Optičke metode analize

Metode u biološkim istraživanjima

Prof. Dr Slobodanka Pajević

Analitičke metode kod kojih se meri interakcija između energije (najčešće u vidu

elektromagnetskih zraka) i materije (atoma, molekula ili većih agregata).

Proces rasprostiranja oscilacija kroz elastičnu sredinu, naziva se talas.

Elektromagnetno zračenje - ne osciluju čestice već električno i magnetno polje, a amplitudi odgovara maksimum intenziteta električnog, odnosno magnetnog polja.

Elektromagnetno zračenje – svetlost :FOTON

talasno - korpuskularne osobine

Energiju elektromagnetnih zraka – fotona - definiše Planck-ov zakon:

Elektromagnetni talasi su transverzalni jer polja osciluju poprečno na pravac prostiranja.

Elektromagnetni talas je sinusna oscilacija čija je brzina prostiranja u vakuumu (c) nezavisna od talasne dužine i iznosi približno 3.108 m/s. Sinusne (harmonijske) oscilacije su one kod kojih se udaljenost oscilujuće tačke od ravnotežnog položaja menja po sinusnom zakonu u zavisnosti od vremena. Za karakterizaciju elektromagnetnih talasa koristi se i talasni broj (1/λ), koji predstavlja broj talasnih dužina zračenja po 1 cm. Energija elektromagnetnog talasa (fotona) iznosi E = hν = hc/λ , gde je h - Planckova konstanta (6,6256.10-34 J.s). Energija elektromagnetnih talasa zavisi direktno od frekvencije zračenja, a obrnuto je proporcionalna njegovoj talasnoj dužini.

Interakcija elektromagnetnog zračenja i materije odnosi se na promene energetskih stanja protona i elektrona materijalnog sistema.

Kada naelektrisana čestica (proton, elektron) usporava ili na bilo koji drugi način smanjuje ukupni iznos sopstvene energije, višak se oslobađa u vidu elektromagnetnog talasa.

Pri apsorpciji elektromagnetnog talasa naelektrisana čestica može da ubrza svoje kretanje ili da poveća iznos svoje potencijalne energije.

Pri utvrđivanju količine pojedinih atomskih i molekulskih vrsta u smeši, interakcija elektromagnetnog zračenja sa elektronima ima daleko širu primenu, dok interakcija s protonima pruža informacije koje su neposrednije vezane za strukturu hemijskih jedinjenja.

Pojava pri kojoj se elektroni iz spoljne orbitale atoma podižu na prvi viši energetski nivo apsorbujući zračenje, a potom se vraćaju u prvobitno stanje emitujući talas iste talasne dužine, naziva se rezonantna apsorpcija i emisija.

Rezonantna frekvencija apsorbovanog, odnosno emitovanog zračenja direktno zavisi od atomskog broja i predstavlja jedinstvenu karakteristiku svakog elementa, što nalazi značajnu primenu pri analizi (npr. teških metala) metodom atomske apsorpcione spektrometrije

Kako svetlost može da deluje na atome i molekule?

Atom

Kada je zračenju, umesto izolovanog atoma, izložen molekul, gde se zbog međusobnih odnosa atoma u molekulu pojavljuje niz novih mogućih energetskih stanja - elektronski energetski nivoi atoma se cepaju na više podnivoa, a pojavljuju se i novi (kao posledica promene kinetičke energije rotacije, uvijanja, vibracije i oscilovanja pojedinih delova molekula).

Molekul

Kako svetlost može da deluje na atome i molekule?

Za pobuđivanje molekula potrebna je manja energija zračenja, pa se molekulski spektri protežu od ultraljubičaste, preko vidljive, daleko u infracrvenu oblast elektromagnetnog zračenja.

Kako svetlost može da deluje na atome i molekule?

Molekul

Broj različitih energetskih stanja raste sa stepenom složenosti molekulske strukture, pa su emisioni i apsorpcioni spektri jedinjenja mnogo složeniji od atomskih, teže se tumače, ali i pružaju mnogo više informacija o strukturi jedinjenja.

Energetske promene u materijalnom sistemu (uzorku) su ekvivalentne energijama upotrebljenih elektromagnetnih zraka.

Energija zračenja pojedinih oblasti je različita pa će prema tome biti različite i promene koje se odigravaju pri interakciji zračenja pojedinih oblasti spektra sa atomima i molekulima ispitivane supstance.

