram hmotnosti 70 ml (ženy), 75 ml (muži), 80-85 ml (deti) krvi, 70 % v žilách, 20 % v tepnách a 10 % v kapilárach, podľa miesta výskytu má krv mierne odlišné vlastnosti. Krv je suspenzia pevných bunkových častíc (krvné bunky, 45 %) v plazme (tekutá zložka krvi, 55 %). Bunkové častice

o krvinky: erytrocyty − červené krvinky (počet erytrocytov je asi 1012 l-1) a leukocyty − biele krvinky (počet 109 l-1),

o krvné doštičky: trombocyty (počet 1011 l-1). Plazma

o tekutá zložka krvi (2,8 až 3,5 l), o priehľadná s nažltlou farbou, o asi 91 % plazmy tvorí voda, o 8 % organických látok (albumíny, globulíny, protrombín, fibrinogén), o 1 % anorganických látok (Na+, K+, Cl-, HCO3- a iné), o stovky ďalších látok, ktorých koncentrácia je nižšia, o plazma má pH 7,4.

Množstvo vody v plnej krvi, v erytrocytoch a v plazme je rôzne (plná krv 83 %, erytrocyty 73 %, plazma 93 %). Preto sa odlišuje aj koncentrácia toho istého analytu stanoveného v uvedených vzorkách získaných z krvi jedného človeka.


Glosár G6

Zrážanie krvi, vznik séra Krvné doštičky sa na vzduchu rozpadajú, pričom uvoľňujú enzým trombokináza. Trombokináza v prítomnosti vápenatých iónov premieňa protrombín v krvnej plazme na trombín. Pôsobením trombínu a krvného faktora XIII sa v krvnej plazme rozpustená bielkovina - fibrinogén postupne mení na nerozpustný fibrin. Fibrin vytvorí hustú a kompaktnú sieť, ktorá zadrží krvinky, krvné doštičky a aj niektoré ďalšie zrážavé látky, pričom vznikne tuhý krvný koláč, z ktorého sa vytlačí sérum (obr. 3-1). Sérum má podobné zloženie ako plazma, len v ňom chýba fibrinogén a niektoré ďalšie zrážavé látky. Fibrinogén monomér fibrinu + fibrinopeptidy A a B ⎯⎯ →⎯trombín

n (monomér fibrinu) fibrin↓ ⎯⎯⎯⎯⎯ XIIIfaktor krvný →

Zrážanie krvi po odbere o závisí od materiálu odberovej nádobky, v sklených

nádobkách prebieha rýchlejšie, v plastových pomal-šie,

o ak sa nechá krv zraziť po odbere do nádobky s polár-nym povrchom bez prídavku antikoagulantu a po-tom sa odstredí, nad zrazeninou (krvným koláčom) sa oddelí tekutina – sérum,

o pri odbere do nádobky s antikoagulantom sa po oddelení krviniek získa plazma.

Plazma (fibrinogén)

Krvinky

Krvné doštičky

Krvný koláč

(fibrín)

Sérum

Obr. 3-1 Zrážanie krvi

Plazma versus sérum - univerzálne použitie obidvoch materiálov nie je možné. Plazma je klinicky vhodnejšia:

o je prirodzený reprezentant toho, čo je prítomné v kvapalnom stave v plnej krvi, o z plnej krvi sa získa asi o 20 % viac plazmy ako séra, o úspora času, po odobratí plnej krvi (po pridaní antikoagulantu) je možné krv ihneď ods-

trediť, o po odstredení sa neobjavuje koagulácia, o nebezpečenstvo hemolýzy (rozpadu červených krviniek) je v plazme 10 krát nižšie.

Nevýhody plazmy: o nie je možné stanovenie bielkovín elektroforézou, pretože fibrinogén interferuje, o pridané antikoagulanty vnášajú ióny (Na+, K+, Ca2+), ktoré nie je možné stanoviť, o pridané antikoagulanty môžu maskovať analyty a inhibovať enzýmy.


Glosár G7

Krvné sérum je z hľadiska potrieb analytickej chémie výhodnejšie: o sérum je sústava zložením bližšia pravému roztoku než plazma, o je svetovo najbežnejšie používaný biologický materiál, o svetová normalizácia a unifikácia (štandardy, metódy, prístrojová technika, správna la-

boratórna prax) je podstatne rozpracovanejšia.

Nevýhody séra: o menej vhodný materiál z hľadiska klinických požiadaviek, o nežiaduca dodatočná koagulácia, o časová strata: po odbere krvi nechať postáť minimálne 30 min, aby sa dosiahla dobrá

koagulácia, potom odstrediť, o skrátiť tento časový interval umožňuje odber do nádobiek s aktivátormi zrážania alebo so

separačným gélom. 3.1.2 Moč Obličky denne prefiltrujú z krvi okolo 180 litrov tekutiny, väčšina sa reabsorbuje, zvyšok sa premení na moč. Zloženie: 95 % voda, 2,5 % močovina, rozpustené soli, organické látky, enzýmy, hormóny. Obličky upravujú zloženie moču tak, aby sa udržala rovnováha v organizme:

o látky potrebné pre organizmus (napr. glukóza) sa reabsorbujú do krvi, o odstraňujú nadbytočnú vodu, nepotrebné látky (močovina, Cl, Na K, fosfáty, sírany,

kreatinín a kyselina močová) a jedy. 3.2 Vplyvy pôsobiace na biologické materiály 3.2.1 Vplyv vyšetrovanej osoby Stále vplyvy (rasa, pohlavie, vek a biorytmy) sú faktory, ktoré nie je možné ovplyvniť, ale pri správnom hodnotení výsledkov analýz je ich potrebné poznať a zohľadniť. Rasa a pohlavie

o referenčné hodnoty analytov kreatínkinázy, α-amylázy a granulocytov narastajú vzostup-ne od belochov cez žltú rasu k černochom,

o ženy majú väčšinou nižšie a užšie referenčné intervaly niektorých analytov (Fe, hemoglo-bín, celkový cholesterol a jeho LDL-frakcia, močovina, a iné).


Glosár G8

Vek o novorodenci majú vyšší obsah bilirubínu v sére (nevyzretá funkcia pečene a

nadprodukcia hemoglobínu vďaka kratšej životnosti erytrocytov), o v detskom veku väčšinou nižšie horné hranice referenčného intervalu (cholesterol, tri-

acylglyceroly, močovina, kyselina močová, kreatinín, pohlavné hormóny), o deti a dospievajúci majú zvýšenú koncentráciu fosforu a zvýšenú aktivitu alkalickej

a kyslej fosfatázy, čo súvisí s tvorbou kostných tkanív. Cyklické zmeny (biorytmy)denné, mesačné, sezónne

o koncentrácia kreatinínu je vyššia večer asi o 50 % než ráno, o ráno sú vyššie koncentrácie Fe o 30 až 100 %, hemoglobínu o 20-30 %, K a P o 10-15 %, o kolísanie hodnôt Fe, cholesterolu, K, fosfátu v sére je väčšie v priebehu dňa než zo dňa

na deň, o zo dňa na deň sa mení o 4-10 % cholesterol, K, kreatinín, fosfáty, o 15-20 % sa mení

močovina, AST a lipidy a až o 30 % železo a ALT, o v dlhších časových úsekoch sa mení hlavne koncentrácia bielkovín.

Premenlivé vplyvy (hmotnosť, diéta, fajčenie, pohyb, alkohol, lieky a životný štýl ako taký) sú faktory, ktoré sú vo väčšine prípadov ovplyvniteľné a ich vplyv na laboratórne vyšetrenie je možné eliminovať. Vplyv diéty

o príjem potravy všeobecne zvyšuje koncentráciu glukózy, kyseliny močovej, plazmového Fe a sodíka a znižuje koncentráciu anorganického fosfátu a laktátdehydrogenázy,

o strava bohatá na tuky → vyššie koncentrácie tukov, o strava bohatá na bielkoviny → vyššia koncentrácia amoniaku a močoviny v sére, o zelenina a ovocie moč alkalizujú, o mäso a potraviny bohaté na tuky moč okysľujú.

Telesná námaha

o zmeny koncentrácie látok, ktoré sa bezprostredne podieľajú na energetickom metaboliz-me (laktát, vyššie karboxylové kyseliny, glukóza, zmena pH),

o veľkosť zmeny závisí od rôznych faktorov: intenzita záťaže, trénovanosť jedinca, teplota (počasie), príjem tekutín a elektrolytov,

o koncentrácia vysokomolekulových látok (bielkoviny, enzýmy, lipidy) je nižšia v polohe ležmo a zvyšuje sa v priemere o 10-15 % v stoji,

o pri krátkodobej záťaži sa znižuje ATP, inzulín, klesá pH; zvyšuje sa laktát a glukóza, o po dlhotrvajúcej záťaži sa zvyšuje Na, K, Ca, alkalická fosfatáza, albumín, anorganický

fosfor, močovina, bilirubín, AST, pyruvátkináza, kreatínkináza.


Glosár G9

Kofeín a fajčenie o kofeín – zvýšenie koncentrácie glukózy, neesterifikovaných vyšších karboxylových

kyselín a katecholamínov v krvi, o fajčenie – vyššie zastúpenie karbonylhemoglobínu (až 8 %), karboxylové kyseliny,

glukóza, fibrinogén, cholesterol, SCN-, počet leukocytov, niektoré hormóny, tumorové markery a kovy (Cd, Cu, Pb). Prostredníctvom voľných radikálov sa zvyšuje oxidácia LDL-cholesterolu a znižuje koncentrácia vitamínu C.

Vplyv alkoholu

o alkohol sa metabolizuje na acetaldehyd a potom na acetát, o okamžité vplyvy alkoholu sú: zníženie sérovej glukózy, zvýšenie plazmového laktátu,

zníženie sérových HCO3- a s tým súvisiaca metabolická acidóza, o dlhodobá konzumácia alkoholu vedie k zvýšeniu enzýmov produkovaných pečeňou

(AST, ALT). U chronických alkoholikov sú zvýšené triacylglyceroly, cholesterol a niek-toré hormóny.

3.2.2 Vplyv predanalytickej fázy Na biologické materiály má vplyv príprava vyšetrovaného na odber, spôsob odberu, následný transport a uchovávanie biologického materiálu pred analýzou. Tieto vplyvy sa označujú poj-mom vplyv predanalytickej fázy. Pre stanovenie rovnakého analytu je zvykom vzorky zhromaž-ďovať a potom analyzovať spoločne, čo si vyžaduje rýchly transport vzoriek alebo ich stabilizá-ciu. Tejto problematike je venovaná časť 4. 3.2.3 Vplyv liekov (interferencie) Lieky môžu ovplyvniť laboratórne vyšetrenie rôznymi spôsobmi:

o liek skutočne zvyšuje alebo znižuje koncentráciu stanovovanej zložky zvýšením alebo znížením jej tvorby v organizme,

o liek pôsobí na metabolizmus stanovovanej zložky (mení rýchlosť metabolizmu, ovplyv-ňuje väzbu na transportné bielkoviny),

o liek interferuje pri vlastnom stanovení, o liek poškodzuje niektorý orgán, čím sa poruší jeho funkcia, o sú možné kombinácie všetkých štyroch vplyvov.


