08. 脇田委員提供資料 190320肝炎対策推進協議会 - …HBV侵入受容体NTCP Yan H et...
31
Ｂ型肝炎ウイルスの感染複製増殖機構の 解明による創薬基盤形成に関する研究 第２３回肝炎対策推進協議会 平成３１年３月２７日 資料４
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Ｂ型肝炎ウイルスの感染複製増殖機構の解明による創薬基盤形成に関する研究
第２３回肝炎対策推進協議会
平成３１年３月２７日 資料４
Ｂ型肝炎ウイルスの感染複製増殖機構の解明による創薬基盤形成に関する研究
Pol
pgRNA
HBc cccDNA
rcDNA
3.5 kb pgRNA
HBx
capsid
recycle
SHBs MHBs
LHBs
１．初期感染過程ウイルス吸着から侵入、核への輸送の解析
２．遺伝子発現および転写機構の解析 ３．ウイルス蛋白質の解析
４．ウイルス複製増殖に関与する宿主因子の同定と解析
６．病原性発現機構に関する解析５．新たな実験系のの開発
Ｂ型肝炎ウイルスの感染複製増殖解析
７．新たな治療を目指した研究1
研究の概要
本研究はHBVの感染複製増殖機構の解明を目指す
HBVの生活環の各過程に関与する宿主因子を同定する
各過程を解析する実験系により、新規創薬標的を同定し、
そのスクリーニング系を樹立する
新規化合物のスクリーニングとその作用機序などの解析を
進める
他の研究班との連携を推進する
2
3
主な取り組み
• NTCPトランスポーター活性を阻害しないエントリー阻害剤の開発研究：特殊環状ペプチド、CsA誘導体、新規抗体など
• 逆転写酵素活性アッセイ系を利用した逆転写阻害剤スクリーニングを重点的に進める
• キャプシド阻害剤、新規核酸アナログ（非RT阻害）の臨床試験開始を目指す研究。企業との共同を開始。
• 新規抗HBVリード化合物について、合成展開により官能基最適化を図り、より高活性な抗HBV剤の開発を行う
• HBc/HBsワクチン療法の解析を進め、ワクチンとIFNおよび核酸アナログ併用による核酸アナログ離脱療法を確立する
• ヒトiPS細胞由来肝芽によるハイスループット創薬スクリーニング系を構築する
• HBV複製増殖機構の解明と関与する宿主因子同定、新規創薬標的の開発
Pol
pgRNA
rcDNA
吸着
HBx
MHBsLHBs SHBs
翻訳
逆転写
放出
cccDNA
cccDNA形成
3.5 kbpgRNA転写
侵入
脱殻
HBc翻訳 キャプシド形成
DNA 合成リサイクル
エンベロープ獲得核移行
Ｂ型肝炎ウイルスのライフサイクル（生活環）
肝細胞
4
B型肝炎ウイルス創薬標的
エントリー阻害剤の開発
逆転写酵素アッセイの構築と阻害剤探索
キャプシド阻害剤と新規核酸アナログの開発
HBs抗原およびHBc抗原による治療ワクチン
感染研 渡士
5
ウイルス培養系を用いた化合物スクリーニング
HepG2-hNTCP-C4 cellsHepaRG cells
HBV chemical libraries infection（HBsAg）
16 h
12 days
0
2
4
6Screening result
Recip
roca
l HBs
Ag
HBsAg <20%
Tsukuda et al. J Biol Chem (2015)
Kaneko et al. J Virol (2015)
Watashi et al. Hepatology (2014)
Iwamoto et al. BBRC (2014)Tsukuda et al. Hepatology (2017)Shimura et al. J Hepatol (2017)
Fukano et al. Front Microbiol (2019)
6
HBV侵入受容体NTCP
Yan H et al. eLife (2012)
HBV
NTCP
感染成立
・ 胆汁酸取り込みトランスポーター・ 肝細胞基底膜側に特異的に局在・ （推定） 7-9回膜貫通タンパク質
bile acids Na+Na+
HBV, HDV
NTCP NTCP
hepatocytes
Sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP/SLC10A1)
7
8
NTCPを標的としたin vitroスクリーニング
In vitroでのハイスループットスクリーニング
9
A) アルファスクリーン・アッセイでのスクリーニング
B
680 nm
Donor 520-620 nm
1O2
LHBsNTCP-His
Acceptor
High Signal
B
Donor
LHBs
NTCP-His
×Low Signal
Acceptor
CsA
(mM)
compounds compounds
100
80
60
40
20
0
96 compounds
分子相互作用
1536 compounds
4%
Saso et al. BBRC (2018)
横浜市立大学・医 梁 明秀 先生セルフリーサイエンス社との共同研究
Small molecules screening using AlphaScreen① AlphaScreen(LHBs-NTCP)
② HBV infection
compound
Bio HisLHBs NTCP
020406080
100120
rapa
myc
in
cycl