Efekti zračenja iz pojedinih oblasti spektra elektromagnetnih talasa

Područje spektra Efekat na:

X-zraci elektrone iz donjih (K i L) orbitala

Daleko ultraljubičasto (UV) zračenje elektrone iz srednjih orbitala

Blisko ultraljubičasto zračenje valentne (spoljne) elektrone

Vidljiva svetlost Vidljiva svetlost valentne (spoljne) elektrone valentne (spoljne) elektrone

Blisko i srednje infracrveno (IR) zračenje molekulske vibracije

Daleko infracrveno zračenje molekulske rotacije i nisko- energetske vibracije

Mikrotalasi molekulske rotacije

1. Promene u elektronskom energetskom stanju atoma i molekula (bliski UV deo spektra 190-370 nm i VIS deo spektra 370-850 nm):

-Atomska apsorpciona spektrofotometrija (atomi

-UV i VIS spektrofotometrija i fotometrija (molekuli i molekulski joni)

-Plamena spektrofotometrija i fotometrija

-Spektrografija

-Kvantometrija

-Plazma emeisona spektrometrija

-Atomska fluorescentna spektrofotometrija (atomi i atomski joni)

-Spektrofluorimetrija i fluorimetrija (molekuli ili molekulski joni)

2. Promene u vibracionim (oscilacija) energetskim stanjima (vibracioni deo IC spektra od 2,5 µm do 50 µm)

-IC spektrofotometrija

3. Promene u energetskim stanjima spina nesparenih elektrona (deo mikrotalasnog spektra oko 0,01 m)

-elektron spin rezonantna spektrometrija (ESR)

-elektron paramagnetno rezonantna spektrometrija (EPR)

4. Promene u energetskim stanjima spina atomskih jezgara (deo radiotalsnog spektra oko 5 m)

-nuklearno magnetna rezonanca (NMR)

-nuklearna spin rezonantna spektrometrija (NSR)

Materijalni sistem (ispitivana supstanca) može kvantirano da menja svoju energiju skoro diskretno (slobodni atomi i

atomski joni) ili manje više kontinualno (u užem rasponu energija – molekuli ili u širem rasponu energija – asocijati).

Apsorpcione metode

Interakcijom energije el.mag. zraka i ispitivane

supstance dolazi do povećanja energije

ispitivane supstance - APSORPCIJA

Emisone metode

Smanjenje energije ispitivane supstance,

otpuštanjem energije u vidu el.mag. zraka

nakon pobuđivanja - EMISIJA

Metode rasipanja svetlosti

Efekti prelamanja svetlosti (refraktometrija) i obrtanja ravni

polarizovane svetlosti (polarometrija)

Spektar

Zavisnost ukupne energije (E) od kvantirane energije (ΔE) tj., raspodela apsorbance po

talasnim dužinama

Spektar

Zavisnost ukupne energije (E) od kvantirane energije (ΔE) tj., raspodela apsorbance po talasnim dužinama

Definisanje kvantirane energije (talasne dužine ili ekvivalentne veličine)

KVALITATIVNA ANALIZA

Apscise karakt.

tačaka – npr. maks.

pikova

Spektar

Zavisnost ukupne energije (E) od kvantirane energije (ΔE) tj., raspodela apsorbance po talasnim dužinama

Smanjenje ukupne energije ili merenje ukupne emitovane energije – površine zahvaćene pikovima – KVANTITATIVNA ANALIZA

Najjednostavniji spektri dobijaju se kod elektronskih energetskih

promena atoma i atomskih jona – prelazi između atomskih orbitala. Zbog male širine spektra atomski

spektar se označava kao

LINIJSKI SPEKTAR

Kod energetskih promena molekula i molekulskih jona dolazi do prelaza elektrona iz jedne u drugu molekulsku

orbitalu. Takođe dolazi do promena u vibracionim i rotacionim energijama molekula. Spekatar je

komplikovaniji i veće širine pa se označava kao

TRAKASTI SPEKTAR

Prema poreklu - nuklearni, atomski, molekulski, agregacioni

Prema nastanku - apsorpcioni, emisioni

Prema izgledu - neprekidni (kontinualni), diskretni (linijski, trakasti)

Prema opsegu talasnih dužina -radio-talasni, mikrotalasni, infracrveni, vidljivi, ultraljubičasti, gama

Prema obliku kretanja iz kojeg nastaje - rotacioni, vibracioni, rotaciono-vibracioni, elektronski

Spektar može biti:

Opšti model optičkih metoda analize

Kada zrak bele svetlosti prolazi kroz staklenu posudu ispunjenu tečnošću (nekom materijom), intenzitet izlazne svetlosti je manji od intenziteta ulazne. To smanjenje intenziteta nije podjednako za elektromagnetne talase svih talasnih dužina: neki talasi apsorbovaće se više od drugih, tako da se spektri upadnog i propuštenog zračenja razlikuju, zbog čega tečnost izgleda obojena – onom bojom koja odgovara spektru izlazne svetlosti.

Boja rastvora u propuštenoj svetlosti uvek je komplement apsorbovane boje.