Glosár G10

4 PREDANALYTICKÁ FÁZA Predanalytická fáza je súbor všetkých postupov a operácií, ktorými prejde vzorka od požiadavky na analýzu až do okamihu, kedy je vzorka vložená do meracieho prístroja. 4.1 Príprava vyšetrovanej osoby

o Pacient má byť na každý odber pripravený (informovaný o diéte, vysadení liekov a pod), o 30 min pred vlastným odberom v kľude, o odber ráno (medzi 6-8 h) nalačno (12 h po poslednej strave, ráno pred odberom konzu-

movať v malom množstve len vodu alebo neosladený čaj), o pokiaľ je to možné, aj po vysadení liekov na dobu aspoň 24-72 h, o pred odberom nefajčiť, nepiť kávu ani alkoholické nápoje.

4.2 Odber, transport a skladovanie biologických materiálov Odber biologického materiálu by mal vykonávať len kvalifikovaný pracovník. Ak si odber robí pacient sám, mal by byť podrobne poučený o vykonaní odberu. Časový interval, v ktorom možno spoľahlivo vykonať analýzu je pre rôzne analyty rôzny a závisí nielen od vlastností samotného analytu, ale aj od typu biologického materiálu (tab. 4-1). Tento časový interval sa zisťuje experimentálne a označuje sa pojmom stabilita. Stabilita sa kvantitatívne vyjadruje ako čas, kedy sa počiatočný obsah analytu nezmení o viac ako 1,5–násobok referenčného intervalu s pravdepodobnosťou 95 %. Pre stanovenie málo stabilných zložiek je zvyčajne potrebné vykonať odber vzorky do nádobky s príslušným ochranným prostriedkom a vzorku dopraviť do labo-ratória čo najskôr.

Tabuľka 4-1 Stabilita niektorých analytov v biologických tekutinách pri rôznych teplotách

Stabilita Analyt Vzorka

20-25 oC 4 oC -20 oC Alkalická fosfatáza (ALP) S 4 dni 1 týždeň 2 mesiace Aspartátaminotransferáza S 1 týždeň 1 týždeň 3 mesiace Kreatínkináza (CK) S 1 týždeň 1 týždeň 1 mesiac Laktátdehydrogenáza (LD) S/P 1 h 4 dni 2 mesiace Sodík S/P 4 dni 2 týždne 1 rok Chloridy S/P 1 deň 1 týždeň roky Albumín S 6 dní 3 mesiace 3 mesiace Glukóza S/P 10 min 1 deň 1 týždeň Kreatinín S 2-3 dni 1 týždeň 3 mesiace Cholesterol S/P 1 týždeň 1 týždeň 3 mesiace

S - sérum, P - plazma


Glosár G11

4.2.1 Krv

Krv je vhodné odoberať posediačky. Pacient by mal byť 30 min pred odberom v kľude.

Odber venóznej (žilnej) krvi o u dospelých zo žily lakťovej jamky alebo zo žily na predlaktí, o u detí aj zo žíl zápästia, prípadne nohy, u kojencov zo spánkových žíl.

Postup: o paža sa stiahne elastickým ovínadlom, o miesto vpichu ihly sa dezinfikuje (Ajatin, Decidin, 70-80 % alkohol, Septonex). Miesto

vpichu nesmie zostať po dezinfekcii vlhké, pretože už stopy dezinfekčného prostriedku vedú k hemolýze séra,

o ovínadlo sa rýchle uvoľní, aby sa odobrala voľne prúdiaca krv. Ak sa elastické ovínadlo neuvoľní dostatočne rýchlo a cvičenie pažou bolo zbytočne intenzívne, pozoruje sa zvý-šenie (ALP, bilirubín, celková bielkovina, hemoglobín, cholesterol) alebo zníženie (glu-kóza, fosfát, kreatinín) niektorých analytov v krvnom sére,

o po skončení odberu sa ihla zo žily vytiahne, o na miesto vpichu sa priloží tampón, ktorý si pacient pritlačí po dobu minimálne 3 min,

aby sa nevytvoril krvný hematóm.

Odber kapilárnej krvi o umožňuje získať iba malé objemy vzorky (3-5 kvapiek), o používa sa u novorodencov a malých detí a na určenie glykémie, o hodnoty zistené z kapilárnej krvi sa odlišujú od hodnôt vyšetrených z venóznej krvi, o používa sa na stanovenie priamo na mieste.

Odberové skúmavky

Aditíva v odberových skúmavkách: o prostriedky urýchľujúce zrážanie krvi, o prostriedky proti zrážaniu (antikoagulanty), o ďalšie ochranné prostriedky.

Skúmavky so separačnými inertnými gélmi o gél vytvorí rozhranie medzi sérom alebo plazmou a krvným koagulom alebo krvinkami

a tým napomáha oddeleniu séra alebo plazmy, o gél zabráni vzájomnému ovplyvňovaniu krvných buniek a séra alebo plazmy po odstre-

dení. Umožňuje dosiahnuť podstatne vyššiu stabilitu analytov, o pri stanovení hormónov, tumorových markerov, liečiv, stopových prvkov a iných, sa pri

použití separačných gélov pozorujú nežiadúce efekty. Vyšetrenia vykonávané z plnej krvi (acidobázická rovnováha, glykémia, laktát, minerály pomocou iónovo-selektívnych elektród), z erytrocytov (glykovaný hemoglobín) alebo z plaz-my (fibrinogén, kyslá fosfatáza) vyžadujú:


Glosár G12

Skúmavky plnené antikoagulantmi: o sodné alebo draselné soli kyseliny citrónovej, šťavelovej alebo etyléndiamíntetra-octovej

(EDTA), ktoré vytvárajú vo vzorke komplexy s iónmi Ca2+ (Ca2+ sú nevyhnutné pre zrážanie krvi),

o heparín vo forme lítnej, vápenatej alebo amónnej soli, heparín akceleruje inhibítor krvnej koagulácie (antitrombín III).

Glykolýza Koncentrácia glukózy vo vzorke krvi rýchlo klesá, lebo erytrocyty aj po odbere krvi využívajú glukózu ako zdroj svojej energie:

o pri teplote okolo 20 oC poklesne koncentrácia glukózy v priebehu dňa o 70 % a na druhý deň obsahuje krv asi 6 % z pôvodnej koncentrácie glukózy,

o pri teplote 4 oC poklesne glukóza v plnej krvi v priebehu dňa o 20 % a na druhý deň obsahuje 32 % z pôvodnej koncentrácie.

Reakciu glykolýzy katalyzuje enzým: o hexokináza, o glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, o enoláza.

Stabilizácia glukózy: o účinok glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy inhibuje prídavok kyseliny monojódocto-

vej, o enolázu inhibuje prídavok fluoridov, o prídavok manózy, ktorá pôsobí namiesto glukózy ako alternatívny substrát pre enzým

hexokinázu Hemolýza

o je rozpad erytrocytov, o z erytrocytov sa do plazmy alebo séra dostáva zvýšené množstvo draslíka, chloridov,

ALT, o červené sfarbenie hemoglobínu interferuje pri fotometrickom stanovení väčšiny analytov.

Podľa príč iny sa hemolýza delí na: o mechanickú − prudká manipulácia, rýchle nasávanie, predčasné odstredenie krvi, o osmotickú − mokrá skúmavka, o tepelnú − krv vystavená mrazu alebo naopak vysokej teplote, o chemickú − dezinfekčný prostriedok, ktorý poruší membránu erytrocytov.

Aby sa hemolýza neprejavila: o odstrediť a oddeliť sérum/plazmu od zrazeného krvného koláča/krviniek optimálne do 30

min, o použiť odberové skúmavky so separačným gélom.


Glosár G13

Chylózne sérum o vysoká koncentrácia cholesterolu (nad 12 mmol/l) alebo rozptýlené tukové kvapôčky, o pozoruje sa mliečny zákal, o dochádza k ovplyvňovaniu predovšetkým stanovenia katalytickej aktivity enzýmov, o pre väčšinu analýz nevhodné.

4.2.2 Moč Na vyšetrenie sa obvykle používa

o moč z jednorazového zberu (vhodný pre kvalitatívnu analýzu), o zberaný moč (vhodný pre kvantitatívnu analýzu), o moč odobratý cievkovaním.

Vyšetrenie z jednorazového zberu

o odoberie sa čerstvý moč, najvhodnejší je prvý ranný moč zo stredného prúdu, o na základné fyzikálne a chemické vyšetrenia a na vyšetrenie močového sedimentu je

vhodný len nekonzervovaný prvý ranný moč, ktorý bol doručený do laboratória do 1 h po odbere,

o inak použiť na odber nádobky s konzervačnými prostriedkami a moč vyšetriť do 2 h. Vyšetrenie zo zberaného moču

o obvykle je to 3, 6, 12 alebo 24 h moč, o pre kvantitatívnu analýzu sa uprednostňuje 24 h (dU) zberaný moč, o na stanovenie Na+, Ca2+, Cl-, močoviny, glukózy, mikroalbuminurie, kreatinínu a kreati-

nínovej clearance. 4.3 Príprava vzorky na meranie 4.3.1 Odstreďovanie

o na oddelenie tuhých častíc z roztokov, o podmienky je potrebné špecifikovať: hodnoty RCS (počet g), času a teploty.

Podmienky pre krv o doba odstreďovania 5-10 min, o RCS 1 000 až 2 000 g, o teplota 18-25 oC.

Pre vyšetrenie močového sedimentu o RCS maximálne do 400 g, inak dochádza k narušeniu rôznych útvarov v moči.


Glosár G14

4.3.2 Deproteinácia biologického materiálu Proteíny možno odstrániť

o precipitáciou zrážadlami (precipitačná deproteinácia), o pôsobením enzýmov, o ultrafiltráciou, o dialýzou.

Precipitačná deproteinácia

Ako zrážadlá sa používajú roztoky kyselín, solí a organické rozpúšťadlá. Roztoky kyselín

o Kyselina trichlóroctová: získa sa supernatant s hodnotou pH asi 1, vyzrážanie bielkovín nie je úplné, absorbuje v UV oblasti spektra.

o Kyselina chloristá: supernatant má pH blízke nule, neutrálny supernatant sa pripraví prídavkom draselnej soli a následným odstredením vyzrážaného chloristanu draselného, supernatant sa môže použiť pre priame meranie v UV oblasti spektra, nedosiahne sa úplné vyzrážanie bielkovín.

o Kyselina wolfrámová: najšetrnejšie deproteinačné činidlo, supernatant má pH asi 6.