ospo
rin A
flurb
ipro
fen
cont
rol
Alph
aScr
een
sign
al (%
)
red: HBcblue: nucleus
control cyclosporin A
rapamycin
10
16 blocks
duplicate
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
……
compounds
Chemical array
B) 化合物アレイによるスクリーニング
incubation compounds
His-NTCP
His-NTCP
NPD8716
74 hits / 29,707
理化学研究所長田 裕之 先生 との共同研究
11
NPD8716の構造活性相関解析
00.20.40.60.8
11.2
HB
s (fo
ld)
1 3435 64 67
#1: chenodeoxycholic acid#67: bile acid-derivative#34: NPD8716
Kaneko et al. Sci Rep (2018)
NPD8716
ONH
O
OO
O
HO
S
SPR (NPD8716-NTCP)
time (sec)
resp
onse
(RU
)
-200
20406080
-50 50 150 250
10 mM2 mM
0.4 mM
00.20.40.60.8
11.2
HB
s (fo
ld)
**** **
**
#34
#34control
red: HBc blue: DAPI (-)
O OO
R2
R3
R1
NH
OAAHO
O
CH3 >>> H
cyclohexanebenzene
S-Bz-Cys >>> S-Me-Cys
HBV infection
12
CY
CY
Cyclic peptide
1st : 高多様性ライブラリーヒット よりモチーフ同定2nd : フォーカストライブラリー10ペプチド同定（WL4, WD1, WL2）
recombinant NTCP
“RaPID system”
C) RaPIDシステムでのNTCP結合特殊環状ペプチド同定
WL4 Y V I W I W P N H F Y Y CWD1 Y F I I V MeG T W T W T W S CWL2 Y I W I W P G Y V I Y C
東京大学・理菅 裕明 先生 との共同研究
13
peptide IC50 (mM)CsA 3.17 ± 0.30WD1 0.85 ± 0.01WL2 2.54 ± 0.11WL4 0.66 ± 0.03
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
cont
rol
HB
s(fo
ld)
WL2WD1 WL4CsA
**
**
****
**
*
**
**
**
****
**
*
****
**
胆汁酸阻害活性のないHBV侵入阻害剤
[3 H]-t
auro
chol
ate
upta
ke(fo
ld)
00.20.40.60.8
11.21.4
N.S.
cont
rol
N.S.N.S.
CsA
** ** **
WD1 WL2 WL4
NTCP依存性胆汁酸取り込み
HBV感染阻害活性
WD1
Passioura et al. Cell Chem Biol (2018)14
エントリー阻害剤開発のまとめ
entry
Na+
NTCP
HBVbile acids
uptake
2
NTCP
HBV entry inhibitorsreported so far
HBV entryBile acid transport
peptidesWD1, WL2, WL4
hepatocyte
Passioura et al. Cell Chem Biol (2018)15
HB
s (fo
ld)
****
RTK
actin
00.20.40.60.8
11.2
HBV感染に関与する新規宿主因子の同定
si-c
ontr
ol
si-N
TCP
si-R
TK
Red : HBcBlue : nucleus
siRNA
HepG2-NTCP cells
72 h
wash out
HBs HBcHBV DNAs
12 days16 h
HBV
si-control
si-NTCP
si-RTK
00.20.40.60.8
11.2
cccD
NA
(fold
)
HBV DNAs
HBs
NTCP
****
si-c
ontr
ol
si-N
TCP
si-R
TK
HBV DNAs
16
si-c
ontr
ol
preS1-attachmentpreS1-internalization
0 h 4 h 8 h
Red : preS1-probeBlue : nucleus
Red : preS1-probe Blue : nucleus
si-R
TK
HepG2-NTCP cells
72 h
siRNA preS1-probe
30 min microscope1 h
wash out
4 oC
4-12 h
37 oCconfocalmicroscope
0 h
: time
RTK はHBVの細胞表面への結合ではなく細胞内への進入に関与する
0
10
20
30
40
50
60
cell
num
bers
(%)
0 h 4 h 8 h 12 h
si-RTK
si-control
N.S.