Boja Boja

Intenzitet elektromagnetskog zracenja I0 smanjuje se prolazom kroz rastvor (ispitivanu supstancu) koja možeapsorbirati zracenje. Smanjenje intenziteta zavisi od koncentracije supstance (c) koja apsorbuje elektromagnetno zračenje, debljine sloja (svetlosnom putu kroz uzorak), molarnom apsorpcionom koeficijentu, specificnom za svaku supstancu (menja se sa talasnom dužinom). Smanjenje intenziteta upadnog zračenja pre i posle prolaza kroz uzorak definisali su Lambert i Beer zakonom apsorpcije.

log I0/I = A = • l • c

Za kvantitativna određivanja optičkim apsorpcionim tehnikama služi Lambert – Beer-ov zakon

Apsorpcija pri propuštanju monohromatskog zračenja kroz rastvor neke supstance kvantitativno je iskazana Lambert-Beerovim zakonom:

Relativno smanjenje intenziteta upadnog zračenja (-dI / I) je proporcionalno (k=const) broju apsorbujućih molekula (n), koje zrak na svom putu sreće. I0 označava intenzitet upadnog, a It intenzitet propuštenog zračenja.

Izraz (1), iskazan u tzv. diferencijalnom obliku, integrisanjem i transformisanjem, dobija oblik:

Za kvantitativna određivanja optičkim apsorpcionim tehnikama služi Lambert – Beer-ov zakon

It

Lambert – Beerov zakon – osnova za kvantitativnu analizu

Pod uslovom da ova jednostavna jednačina se transformiše u:

Kada se prirodni logaritam svede na dekadni preko relacije:

Specifični koeficijent apsorbancije

– veza između apsorbance i koncentracije supstance –

je apsorbancija rastvora debljine 1 cm koji sadrži 1 g supstance u 100 ml, dok je molarani koeficijent to isto sa koncentracijom 1 mol u 1 l

Greška merenja

Greška je najmanja kada je apsorbanca A=0,4343, a prihvatljiva u rasponu apsorbance od A=0,2 do A=0,8

FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

“KOLORIMETRIJA”

Apsorpciona tehnika

Kvantitativna određivanja (primenom Lambert-Beer-ovog zakona)

Merenje apsorbance uz prethodno eksperimentalno definisanu funkcionalnu vezu apsorbance (ili transimisije) i koncentracije

Analiziraju se molekuli koji ulaze u interakciju sa UV i VIS delom spektra

Optički filteri

Kolorimetrijskim metodama se određuju koncentracije obojenih rastvora koji apsorbuju u vidljivom ili bliskom UV delu spektra.

Boja koju ima rastvor neke supstance komplementarna je boji koju ta supstanca apsorbuje.  

FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

Šema fotoelektričnog fotometra

Fotoelektrični fotometar

Skala galvanometra sa apsorbancom i transmisijom

Potenciometar za podešavanje nule apsorpcije

Mesto za kivetuOptički filteri

Slot za filter

Optički filter

Optički filter komplementarne boje boji rastvora (supstance) čija se apsorbanca meri

Skala fotometra

FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

Mesto za kivete

Optički filteri

Dvozračni fotometar

UzorakSlepa proba

UV i V SPEKTROFOTOMETRIJA

Za razliku od fotometrije, u spektrofotometriji se koristi mnogo uži deo spektra zračenja koji

se od izvora kontinualnog zračenja dobija pomoću monohromatora (optičke prizme ili

difrakcione rešetke).

Principijelnih razlika u donosu na fotometar gotovo da nema,

konstrukcione razlike su veoma velike!

Fotometar

Optički filter

Mere se veće promene energije

Polihromatsko zračenje – samo

kvantitativna analiza

Optički delovi su sočiva

Detektor – fotonaponska ćelija

Standardni izvor napajanja i pojačivač

signala

Spektrofotometar

Monohromatski filter

Mere se male promene energije uskog snopa zračenja

Monohromatsko zračenje – mogućnost kvalitativne i

kvantitativne analize

Umesto sočiva, često ogledala radi manjih gubitaka energije

Osetljiviji detektori – fotoemisione ćelije, fotomultiplikatori

Stabilizovani izvor napajanja i pojačivač signala električnih

veličina

Vezivanje izvora zračenja na stabilan naponski izvor velikog

kapaciteta (akumulator)

Izbegavanje rada na nižim talasnim dužinama, merenje u crvenom delu

spektra ako je moguće

Spektrofotometar je uređaj za analizu spektra elektromagnetskog zračenja. Sastoji se od izvora zračenja, monohromatora i detektora. Monohromator menja talasnu dužinu zračenja koje propušta. Registrovanjem intenziteta zračenja koje je uzorak apsorbovao, propustio ili reflektovao u zavisnosti od talasne dužine nastaje spektar.

Šema spektrofotometra

Da bi se postigla moguća tačnost i osetljivost, bitan je izbor talasne dužine merenja

Spektrofotometrija mora da ispuni sledeće uslove: 

-da se merenjem postiže maksimalna osetljivost

-da male promene talasne dužine ne utiču na reproduktivnost (najčešće se meri na talasnoj dužini

maksimuma apsorpcije)

-da važi Lambert – Beer-ov zakon

UV i V SPEKTROFOTOMETRIJA

Preklapanje pikova

Pravilo aditivnosti apsorbance

Ahl a +

A hl b