Rôzne soli o Síran zinočnatý a hydroxid lítny: majú veľmi dobrú precipitačnú účinnosť, supernatant

má výsledné pH okolo 7. o Chlorid hlinitý: veľmi účinný predovšetkým pre stanovenie zásaditých zložiek, nevýho-

dou je vysoká koncentrácia solí v supernatante.

Organické rozpúšťadlá (metanol, etanol, acetonitril, acetón) o výhodné je miešať vzorku a etanol v pomere (1:2), o ak sa použije acetonitril, zložky sa miešajú v pomere vzorka : acetonitril (1:1,5), o postup je vhodný hlavne pre HPLC a GC. o nevýhodou metanolu a acetónu je vysoká absorpcia žiarenia v UV oblasti spektra, o precipitačná účinnosť klesá v poradí acetonitril > acetón > etanol > metanol.

Výhody pecipitačnej deproteinácie: o jednoduchosť, o rýchlosť.

Nevýhody: o možné straty analytov spôsobené adsorpciou na vznikajúci precipitát, o vplyv silných zrážacích kyselín na stabilitu analytov pri nízkom pH a pod.


Glosár G15

Enzýmová deproteinácia

o pôsobením proteolytických enzýmov (subtilisín, trypsín, papaín, ketodáza) alebo ich zmesi,

o výhodná predovšetkým v screeningových metódach (liečivá, drogy, toxikológia). Ultrafiltrácia

o membránový separačný proces, o odstránenie makromolekulových zložiek prechodom vzorky cez separačnú membránu

umiestnenú v skúmavke, o umožňuje zistiť napr. pomer liečiva viazaného na proteíny a voľného liečiva.

Ultrafiltrácia je vhodná napr. na: o stanovenie liečiv, ktoré nie sú naviazané na proteíny, ale pred vlastnou analýzou je

potrebné ich od proteínov oddeliť, o stanovenie voľného podielu liečiva z celkového množstva liečiva, ktorého druhý podiel je

viazaný na proteíny. Ak sa má stanoviť pomer voľného a viazaného liečiva, je potrebné buď najskôr stanoviť celkové množstvo liečiva, alebo v zvyšku na membráne stanoviť množstvo zachyteného liečiva.

Výhody o rýchlosť procesu, o malá spotreba vzorky.

Nevýhoda o riziko naviazania analytu na membránu.

Dialýza

o separácia analytu od matrice difúziou cez polopriepustnú membránu (separácia molekúl podľa ich veľkosti),

o samovoľný pomalý proces, o riadená koncentračným gradientom až do ustálenia rovnováhy, o MWCO (molecular weight cut-off) je definovaná ako molová hmotnosť najmenšej zlož-

ky, ktorú membrána zadrží na viac ako 90 %, o vybrať membránu s vhodnou hodnotou MWCO, o zadržať proteíny a iné veľké biopolyméry − membrány s MWCO 10 000 až 15 000.

Využitie: o spojenie on-line s LC, stanovenie liečiv v krvnom sére a plazme, o účinnosť dialýzy plnej krvi je podobná ako pri dialýze séra alebo plazmy.


Glosár G16

4.3.3 Hydrolýza konjugátov V živom organizme prechádzajú látky endogénneho aj exogénneho pôvodu zložitým systémom biotransformácie:

1. fáza: zavedenie hydroxy-, amino- alebo sulfhydrylovej skupiny do štruktúry látky 2. fáza: konjugácia tejto skupiny s polárnymi kyselinami, napr. kyselinou glukuronovou,

sírovou, octovou, benzoovou, fosforečnou a aminokyselinami. Konjugáty

o s kyselinou glukuronovou – glukuronidy a sírovou – sulfáty, o zvyšujú polaritu pôvodnej zlúčeniny, jej rozpustnosť v polárnom biologickom prostredí,

čo má za následok zrýchlenie vylučovania močom, o významné predovšetkým v moči.

Rozštiepenie konjugátov možno dosiahnuť kyslou alebo enzýmovou hydrolýzou.

Kyslá hydrolýza o použitím silných anorganických kyselín, o najčastejšie koncentrovaná HCl, o kyselina sírová nie je vhodná, pretože reakciou vznikajú farebné produkty.

Enzýmová hydrolýza

o používa sa enzým β-glukuronidáza, o aktivita enzýmu β-glukuronidáza závisí od hodnoty pH prostredia, o pre enzým získaný z baktérií E. coli je optimálne pH v intervale 5,0 až 7,5, o sulfáty sa štiepia enzýmom sulfatáza - optimálne účinkuje v intervale pH 5 až 7, o enzým β-glukuronidáza obsahuje aj aktívnu sulfatázu (zo surovín použitých na prípravu

β-glukuronidázy).

Výhody o špecifický mechanizmus štiepenia, o reakciou nevznikajú rušivé produkty (napr. pôsobením HCl často vznikajú chlórderiváty).


Glosár G17

5 VÝBER ANALYTICKEJ METÓDY 5.1 Vlastnosti metódy z klinického hľadiska Pri klinickej interpretácii laboratórneho výsledku sa obvykle porovnáva výsledok laboratórneho vyšetrenia (analýzy) s referenčnými medzami (hodnotami):

o ak výsledok leží vo vnútri referenčných medzí, výsledok je normálny (fyziologický), o ak je mimo, či už zvýšený, alebo znížený, je patologický, o poloha výsledku vo vnútri referenčného rozmedzia (bližšie k dolnej alebo k hornej medzi,

leží uprostred), o pre 5 % zdravých jedincov sa získa výsledok, ktorý sa nachádza mierne mimo referenč-

ných medzí (prejav individuality jedincov). Referenčné rozmedzie sú také hodnoty laboratórneho testu, medzi ktorými leží väčšina (95 %) hodnôt získaných meraním referenčnej populácie. Referenčná populácia:

o súbor jedincov spĺňajúcich určité predpoklady, o najčastejšie súbor jedincov, ktorí sú hodnotení ako zdraví, o podľa IFCC minimálne 120 jedincov.

Vlastný výpočet odhadov referenčných medzí:

horná referenčná medza = aritmetický priemer + k s,

dolná referenčná medza = aritmetický priemer - k s,

pre 95 % pravdepodobnosť je k = 1,96, s je smerodajná odchýlka. Referenčné medze definujú referenčný interval = (aritmetický priemer ± 2s). Referenčné (normálne, fyziologické) hodnoty:

o boli stanovené pre všetky bežné klinicky významné analyty (tab. 5-1), o predstavujú určitú normu (hranice) pre zdravých jedincov, o niekedy sa líšia podľa druhu použitej metódy (stanovenie aktivity enzýmov, Na a K), o definujú požiadavka na minimálny rozsah kalibračnej funkcie analytickej metódy.

Rozsah kalibračnej funkcie by mal príslušný referenčný interval na obidve strany značne presahovať.

o definujú požiadavky na zhodnosť metódy.


Glosár G18

Tabuľka 5-1 Referenčné intervaly niektorých analytov u dospelých jedincov

Analyt Referenčný interval Jednotka Albumín 38-54 g/l Bilirubín do 20 μmol/l Celkové bielkoviny 64-82 g/l Glukóza 3,33-5,83 mmol/l Cholesterol 3,87-5,20 mmol/l Močovina Muži: 2,5-8,3 Ženy: 2,0-6,9 mmol/l Kreatinín 55-110 μmol/l Kyselina močová Muži: 200-420 Ženy: 140-340 μmol/l ALP Muži: 1-8 Ženy: 0,7-2,3 μkat/l ALT Muži: 0,15-0,78 Ženy: 0,15-0,85 μkat/l

Výsledok laboratórneho vyšetrenia je interval čísel s určitým rozptylom (variabilitou). Priamym ukazovateľom rozptýlenia (variability, nezhodnosti) výsledkov je smerodajná odchýlka s (rozptyl s2). Môže sa vyjadriť aj ako relatívna smerodajná odchýlka RSD % (podľa ISO 3534-1 sa označuje ako variačný koeficient CV %). Celkovú variabilita CVT 2 možno vyjadriť ako:

CVT 2 = CVA 2 + CVI 2 alebo CVT 2 = CVA 2 + CVI 2 + CVG 2

CVA 2 predstavuje variabilitu analytickej metódy,

CVI 2 intra-individuálna biologická variabilita – charakterizuje individuálne kolísanie hodnôt určitého parametra okolo hodnoty typickej pre daného jedinca, zohľadňuje sa pri monitorovaní individuálneho pacienta,

CVG 2 inter-individuálna biologická variabilita – charakterizuje kolísanie hodnôt v prípade, že sa sleduje väčšia populácia. 5.1.1 Výber metódy založený na biologickej variabilite

o je v súčasnosti považovaný za najprimeranejší ako klinickým, tak aj analytickým požia-davkám,

o princípom je zistenie takých podmienok, kedy bude možné s požadovanou pravdepodob-nosťou vydeliť klinicky významný signál z hladiny biologického a analytického šumu.

Klinicky vhodná analytická metóda by mala mať:

o CVA ≤ 0,5 CVI (alebo dokonca až CVA ≤ 0,25 CVI), o vychýlenie B v % (bias, systematická chyba merania) B ≤ 0,25 (CVI 2 + CVG 2)1/2, o celková chyba TE (total error) v % TE ≤ k .0,5 CVI + 0,25 (CVI 2 + CVG 2)1/2,

kde k = 1,65 pre 95 % pravdepodobnosť. V tab. 5-2 sú uvedené hodnoty biologickej variability CVI a CVG spolu s požadovanými hodno-tami CVA, B a TE pre rôzne analyty a biologické materiály.


Glosár G19

Tabuľka 5-2 Intra-individuálna (CVI), inter-individuálna (CVG) biologická variabilita, analytická variabilita (CVA), vychýlenie (B) a celková chyba (TE) niektorých analytov v sére

Biologická variabilita Požadované charakteristiky Analyt

CVI (%) CVG (%) CVA (%) B (%) TE (%) Metóda

albumín 3,1 4,2 1,6 (2) 1,3 (2) 3,9 (6) BCG, BCP celkové bielkoviny 2,7 4,0 1,4 (2) 1,2 (2) 3,4 (6) Biuret ALP 6,4 24,8 3,2 (5) 6,4 (10) 11,7 (18) IFCC ALT 24,3 41,6 12,2 (6) 12,0 (6) 32,1 (6) IFCC AST 11,9 17,9 6,0 (6) 5,4 (5) 15,2 (15) IFCC α-amyláza 9,5 29,8 4,8 (5) 7,8 (8) 15,7 (16) IFCC LD 8,6 14,7 4,3 (7) 4,3 (7) 11,4 (17) IFCC sodík 0,7 1,0 0,4 (1) 0,3 (2) 0,9 (4) FAES

www.westgard.com/guest25.htm, update 2004; návrh analytických kritérií v SR je uvedený na http://sskb.itconsulting.sk/index.html Monitorovanie stavu pacienta (sledovanie pacienta v čase):

o vyžaduje minimálny rozptyl výsledkov merania v čase, o systematická zložka chyby merania je menej významná.