**
***
17
HBV感染におけるRTKの役割
HBV
NTCP
RTK
RTK
RTK inhibitor
00.20.40.60.8
11.2
**
HBV infection
cont
rol
RTK
in
hibi
tor
HB
s (fo
ld)
RTK: A new target for anti-HBV agents
18
B型肝炎ウイルス創薬標的
エントリー阻害剤の開発
逆転写酵素アッセイの構築と阻害剤探索
キャプシド阻害剤と新規核酸アナログの開発
HBs抗原およびHBc抗原による治療ワクチン
19
HBV逆転写酵素・RNase H阻害剤のハイスループットスクリーニング系の開発
50 mM TrisHCl, pH 8.54 mM MgCl21 mM DTT 0.02% Triton X-100RNase inhibitor0.2 mM HBV RNase H 68120 nM probe : 5'-(6-FAM)-rCrCrArCrArUrArGrGrCrUrArUrGrUrGrGrArArCTTTTGTTCCACATAGCCTATGTGG-(Eclipse)-3‘up to 0.6 % DMSO
42 ºC, 8 hr.
長寿研 豊田先生理研 古谷先生、小嶋先生
阻害剤濃度 (%)
RNase H阻害剤のスクリーニング系
20
B型肝炎ウイルス創薬標的
エントリー阻害剤の開発
逆転写酵素アッセイの構築と阻害剤探索
キャプシド阻害剤と新規核酸アナログの開発
HBs抗原およびHBc抗原による治療ワクチン
21
新規抗HBV薬の同定と開発（１）馬場昌範，外山政明，岡本実佳 （鹿児島大），渡士幸一，脇田隆字 （感染研）
• 新規核酸誘導体に抗 HBV 効果を同定した。
AR-II-04-26 MK-III-02-03
EC50: 0.77 ± 0.23 µMCC50: > 100 μM
EC50: 0.83 ± 0.36 µMCC50: 67.8 ± 7.7 µM
図１．HepG2.2.15.7 細胞における HBV 増殖阻害効果
OH OH
HO N
N
N
Br
OH OH
HO N
N
N
N
NH2I
• これらの薬剤は既存の逆転写酵素阻害（3TC やETV） とは異なり，感染細胞からの HBs およびHBe 抗原の産生を阻害する。
図２．HepG2.2.15.7 細胞における HBV 抗原産生阻害効果 図４．HBV 感染初代肝細胞における HBV 抗原産生阻害効果
0
50
100
0 0.01 0.1 1 10 100 AR-II-04-26
0
50
100
0 0.01 0.1 1 10 100 MK-III-02-03
3000 IU/ml 0
50
100
0 1 µM 100 nM
Cell viability HBV DNA in supernatant
3TC ETV IFN-α
% o
f con
trol
Concentration (µM)
(B)
• 新規薬剤はHBV感染初代肝細胞にも同様に抗 HBV効果を示した。
• 新規薬剤は HBV 感染初代肝細胞も HBV 抗原産生阻害した。
図３．HBV感染初代肝細胞における HBV 増殖阻害効果
22
新規抗HBV薬の同定と開発（２）馬場昌範，外山政明，岡本実佳 （鹿児島大），渡士幸一，脇田隆字 （感染研）
• 抗 HBV 作用機序は viral RNA の分解促進であることを明らかにした。
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
0 6 12 24
Arb
itrar
y U
nit o
f pre
geno
mic
RN
A (
fold
)
Time after actinomycin D treatment (hr)
control
AR-II-04-26
MK-III-02-03
control + Act.D
AR-II-04-26 + Act.D
MK-III-02-03 + Act.D
図３．cccDNA から転写される HBV RNA に対する効果
• 新規核酸誘導体は HBV RNAの分解を促進した。
Tet (1 µg/ml) - + + + + + + + + + +3TC - + + + + + + + + + +AR-II-04-26 - - - + - - + - - + -MK-III-02-03 - - - - + - - + - - +Day 14 18 20 20 20 22 22 22 24 24 24
cccDNA
RNApgRNA
sRNA
28S
18S
DP-rcDNADP-dslNA
• 新規核酸誘導体はcccDANから転写される HBV RNA を減少させた。
図４．新規核酸誘導体の HBV RNA 分解に対する効果
23
新規抗HBV薬の同定と開発（３）馬場昌範，外山政明，岡本実佳 （鹿児島大），岡村浩昭，鬼束聡明（鹿児島大）
渡士幸一，脇田隆字 （感染研）
• さらに抗 HBV 効果の強い誘導体を同定した。
EC50: 5.8 ± 0.9 µMCC50: > 100 μM
N
N N
NH
O
NH
Cl
Cl
% o
f con
trol
0
50
100
0 0.16 0.8 4 20 100Concentration (µM)
HBV DNA in su
0
50
100
0 0.16 0.8 4 20 100Concentration (µM)
% o
f con
trol
Cell viability
HBV DNA in sup.