Stanovenie pre diagnostické účely: o vyžaduje čo najnižšiu systematickú chybu, o toleruje trochu väčší rozptyl meraní (vyššiu náhodnú chybu).

Ak v praxi nie je možné dosiahnuť požadovanú kvalitu analytických meraní, pracuje sa s dohodnutými odchýlkami od cieľovej hodnoty analytu (target value, TV). Cieľová hodnota

o priemerná hodnota všetkých výsledkov súboru po vylúčení odľahlých výsledkov, o priemer stanovený definičnou alebo referenčnou metódou.

Dohodnuté odchýlky od cieľovej hodnoty:

o 20-30 % pre enzýmy, o 10 % pre bielkoviny, cholesterol, glukózu, o 5 % pre chloridy.

5.1.2 Výber metódy podľa jej klinickej úspešnosti Vyhodnotenie úspešnosti laboratórnej metódy je zistenie, do akej miery možno výsledky metódy použiť na spoľahlivú diagnostickú výpoveď. V laboratóriách sa v podstate používajú dva typy metód/testov:

1. Metódy/testy, ktoré poskytujú binárne výsledky v tvare áno/nie, pozitívny/negatívny. 2. Metódy, ktoré poskytujú kvantitatívne údaje v číselnej forme. Postup hodnotenia diagnostickej úspešnosti týchto dvoch typov metód je podobný.


http://www.westgard.com/guest25.htmhttp://sskb.itconsulting.sk/index.html

Glosár G20

Testy s binárnymi výsledkami

Preverovaný (hodnotený) test má za úlohu odlíšiť populáciu chorých a zdravých. Postup vyhodnotenia úspešnosti testu:

1. Vyšetrované osoby sa nezávislou metódou rozdelia do skupiny chorých alebo zdravých.

2. Pre preverovaný test sa určí hranica rozhodovania.

Hranica rozhodovania diskriminačná medza, decision level, operating point, cut-of-point) je výsledkom skúšky, ktorá odlíši (diskriminuje) prítomnosť a neprítomnosť špecifickej choro-by.

Hranica rozhodovania sa určí: o ako dolná alebo horná hranica referenčného intervalu. Napr. horná hranica referenčného

intervalu pre izoenzým CK-MB je 5 μg/l, u jedincov s CK-MB>5 μg/l sa predpokladá prítomnosť akútneho koronárneho syndrómu,

o ako dohodnutá hodnota. Napr. podľa WHO je koncentrácia glukózy v plazme nad hodnotu 7 mmol/l dôvodom diagnostikovať diabetes,

o postupom ROC analýzy.

3. Na základe zvolenej hranice rozhodovania a výsledkov preverovaného testu sa zatriedia jedinci do skupiny zdravý/chorý.

Napr. pre zvolenú hranicu rozhodovania pre CK-MB sa jedinci s negatívnym výsledkom testu (< 5 μg/l) zaradia do skupiny zdravý a jedinci s pozitívnym výsledkom (> 5 μg/l) sa zaradia do skupiny chorý. Postup testu musí byť zvolený tak, aby pre koncentrácie < 5 μg/l poskytoval negatívny výsledok a pre koncentrácie > 5 μg/l pozitívny výsledok.

4. Porovná sa zatriedenie osôb získané preverovaným testom so správnym zatriedením. Nastane jedna zo štyroch možností a to, že preverovaný test poskytol: o pozitívny výsledok u chorého (správne pozitívny výsledok, sp), o negatívny výsledok u chorého (falošne negatívny výsledok, fn), o negatívny výsledok u zdravého (správne negatívny výsledok, sn), o pozitívny výsledok u zdravého (falošne pozitívny výsledok, fp).

5. Zistí sa počet osôb v jednotlivých podskupinách a výsledky sa zoradia do kontingenčnej tabuľky (tab. 5-3). Tabuľka 5-3 Kontingenčná tabuľka

Výsledok preverovaného testu Správne zatriedenie pozitívny negatívny Suma

Chorý

správne pozitívny sp, počet Nsp

falošne negatívny fn, počet Nfn

počet chorých Nsp + Nfn

Zdravý falošne pozitívny

fp, počet Nfp správne negatívny

sn, počet Nsn počet zdravých

Nfp + Nsn

Suma počet pozitívnych

Nsp + Nfp počet negatívnych

Nfn + Nsn počet všetkých vyšetrených

Nsp + Nfn + Nfp + Nsn


Glosár G21

6. Z takto usporiadaných výsledkov sa vypočítajú charakteristiky preverovaného testu a na ich základe sa posúdi úspešnosť (diagnostický význam) preverovaného testu.

Charakteristiky testov

Citlivosť, senzitivita, sens – udáva s akou pravdepodobnosťou sa u chorého získa správne pozitívny výsledok testu. Je to podiel počtu chorých s pozitívnym testom a celkového počtu testovaných chorých. Charakterizuje úspešnosť testu pri odhaľovaní choroby. Diagnosticky naj-významnejšie testy majú najvyššiu citlivosť.

sens = Nsp / (Nsp + Nfn).

Necitlivosť, nesenzitivita, nesens – udáva s akou pravdepodobnosťou sa u chorého získa falošne negatívny výsledok testu.

nesens = (1 - sens) = Nfn / (Nsp + Nfn).

Špecifickosť, spec – udáva s akou pravdepodobnosťou sa u zdravého získa správne negatívny výsledok. Je to podiel počtu zdravých osôb s negatívnym testom a celkového počtu testovaných zdravých jedincov. Charakterizuje úspešnosť testu pri vylučovaní prítomnosti choroby. Diagnos-ticky najvýznamnejšie testy majú najvyššiu špecifickosť.

spec = Nsn / (Nfp + Nsn).

Nešpecifickosť, nespec – udáva s akou pravdepodobnosťou sa u zdravých získa falošne pozitívny výsledok.

nespec = (1 - spec) = Nfp / (Nfp + Nsn). Pre posúdenie/hodnotenie úspešnosti preverovaného testu nie je ani tak zaujímavá pravdepo-dobnosť pozitívneho (negatívneho) výsledku u chorého (zdravého), ale aká je pravdepodobnosť, že vyšetrovaný jedinec je skutočne chorý (zdravý), ak je výsledok testu pozitívny (negatívny). Tieto pravdepodobnosti opisujú ďalšie charakteristiky preverovaného testu. Prediktívna hodnota pozitívneho výsledku, pozitívna prediktívna hodnota (positive predictive value), predpos – udáva pravdepodobnosť, že daný jedinec bude diagnostikovaný ako chorý, ak je výsledok testu pozitívny. Charakterizuje úspešnosť testu pri vyhľadávaní chorých medzi všet-kými jedincami s pozitívnym výsledkom testu.

predpos = Nsp / (Nsp + Nfp).

Prediktívna hodnota negatívneho výsledku, negatívna prediktívna hodnota (negative predictive value), predneg – udáva pravdepodobnosť, že daný jedinec bude diagnostikovaný ako zdravý, ak je výsledok testu negatívny. Ukazuje úspešnosť testu pri vyhľadávaní zdravých medzi všetkými jedincami s negatívnym výsledkom testu.

predneg = Nsn / (Nsn + Nfn). Diagnostická citlivosť charakterizuje výsledky testu v skupine chorých a diagnostická špecific-kosť charakterizuje výsledky testu v skupine zdravých jedincov. Ak sa tieto charakteristiky určia


Glosár G22

spracovaním údajov získaných z veľkého súboru jedincov, sú pre daný test konštantné (v prípa-de, že sa nezmení test ani kritériá hodnotenia výsledkov).

Posudzovanie spojitých údajov

Ideálna metóda: o výsledky populácie zdravých a chorých jedincov sa neprekrývajú, o na základe stanovenia koncentrácie umožňuje oddeliť populáciu zdravých a chorých, o citlivosť a špecifickosť metódy je 1 (obr. 5-1, všetci zdraví aj chorí sú zaradení správne), o s takouto metódou sa v praxi stretávame len výnimočne.

Zdraví

Väčšina metód:

o výsledky populácie zdravých a chorých jedincov sa prekrývajú (obr. 5-2), o citlivosť a špecifickosť testu závisí od určenia takej hodnoty testu (koncentrácie), od

ktorej sa bude výsledok testu považovať za pozitívny, teda od určenia hranice rozhodovania. Posúvaním hranice rozhodovania medzi referenčnými a patologickými hodnotami v oblasti hraničných koncentrácií, možno meniť citlivosť a súčasne aj špecifickosť testu.. Ak sa citlivosť určitého testu zvyšuje posúvaním hranice doľava, znižuje sa zároveň jeho špecifickosť a naopak. Zvýšenie oboch charakteristík možno dosiahnuť len zamenením samotného testu za test s vyššou informačnou váhou.

Vzťah medzi diagnostickou citlivosťou, nešpecifickosťou (1-spec) a sériou hodnôt hraníc rozhodovania vyjadruje tzv. ROC krivka (receiver characteristic operating curve) opisujúca operačnú charakteristiku testu (obr. 5-3).

f(x)

c

b

parameter

a

Zdraví f(x) Zdraví

parameter

Chorí

d Obr. 5-2 Zmena citlivosti a špecifickosti metódy posúvaním hranice rozhodovania Hranica rozhodovania (označená šipkou):

metóda má vysokú citlivosť, b - metóda má vysokú špecifickosť, c - kompromis medzi citlivosťou a špecifickosťou, d - nevhodná metóda

a -

Obr. 5-1 Ideálna laboratórna metóda s citlivosťou aj špecifickosťou rovnou 1 Šípka * označuje hranicu rozhodovania, f(x) je hustota pravde-podobnosti, ktorú možno pre dostatočne veľké súbory aproximo-vať relatívnou početnosťou, parameter testu môže byť napr. koncentrácia

*

f(x) Chorí

parameter


Glosár G23

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

sens

1-spec

Obr. 5-3 Krivka operačnej charakteristiky testu (ROC krivka)

ROC krivka umožňuje zvoliť hranicu rozhodovania tak, aby sa v súlade s cieľmi diagnostického procesu dosiahla:

o maximálna citlivosť testu (zachytiť všetkých chorých), o maximálna špecifickosť skúšky (vylúčiť všetkých zdravých), o optimálna kombinácia detekcie ochorenia a vylúčenie choroby. Z krivky sa môže určiť,

kde sú minimalizované chyby − počet falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsled-kov. Je to v bode, kde má smernica operačnej charakteristiky hodnotu rovnú pomeru počet zdravých/počet chorých.

ROC analýza umožňuje:

o posúdiť diagnostickú úspešnosť metódy, o porovnať niekoľko laboratórnych metód a vybrať z nich najlepšiu. Pri porovnávaní

viacerých metód bude najlepšia taká metóda, ktorá uzatvára najväčšiu plochu medzi operačnou charakteristikou a priamkou spájajúcou body (0,0) a (1,1).

5.2 Charakteristiky analytickej metódy Hlavnou úlohou použitia analytických metód v laboratóriu je produkovanie analytických výsledkov, ktoré sú porovnateľné s výsledkami získanými v iných laboratóriách a inými metódami. To možno dosiahnuť, ak použité analytické metódy majú zodpovedajúce metrologické charakteristiky, ako sú: zhodnosť, presnosť, správnosť, selektivita/špecifickosť, kalibrácia a nadväznosť, linearita, citlivosť, koncentračný rozsah, medza detekcie a medza stanovenia, výťažnosť, vplyv matrice a neistoty výsledkov analýz. Tieto charakteristiky sa zisťujú v procese validácie metód pri ich vývoji alebo zavádzaní do laboratórií. V regulovaných oblastiach ako je zdravotníctvo, farmácia a potravinárstvo sa uprednostňujú normované metódy, ktoré sa považujú za validované, hoci pri ich zavádzaní do laboratória je žiaduca aspoň ich


Glosár G24

čiastočná validácia. Okrem uvedených charakteristík sú prirodzene významné aj také vlastnosti analytickej metódy, ako použiteľnosť metódy, informačná obsahovosť a informačný výkon metódy, náročnosť úpravy vzorky, obsluhy a údržby prístrojov a zariadení, doba trvania analýzy a výsledná cena analýzy.

Presnosť (accuracy) je tesnosť zhody medzi výsledkom merania a prijatou referenčnou hodno-tou. Súvisí so systematickou a náhodnou chybou merania.

Zhodnosť (precision) je tesnosť zhody medzi nezávislými výsledkami meraní získanými pri vopred špecifikovaných podmienkach. Zhodnosť závisí len na rozdelení náhodných chýb, nemá vzťah ku skutočnej hodnote. Miera zhodnosti sa počíta ako smerodajná odchýlka výsledkov.

Správnosť (trueness) je tesnosť zhody medzi priemernou hodnotou získanou z veľkého radu výsledkov meraní pri vopred špecifikovaných podmienkach a prijatou referenčnou hodnotou. Súvisí len so systematickou chybou merania.

Prijatá referenčná hodnota je konvenčne pravá referenčná hodnota, ktorou môže byť: o teoretická hodnota, o konsenzuálna alebo certifikovaná hodnota založená na experimentálnych prácach

národných alebo medzinárodných organizácií, o očakávaná hodnota meranej veličiny, tzn. stredná hodnota špecifikovaného základného

súboru meraní.

Vychýlenie, systematická chyba (bias) je rozdiel medzi priemernou hodnotou výsledkov meraní a prijatou referenčnou hodnotou.

Opakovateľnosť (repeatability) je zhodnosť v podmienkach opakovateľnosti.

Podmienky opakovateľnosti sú podmienky, pri ktorých sa nezávislé výsledky meraní získajú tou istou metódou s identickými vzorkami, v tom istom laboratóriu, tým istým operátorom pri použi-tí toho istého vybavenia počas krátkeho časového rozpätia.

Reprodukovateľnosť (reproducibility) je zhodnosť v podmienkach reprodukovateľ-nosti.

Podmienky reprodukovateľnosti sú podmienky, pri ktorých sa výsledky meraní získajú rovnakou metódou s identickými vzorkami, v rôznych laboratóriách, rôznymi operátormi používajúcimi rôzne zariadenia.

Neistota merania (uncertainty of measurement) je parameter, ktorý súvisí s výsledkom merania. Charakterizuje rozptyl hodnôt, ktoré možno dôvodne priradiť meranej veličine. Parametrom môže byť smerodajná odchýlka, prípadne je násobok, alebo šírka intervalu spoľahlivosti. Neistota merania pozostáva z mnohých zložiek. Niektoré z nich možno odvodiť zo štatistického rozdelenia výsledkov opakovaných meraní a vyjadriť smerodajnou odchýlkou (neistota typu A). Ostatné zložky, ktoré sa tiež charakterizujú smerodajnou odchýlkou, sa získajú z predpokla-daných rozdelení pravdepodobnosti na základe skúseností (neistota typu B). Na rozdiel od chyby sa neistota nemôže použiť na korekciu výsledku.

Chyba (error) je definovaná ako rozdiel medzi individuálnym výsledkom a skutočnou hodnotou. Je to jednoduchá hodnota, ktorá sa môže použiť na korekciu výsledku. Chyba sa skladá z dvoch zložiek: náhodnej a systematickej.


Glosár G25

Kalibrácia (calibration) je súbor činností, ktorými sa za špecifikovaných podmienok stanoví vzťah medzi hodnotami veličín, ktoré sú indikované prístrojom alebo meracím systémom a zodpovedajúcimi známymi hodnotami meranej veličiny, ktoré sú realizované etalónmi (štan-dardmi). Výsledkom kalibrácie je kalibračná funkcia opisujúca meraný signál y ako funkciu známych hodnôt meranej veličiny y = f(c). Kalibrácia alebo použitie metrologického etalónu (štandardu) spája laboratórium s národným (medzinárodným) referenčným meracím systémom. Toto spojenie sa nazýva nadväznosť.

Nadväznosť (traceability) je vlastnosť výsledku merania alebo hodnoty štandardu, pomocou ktorej sa tieto môžu vztiahnuť na vhodný etalón (štandard, v klinickej chémii obvykle medziná-rodný štandard) neprerušovaným reťazcom porovnávaní s určenými neistotami.

Analytická citlivosť (analytical sensitivity) je podiel zmeny meraného analytického signálu a zodpovedajúcej zmeny koncentrácie alebo množstva analytu. Matematicky je vyjadrená ako prvá derivácia kalibračnej funkcie y = f(c) podľa c a pre lineárnu závislosť je to smernica kalib-račnej priamky.

Medza detekcie (limit of detection) je najnižšia koncentrácia analytu, pri ktorej je analytický signál štatisticky významne odlišný od šumu.

Medza stanovenia (limit of determination) je najnižšia koncentrácia analytu, pre ktorú je relatívna smerodajná odchýlka predikcie z kalibračného modelu dostatočne malá (obvykle 10 %).

Linearita (linearity) je schopnosť metódy poskytovať analytický signál, ktorý je lineárnou funkciou množstva/koncentrácie analytu.

Lineárny rozsah (linear range) je rozsah koncentrácií, v ktorom je analytický signál lineárnou funkciou množstva/koncentrácie analytu.

Výťažnosť (recovery) udáva pomer množstva (koncentrácie) analytu získaného danou analy-tickou metódou k prijatej referenčnej hodnote.

Analytická selektivita (analytical selectivity) je schopnosť metódy presne a správne určiť analyt aj v prítomnosti interferujúcich látok (matrice).

Analytická špecifickosť (analytical specificity) je schopnosť meracieho postupu stanovovať len tú meranú veličinu, ktorá má byť stanovená.

Robustnosť metódy (ruggedness, robustness) je schopnosť metódy poskytovať prijateľné výsledky meraní aj v prípade malých odchýlok v meracom postupe alebo zložení vzorky.


Glosár G26

6 MANAŽÉRSTVO KVALITY Hodnotenie kvality (Quality Assessment, QAs):

o slúži na monitorovanie a preukazovanie presnosti (zhodnosti a správnosti) analytického systému,

o vykonáva sa vlastnými prostriedkami laboratória – vnútorné hodnotenie kvality, o vykonáva sa za účasti externých inštitúcií – externé hodnotenie kvality.

Vnútorné hodnotenie kvality (Internal Quality Assessment, IQAs, Internal Quality Control, IQC) využíva na preverovanie správnosti a zhodnosti (opakovateľnosti) laboratóriom produkovaných výsledkov:

o opakovanie meraní/analýz, o prídavkové metódy, o analýzu modelových štandardov, o certifikované referenčné materiály, o periodickú analýzu kontrolných vzoriek (interných referenčných materiálov), o rôzne druhy regulačných diagramov, o zámenu pracovníkov alebo prístrojov, o porovnávacie (aj primárne) a kontrolné analytické metódy, o rozbor neúspešných analýz.

Externé hodnotenie kvality (External Quality Assessment, EQAs, External Quality Control, EQC) je zamerané najmä na preverovanie správnosti spoluprácou s inými laboratóriami, a to:

o výmenou analyzovaných vzoriek, o analýzou referenčných materiálov pochádzajúcich z renomovaných (expertných)

laboratórií, o účasťou na medzilaboratórnych porovnávacích analýzach zameraných na hodnotenie

vlastností jednej alebo viacerých metód analýzy, o účasťou na medzilaboratórnych analýzach zameraných na priradenie konsenzuálnej

hodnoty referenčnému materiálu, o účasťou na medzilaboratórnych testoch spôsobilosti (Proficiency Tests) zameraných na

hodnotenie kompetentnosti laboratórií pri používaní určitej metódy alebo rôznych metód.


Glosár G27

6.1 Kontrola stability a presnosti analytickej metódy

použitím kontrolných vzoriek Kontrolná vzorka

o musí mať podobné vlastnosti ako vzorka pacientov, o musí byť stála, s minimálnou zmenou koncentrácie od podielu k podielu, o jej množstvo musí vystačiť minimálne na pol roka.

Postup kontroly stabili ty a presnosti

1. Opakované merania kontrolnej vzorky o predpokladá sa normálne rozdelenie dát, o z opakovaných meraní kontrolnej vzorky v priebehu 20 dní, pričom kontrolná vzorka sa

meria raz za deň, sa po vylúčení odľahlých výsledkov vypočíta aritmetický priemer a smerodajná odchýlka s,

o ak sa použije viac kontrolných vzoriek (napr. dve o rôznej koncentrácii analytu), potom sa každá vzorka analyzuje raz denne v priebehu 20 dní a pre každú z nich sa po vylúčení odľahlých výsledkov vypočíta aritmetický priemer a smerodajná odchýlka.