EC50: 6.9 ± 1.9 µMCC50: > 100 μM
• カプシドタンパク質を標的とした in silico screening を実施した。
• In silico screening 2より選ばれた化合物から，選択的な抗 HBV 効果を有する化合物を同定した。
N
N N
NH
O
NH
Cl
EC50: 25.6 ± 13.4 µMCC50: > 100 μM
Cell viability
HBV DNA in sup.
Concentration (µM)
% o
f con
trol
Compound 2a
Compound 2b
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新規抗HBV薬の同定と開発（４）馬場昌範，外山政明，岡本実佳 （鹿児島大），岡村浩昭，鬼束聡明（鹿児島大学）
渡士幸一，脇田隆字 （感染研）
1 µM
3TC
100
nM G
LS4
Compound 2a (µM)
2 10 50 2 10 50
Capsid-associatedHBV DNA
HBc
GAPDH
Cont
rol
Capsid-associatedHBV RNA
Total RNApgRNA
sRNA
28S
18S
NB
CapsidPB
SB
WB
Compound 2b (µM)
• In silico screening より得られた化合物はカプシドタンパク質のみからのカプシド形成を阻害した。
• In silico screening より得られた化合物はHepG2.2.15.7細胞のカプシド形成を阻害した。
• In silico screening より得られた化合物はカプシド形成を阻害することで抗 HBV 効果を示したことが明らかとなった。
25
B型肝炎ウイルス創薬標的
エントリー阻害剤の開発
逆転写酵素アッセイの構築と阻害剤探索
キャプシド阻害剤と新規核酸アナログの開発
HBs抗原およびHBc抗原による治療ワクチン
26
NASVAC（HBcおよびHBs抗原ワクチン）による抗HBV，肝臓保護、抗肝硬変を目指す新規免疫療法
Fazle Akbar, MBBS, MD, PhDDepartment of Pathology,
Protein Science-Center, Ehime University Graduate School of Medicine
27
NASVACの成分: HBsAg and HBcAg (Each 100 ug/Administration)
投与経路：経鼻および皮下
NASVAC: A New Drug For Chronic Hepatitis B
28
NASVACの開発経過
Proof Of Concept, Animal Study, In vitro in CHB, 正常成人(愛媛大学およびキューバ )
（HBsAg単独ワクチンでは効果が得られず）
Phase I/II 臨床試験18名 慢性B型肝炎(バングラデッシュ未治療患者）
核酸アナログ既治療患者 (キューバ, アジア各国, 日本, バングラデッシュ)
1988-2006
2009
2012 Phase III 臨床試験160 名、 peg-IFNとの比較試験(バングラデッシュ未治療患者）
数カ国でNASVAC が薬剤として承認される
2013
2016
NASVACの有効性を核酸アナログ治療歴のある患者グループで確認試験
NASVACの有効性のメカニズムを解析
2016
29
B型肝炎創薬研究
HBワクチン、輸血のスクリーニングなどにより新規感染
は減ったが、多数のHBVキャリアが存在する
背景と現状
核酸アナログ単独治療によるウイルス排除は困難
新規抗HBV治療法の開発が必要目標：cccDNA排除、HBs抗原陰性
→ Drug free化
核酸アナログ＋新規抗HBV薬（特に抗cccDNA)
30