2. Pre každú kontrolnú vzorku sa pripraví regulačný diagram (obr. 6-1) (control chart, Shewhart charts, Levey-Jennings charts).

o diagram znázorňuje koncentráciu na y osi vs čas (poradové číslo merania) na osi x. o do diagramu sa vynesú hodnoty aritmetický priemer ±1s, ±2s, ±3s ako horizontálne čiary

rovnobežné s osou x. o rovnobežky ±2s sa nazývajú horná a dolná varovná medza. o rovnobežky ±3s sa označujú ako horná a dolná regulačná medza.

Obr. 6-1 Regulačný diagram

+ 3s

- 3s Dolná regulačná medza

Horná regulačná medza

+ 2s

+ 1s

x

- 1s

- 2s

3. Regulačný diagram sa použije na kontrolu meraní vzoriek pacientov.

o s každou sériou vzoriek pacientov sa meria kontrolná vzorka (napr. po každých 20-30 vzorkách pacientov),

o do regulačných diagramov sa vynesú výsledky meraní príslušných kontrolných vzoriek.

0 10 20 30 Dni/meranie

Dolná varovná medza

Horná varovná medza


Glosár G28

Rozptyl hodnôt meraní kontrolných vzoriek poskytuje informácie o stupni zhodnosti (stability) meraní:

o ak hodnoty nepresahujú ±2s a sú rovnomerne rozptýlené okolo osi x, meranie je zhodné (stabilné) a v limite kontroly kvality,

o ak hodnoty majú v intervale ±2s stúpajúcu alebo klesajúcu tendenciu, niektorá časť postupu sa zhoršuje,

o ak sú viaceré hodnoty nad alebo pod osou x v rámci +2s alebo -2s, ide o systematickú chybu,

o ak niektorá hodnota presiahne limit ±2s (varovné medze), nastalo porušenie varovného pravidla, čo môže aj nemusí byť dôvodom k odmietnutiu celej série. Rozhodnutie je na zodpovednom pracovníkovi. Túto situáciu je potrebné chápať ako podnet na preverenie celého analytického systému,

o ak niektorá hodnota presiahla limit ±3s (regulačné medze), nastalo porušenie regulačného pravidla, čo je vždy dôvodom na odmietnutie celej série meraní. Nasleduje preverenie celého analytického systému, odstránenie chýb, rekalibrácia a zopakovanie celej série meraní.

Na hodnotenie stability série (niekoľkých sérií) meraní sa používajú Westgardove pravidlá . 6.2 Kontrola správnosti analytickej metód pomocou

referenčných materiálov Referenčný materiál

o je materiál alebo látka, ktorej jedna alebo viac vlastností sú dostatočne dobre známe (homogénne) na to, aby ich bolo možné použiť na:

- kalibráciu prístroja na overenie analytickej metódy, - na priradenie hodnôt určitých veličín skúmaným materiálom.

o je charakterizovaný: - referenčnou hodnotou meraného/kontrolovaného parametra, - povolenou odchýlkou od referenčnej hodnoty, - povolenou hodnotou nezhodnosti (smerodajná odchýlka).

Pri kontrole správnosti sa určí priemerná hodnota z 10 meraní referenčného materiálu, ktorá by mala byť v intervale uvedenej referenčnej hodnoty. Výsledky vyšetrenia sú akceptovateľné ak: o výsledky meraní kontrolných vzoriek nepresahujú ±2s, o výsledky meraní referenčného materiálu nepresahujú povolený limit, o smerodajná odchýlka s opakovaných vyšetrení tej istej vzorky nepresahuje viac ako 10 %

intervalu referenčných (normálnych) hodnôt.


Glosár G29

6.3 Medzilaboratórne porovnávacie merania Externé hodnotenie kvality (EQAs)

o je nezávislé a objektívne overenie odbornej spôsobilosti laboratória na základe porovna-nia výsledkov merania rovnakých kontrolných materiálov distribuovaných externou orga-nizáciou vykonaných na určitom mieste s výsledkami získanými na iných miestach,

o vykonáva sa cyklicky s materiálmi (vzorkami) zhotovenými len pre účely EQAs, o poskytuje laboratóriám informácie o úrovni kvality ich výkonov, o má charakter výlučne informačný a poradný, nie kontrolný, o výsledky konkrétneho laboratória sú dôverné.

Ciele EQAs

o celkové zlepšenie analytickej činnosti a dosiahnutie maximálnej zhody výsledkov meraní rovnakých vzoriek v rôznych laboratóriách,

o štandardizácia a vývoj referenčných metód a materiálov, o definovanie cieľových hodnôt (Target Value, TV), o určenie medze prípustných odchýlok (kontrolných, tolerančných limitov), o identifikácia laboratórií s neuspokojivými výsledkami, o celkové zlepšenie laboratórnej diagnostiky, výchova a výučba.

Kvalita výsledkov EQAs je daná ich polohou a rozptylom. Poloha je definovaná cieľovou hodnotou (Target Value, TV). Hodnotí sa teda miera zhody výsledku laboratória s cieľovou hodnotou.

Cieľová hodnota môže byť:

o určená referenčnou metódou (Reference Method Value, RMV), o určená inou metódou (Assigned Value, Consensus Target Value).

Kontrolný (tolerančný) limit externého posudzovania kvality (TE EQAs) o je povolená percentuálna odchýlka meraní účastníkov od cieľovej hodnoty meranej veli-

činy, o je celková chyba merania akceptovaná v programe EQAs.

Pre akceptovanie výsledkov laboratória v programe EQAs platí, že:

⏐x - TV⏐ ≤ TE EQAs,

kde x je výsledok merania laboratória a TV je cieľová hodnota. Jedným z problémov v harmonizácii európskych systémov kvality sú rozdielne tolerančné limity. V Európe sa kontrolné (tolerančné) limity určujú dvojakým spôsobom:


Glosár G30

o Štatistickým hodnotením výsledkov každého kruhového pokusu sa určia tzv. variabilné tolerančné limity. Variabilný tolerančný limit je vymedzený intervalom (aritmetický priemer meraní skupiny laboratórií ±2s).

o Využitím kritérií založených na biologickom rozptyle, názoroch odborníkov a súčasnom stave techniky alebo na ich kombinácii sa získajú tzv. pevné (biologické, empirické) tolerančné limity.

Pevné biologické tolerančné limity sa vypočítajú z inter- a intra-individuálnych rozptylov (CVI a CVG):

TE = 1,65 · 0,5 CVI % + 0,25 (CVI2 + CVG2)1/2 % pre 95 % interval spoľahlivosti,

TE = 2,33 · 0,5 CVI % + 0,25 (CVI2 + CVG2)1/2 % pre 99 % interval spoľahlivosti.

Pevné empirické tolerančné limity sú definované empiricky (dohodou) ako percentuálna maxi-málna povolená hodnota TE pri rešpektovaní súčasného stavu úrovne analytických meraní

Rozptyl je definovaný hodnotou medzilaboratórnej reprodukovateľnosti.

Hodnota medzilaboratórnej reprodukovateľnosti môže byť zvolená: o pevne ako cieľová hodnota smerodajnej odchýlky s (CV %), o vypočítaná z aktuálnych výsledkov kontrolného cyklu.

Použitie pevnej, definovanej cieľovej hodnoty s (CV %) je principiálne lepšie, pretože môže odrážať klinické požiadavky, ale jej stanovenie je problematické. Väčšina programov EQAs pou-žíva druhý spôsob stanovenia reprodukovateľnosti.

Štatistické vyhodnotenie testu:

o vypočíta sa vychýlenie ako rozdiel (x – TV), o vychýlenie sa porovná s cieľovou hodnotou medzilaboratórnej reprodukovateľnosti (sme-

rodajnej odchýlky s alebo koeficientom variácie CV), o najjednoduchšie porovnanie umožňuje výpočet hodnoty tzv. Z-skóre:

Z = (x - TV)/s = d %/CV , kde d % = (x - TV)/TV×100,

o na základe vypočítanej hodnoty Z-skóre sa uvedie nasledujúce hodnotenie účastníkov programu EQAs:

Z < 1,0 veľmi dobrý výsledok Z = 1 – 2 akceptovateľný výsledok Z = 2 – 3 problematický výsledok Z > 3 neakceptovateľný výsledok.

Výhody použitia Z-skóre o veľmi jednoduchým a názorným spôsobom ilustruje analytické schopnosti laboratória

a ich prípadné zmeny v čase, o dobre odhaduje vzájomné proporcie systematických a náhodných chýb meraní (systema-

tická chyba v čitateli, náhodná chyba v menovateli príslušného výpočtového vzťahu), o rozpoznáva negatívny a pozitívny charakter systematickej chyby.


Glosár G31

7 ANALYTICKÉ METÓDY Rozdelenie metód podľa metrologickej kvality Definičná (primárna) metóda

o je metóda s najvyššou úrovňou analytickej spoľahlivosti (najvyššou metrologickou kvali-tou), pre ktorú možno vyjadriť úplný rozbor neistôt v SI jednotkách,

o má opodstatnený a dobre overený teoretický základ, o je dôkladne experimentálne overená, o výsledky merania majú zanedbateľnú systematickú chybu a vysoký stupeň presnosti, o tvoria základ správnosti v chemickej analýze, o využívajú sa hlavne na získanie hodnôt primárnych referenčných materiálov, o v súčasnosti je to gravimetria, coulometria, odmerná analýza a metóda izotopového

zrieďovania v hmotnostnej spektrometrii (ID-MS), o v klinickej chémii sa používa hlavne ID-MS a ID-GC, o boli vypracované pre anorganický fosfor, Na, K, Ca, Mg, glukózu, cholesterol, kreatinín,

kyselinu močovú, močovinu a triacylglyceroly. Referenčná metóda

o je dôsledne preskúmaná metóda, ktorá jasne a presne opisuje potrebné podmienky a postupy pre meranie jednej alebo viacerých hodnôt vlastnosti, o ktorých sa dokázalo, že ich presnosť vyhovuje zamýšľanému použitiu metódy,

o môže sa použiť na posúdenie správnosti iných metód pre rovnaké merania a na charakterizovanie sekundárneho referenčného materiálu,

o nízka náchylnosť na rušivé vplyvy (interferencie), o v klinickej chémii sa využívajú predovšetkým na validáciu rutinných metód

a charakterizáciu referenčných materiálov, o stanovenie celkového obsahu bielkovín v štandardoch metódou podľa Kjeldahla, o niektoré sa používajú aj rutinne.

Odporučená metóda (podľa IFCC)

o má mať opísanú logickú postupnosť činností, ktoré sú súčasťou postupu merania, tak ako boli definované a odporučené príslušnou pracovnou skupinou,

o napr. stanovenie enzýmov AST, ALT, ALP, LD podľa postupov spracovaných enzýmo-vým panelom expertov IFCC.

Rutinné metódy

o sú obvykle porovnávacie metódy, o metódy založené na porovnávaní hodnoty meranej veličiny so známou hodnotou tej istej

veličiny, o namerané výsledky sa vyznačujú dobrou presnosťou, ale ich správnosť je nižšia.


Glosár G32

Rozdelenie metód podľa zamerania a účelu Akútne (statimové) vyšetrenie

o určené na rýchlu orientáciu lekára, o stanovenie jedného alebo skupiny hlavných analytov (z klinického pohľadu), o lekár potrebuje výsledky čo najskôr, o laboratórium musí vykonávať non-stop.

Základné (screeningové) biochemické vyšetrenie o na určenie predbežnej diagnózy v neakútnych prípadoch, o jeho úlohou je obsiahnuť čo možno najviac metabolických funkcií, o vyšetrenie sa vykonáva zo séra.

Napr. - súbor obsahujúci základné analyty typické pre činnosť hlavných orgánov a funkcií napr. glukóza (diabetes), kreatinín alebo močovina (obličky), bilirubín, AST, ALT (pečeň), kreatínkináza a troponín (srdce), α-amyláza (slinivka), acidobázická rovnováha (pH krvi, pO2, pCO2), chloridy, Na, K, celková bielkovina, albumín. Pri vybočujúcej hodnote určitého analytu pri screeningu sa dodatočne vyžiada stanovenie ďalších analytov typických pre daný prípad.

Základné hematologické vyšetrenie

o využíva sa na určenie predbežnej diagnózy, o pozostáva z vyšetrenia krvného a základného vyšetrenia hemostázy.

Základné vyšetrenie moču

o semi-kvantitatívna analýza moču vykonávaná diagnostickými prúžkami, o vyšetrenie močového sedimentu.

Cielené (orgánové) vyšetrenie

o zamerané na zhodnotenie funkčného stavu určitého orgánu alebo systému.

Napr. vyšetrenie pečene ALT, AST/ALT, AST, GGT/AST, GGT, ALP a bilirubínu v sére a urobilinogénu a bilirubínu v moči, kardiologický súbor obsahuje stanovenie AST, CK, CK-MB, troponínu T, troponínu I, myoglobínu a LD.

Klinická chémia akútnych stavov (bedside monitoring, Point-Of-Care), POCT

o v blízkosti chorého, napr. pri lôžku pacienta, o je zameraná na sledovanie stability tzv. vnútorného prostredia pacienta (určenie pH krvi,

pO2, pCO2, Na, K, chloridy a hemoglobín), o POCT stanovenie glukózy, laktátu, funkcie trombocytov, kreatinínu, močoviny, choleste-

rolu, triacylglycerolov, troponínu T a I, myoglobínu, CK-MB, drog, alkoholu, tumorových markerov a iných.


Glosár G33

Samokontrola (selfmonitoring) pacientov o vykonáva sa mimo zdravotníckych zariadení, o najčastejšie stanovenie glukózy v plnej kapilárnej krv, o určenie tehotenstva testom poskytujúcim odpoveď áno/nie.

Terapeutické monitorovanie hladín lieč iv (therapeutic drug monitoring), TDM

o monitorovanie koncentrácie liečiv v klinických vzorkách v priebehu terapie, o špeciálne analyzátory.

Odhaľovanie zneužívania liečiv alebo užívania drog (drug of abuse)

o špeciálne analyzátory. 7.1 Spektrálne metódy 7.1.1 Molekulová absorpčná spektrometria v UV/VIS oblasti

o založená na meraní zoslabenia intenzity žiarenia vlnovej dĺžky 200 až 800 nm skúmanou vzorkou,

o kvantitatívna analýza: Bouguerov-Lambertov-Beerov zákon

Aλ = log (I0,λ /Iλ) = ελ b c

kde I0,λ je intenzita žiarenia vstupujúceho do absorbujúcej vrstvy Iλ je intenzita žiarenia po prechode touto vrstvou ελ je molový absorpčný koeficient absorbujúcej látky c je koncentrácia absorbujúcej látky b je dráha, ktorú lúč prechádza v absorbujúcom prostredí

Zákon platí pre monochromatické žiarenie a opticky číre zriedené (c < 0,01 mol/l) rozto-ky.

Odchýlky od linearity závislosti Aλ = f(c) môžu byť spôsobené: 1. λ ≠ konst 2. c > 0,01 mol/l 3. odrazom a rozptylom žiarenia

o na koloidných časticiach (zákal, lipemické sérum), o chyby sa prejavujú predovšetkým v UV oblasti.

4. fluorescenciou o veľkosť chyby a vlnová dĺžka závisia od usporiadania optickej časti spektrometra.


Glosár G34

Stanovenia v UV/VIS oblasti o priame - v praxi sa v podstate nevykonávajú, o založené na špecifickej chemickej reakcii medzi analytom a činidlom, pri ktorej

vzniká spektrofotometricky stanoviteľný produkt. Množstvo produktu sa sleduje mera-ním absorbancie v závislosti od času. Napr.:

Bilirubín + kyselina sulfanilová + NaNO2 + HCl červený azobilirubín. ⎯⎯⎯⎯⎯⎯ (kofeín)r akceleráto →

β-D-glukóza + O2 + H2O ⎯⎯→⎯GOD kyselina D-glukonová + H2O2.

R-NH2 + C6H5-OH + 2 H2O2 červené chinónimínové farbivo R-N=C⎯⎯→⎯POD 6H4=O + 4 H2O.

Absorpčná denzitometria

o princíp je rovnaký ako u absorpčnej fotometrie, riadi sa rovnakými zákonmi, o odlišuje sa v inštrumentálnom usporiadaní, o meria sa absorpcia žiarenia prechádzajúceho pevnou opticky priepustnou vrstvou, o získa sa grafický záznam (obr. 7-1), kde jednotlivé zložky rozdelenej zmesi sú v ideál-

nom prípade zaznamenané ako súmerné pásy tvaru Gaussovej krivky, o plocha pod jednotlivými krivkami je úmerná relatívnemu zastúpeniu jednotlivých zložiek

v stanovovanej vzorke, o využíva sa na detekciu bielkovín/lipoproteínov rozdelených plošnou chromatografiou/

elektroforézou, pri vyhodnocovaní diagnostických prúžkov, o problémom sú obmedzená priepustnosť vrstvy pevnej fázy, o pri vyhodnocovaní farebných reakcií na pevnej fáze je výhodnejšie využiť meranie

odrazeného žiarenia tzv. reflektometriu.

Obr. 7-1 Separácia bielkovín v sére plošnou elektroforézou a záznam z denzitometra

Elektroforéza

Albumín

Záznam z denzitometra

α1 α2 β γ


Glosár G35

7.1.2 Luminiscenčné metódy Luminiscencia

o emisia žiarenia pri prechode molekuly z excitovaného stavu do jej základného stavu, o energia na prechod do excitovaného stavu dodaná:

- elektromagnetickým žiarením (fotoluminiscencia − fluorescencia a fosforescencia) - teplom (pyroluminiscencia, termoluminiscencia) - chemickou reakciou (chemiluminiscencia) - elektrickým poľom (elektroluminiscencia, katódoluminiscencia) - energia biologických pochodov (bioluminiscencia).

V klinickej chémii má najväčší význam fluorescencia a chemiluminiscencia. Fluorescencia

o poskytuje ju značný počet endogénnych zložiek a mnoho liečiv, o citlivosť obvykle o niekoľko poriadkov vyššia než citlivosť spektrofotometrie, o relatívne nízka cena prístroja v porovnaní s inými metódami s podobnou citlivosťou.

Využitie fluorescencie

Kvalitatívna analýza o porfyríny (λEXC = 366 nm) v moči, o aromatické aminokyseliny fenylalanín (λEXC = 260 nm), tyrozín (λEXC = 275 nm) a

tryptofán (λEXC = 260-280 nm, λEM = 340 nm) v plazme, o fluorescencia fenylalanínu a tyrozínu silne zhášaná, pozoruje sa len fluorescencia zodpo-

vedajúca tryptofánu.

Kvantitatívna analýza o priama fluorimetria - využitie prirodzenej fluorescencie stanovovaných zložiek, o nepriama fluorimetria - založená na reakcii stanovovanej zložky s vhodným fluores-

cenčným činidlom (deriváty fluoresceínu a rodamínu, kumaríny a iné), o stanovujú sa aminokyseliny, katecholamíny, serotonín, histamín, porfyríny, bilirubín,

nukleotidy (ATP, ADP, NADH, NADPH), enzýmy (LD, AST, ALT, CK), hormóny, steroidy, vitamíny a mnohé liečivá.

Fluorescenčná imunoanalýza (FIA)

o fluorofory sa využívajú na označenie protilátok alebo antigénov. Časovo rozložená fluorescencia

o na excitáciu sa nepoužíva kontinuálne excitačné žiarenie, ale excitačný pulz (obr. 7-2), o fluorescenčné žiarenie analytov trvá podstatne dlhšie ako fluorescencia pozadia, o fluorescencia analytov sa meria až po vyhasnutí fluorescencie pozadia, o zvýši sa citlivosť stanovenia,

každá fluoreskujúca molekula vykazuje rozdielne parametre ∑I a Imax.


Glosár G36

Fluorescenčné detektory v separačných metódach

o v HPLC a CE, o výhodou je vysoká selektivita a citlivosť detekcie, o nevýhodou býva nutnosť priebežne meniť vlnovú dĺžku excitačného žiarenia.

Chemiluminiscencia

Výhody chemiluminiscencie o na excitáciu molekúl nie je potrebný zdroj žiarenia, o problémy súvisiace s rozptylom žiarenia alebo nestabilitou zdroja žiarenia sa tu nevysky-

tujú, o pozoruje sa nižší signál pozadia v porovnaní s fotoluminiscenciu, o nie je potrebné používať časovo rozloženú fluorescenciu, o luminometre využívajúce optické vlákna patria medzi najlacnejšie zariadenia, o sú známe mnohé chemiluminiscenčné činidlá (luminol, izoluminol a ich deriváty, derivá-

ty akridínu a peroxyšťavelanu).

Luminol, izoluminol a ich deriváty o v protogénnych rozpúšťadlách (voda, zmes vody a alkoholu), o rôzne kyslíkaté zlúčeniny (O2, peroxidy) oxidujú deriváty luminolu v prítomnosti kataly-

zátora (obr. 7-3), o katalyzátory - rôzne enzýmy (mikroperoxidáza, myeloperoxidáza, peroxidáza z chrenu,

kataláza), metaloproteíny (hemoglobín) a minerálne zložky (ozón, halogény, Fe3+, Co2+ a Cu2+ a ich komplexy),

o do reakcie môžu byť zahrnuté enzýmy produkujúce kyslíkaté deriváty (ALP, β-D-galak-tozidáza, β-glukozidáza, laktátoxidáza).

Obr. 7-2 Zmena intenzity I fluorescenčného žiarenia s časom v časovo rozloženej fluorescencii

Imax

0 Čas, μs Nový cyklus

Meranie ∑ I

Analyt

Pozadie

Excitačný pulz

I


Glosár G37

NH2 O

NHNH

O

NH2 O

O

OH

OH2O2 N2+ +2 +

peroxidáza+ hOH- + 3 H2O ν (λmax = 430 nm)

luminol 3-aminoftalát Obr. 7-3 Reakčná schéma luminolu

Deriváty akridínu eroxidu vodíka a silných zásad (obr. 7-4),

k, e pozadie nižšie), výsledkom je vysoká citlivosť

o žu na proteíny, čo je výhodné pri značení reaktantov v imunoanalýze.

o v prítomnosti po nie je potrebný katalyzátor reakcie, o výhodou je vysoký kvantový výťažoo malý signál pozadia (bez katalyzátora j

stanovení, ľahko sa via

N+

CH3

H2O2 CO2

OX

NCH3

O

+ + 2 + OH- + X-

derivát akridínu

+ hν

Obr. 7-4 Reakčná schéma derivátov akridínu

eriváty peroxyšťavelanu

díka za vzniku vysokoenergetických medziproduktov (obr. 7-5),

energie na akceptor (fluorescer),

ebiologické zdroje lumi-

o ťavelan sa vyberajú pre určitú aplikáciu nezávisle, účinnosť a flexibilita sú

o oré tvoria peroxid vodíka: cholínoxidáza, cholesterol-

Do oxidujú sa peroxidom voo medziprodukty samotné žiarenie neemitujú, o emisia žiarenia nastáva až procesom prenosuo akceptor v excitovanom stave je potom zdrojom luminiscencie, o v kombinácii s akceptorom sú deriváty šťavelanu najúčinnejšie n

niscencie, akceptor a šteda hlavné výhody tohto systému, využíva sa na detekciu enzýmov, ktoxidáza, xantínoxidáza, glukózaoxidáza.

C COO

O O

NO2

NO2NO2

O2NH2O2

akceptor

prenos energie

hνdonordioxyetándion

perylén

bis(2,4-dinitrofenyl)štavelan

Obr. 7-5 Reakčná schéma šťavelanu


Glosár G38

Optické senzory nejšie senzory v analýze biologických vzoriek,

álu, n v absorpcii, luminiscencii, rozptyle a odraze

o e pO2, pCO2, pH, Na, K, Ca, Cl, celkový hemoglobín, saturácia hemoglobínu

Optoda na 2 va

meranie pH využíva zmenu fluorescencie farbiva (acidobázického indikátora) imobilizovaného na

epriepustnú pre ióny a priepustnú

eranie Na, K, Ca a Cl využívajú rovnaké membrány ako iónovo-selektívne elektródy pre Na, K, Ca

aložené na princípe

1.3 Plameňová atómová emisná spektrometria (FAES)

o na stanovenie sodíka, draslíka, vápnika a lítia v biologických tekutinách, pomere 1:50 až

o riediaci roztok obsahuje aj povrchovo aktívnu látku (Brij 35) na zlepšenie atomi-

o sa riedi s LiCl alebo CsCl (spektrálne pufre),

1.4 Nefelometria a turbidimetria

o na stanovenie bielkovín (antigénov alebo protilátok) imunoprecipitačnými reakciami,

zníženie

o meraním žiarenia vzniknutého rozptylom (nefelometria),

o sú najpopuláro výhodou je nedeštruktívna analýza, o rýchle generovanie a načítavanie signo optické senzory založené na meraní zmie

žiarenia, stanovenikyslíkom založené na fluorescenčnej detekcii všetkých meraných parametrov (okrem hemoglobínu a saturácie hemoglobínu kyslíkom) pomocou fluorescenčných optod.

meranie parciálneho tlaku kyslíka pO je založená na meraní zhášania fluorescencie katiónového farbikyslíkom.

Optoda na povrchu optody v závislosti od zmeny pH. Na rozdiel od klasickej sklenej elektródy, táto optoda nepotrebuje referenčnú elektródu a je málo ovplyvňovaná nerovnakou iónovou silou roztoku.

Optoda na meranie parciálneho tlaku oxidu uhličitého pCO2 využíva membránu npre CO2, ktorá pokrýva optodu na meranie pH. pH optoda meria zmenu pH spôsobenú prenikajúcim CO2 cez membránu.

Optody na ma Cl obsahujúce naviac vhodné fluorescenčné farbivo. S rastúcou koncentráciou iónu intenzita fluorescencie farbiva rastie alebo klesá, podľa typu iónu. Ani tieto optoelektródy nepotrebujú referenčnú elektródu.

Meranie koncentrácie celkového hemoglobínu a saturácie hemoglobínu kyslíkom je zreflektancie (odraz) červeného a IČ žiarenia. Červené svetlo sa používa na meranie saturácie kyslíkom, IČ žiarenie na meranie celkového hemoglobínu.

7.

o vzorky (sérum, moč, punktát, obsah cysty) sa obvykle riedia vodou v 1:200, niekedyzácie, vzorka

o lítium má funkciu vnútorného štandardu.

7.

o imunoprecipitáty vznikajú v roztoku reakciou antigénov s protilátkami, o žiarenie sa absorbuje, rozptyľuje, odráža a časť žiarenia prechádza nezmenená, o zvyšovanie koncentrácie imunoprecipitátu spôsobuje nárast rozptylu a odrazu a

priepustnosti (transmitancie), množstvo precipitátu stanoviť:

meraním rozptylom zoslabeného žiarenia (turbidimetria).


Glosár G39

Nefelometria precipitátu sa stanoví meraním žiarenia vzniknutého rozptylom,

úč so smerom

o -100 nm → rozptyľujú UV/VIS takmer symetricky, a-

o na časticiach 1 000 nm rozptyľuje pod uhlom menším ako 10o, uhol

o pre nižšie koncentrácie.

efelometre oskytujúci žiarenie s vysokou intenzitou,

žiarenia pred dopadom na detektor,

tenzita rozptýleného žiarenia závisí od:

ozptýlené žiarenie meria, bsorpcia → použiť vyššie λ,

a medzi

urbidimetria

tenzita prechádzajúceho žiarenia, tého rozptýleného žiarenia,

stačuje menšie

o nm alebo 500-650 nm sa dosiahne maximálna turbidita bez vplyvu interfe-

o

o množstvoo svetelný tok rozptýleného žiarenia závisí od uhla, ktorý zviera primárny l

k detektoru rozptýleného žiarenia, rozpustné proteíny majú rozmery 1

o imunoprecipitáty majú veľkosť 250-1000 nm, zvyčajne sú väčšie ako vlnová dĺžka dopdajúceho žiarenia, asi 90 % žiarenia sa

o väčšie častice (nad 10 000 nm) rozptyľujú žiarenie pod uhlom 1o, čo výrazne znižujemerania, vhodnejšia

No zdroj po zložitý systém zosilnenia rozptylom vzniknutého o lúč žiarenia musí byť rovný → ako zdroje lasery s malou divergenciou lúča.

Ino počtu rozptyľujúcich častíc/objem, o veľkosti a tvaru častíc, o od uhla, pod ktorým sa ro znižovanie λ zvyšuje rozptyl, ale súčasne rastie aj ao empirický vzťah medzi pomerom toku žiarenia rozptýleného ku dopadajúcemu

koncentráciou častíc vo vzorke.

To meria sa ino technicky menej náročné než meranie vzniknuo zoslabené žiarenie predstavuje veľký podiel z dopadajúceho žiarenia → po

zosilnenie, pri 320-380 rencie napr. z proteínov, ktoré absorbujú pri 400-425 nm, výhodnejšia pre meranie vyšších koncentrácií,

o vzťah podobný Lambert-Beerovmu zákonu.


Glosár G40

7.1.5 Reflexná fotometria

o kvantitatívne vyhodnotenie chromatogramov, elektroforeogramov a diagnostických prúž-

o sa žiarenie odrazené od vyfarbenej časti pevnej podložky,

odrazeného toku žia-

ou metódou - porovnaním reflektancie skúmanej vzorky a referenčného mate-

o konštrukcia reflexných fotometrov býva rôzna podľa typu vyhodnocovaného materiálu.

.1.6 Hmotnostná spektrometria

motnostná spektrometria sa často používa v spojení s niektorou zo separačných metód, pričom

.2 Elektrochemické metódy

.2.1 Coulometrické titrácie

oulometrické titrácie (coulometria pri konštantnom prúde) a kvantitatívnu chemickú premenu

o inidlo sa generuje elektrolýzou v roztoku na pracovnej elektróde prechodom

o ovovanou látkou, ekvivalencie,

ýhody coulometrie oproti odmernej analýze:

odmerných roztokov, ožné automatizovať.

kov, meria

o meranie reflexie svetelných lúčov (reflektancie): absolútnou metódou - meria sa skutočný pomer dopadajúceho a renia, relatívnriálu,

7 Htáto kombinácia spája výhody moderných separačných metód − vysoká účinnosť separácie zložiek s výhodami hmotnostnej spektrometrie − možnosť identifikácie zložiek. Kombinácia plynovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou je jedna z najvýznamnejších analytic-kých metód na identifikáciu zložiek v zložitých biologických vzorkách. Využíva sa predovšet-kým v toxikológii, farmakológii a dopingovej kontrole. 7 7 C

o založené na meraní elektrického náboja potrebného nanalytu, titračné čkonštantného jednosmerného prúdu, titračné činidlo potom reaguje so stan

o meria sa čas od začiatku elektrolýzy do dosiahnutia boduo bod ekvivalencie sa určí potenciometricky alebo amperometricky.

Vo nie je potrebná príprava a štandardizáciao umožňuje analyzovať zafarbené a kalné roztoky, stanovenie je m


Glosár G41

Chloridometre ie chloridov v biologických vzorkách (sérum, moč, likvor, pot),

u V),

katóda,

y na indikáciu bodu ekvivalencie.

itračné činidlo (Ag+) vzniká na Ag anóde prechodom konštantného prúdu I: Ag → Ag+ + e.

Bod ekvivalencie možno indikovať:

entochloridová alebo iónovo-selektívna (na Ag+ alebo Cl-) elektróda,

é do AgCl) nastane

1 O RGANIZÁCIA A ÚLOHY KLINICKEJ CHÉMIE - stuba.sk · 2008. 9. 13. · Krv je suspenzia pevných...

Documents

Transcript of 1 O RGANIZÁCIA A ÚLOHY KLINICKEJ CHÉMIE - stuba.sk · 2008. 9. 13. · Krv je suspenzia pevných...